KR20030005212A - 녹내장의 진단법 및 치료법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 녹내장을 진단하고 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

녹내장의 진단법 및 치료법 {DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR GLAUCOMA}
녹내장
녹내장은 시신경의 퇴화를 특징으로 하는 안구 질환군이다. 이는 전세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나이다. 녹내장 발병과 관련된 하나의 두드러진 위험인자는 가족력이다. 녹내장의 다수의 상이한 유전 형태가 공지되었다.
원발성 선천 녹내장 또는 유아 녹내장은 안내압 상승, 글러브(glove) 또는 각막의 확장(즉, 우안(buphthalmos)), 시신경의 손상 및 궁극적으로 시각장애를 일으키는 눈의 방수배출 시스템의 부적절한 발달을 특징으로 하는 유전 질환이다.
원발성 개방각 녹내장(POAG)은 시야 결손 및 궁극적으로 실명을 야기하는 시신경의 위축을 특징으로 하는 흔한 질환이다. POAG는 발병 연령 및 임상 발표의 차이점을 기초로 하여 두 가지 주요 그룹으로 나뉘었다. 청소년성 POAG는 보통 소아기 말기 또는 성인기 초기에 나타난다. 이의 진행은 빠르고 심각한데, 높은 안내압을 수반한다. 이러한 타입의 POAG는 의학적 치료에 불충분하게 감응하며, 보통 안과 수술을 필요로 한다. 성인성 또는 만발성 POAG는 가장 흔한 타입의 녹내장이다. 이는 청소년성 POAG 보다 온후하고 보다 점진적으로 진행하며, 발병 시기는 가변적인데 보통 40세 이후이다. 이러한 타입의 POAG는 약간 내지 중간정도의 안내압 상승과 관련되며, 종종 정기적으로 모니터링된 의학적 치료에 만족스럽게감응한다. 불운하게도, 상기 질병은 시신경에 되돌릴 수 없는 손상이 이미 발생한 후에야 검출될 수 있는데, 이는 질병이 점진적으로 고통없이 진행되기 때문이다.
POAG의 두 타입 모두는 종종 잔기둥(trabecular) 그물(meshwork)을 통한 안구방수(aqueous humor) 배출의 억제로 인한 안내압 증가와 종종 관련된다. POAG에서의 사람 잔기둥 그물(HTM)의 병리생리학은 세포외 매트릭스 성분의 증가 및 잔기둥 그물 세포수 감소를 특징으로 하였다. 따라서, HTM 세포의 구조, 기능 또는 수의 결함이 POAG의 병인론에 영향을 주는 것으로 여겨진다. 또한, POAG의 병리생리학은 사람 사상판(human lamina cribrosa, HLC)의 세포를 포함하며, 이 세포는 HTM과 유사한 단백질 발현 패턴을 지니는 것으로 밝혀졌다 (Steely et al. (2000) Exp Eye Res 70:17-30). 따라서, POAG는 신경망막에 대한 손상을 주로 일으키는 두 조직에서 공통의 원인성 기시부를 지닐 수 있다. 따라서, POAG의 분자 병인론을 이해하고 독특한 치료 양식을 확인하기 위해 HTM 및 HLC내에서 작용하는 세포 조절 메카니즘을 확인하고 이해하는 것이 중요할 것이다.
배양된 HTM 세포는 다수의 성장 인자 수용체에 대한 mRNA를 발현하는 것으로 밝혀졌고, 또한 이렇게 발현된 수용체는 작용성인 것으로 밝혀졌는데 이는 외인성 성장 인자 투여가 생리학적 반응을 유도시키기 때문이다 (Wordinger et al. (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 1575-89). 생체내에서, 이러한 수용체는 안구방수 (aquecrine/paracrine)내에 존재하는 성장 인자에 의해 활성화되거나 잔기둥 그물 세포 자체 (autocrine)에 의해 국소적으로 합성되고 방출된 성장 인자에 의해 활성화될 수 있다. 실제로, TGF-b 이소폼은 EGF 자극된 잔기둥 그물 세포 증식을 현저하게 억제하는 반면 FGF-1, TGF-a, EGF, IL-1a, Il-1b, HGF, TNF-a, PDGF-AA 및 IGF-1는 세포외 산성화를 현저하게 자극하는 것으로 밝혀졌다 (상기 문헌 참조). 고친화도 수용체를 통해 작용하는 특정 성장 인자가 HTM의 전형적인 미세환경을 유지하는 데에 관여할 수 있고, POAG의 병인학에도 관여할 수 있다.
분자 병인학에 대한 한 가지 통찰력은 동물과 사람 둘 모두에서 고안압증을 유도할 수 있는 글루코코르티코이드가 배양된 HTM 세포의 세포골격 구조를 변경시킨다는 관찰로부터 유래한다 (Wilson et al. (1993) Current Eye Res 12: 783-93). 이러한 세포골격 변화는 액틴이 가교된 액틴 그물(cross-linked actin network, CLAN)로 재조직화되는 것을 포함하며, 이러한 구조적 변화는 고안압증을 초래하는 궁극적인 생리학적 변화일 수 있다 (Clark et al. (1993) J Glaucoma 4:183-88). 실제로, 글루코코르티코이드 유도된 고안압증의 안내압(IOP)을 저하시키는 것으로 밝혀진 혈압강하성 스테로이드 테트라히드로코르티솔도 HTM 세포골격에서 이러한 글루코코르티코이드 매개성 변화를 억제하는 것으로 여겨진다 (Clark et al. (1996) Inv Ophthal & Vis Sci 37: 805-813).
미국 특허 제 5,925,748호, 제 5,916,778호 및 제 5,885,776호에는 GLCIA 유전자의 돌연변이와 관련된 녹내장의 진단 방법 및 GLCIA 유전자에 의해 엔코딩된 MYOC 단백질의 활성을 조절하는 녹내장 치료제를 확인하는 방법이 기재되어 있다.
Wnt 시그널링 경로
Wnt유전자 패밀리는 분화 및 발육에서 중요한 역할을 하는 분비된 리간드 단백질을 엔코딩한다. 이러한 패밀리는 드로소필라 분절 극성 유전자인 w ingless및 이의 척추동물 호몰로그(homologue)의 하나인i nt egrated를 포함하는 15가지 이상의 척추동물 및 비척추동물 유전자를 포함하며, Wnt란 명칭은 밑줄그은 부분으로부터 유래된다. Wnt 단백질은 다수의 발육 작용 및 항상성 작용을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 척추동물Wnt1은 몸분절내에서 근육분절을 유도시키고, 중뇌의 경계를 확정하는 데에 있어서 활성인 것으로 여겨진다 (참조: McMahon and Bradley (1990) Cell 62: 1073; Ku and Melton (1993) Development 119: 1161; Stern et al. (1995) Development 121:3675). 포유동물 장배형성(gastrulation) 도중에,Wnt3a,Wnt5a및Wnt5b가 원시선조내의 독특하지만 오버랩핑하는 영역에서 발현된다. Wnt3a는 등쪽 (몸분절) 중배엽을 생성시키는 선조(streak)의 영역에서 발견되는 유일한 Wnt 단백질이며,Wnt3a유전자의 널(null) 대립형질에 대해 동형접합성인 마우스는 꼬리측 내지 앞다리의 선조를 지니지 않는다. 또한,Wnt유전자는 비척추동물 호몰로그wingless가 곤충 림(limb) 발육 동안 극성을 확립하는 것으로 밝혀진 바와 같이 척추동물 림의 극성을 확립하는 데에 있어서 중요하다. 둘 모두의 경우, 헤지호그 패밀리 일원과의 상호작용이 또한 존재한다.
Wnt 시그널링 경로는 Wnt/wingless 시그널링의 형질도입에 관여하는 다수의 단백질을 포함하며, 헤지호그 발생 경로와 밀접하게 연결되어 있다. 드로소필라의 경우, 분비된 wingless 단백질은 프리즐드(frizzled) 수용체를 통해 이웃하는 세포에 결합함으로써 wingless-헤지호그 경로에서 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 그 후, 프리즐드 수용체는 디쉐블드(Disheveled) 단백질을 활성화시키며, 이는 아마딜로(Armadillo) 단백질(베타-카테닌 단백질)에 대한 제스테-화이트(Zeste-white)-3 키나제의 작용을 억제시킨다. 활성 아마딜로 단백질은 고이동성 그룹(HMG) 단백질 LEF/TCF (Lymphoid Enhancer Factor/T-Cell Factor)와 함께 작용하여 헤지호그(hh) 유전자의 핵발현을 촉진시킨다. 헤지호그는 패치드(Patched) 단백질인 또 다른 단백질을 통해 Wnt/wingless 활성화된 세포에 인접한 세포에 결합할 수 있는 분비된 단백질이다. 헤지호그 단백질이 패치드 수용체에 결합하면 wingless 단백질의 핵발현을 활성화시키며, 이는 그 후 분비되고 이웃하는 헤지호그 분비 세포와의 상호 시그널링을 추가로 증강시킨다. 이로써 Wnt/Wingless-헤지호그 상호 시그널링 시스템은 척추동물 및 비척추동물 발육 도중에 두 개의 인접 세포의 차별 결정(differential determination)을 촉진시킨다. 이는 차별된 경계를 안정화시키는데, 조직은 한쪽면에서 헤지호그 단백질을 분비하는 한편 다른쪽에서는 Wingless를 생성시킨다. 실제로, 세포 표면은 하나의 세포가 또 다른 세포 뿐만 아니라 세포외 매트릭스에 차별 부착함으로써 발육 및 항상성에서 극히 중요한 역할을 한다. 또한, 차별 세포 부착이 일어난 경우, Wnt/Wingless-헤지호그 프로세스의 작용은 인접 세포층 사이의 연속적 시그널링을 촉진시킨다.
이러한 Wnt/Wingless 경계는 드로소필라에서의 분절 및 부속기(appendage)의 생성 뿐만 아니라 포유류에서의 뇌 및 림 소구획의 생성에서 중요하다 (Ingham (1994) Curr Biol 4: 1; Niswander et al. (1994) Nature 371:609; Wilder and Perrimon (1995) Development 121:477). 제노푸스의 경우, 프리즐드-2 수용체(xfz2)가 눈 원기(anlage) 및 이소포(otic vesicle)에서 장배형성 후에 고도로 발현되며, 닭의 경우, 특정 Wnt 유전자 패밀리 일원인Wnt13은 수정체의 증식성상피 및 섬모체 가장자리의 색소층과 비색소층 둘 모두에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Jasoni et al. (1999) Dev Dyn 215: 215). 상호 Wnt/Wingless-헤지호그 경로는 정상 분화된 체성 조직을 유지하는 데에 있어서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 사람의 경우, 체성 조직에서의 패치드 유전자의 산발성 기능손실 돌연변이는 사람 암의 가장 흔한 타입인 기저세포 암종을 유발한다. 또한, 패치드 유전자의 유전성 돌연변이는 늑골 및 두개안면 변화를 포함하는 발육이상을 특징으로 하는 상염색체 우성 질환인 기저세포 모반 증후군, 및 악성종양을 일으킨다 (Hahn et al. (1996) Cell 85:841; Johnson et al. (1996) Science 272: 1668).
최근, 분비된 또는 가용성 프리즐드 관련 단백질 5 (SFRP5)로 명명되는 포유류 Wnt 수용체 프리즐드와 상동인 단백질이 척추동물 망막색소상피(RPE)에 의해 우선적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Chang et al. (1999) Hum Mol Gene 8: 575). 또한, 또 다른 SFRP인 SPRP2가 내부 핵층의 세포에 의해 특이적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 망막의 광수용 세포는 SFRP 분자의 두 가지 반대되는 구배에 노출된다. 프리즐드 관련 단백질이 막 스패닝(spanning) 도메인을 함유하지 않으므로, 이들은 정상적인 7개의 트랜스멤브레인 프리질드 수용체를 통한 Wnt 시그널링을 간섭하는 수용체의 분비된 가용성 형태인 것으로 생각된다. 실제로, 맥관 내피 및 다양한 상피에서 고도로 발현되는 sFRP인 FrzA는 Wnt-1 단백질에 특이적으로 결합함으로써, 프리즐드 수용체를 통한 Wnt-1 시그널링을 블록킹한다 (Dennis et al. (1999) J Cell Sci 112: 3815).
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 사람 프리즐 관련 단백질(FRP-1)(Seq ID No.1)의 cDNA 서열을 도시한다.
도 2는 사람 FRP-1의 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 Wnt 시그널 형질도입 경로를 개략적으로 도시한다. 도 3a는 FRP가 Wnt에 결합하는 것을 기초로 한 유전자 발현의 억제를 도시한다. 도 3b는 Wnt 자극된 유전자 발현을 도시한다. Wnt가 프리즐드 단백질(Fz)에 결합하면 디쉐블드(Dsh)를 활성화시키고, 이는 글리코겐-신타제-키나제 3 (GSK3)이 단백질키나제 C (APC)에 결합하는 것을 억제하며, 이는 β-카테닌을 축적시키고, 이는 T 세포 인자(TCF)와 같은 전사 인자의 상호작용을 촉진시킴으로써 유전자 발현을 촉진시킨다.
4. 발명의 상세한 설명
4.1.개괄
일반적으로, 본 발명은 프리즐드 관련 단백질-1(FRP-1)이 녹내장 환자의 잔기둥그물(TM)에서 상향조절된다는 발견을 기초로 한다. 한정시키고자 하는 것은 아니지만, Wnt 시그널링 경로는 중요한 잔기둥 그물세포 기능을 조절하기 위해 도 3a에 도시된 바와 같이 TM에서 작용하고, FRP-1은 도 3a에 도시된 바와 같이 정상 Wnt 시그널링을 길항하여 TM 세포 기능을 간섭하는 것으로 생각된다.
4.2정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 특정 용어 및 표현의 의미를 하기 나타낸다.
본원에 사용된 "비정상(aberrant)"이란 용어는 녹내장 조직에서는 발견되지만 비녹내장 조직에서는 발견되지 않는 유전자 생성물 레벨 또는 생활성의 변화를 의미한다. 예를 들어, 프리즐 관련 단백질 유전자 생성물의 비정상으로 높은 레벨은 정상 환자로부터 수득한 비녹내장 잔기둥 그물세포 보다는 녹내장 환자로부터 수득한 녹내장 잔기둥 그물세포과 관련된다. 또한, Wnt 경로 성분의 비정상적으로 낮은 생활성은 정상 환자로부터의 잔기둥 그물세포와 관련된다.
FRP와 같은 폴리펩티드의 활성에 적용되는 "비정상 활성"이란 용어는 야생형또는 본래의 폴리펩티드의 활성과 상이하거나 건강한 피검자의 폴리펩티드의 활성과 상이한 활성을 의미한다. 폴리펩티드의 활성은 비정상적일 수 있는데, 이는 이의 본래의 대응물의 활성 보다 강력하기 때문이다. 비정상 활성은 또한 활성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 비정상 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 FRP를 엔코딩하는 유전자의 과발현 또는 저발현으로 인해 비정상 FRP 활성을 지닐 수 있다.
본원에 사용되는 "아고니스트(agonist)"란 용어는 Wnt 개시된 유전자 발현 또는 Wnt 조절되는 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질 또는 Wnt 시그널링 경로의 유전자 또는 단백질의 레벨 또는 활성을 직접적 또는 간접적으로 향상시키거나, 보충하거나 증강시키는 작용제(agent)를 의미한다.
"대립형질 변이체"와 호환하여 사용되는 "대립형질(allele)"이란 용어는 유전자 또는 이의 부분의 택일적(alternative) 형태를 의미한다. 대립형질은 상동 염색체에서 동일한 로커스(locus) 또는 위치를 차지한다. 피검자가 어떤 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 지닌 경우, 피검자는 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성이라고 일컬어진다. 피검자가 어떤 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 지닌 경우, 피검자는 그 유전자에 대해 이형접합성이라고 일컬어진다. 특정 유전자의 대립형질은 하나의 누클레오티드 또는 수 개의 누클레오티드에서 서로 다를 수 있고, 누클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 또한, 유전자의 대립형질은 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용되는 "안타고니스트(antagonist)"란 용어는 Wnt 개시된 유전자발현 또는 Wnt 조절되는 유전자에 의해 엔코딩된 단백질 또는 Wnt 시그널링 경로의 유전자 또는 단백질의 레벨 또는 활성을 직접적 또는 간접적으로 방지하거나, 최소화하거나, 억제하는 작용제를 의미한다.
본원에 사용되는 "결합 파트너"란 용어는 특정 유전자 생성물과 비공유적 힘을 통해 상호작용하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 "결합 파트너"로는 FRP-1 안티센스 폴리누클레오티드와 같은 프리즐드 관련 단백질 유전자 mRNA와 상호작용하는 물질, 및 Wnt 폴리펩티드와 같은 프리즐드 관련 단백질 포리펩티드와 상호작용하는 물질이 있다.
본원에 사용되는 "폴리펩티드의 생활성 단편"이란 용어는 상응하는 전장 야생형 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 의태하거나 길항하는 전장 폴리펩티드의 단편을 의미한다.
"세포", "숙주세포" 또는 "재조합 숙주세포"는 본원에서 호환하여 사용하는 용어이다. 이들 용어는 특정 피검자 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 프로제니 또는 잠재적 프로제니를 의미하는 것으로 이해된다. 특정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있으므로, 이러한 프로제니는 실제로 모세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용되는 용어의 범위에는 여전히 속한다.
"키메라 폴리펩티드" 또는 "융합 폴리펩티드"는 예를 들어 피검자 FRP 폴리펩티드의 하나를 엔코딩하는 제 1 아미노산 서열과 FRP 폴리펩티드의 임의의 도메인에 대해 외래이고 실질적으로 상동성이 아닌 도메인(예를 들어, 폴리펩티드 부분)을 규정하는 제 2 아미노산의 융합체이다. 키메라 폴리펩티드는 제 1 폴리펩티드를 또한 발현하는 생물체에서 발견되는 외래 도메인을 제공하거나 (비록 상이한 폴리펩티드 형태이긴 하지만), 이것은 상이한 종류의 생물체에 의해 발현되는 폴리펩티드 구조의 "종간(interspecies)", "유전자간(intergenic)" 등의 융합체일 수 있다. 일반적으로, 융합 폴리펩티드는 일반식 X-FRP-Y에 의해 표현될 수 있으며, 여기서 FRP는 FRP 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드의 일부를 나타내고, X와 Y는 독립적으로 부재하거나 천연 돌연변이체를 포함하는 생물체의 FRP 서열과 관련되지 않은 아미노산 서열을 나타낸다.
"전달 복합체(delivery complex)"는 표적화 수단을 의미한다 (예를 들어, 표적 세포 표면에 대한 유전자, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 높은 친화성 결합 및/또는 표적 세포에 의한 세포 또는 핵 흡수율 증가을 일으키는 분자). 표적화 수단의 예로는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜), 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 레트로바이러스) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예를 들어, 표적 세포 특이적 수용체에 의해 인식되는 리간드)가 있다. 바람직한 복합체는 표적 세포에 의한 내재화(internalization) 전에 현저한 분해를 방지하기에 생체내에서 충분히 안정하다. 그러나, 복합체는 세포내에서 적합한 조건하에서 분해될 수 있으므로, 유전자, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 작용성 형태로 방출된다.
널리 공지된 바와 같이, 유전자는 개체의 게놈내에 하나의 복사체 또는 다수의 복사체로 존재할 수 있다. 이러한 복사(duplicate) 유전자는 동일하거나 누클레오티드 치환, 첨가, 역위 또는 결실을 포함하는 특정한 변형을 지닐 수 있으며, 이들 모두는 실질적으로 동일한 활성을 지닌 폴리펩티드를 여전히 코딩한다. 따라서, "FRP 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열"이란 용어는 특정한 개체내의 하나 이상의 유전자를 의미할 수 있다. 더욱이, 누클레오티드 서열의 몇몇 차이가 개개의 생물체 사이에 존재할 수 있는데, 이는 대립형질이라 일컬어진다. 이러한 대립형질 차이는 엔코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 차이를 초래하거나 초래하지 않을 수 있지만, 여전히 동일한 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 엔코딩한다.
"프리즐드 관련 단백질(Frizzled Related Protein, FRP)"이란 프리즐드 단백질의 세포외 리간드 결합 도메인과 유사한 분리된 단백질 패밀리의 임의의 일원일 수 있다. FRP는 또한 분리된 또는 가용성 프리즐드 관련 단백질(sFRP)로 일컬어지는데, 이는 이들이 막 스패닝 도메인을 함유하지 않아서 Wnt 단백질의 우성 네거티브 수용체로서 작용하는 것으로 여겨지기 때문이다. FRP는 사람 분비된 프리즐드 관련 단백질 엔코딩 유전자Frz-1(GenBank Accession No. AF056087); 사람 분비된 프리즐드 관련 단백질 엔코딩 유전자SFRP5(GenBank Accession No. AF117758); 사람FrzB유전자 (GenBank Accession No. U24163); 및 제노푸스FrzA유전자 (GenBank Accession No. AF049908)을 포함하는 다양한 척추동물 유전자에 의해 엔코딩된다.
본원에 사용되는 "녹내장"이란 용어는 안구방수(aqueous humor)가 흐르는 채널의 막힘으로 인한 안내압 상승(만성 또는 개방각 녹내장) 또는 수정체에 가해지는 홍채의 압력(급성 또는 폐쇄각 녹내장)에 의해 종종 유발되는, 시신경 유두의독특한 퇴화 및 시야 상실을 특징으로 하는 안구 질환군을 의미한다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩티드 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 상동성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 중의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교 서열 중의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된 경우, 상기 분자는 그 위치에서 동일하다. 핵산 서열 사이의 상동성 또는 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열에 의해 공유된 위치에서의 동일한 또는 매칭(matching) 누클레오티드 갯수의 함수이다. 아미노산 서열의 동일성의 정도는 아미노산 서열에 의해 공유된 위치에서의 동일한 아미노산 갯수의 함수이다. 아미노산의 상동성 또는 유사성의 정도는 아미노산 서열에 의해 공유된 위치에서의 아미노산 (즉, 구조적으로 관련된) 갯수의 함수이다. 두 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상동성 퍼센트는 당 분야에 널리 공지된 다수의 수학적 알고리즘 중의 어느 하나를 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, BLAST 서열 상동성 소프트웨어(입수처: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 의해 제공됨).
본원에 사용된 "상호작용(interact)"이란 용어는 예를 들어 효모 투 하이브리드 검정(yeast two hybrid assay)을 사용하여 검출될 수 있는, 분자 사이의 검출가능한 상호작용을 포함하도록 의도된다. 상호작용이란 용어는 분자 사이의 "결합" 상호작용을 또한 포함하도록 의도된다. 예를 들어 상호작용은 사실상 단백질-단백질 또는 단백질-핵산 또는 핵산-핵산일 수 있다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산과 관련하여 본원에 사용되는 "단리된(isolated)"이란 용어는 거대분자의 천연 공급원에 존재하는, 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 의미한다. 예를 들어, 피검자 FRP 폴리펩티드의 하나를 엔코딩하는 단리된 핵산은 바람직하게는 지놈 DNA에서 FRP 유전자를 천연적으로 바로 플랭킹하는 핵산 서열을 10 킬로염기(kb) 이하로, 더욱 바람직하게는 이러한 천연 플랭킹 서열을 5kb 이하로, 가장 바람직하게는 이러한 천연 플랭킹 서열을 1.5kb 이하로 포함한다. 본원에 사용되는 단리된이란 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 경우 세포성 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 화학 합성되는 경우 화학적 전구물질 또는 그 밖의 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 또한 의미한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연 발생하지 않고 천연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 의도된다. "단리된"이란 용어는 다른 세포성 단백질로부터 단리되는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 본원에 사용되며, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 "모듈레이션(modulation)"이란 용어는 상향조절(즉, 활성화 또는 자극 (예를 들어, 아고나이징(agonizing)하거나 증강시킴으로써)) 및 하향조절(즉, 억제 또는 서프레션 (예를 들어, 길항하거나, 감소시키거나 억제시킴으로써)) 둘 모두를 의미한다.
"돌연변이된 유전자(mutated gene)"란 돌연변이된 유전자를 지니지 않는 환자와 비교하여 돌연변이된 유전자를 지닌 환자의 표현형을 변화시킬 수 있는 유전자의 대립형질 형태를 의미한다. 피검자가 변화된 표현형을 지니게 하는 이러한돌연변이를 위해 동형접합성이어야 하는 경우, 이 돌연변이는 열성이라 일컬어진다. 돌연변이된 유전자의 하나의 복사체가 피검자의 표현형을 변화시키기에 충분한 경우, 이 돌연변이는 우성이라 일컬어진다. 피검자가 돌연변이된 유전자의 하나의 복사체를 지니고 동형접합성 피검자의 표현형과 이형접합성 피검자의 표현형 사이의 중간형태의 표현형을 지니는 경우 (상기 유전자에 대해), 이 돌연변이는 공우성(co-dominant)이라 일컬어진다.
본 발명의 "사람 이외의 동물"이란 설치류, 사람 이외의 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유류를 포함한다. 바람직한 사람 이외의 동물은 쥐과(rodent family)로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 마우스이지만, 제노푸스속과 같은 유전자이식(transgenic) 양서류, 및 유전자이식 닭이 또한 예를 들어 배형성 및 조직 형성에 영향을 미칠 수 있는 작용제를 이해하고 확인하기 위한 중요한 도구를 제공할 수 있다. "키메라 동물"은 재조합 유전자가 발견되거나 재조합 유전자가 동물의 모든 세포가 아닌 일부 세포에서 발현되는 동물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. "조직 특이적 키메라 동물"이란 용어는 재조합 유전자 중의 하나가 다른 조직을 제외한 일부 조직에 존재하고/하거나 이 조직에서 발현되거나 파괴됨을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산"이란 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 및 적합한 경우 리보핵산(RNA)과 같은 폴리누클레오티드를 의미한다. 또한, 이 용어는 균등물로서 누클레오티드 유사체로부터 생성된 RNA 또는 DNA의 유사체, 및 하기 설명될 구체예에 적용가능한 바와 같이 단일 가닥 (센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리누클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"SEQ ID NO. x로 표시된 누클레오티드 서열과 상보적인 누클레오티드 서열"이란 용어는 SEQ ID NO.x를 지닌 핵산 가닥의 상보적 가닥의 누클레오티드 서열을 의미한다. "상보적 가닥"이란 용어는 "상보체"란 용어와 호환하여 본원에서 사용된다. 핵산 가닥의 상보체는 코딩 가닥의 상보체 또는 비코딩 가닥의 상보체일 수 있다. 이중가닥 핵산을 의미하는 경우, SEQ ID NO.x를 지닌 핵산의 상보체는 SEQ ID NO.x를 지닌 가닥의 상보적 가닥 또는 SEQ ID NO.x의 상보적 가닥의 누클레오티드 서열을 지닌 임의의 핵산을 의미한다. 누클레오티드 서열 SEQ ID NO.x를 지닌 단일가닥 핵산을 의미하는 경우, 이 핵산의 상보체는 SEQ ID NO.x의 누클레오티드 서열과 상보적인 누클레오티드 서열을 지닌 핵산이다. 누클레오티드 서열 및 이의 상보적 서열은 항상 5'에서 3' 방향으로 주어진다.
"다형성(polymorphism)"이란 용어는 하나의 유전자 또는 이의 부분(예를 들어, 대립형질 변이체)의 하나를 초과하는 형태의 공존을 의미한다. 두 개 이상의 상이한 형태, 즉, 두 개의 상이한 누클레오티드 서열이 존재하는 하나의 유전자의 부분은 "유전자의 다형성 영역"으로 일컬어진다. 다형성 영역은 단일 누클레오티드일 수 있고, 이의 동일성은 다수의 대립형질에서 달라진다. 다형성 영역은 또한 수 개의 누클레오티드 길이일 수 있다.
"다형성 유전자"란 하나 이상의 다형성 영역을 지닌 유전자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "프로모터"란 용어는 이 프로모터에 작동적으로 결합된 선택된 DNA 서열의 발현을 조절하고, 세포에서 선택된 DNA 서열을 발현시키는 DNA 서열을 의미한다. 이 용어는 "조직 특이적" 프로모터, 즉, 특정 세포(예를 들어, 특정 조직의 세포)에서만 선택된 DNA 서열을 발현시키는 프로모터를 포함한다. 이 용어는 하나의 조직에서 선택된 DNA의 발현을 주로 조절하지만 다른 조직에서도 발현을 일으키는 소위 "리키(leaky)" 프로모터를 또한 포함한다. 또한, 이 용어는 비조직 특이적 프로모터 및 구성적으로 발현하거나 유도성(즉, 발현 레벨이 조절될 수 있음)인 프로모터를 포함한다.
"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"란 용어는 아미노산 함유 유전자 생성물을 의미하는 경우 본원에서 호환하여 사용된다.
"재조합 단백질"이란 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 본 발명의 폴리펩티드를 의미하며, 상기 기술은 일반적으로, FRP 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA가 적합한 발현 벡터내로 삽입되고 이를 사용하여 숙주 세포를 트랜스펙션시켜서 이종 단백질을 생성시키는 것이다. 더욱이, 재조합 FRP 유전자와 관련하여 "유래된"이란 표현은 "재조합 단백질"의 의미속에 본래의 FRP 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 천연 형태의 폴리펩티드의 치환 및 결실(트렁케이션(truncation) 포함)을 포함하는 돌연변이에 의해 생성된 이와 유사한 아미노산 서열을 지닌 단백질을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 "소분자(small molecule)"는 분자량이 약 5kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4kD 미만의 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 소분자는 해산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 탄수화물, 지질 또는 그 밖의 유기(탄소함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 다수의 제약 회사들은 FRP 또는 Wnt시그널링 생활성을 모듈레이팅하는 화합물을 확인하기 위한 본 발명의 검정 중 어느 하나로 스크리닝될 수 있는 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 종종 진균, 세균 또는 조류 추출물의 광범위한 라이브러리를 보유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 하이브리드화하는" 또는 "특이적으로 검출하는"이란 용어는 본 발명의 핵산 분자가 척추동물의 약 6개, 12개, 20개, 30개, 50개, 100개, 150개, 200개, 300개, 350개, 400개 또는 425개 이상의 연속 누클레오티드, 바람직하게는 FRP 유전자와 하이브리드화할 수 있는 능력을 의미한다.
"전사 조절 서열"은 이들이 작동적으로 결합된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도하거나 조절하는, 개시 시그널, 인핸서 및 프로모터와 같은 DNA 서열을 의미하기 위해 명세서에 걸쳐 사용되는 일반적 용어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "트랜스펙션"이란 핵산 매개된 유전자 전달에 의해 핵산을, 예를 들어 발현 벡터를 통해, 수용 세포내로 도입시키는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 "형질전환"이란 용어는 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수의 결과로써 세포의 유전자형이 변화되는 작용을 의미하며, 예를 들어, 형질전환된 세포는 재조합 형태의 FRP 폴리펩티드를 발현하거나, 전달된 유전자로부터의 안티센스 발현의 경우, 천연 형태의 FRP 폴리펩티드의 발현이 파괴된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이식유전자(transgene)"란 용어는 세포내로 도입된 핵산 서열(예를 들어 FRP 폴리펩티드 또는 이에 대한 안티센스 전사체 중 어느 하나를 엔코딩함)을 의미한다. 이식유전자는 이것이 도입되는 유전자이식 동물또는 세포에 대해 완전히 또는 부분적으로 이종, 즉, 외래일 수 있거나, 이것이 도입되는 유전자이식 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대해 상동이지만, 이것은 이것이 삽입되는 세포의 지놈을 변화시키는 방식으로 동물의 지놈내로 삽입되거나 삽입되도록 설계된다 (예를 들어, 이것은 천연 유전자의 위치와 상이한 위치에 삽입되거나 이의 삽입은 녹아웃(knockout)을 일으킨다). 이식유전자는 또한 에피솜의 형태로 세포에 존재할 수 있다. 이식유전자는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 선택된 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 인트론과 같은 그 밖의 임의의 핵산 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
"유전자이식 동물"이란 동물의 세포 중 하나 이상이 사람의 개입에 의해, 예를 들어 당 분야에 널리 공지된 유전자이식 기술에 의해 도입된 이종 핵산을 함유하는, 임의의 동물, 바람직하게는 사람 이외의 포유류, 조류 또는 양서류를 의미한다. 핵산은 세포의 전구체내로의 도입, 마이크로인젝션과 같은 계획적인 유전자 조작 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 직접적 또는 간접적으로 세포내로 도입된다. 유전자 조작이란 용어는 고전적인 교잡육종(cross-breeding) 또는 시험관내 수정을 포함하지 않지만, 오히려 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체내에 통합될 수 있거나, 염색체외 복제성 DNA일 수 있다.
본원에 사용되는 "치료(treating)"란 용어는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 치유시키는 것 뿐만 아니라 개선시키는 것도 포함하는 것으로 의도된다.
"벡터"란 용어는 이와 결합한 또 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 벡터의 한 가지 타입은 에피솜, 즉, 염색체외 복제할 수 있는핵산이다. 바람직한 벡터는 이들과 결합된 핵산을 자율적으로 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드"의 형태인데, 이는 일반적으로 벡터 형태에 있어서 염색체에 결합되어 있지 않은 환형의 이중가닥 DNA 루프를 의미한다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드" 및 "벡터"는 호환하여 사용되는데, 이는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하고 이후 당 분야에 공지되는 그 밖의 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
"야생형 대립형질"이란 용어는 피검자내에 두 개의 복사체로 존재하는 경우 야생형 표현형을 일으키는 유전자의 대립형질을 의미한다. 특정 유전자의 다수의 상이한 야생형 대립형질이 존재할 수 있는데, 이는 유전자의 특정한 누클레오티드 변화가 누클레오티드 변화를 지닌 유전자의 두 개의 복사체를 갖는 피검자의 표현형에 영향을 미치지 않을 수 있기 때문이다.
"Wnt 시그널링 성분"은 Wnt 시그널링 경로에 관여하는 단백질 또는 단백질을 엔코딩하는 유전자를 의미한다. 이러한 단백질의 예로는 Wnt, 프리즐드(Fz), 디쉐블드(Dsh), 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3), 단백질 키나제 C (APC), β-카테닌 및 고이동성 그룹(HMG) 단백질 (예를 들어, LEF/TCF (림프양 인핸서 인자/T-세포 인자))가 있다.
"Wnt 단백질"은Wnt3a, Wnt5a및Wnt5b를 포함하는 거대한 포유류 유전자군에 의해 엔코딩된다.
4.3.녹내장의 예후학 및 진단학
녹내장에 걸린 몇몇 피검자의 FRP 레벨이 증가하였다는 결과를 기초로 하여, 다양한 녹내장 진단학이 개발될 수 있다. 몇몇 진단학은 FRP의 부적절하게 높은 레벨을 초래하는 핵산 서열의 돌연변이를 검출할 수 있다. 이러한 진단학은 도 1에 도시된 공지된 사람 FRP cDNA의 핵산 서열 또는 도 2에 도시된 엔코딩된 핵산 서열을 기초로 하여 개발될 수 있다. 그 밖의 진단학은 사람 FRP의 지놈 서열 또는 FRP 발현을 조절하는 유전자의 서열의 지놈 서열을 기초로 하여 개발될 수 있다. 그 밖의 진단학은 mRNA 레벨에서 FRP 유전자 발현의 레벨의 변화를 기초로 하여 개발될 수 있다. 사람 FRP의 지놈 서열을 함유하는 플라스미드는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 제 호가 부여되었다.
그 밖의 진단학은 Wnt 시그널링 단백질 또는 Wnt 시그널링 단백질을 엔코딩하는 유전자의 활성 또는 레벨을 검출할 수 있다. 예를 들어, 프리즐드(Fz); 디쉐블드(Dsh); 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3), 단백질 키나제 C (APC), β-카테닌 고이동성 그룹 (HMG) 단백질 (예를 들어 LEF/TCF(림프양 인핸서 인자/T-세포 인자)), 및 헤지호그(Hh)를 포함하는 Wnt 시그널링 성분의 부적절한 작용을 초래하는 예를 들어 돌연변이를 포함하는 부적절하게 낮은 Wnt 시그널링 활성을 검출하는 진단학이 개발될 수 있다. 또한, 핵산을 기재로 하지 않는 기술을 사용하여 이러한 Wnt 시그널링 단백질 중 어느 하나의 양 또는 특이적 활성의 변화를 검출할 수있다.
유전자 및 유전자 생성물의 비정상적 레벨 또는 활성을 검출하는 데에 있어서 다수의 수단이 현재 이용가능하다. 예를 들어, 많은 방법은 사람 다형성 로커스에서 특정 대립형질을 검출하는 데에 있어서 이용가능하다. 특정 다형성 대립형질을 검출하기 위한 바람직한 방법은 부분적으로는 다형성의 분자적 특성에 좌우될 것이다. 예를 들어, 다형성 로커스의 다수의 대립형질 형태는 DNA의 단일 염기쌍만큼 상이할 수 있다. 이러한 단일 누클레오티드 다형성(또는 SNP)은 모든 공지된 다형성의 80%를 차지하는 유전적 변이에 대한 주요 기여인자이며, 사람 지놈 중의 이들의 밀도는 1,000개 염기쌍 당 평균 1개로 추정된다. SNP는 단지 두 개의 상이한 형태로 가장 빈번히 이중대립형질(biallelic)로 존재한다 (그러나, DNA에 존재하는 4개의 상이한 누클레오티드 염기에 상응하는 SNP의 4개 이하의 상이한 형태가 이론적으로 가능하다). 그럼에도 불구하고, SNP는 다른 다형성 보다 돌연변이면에서 더욱 안정하여, 이들을 마커 및 미지의 변이체 사이의 연관 불평형을 사용하여 질병 유발 돌연변이를 맵핑하는 관련 실험에 적합하도록 해준다. 또한, SNP가 전형적으로 단지 두 개의 대립형질을 지니므로, 이들은 길이 측정 보다는 간단한 플러스/마이너스 검정에 의해 제노타입핑(genotyping)될 수 있으며, 이는 이들을 자동화에 더욱 적합하게 해준다.
개체의 특정한 단일 누클레오티드 다형성 대립형질의 존재를 검출하는 데에 있어서 다수의 방법이 이용가능하다. 이 분야의 진보는 정확하고, 용이하고, 저렴한 대규모 SNP 제노타입핑을 제공하였다. 가장 최근에는, 예를 들어 동적 대립형질-특이적 하이브리드화(dynamic allele-specific hybridization, DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(microplate array diagonal gel electrophoresis, MADGE), 피로시퀀싱(pyrosequencing), 올리고누클레오티드-특이적 리게이션, TaqMan 시스템 뿐만 아니라 아피메트릭스(Affymetrix) SNP 칩과 같은 다수의 DNA "칩(chip)' 기술을 포함하는 다수의 신기술이 공지되었다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의해 표적 유전자 영역의 증폭을 필요로 한다. 침입성 절단 후 질량 분석법 또는 고정된 패드록(padlock) 프로브 및 롤링-써클(rolling-circle) 증폭에 의한 작은 시그널 분자의 생성을 기초로 하는 그 밖의 새롭게 개발된 기술은 PCR의 필요성을 결국 제거할 수 있다. 특정한 단일 누클레오티드 다형성을 검출하는 것과 관련하여 당 분야에 공지된 방법 중 몇몇 방법을 하기 요약하였다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
단일 누클레오티드 다형성의 분석을 촉진시키기 위해 다수의 방법이 개발되어 왔다. 한 가지 구체예에 있어서, 단일 염기 다형성은 예를 들어 먼디, 씨. 알.(Mundy, C.R.)에 의해 기술된 바와 같이 (미국 특허 제 4,656,127호) 특수 엑소누클레아제 내성 누클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 이 방법에 따르면, 다형성 부위의 바로 3'에 있는 대립형질 서열과 상보적인 프라이머가 특정한 동물 또는 사람으로부터 수득한 표적 분자에 하이브리드화하게 된다. 존재하는 특정 엑소누클레아제-내성 누클레오티드 유도체와 상보적인 누클레오티드를 표적 분자상의 다형성 부위가 함유하는 경우, 상기 유도체는 하이브리드화된 프라이머의 말단상으로 통합될 것이다. 이러한 통합은 프라이머를 엑소누클레아제에 대해 내성이 되게 함으로써, 이의 검출을 가능하게 해준다. 샘플의 엑소누클레아제-내성 유도체의 동일성이 공지되어 있으므로, 프라이머가 엑소누클레아제에 대해 내성이 되었다는 결과는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 누클레오티드가 반응에 사용된 누클레오티드 유도체와 상보적임을 나타내준다. 이 방법은 대량의 생체외 서열 데이터의 결정을 필요로 하지 않는다는 이점을 지닌다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 다형성 부위의 누클레오티드의 동일성을 결정하기 위해 용액 기재 방법이 사용된다 (Cohen, D. et al. (French Patent 2,650,840; PCT Appln. No. WO91/02087). 미국 특허 제 4,656,127호의 먼니의 방법에서와 같이, 다형성 부위의 바로 3'에 있는 대립형질 서열과 상보적인 프라이머가 사용된다. 이 방법은 다형성 부위의 누클레오티드와 상보적인 경우 프라이머의 말단상으로 통합되는 표지된 디데옥시누클레오티드 유도체를 사용하여 상기 부위의 누클레오티드의 동일성을 결정한다.
제네틱 비트 분석(Genetic Bit Analysis) 또는 GBA™로서 공지된 또 다른 방법은 고엘렛, 피.(Goelet, P.) 등에 의해 기술되었다 (PCT Appln. No. 92/15712). 고엘렛, 피. 등의 방법은 다형성 부위의 3'에 있는 서열과 상보적인 프라이머 및 표지된 터미네이터의 혼합물을 사용한다. 따라서, 통합되는 표지된 터미네이터는 평가하려는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 누클레오티드에 의해 결정되며, 이와 상보적이다. 코헨 등의 방법 (French Patent 2,650,840; PCT Appln. No. WO91/02087)과 대조적으로, 고엘렛, 피. 등의 방법은 표적 분자의 프라이머가 고체상에 고정화되는 불균일상 검정인 것이 바람직하다.
최근, DNA 중의 다형성 부위를 검정하기 위한 다수의 프라이머 가이딩(guiding)된 누클레오티드 통합 방법이 공지되었다 (Komher, J.S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B.P., Nucl. Acids Res.18:3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). 이들 방법은 이들 모두가 다형성 부위에 있는 염기들 사이의 디스크리미네이트(discriminate)에 표지된 데옥시누클레오티드가 통합되는 것에 의존한다는 점에서 GBA™와 상이하다. 이러한 포맷에 있어서, 시그널은 통합되는 데옥시누클레오티드의 수에 비례하므로, 동일한 누클레오티드의 런(run)에 존재하는 다형성은 런의 길이에 비례하는 시그널을 생성시킬 수 있다 (Syvanen, A. -C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
단백질 번역의 조기 종결을 일으키는 돌연변이의 경우, 단백질 트렁케이션 시험(PTT)은 효율적인 진단 방법을 제공한다 (Roest, et al., (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et al., (1994) Genomics 20:1-4). PTT의 경우, RNA는 먼저 이용가능한 조직으로부터 단리되고 역전사되며, 관심의 세그먼트가 PCR에 의해 증폭된다. 그 후, 역전사 PCR의 생성물은 RNA 폴리머라제 프로모터 및 진핵생물 번역을 개시하는 서열을 함유하는 프라이머와의 네스팅(nesting)된 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된다. 관심의 영역의 증폭 후, 프라이머내로 통합된 독특한 모티프는 PCR 생성물의 순차적인 시험관내 전사 및 번역을 가능하게 해준다. 번역 생성물의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시에, 트렁케이팅된 폴리펩티드의 출현은 번역의 조기 종결을 야기시키는 돌연변이의 존재를 나타낸다. 이 기술의 변형예에 있어서, 관심의 표적 영역이 단일 엑손으로부터 유래되는 경우 DNA (RNA와 반대로)가 PCR 주형으로서 사용된다.
임의의 세포 타입 또는 조직이 본원에 기술된 진단학에 사용되는 핵산 샘플을 수득하기 위해 이용될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, DNA 샘플은 체액, 예를 들어 공지된 기술(예를 들어, 정맥천자)에 의해 수득되는 혈액 또는 타액으로부터 수득된다. 대안적으로, 핵산 시험이 건조 샘플(예를 들어, 모발 또는 피부)로 수행될 수 있다.
진단 방법은 핵산 정제가 필요없도록 생검 또는 절제로부터 수득한 환자 조직의 조직 섹션(고정화된 및/또는 동결된)으로 직접 원위치에서 또한 수행될 수 있다. 핵산 시약은 이러한 원위치 방법에 대한 프로브 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다 (참조: Nuovo, G.J., 1992, PCRin situhybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).
하나의 핵산 서열의 검출에 주로 초점을 맞춘 방법 이외에, 프로파일이 이러한 검출 계획에서 또한 평가될 수 있다. 핑거프린트(fingerprint) 프로파일이 예를 들어 차별 디스플레이 방법, 노던 분석 및/또는 RT-PCR에 의해 생성될 수 있다.
바람직한 검출 방법은 녹내장을 나타내는 Wnt 시그널링 성분의 하나 이상의 대립형질의 영역을 오버랩하고 돌연변이 또는 다형성 영역 주위에 약 5개, 10개, 20개, 25개 또는 30개 누클레오티드를 지닌 프로브를 사용하는 대립형질 특이적 하이브리드화 방법이다. 본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 녹내장에 관여하는 그 밖의 대립형질 변이체에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 다수의 프로브가 고체상 지지체, 예를 들어 "칩" (약 250,000개 이하의 올리고누클레오티드를 보유할 수 있음)에 부착된다. 올리고누클레오티드는 리토그래피(lithography)를 포함하는 다수의 방법에 의해 고체상에 결합될 수 있다. "DNA 프로브 어레이"로도 일컬어지는 올리고누클레오티드를 포함하는 이들 칩을 사용하는 돌연변이 검출 분석은 예를 들어 크로닌(Cronin) 등의 문헌[(1996) Human Mutation 7:244]에 기술되어 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 칩은 유전자의 하나 이상의 다형성 여역의 모든 대립형질 변이체를 포함한다. 그 후, 고체상 지지체는 시험 핵산과 접촉하고, 특정 프로브에 대한 하이브리드화가 검출된다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 다수의 대립형질 변이체의 동일성은 간단한 하이브리드화 실험으로 확인될 수 있다.
이들 기술은 분석 전에 핵산을 증폭시키는 단계를 또한 포함할 수 있다. 증폭 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 특정 대립형질의 폴리머라제 연쇄 반응(ASA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 네스팅된 폴리머라제 연쇄 반응, 자체 지속성 서열 복제(Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), 및 Q-베타 리플리카제 (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197)를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
증폭 생성물은 크기 분석, 제한 분해 후 크기 분석, 반응 생성물에서 특정한 태깅(tagging)된 올리고누클레오티드 프라이머의 검출, 대립형질 특이적 올리고누클레오티드(ASO) 하이브리드화, 대립형질 특이적 5' 엑소누클레아제 검출, 시퀀싱,하이브리드화 등을 포함하는 다양한 방법으로 검정될 수 있다.
PCR 기재 검출 수단은 다수의 마커를 동시에 복합 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, PCR 프라이머를 선택하여 크기가 오버랩되지 않고 동시에 분석될 수 있는 PCR 생성물을 생성시키는 것은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 차별적으로 표지화되어 각각 차별적으로 검출될 수 있는 프라이머를 사용하여 다양한 마커를 증폭시킬 수 있다. 물론, 하이브리드화 기재 검출 수단은 샘플내의 다수의 PCR 생성물의 차별적 검출을 가능하게 해준다. 다수의 마커의 복합 분석을 가능하게 해주는 그 밖의 기술이 당 분야에 공지되어 있다.
한 가지 단지 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 (i) 환자로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, (ii) 샘플의 세포로부터 핵산(예를 들어, 지놈, mRNA 또는 둘 모두)을 단리하는 단계, (iii) 대립형질의 하이브리드화 및 증폭이 일어나게 하는 조건하에서 녹내장을 나타내는 Wnt 시그널링 성분의 하나 이상의 대립형질의 5' 및 3'에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 핵산 샘플을 접촉시키는 단계, 및 (iv) 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 검출 계획은 이러한 분자가 매우 작은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 있어서 특히 유용하다.
본 발명의 검정의 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 녹내장을 나타내는 Wnt 시그널링 성분의 비정상적 레벨 또는 활성은 제한 효소 절단 패턴의 변화에 의해 확인된다. 예를 들어, 샘플 및 대조 DNA가 단리되고, 증폭되고(임의로), 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 분해되고, 단편 길이 크기가 겔 전기영동에 의해 측정된다.
또 다른 구체예에 있어서, 당 분야에 공지된 다수의 시퀀싱 반응 중의 어느 하나를 사용하여 대립형질을 직접 시퀀싱할 수 있다. 전형적인 시퀀싱 반응은 막심(Maxim)과 길버트(Gilbert)((1997) Proc. Natl Acad Sci USA 74:560) 또는 상거(Sanger)(Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463)에 의해 개발된 기술을 기초로 하는 반응을 포함한다. 본 발명의 검정을 수행하는 경우 (참조: Biotechniques (1995) 19:448) 질량 분광법에 의한 시퀀싱(참조: PCT publication WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; and Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159)을 포함하는 다수의 자동 시퀀싱 방법 중 어느 하나가 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 특정 구체예에 있어서 핵산 염기 중 오직 1개, 2개 또는 3개의 존재가 시퀀싱 반응에서 결정될 필요가 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, A-트랙(track) 등(예를 들어, 오직 하나의 핵산이 검출됨)이 수행될 수 있다.
한 가지 또 다른 구체예에 있어서, 절단제(예를 들어, 누클레아제, 히드록실아민 또는 오스뮴 테트라옥사이드 및 피페리딘)로부터의 방어를 사용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 헤테로듀플렉스(heteroduplex)에서 미스매치된 염기을 검출할 수 있다 (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). 일반적으로, 당 분야의 "미스매치 절단(mismatch cleavage)" 기술은 야생형 대립형질을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 샘플과 하이브리드화시킴으로서 형성된 헤테로듀플렉스를 제공함으로써 출발한다. 이중가닥 듀플렉스는 대조 가닥 및 샘플 가닥 사이의 염기쌍미스매치로 인해 존재하는 듀플렉스의 단일가닥 영역을 절단하는 작용제로 처리된다. 예를 들어, RNA/DNA 듀플렉스는 RNase로 처리되고 DNA/DNA 하이브리드는 S1 누클레아제로 처리되어, 미스매치된 영역을 효소적으로 분해시킬 수 있다. 다른 구체예에 있어서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스는 히드록실아민 또는 오스뮴 테트라옥사이드 및 피페리디으로 처리되어 미스매치된 영역을 분해시킬 수 있다. 미스매치된 영역의 분해 후, 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아미드겔상에서 크기에 의해 분리하여 돌연변이의 부위를 결정한다 (참조: Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; and Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286-295). 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 대조 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 미스매치된 절단 반응은 이중가닥 DNA내의 미스매치된 염기쌍을 인식하는 1종 이상의 단백질(소위 "DNA 미스매치 복구" 효소)을 사용한다. 예를 들어, E.coli의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하며, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다 (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). 한 가지 전형적인 구체예에 따르면, 적합한 프로브가 시험 세포(들)로부터의 cDNA 또는 그 밖의 DNA에 하이브리드화된다. 듀플렉스는 DNA 미스매치 복구 효소로 처리되고, 절단 생성물 (있는 경우)이 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,459,039호).
그 밖의 구체예에 있어서, 전기영동 이동도의 변화를 사용하여 녹내장을 나타내는 Wnt 시그널링 성분의 비정상적 레벨 또는 활성을 확인한다. 예를 들어, 단일가닥 형태 다형성(SSCP)을 사용하여 돌연변이 및 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동도의 차이를 검출할 수 있다 (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, 참조: Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 샘플 및 대조 대립형질의 단일가닥 DNA 단편은 변성되고 재생된다. 단일가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다르며, 전기영동 이동도의 결과적인 변화는 심지어 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 해준다. DNA 단편은 표지되거나 표지된 프로브로 검출될 수 잇다. 검정의 감도는 2차 구조가 서열의 변화에 보다 민감한 RNA (DNA 보다는)를 사용함으로써 향상될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 전기영동 이동도의 변화를 기초로 하여 이중가닥 헤테로듀플렉스 분자를 분리하기 위해 헤테로듀플렉스 분석을 이용한다 (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
또 다른 구체예에 있어서, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드겔에서의 대립형질의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)를 사용하여 검정된다 (Myers et al. (1985) Nature 313:495). DGGE가 분석 방법으로서 사용되는 경우, DNA는 예를 들어 PCR에 의한 고용융(high-melting) GC 풍부 DNA의 약 40bp의 GC 클램프(clamp)를 첨가시킴으로써 변형되어 완전 변성이 일어나지 않음을 보장한다. 한 가지 또 다른 구체예에 있어서, 온도 구배를 변성제 구배 대신 사용하여 대조 및 샘플 DNA의 이동도의 차이를 확인한다 (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
대립형질을 검출하기 위한 그 밖의 기술의 예로는 선택적 올리고누클레오티드 하이브리드화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 신장이 있지만 이들에 제한되지 않는다. 예를 들어, 공지된 돌연변이 또는 누클레오티드 차이 (예를 들어, 대립형질 변이체 중의)가 중심에 위치해 있고, 그 후 완벽한 매치가 발견되는 경우에만 하이브리드화를 일으키는 조건하에서 표적 DNA에 하이브리드화되는 올리고누클레오티드 프라이머가 제조될 수 있다 (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230). 이러한 대립형질 특이적 올리고누클레오티드 하이브리드화 기술을 사용하여, 올리고누클레오티드가 PCR 증폭된 표적 DNA에 하이브리드화되는 경우에는 반응 당 하나의 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험하거나 다수의 상이한 돌연변이 또는 올리고누클레오티드가 하이브리드화막에 부착되고 표지된 표적 DNA와 하이브리드화하는 경우에는 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험할 수 있다.
대안적으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립형질 특이적 증폭 기술이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 특이적 증폭을 위한 프라이머로서 사용되는 올리고누클레오티드는 분자의 중심에 (증폭이 차별 하이브리드화에 의존하도록) (Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) 또는 적합한 조건하에서 미스매치가 폴리머라제 신장을 억제하거나 감소시킬 수 있는 하나의 프라이머의 최종 3' 말단에 (Prossner (1993) Tibtech 11:238) 관심의 돌연변이 또는 다형성 영역을 함유할 수 있다. 또한, 돌연변이의 영역에 신규한 제한 부위를 도입하여 절단 기초 검출을 발생시키는 것이 바람직할 수 있다 (Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1). 특정 구체예에 있어서 증폭이 증폭용의 Taq 리가제를 사용하여 또한수행될 수 있는 것으로 예상된다 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). 이러한 경우, 리게이션은 5' 서열의 3' 말단에 완벽한 미스매치가 존재하는 경우에만 일어날 것이며, 이는 증폭의 존재 또는 부재를 조사함으로써 특정 부위에서의 공지된 돌연변이의 존재를 검출할 수 있게 해준다.
또 다른 구체예에 있어서, 대립형질 변이체의 확인은 예를 들어 미국 특허 제 4,998,617호 및 란데그렌, 유.(Landegren, U.) 등의 문헌((1988) Science 241:1077-1080))에 기재된 바와 같이 올리고누클레오티드 리게이션 검정(OLA)을 사용하여 수행된다. OLA 프로토콜은 표적의 단일가닥의 인접 서열에 하이브리드화할 수 있도록 설계된 두 개의 올리고누클레오티드를 사용한다. 올리고누클레오티드 중의 하나는 분리 마커에 결합, 예를 들어 비오티닐화되며, 나머지 하나는 검출가능하게 표지된다. 정확한 상보서열이 표적 분자에서 발견되는 경우, 올리고누클레오티드는 이들의 단부가 인접하여 리게이션 기질을 생성시키도록 하이브리드화할 것이다. 그 후, 리게이션은 표지된 올리고누클레오티드가 아비딘 또는 또 다른 비오틴 리간드를 사용하여 회수될 수 있게 해준다. 니커슨, 디.에이.(Nickerson, D.A.) 등은 PCR 및 OLA의 속성을 결합시킨 핵산 검출 검정을 기술하였다 (Nickerson, D.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27). 이 방법에 있어서, PCR을 사용하여 표적 DNA의 지수적 증폭을 달성하며, 이는 이후 OLA에 의해 검출된다.
이러한 OLA 방법을 기초로 하는 다수의 방법이 개발되었고, 이를 사용하여 녹내장을 나타내는 Wnt 시그널링 성분의 비정상적 레벨 또는 활성을 검출할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,593,826호에는 포스포라미데이트 결합을 지닌 컨쥬게이트를 형성하도록 3'-아미노기 및 5'-인산화된 올리고누클레오티드를 지닌 올리고누클레오티드를 사용하는 OLA가 기재되어 있다. 토베(Tobe) 등의 문헌((1996) Nucleic Acids Res 24:3728)에 기술된 OLA의 또 다른 변형예에 있어서, PCR과 결합된 OLA는 하나의 마이크로리터 웰에서의 두 개의 대립형질의 타이핑(typing)을 가능하게 해준다. 각각의 대립형질 특이적 프라이머를 독특한 합텐, 즉, 디곡시제닌 및 플루오레세인으로 마킹함으로써, 각각의 OLA 반응은 상이한 효소 수용체, 알칼리 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 합텐 특이적 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 이러한 시스템은 두 개의 상이한 색을 생성시키는 고처리량 포맷을 사용하여 두 개의 대립형질의 검출을 가능하게 해준다.
본 발명의 또 다른 구체예는 녹내장을 발달시키는 소인을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 하나 이상의 Wnt 시그널링 성분의 5' 및 3'에 하이브리드화하는 5' 및 3' 올리고누클레오티드를 포함하는 하나 이상의 올리고누클레오티를 함유할 수 있다. PCR 증폭 올리고누클레오티드는 후속 분석을 위한 편리한 크기의 PCR 생성물을 생성시키기 위해 25개 내지 2500개 염기쌍, 바람직하게는 약 100개 내지 약 500개 염기쌍 만큼 떨어진 사이에서 하이브리드화해야 한다.
키트에 사용되는 경우, 올리고누클레오티드는 합성 올리고누클레오티드, 제한 단편, cDNA, 합성 펩티드 핵산(PNA) 등과 같은 다양한 천연 및/또는 합성 조성물 중 어느 하나일 수 있다. 검정 키트 및 방법은 검정에서 확인이 용이해지도록 표지된 올리고누클레오티드를 또한 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로는 방사성표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 마그네틱 잔기, 금속 결합 잔기, 항원 또는 항체 잔기 등이 있다.
키트는 임의로 DNA 샘플링 수단도 포함할 수 있다. DNA 샘플링 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 필터 페이퍼 등과 같은 기질; 누클레온(Nucleon™) 키트, 용해 완충액, 프로테이나제 용액 등과 같은 DNA 정제 시약; 10X 반응 완충액, 열안정성 폴리머라제, dNTP 등과 같은 PCR 시약; 및 제한 효소, 대립형질 특이적 올리고누클레오티드, 건조 혈액으로부터의 네스팅된 PCR용의 축중 올리고누클레오티드 프라이머와 같은 대립형질 검출 수단을 포함할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.
4.4.녹내장 치료제를 위한 스크리닝 검정
본 발명은 녹내장 치료제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 또한 제공한다. 녹내장 치료제는 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱, 소분자, 및 핵산을 포함하는 임의의 타입의 화합물일 수 있다. 핵산은 예를 들어 유전자, 안티센스 핵산, 리보자임 또는 트리플렉스 핵산일 수 있다. 본 발명의 녹내장 치료제는 Wnt 시그널링 성분 활성의 아고니스트 또는 FRP 또는 Wnt 시그널링 길항 활성의 안타고니스트일 수 있다. 바람직한 아고니스트는 Wnt 시그널링 성분 또는 발현이 Wnt 시그널링에 의해 조절되는 유전자 및 단백질을 포함한다.
본 발명은 FRP 단백질에 결합하여 Wnt 시그널링의 블록킹을 간섭할 수 있는 녹내장 치료제 또는 Wnt 시그널링 성분과 결합하여 Wnt 시그널링 성분 활성을 작용화할 수 있는 치료제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 또한 제공한다.
본 발명의 화합물은 요망되는 화합물의 타입 및 활성에 의존하는 다양한 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 녹내장 치료제를 확인하기 위해 사용될 수 있는 몇몇 검정을 하기 나타내었다. 잔기둥 그물 유전자의 Wnt 시그널링 기재 활성화를 기초로 하여 녹내장 치료제를 확인하기 위한 추가의 검정을 설계하는 것은 당업자에 지식범위에 속한다.
4.4.1세포 비함유 검정
세포 비함유 검정을 사용하여 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 이의 결합 파트너와 상호작용할 수 있는 화합물을 확인할 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 결합 파트너의 구조를 변형시켜, 이의 활성을 변화시킬 수 있다. 세포 비함유 검정을 사용하여 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 및 결합 파트너 사이의 상호작용을 모듈레이팅하는 화합물을 또한 확인할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 이러한 화합물을 확인하기 위한 세포 비함유 검정은 본질적으로 결합 파트너의 존재 또는 부재하에서 FRP 또는 Wnt 시그널링 화합물 및 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리를 함유하는 반응 혼합물에 있다. 시험 화합물은 예를 들어 결합 파트너의 유도체, 예를 들어 생물학적 비활성 표적 펩티드 또는 소분자일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 가지 전형적인 스크리닝 검정은 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 이의 작용성 단편 또는 결합 파트너를 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리와 접촉시키는 단계 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출을 위해, 분자는 특정한 마커로 표지될 수 있고, 시험 화합물 또는 시험 화합물의라이브러리는 상이한 마커로 표지될 수 있다. 그 후, 시험 화합물과 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 이의 단편 또는 결합 파트너와의 상호작용은 인큐베이션 단계 및 세척 단계 후 두 표지의 레벨을 측정함으로써 검출될 수 있다. 세척 단계 후 두 표지의 존재는 상호작용을 나타낸다.
분자들 사이의 상호작용은 광학 현상인 표면 플라스몬 공명(SPR)을 검출하는 실시간 BIA(Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB)를 사용함으로써 또한 확인될 수 있다. 검출은 생체특이적 계면에서 거대분자의 질량농도의 변화에 좌우되며, 상호작용물질의 임의의 표지화를 필요로 하지 않는다. 한 가지 구체예에 있어서, 시험 화합물의 라이브러리는 센서 표면상에 고정화될 수 있으며, 예를 들어 이는 마이크로-플로우셀(micro-flow cell)의 한쪽 벽을 형성한다. 그 후, FRP, Wnt 시그널링 성분, 이의 작용성 단편 또는 결합 파트너를 함유하는 용액은 센서 표면 위로 연속적으로 유동한다. 시그널 기록에 나타나는 공명각의 변화는 상호작용이 일어났음을 나타내준다. 이러한 기술은 예를 들어 파마시아(Pharmacia)의 바이아테크놀로지 핸드북(BIAtechnology Handbook)에 추가로 기재되어 있다.
본 발며의 또 다른 전형적인 스크리닝 검정은 (a) FRP 또는 Wnt 시그널링 성분(i), 이의 결합 파트너(ii) 및 시험 화합물(iii)을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 (b) FRP 또는 Wnt 시그널링 화합물 및 결합 단백질의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 및 결합 파트너는 재조합적으로 생성될 수 있거나, 혈장과 같은 공급원으로부터 정제되거나, 본원에 기술된바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 시험 화합물의 부재하에서의 상호작용과 비교하여 시험 화합물의 존재하에서의 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 및 결합 단백질의 상호작용의 통계적으로 유의할 만한 변화 (증강 또는 억제)는 시험 화합물이 FRP 또는 Wnt 시그널링 생활성의 잠재적 아고니스트(미메틱 또는 증강제) 또는 안타고니스트(억제제)임을 나타낸다. 대안적으로, FRP 또는 Wnt 시그널링 성분은 적당한 시간 동안 시험 화합물과 먼저 접촉할 수 있으며, 그 후, 결합 파트너가 반응 혼합물에 첨가된다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 수득한 데이터로부터 용량 반응 곡선을 생성시킴으로서 평가될 수 있다. 더욱이, 대조 검정을 또한 수행하여 비교를 위한 기선을 또한 제공할 수 있다. 대조 검정에 있어서, 단리된 및 정제된 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분이 FRP 결합 파트너 또는 Wnt 시그널링 성분 결합 파트너를 함유하는 조성물에 첨가되고, 복합체의 형성이 시험 화합물의 부재하에서 정량된다.
FRP 단백질과 FRP 결합 파트너 사이의 복합체 형성은 다수의 기술에 의해 검출될 수 있다. 복합체의 형성의 모듈레이션은, 예를 들어 방사성표지되거나, 형광 표지되거나, 효소 표지된 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 결합 파트너와 같은 검출가능하게 표지된 단백질을 사용하여, 면역검정에 의해, 또는 크로마토그래피 검출에 의해 정량될 수 있다.
전형적으로, FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 이의 결합 파트너를 고정화시켜 단백질 중 하나 또는 둘 모두의 복합체화되지 않은 형태와 복합체의 분리를 촉진시킬 뿐만 아니라 검정의 자동화에 적응시키는 것이 바람직하다. FRP 또는 Wnt 시그널링 성분이 결합 파트너에 결합하는 것은 반응물을 수용하는 데에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 예로는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세원심분리관이 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 단백질이 매트릭스에 결합될 수 있게 하는 도메인을 첨가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트래스퍼라제 융합 단백질이 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 유도체화된 미세역가 플레이트상으로 흡착될 수 있으며, 이는 그 후 결합 파트너, 예를 들어 35S-표지된 결합 파트너 및 시험 화합물과 합쳐지고, 혼합물은 복합체 형성을 유도하는 조건, 예를 들어 염 및 pH에 대한 생리적 조건에서 인큐베이션되지만, 약간 더 엄격한 조건이 바람직할 수 있다. 인큐베이션 후, 비드를 세척하여 임의의 결합되지 않은 표지를 분리시키고, 매트릭스를 고정화시키고, 직접 방사성표지 측정하거나(예를 들어, 신틸런트(scintilant) 중에 위치한 비드), 상층액의 경우, 복합체를 후속하여 해리시킨 후 측정한다. 대안적으로, 복ㅎ바체는 매트릭스로부터 해리되고, SDS-PAGE에 의해 분리되고, 비드 분획에서 발견되는 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 또는 결합 파트너의 레벨이 첨부된 실시에에 기술된 표준 전기영동 기술을 사용하여 겔로부터 정량될 수 있다.
본 발명의 검정에 사용되는 단백질을 매트릭스에 고정화시키는 그 밖의 기술이 이용가능하다. 예를 들어, FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 이의 동족(cognate) 결합 파트너가 비오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 이용하여 고정화될 수 있다. 예를 들어, 비오티닐화된 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분은 당 분야에 널리 공지된 기술(예를 들어, 비오티닐화 키트(Pierce Chemicals, Rockford, IL))을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조될 수 있고, 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트(Pierce Chemical)의 웰에 고정화될 수 있다. 대안적으로, FRP 또는 Wnt 시그널링 성분과 반응하는 항체는 플레이트의 웰에 유도체화될 수 있고, FRP 또는 Wnt 시그널링 성분은 항체 컨쥬게이션에 의해 웰에 포획될 수 있다. 상기와 같이, FRP 또는 Wnt 시그널링 성분, 결합 단백질 및 시험 화합물의 프리퍼레이션이 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분을 제공하는 플레이트의 웰에서 인큐베이션되고, 웰에 포획된 복합체의 양이 정량될 수 있다. GST 고정화된 복합체와 관련하여 상기 기술된 방법 이외에 이러한 복합체를 검출하기 위한 전형적인 방법은 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 결합 파트너와 반응성인 항체 또는 FRP 또는 Wnt 시그널링 성분 단백질과 반응성이고 결합 파트너와 경쟁하는 항체를 사용하는 복합체의 면역검출 뿐만 아니라 고유 활성 또는 외인성 활성인 결합 파트너와 관련된 효소 활성을 검출하는 것에 의존하는 효소 결합 검정을 포함한다. 후자의 경우, 효소는 화학적으로 컨쥬게이션되거나 결합 파트너와의 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 예시를 위해, 결합 파트너는 양고추냉이 퍼옥시다제와 화학적으로 가교되거나 이와 유전학적으로 융합될 수 있고, 복합체에 포획된 폴리펩티드의 양은 3,3'-디아미노-벤자딘 테트라히드로클로라이드 또는 4-클로로-1-나프톨과 같은 색소생산성 효소 기질을 사용하여 평가될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 포함하는 융합 단백질이 제공될 수 있고, 1-클로로-2,4-디니트로벤젠을 사용하여 GST 활성을 검출하여 복합체 형성을 정량화 할 수 있다(참고문헌: Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130].
복합체내에 포획된 하나 이상의 단백질을 정량화하기 위하여 면역검출(immunodetection)에 의존하는 과정에 대하여, 단백질에 대한 항체가 사용될 수 있다. 대안적으로, 복합체내에서 검출되는 단백질은, FRP 또는 Wnt 시그널 성분 서열에 더하여, 항체가 즉시 가용한 (예를 들어, 상업적 공급원으로부터) 제 2폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 형태로 "에피토프 표지된" 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 GST 융합 단백질은 GST 부분에 대한 항체를 사용하여 결합을 정량화 하는데 사용될 수도 있다. 다른 유용한 에피토프 표지는 c-myc로부터 10개-잔기 서열을 포함하는 myc-에피토프[참고문헌: Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266:21150-21157] 뿐만 아니라 pFLAG 시스템을 포함한다.
또한, 세포 비함유 검정은 FRP 또는 Wnt 시그널 성분과 상호작용하고 그들의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, FRP 또는 Wnt 시그널 성분은 시험용 화합물과 접촉되고, FRP 또는 Wnt 시그널 성분의 촉매 활성이 관찰된다. 일 구체예에서, 표적 펩티드에 결합하는 FRP 또는 Wnt 시그널 성분의 능력은 당업계에 공지된 방법에 따라 결정된다.
4.4.2.세포 기재 검정
상기와 같은 세포 비함유 검정에 더하여, 예를 들어 작은 분자의 아고니스트 또는 안타고니스트를 위하여 세포 기재 검정의 생성을 용이하게 한다. 일 구체예에서, 세포막 외표면상의 세포 발현 FRP 단백질은 시험용 화합물 단독, 또는 시험용 화합물 및 FRP와 상호작용하는 것으로 알려진 분자의 존재하에 배양되고, FRP와 시험용 화합물 사이의 상호작용이 예를 들어마이크로피지오미터(microphysiometer)를 사용하여 관찰되었다[참고문헌: McConnell et at. (1992) Science 257:1906]. FRP 단백질과 시험용 화합물 사이의 상호작용은 매질 내의 산성화의 변화로서 마이크로피지오미터로 검출된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포에 기초한 검정은 정상 또는 녹내장-감염된 환자의 잔기둥 그물 안구 조직으로부터 획득된 인간 세포를 이용한다.
배양기내에서의 인간 잔기둥 세포의 증식은 재생가능한 시험 조건하에서 이러한 세포형의 분명한 구조적 및 기능적 특징을 연구할 수 있게 한다. 인간 잔기둥 세포는 잔기둥 조직의 절단된 체외배양편으로부터 효과적으로 성장될 수 있고, 배양된 세포는 시험관내 많은 통과에 걸쳐 비배양된 잔기둥 세포의 분명한 초구조적 특징을 유지할 수 있다. 잔기둥 세포는 수성 유출통로의 유지를 위하여 중요한 폭 넓은 생화학적 및 구조적 특성을 갖는다. 이들 특징은 비혈전생성(nonthrombogenic) 세포 표면을 가진 내피 단일층으로서의 잔기둥 세포의 성장, 플라스미노겐 활성인자의 생성, 왕성한 식균작용, 및 글리코사미노글리캔, 콜라겐, 피브로넥틴 및 기타 연결 조직 성분을 합성하는 능력을 포함한다. 히알루로니다아제 및 기타 리소좀 효소의 존재는 인간 잔기둥 세포가 히알루론산 및 기타 외세포 물질을 대사할 수 있다는 것을 강조한다. 시험관내 잔기둥 세포 손상의 잠재적 메카니즘은 예를 들어 세포 형태에 대한 지속적 통과(extended passage), 과산화물 노출, 및 레이저 처리의 효과를 평가하여 관찰될 수 있다.
또한, 잔기둥 그물 세포 또는 기타 세포형에 기초한 세포 기초한 검정은 FRP 유전자의 발현을 조절하고, FRP mRNA의 번역을 조절하거나, FRP mRNA 또는 단백질의 안정성을 조절하는 화합물을 식별하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, FRP를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어 잔기둥 그물 세포가 시험용 화합물과 함께 배양되고, 세포 매질내에서 생산된 FRP의 양이 측정되고, 시험용 화합물과 접촉되지 않은 세포로부터 생산된 것에 비교된다. FRP와 비교된 화합물의 특이성은 다양한 조절 분석 예를 들어 하나 이상의 조절 유전자의 발현을 측정하여 확인될 수 있다.
시험될 화합물은 작은 분자, 단백질 및 핵산을 포함한다. 특히, 이 검정은 FRP 안티센스(antisense) 분자 또는 리보자임의 효용을 결정하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, FRP 유전자의 전자에 대한 시험용 화합물의 효과는 FRP 유전자의 프로모터의 적어도 일부에 동작적으로 결합된 리포터 유전자를 사용하는 핵산감염 심험에 의해 결정된다. 유전자의 프로모터 영역은 당업계에 공지된 방법에 따라 예를 들어 염색체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 리포터 유전자는 즉시 정량화 할 수 있는 단백질을 인코딩 하는 임의의 유전자, 예를 들어 당업계에 공지된 루시페라제 또는 CAT 유전자일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 리포터 유전자는 Wnt 시그널에 응답하여 전사적으로 활성화되는 천연 또는 합성 유전자이다. 예를 들어, 인그레일드(engrailed) 유전자가 Wnt 시그널에 응답하여 활성화된다. 게다가, 상기 유전자의 증가된 발현은 헤지호그(hedgehog) 유전자의 전사적 유도를 초래하고, 이것은 그것대신에 이제 Wnt 시그널에 응답하여 활성화된다. 결국, 핵의 LEF(tcf)/베타-카테닌에 의해 활성화 된 합성 리포터 유전자는 또한 Wnt 유도를 측정하기 위한 민감한 리포터 유전자를 제공한다.
추가로, 본 발명은 상기 선발 검정에 의해 확인된 신규한 시약 및 그것의 상기 처치로의 용도에 관한 것이다.
4.5질병 처치의 방법
"녹내장 치료제"는, 안타고니스트 또는 아고니스트가 될 수 있으며, 적당한 경우에, 본원에 제공된 약물 검정에 의해 확인된 분리된 폴리펩티드, 유전자 치료 구성, 안티센스 분자, 펩티드유사물(peptidomimetics), 작은 분자, 비-핵산, 비-펩티드 또는 시약을 포함하는 임의의 전술한 제제가 될 수 있다.
본 발명은 비정상적 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 발현 또는 활성과 관련된 장애, 예를 들어 녹내장을 갖거나 발병시킬 환자를 처치하는 예방적 및 치료적 방법을 제공한다.
4.5.1.예방적 방법
하나의 관점으로, 본 발명은 환자에게 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 발현 또는 하나 이상의 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 활성을 조절하는 시약을 투여하여, 환자내에서 비정상적 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 상태를 방지하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 질병의 위험을 가진 환자는 예를 들어 전술한 진단 및 예후 검정에 의해 확인될 수 있다. 예방적 시약의 투여는 비정상 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자에 특징적인 증상의 출현전에 이루어짐으로써, 질병 또는 장애가 방지되거나 대안적으로 진행이 지연된다. FRP 또는Wnt 경로 성분 유전자의 비정상 유형에 따라, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 아고니스트 또는 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 안타고니스트가 환자를 예방적으로 처치하기 위하여 사용될 수 있다. 예방적 방법은 본 발명의 치료적 방법에 유사하고, 아래에서 추가로 논의된다.
4.5.2.치료적 방법
일반적으로, 본 발명은 비정상적인 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 활성에 의해 또는 그에 기인하는 질병 또는 상태를 처리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에게 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 활성을 조절할 수 있는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 비정상적인 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 활성에 관련된 질병 증상을 완화하기 위해 사용되는 접근법 중에는, 예를 들어 전술한 안티센스, 리보자임, 및 3중 나선 분자 또는 작은 유기 시약이 있다. 적당한 화합물의 예로는 본원에 상세하게 설명된 안타고니스트, 아고니스트 또는 호몰로그(homologue)가 있다.
4.5.3.유효 투여량
그러한 화합물의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물내에서 예를 들어 LD50(집단의 50%가 치사하는 투여량) 및 ED50(집단의 50%에 치료가 유효한 투여량)을 결정하는 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여량 비율은 치료적 지표가 되고, 그것은 비율 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료적 결과를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는화합물이 사용되는 경우에, 비감염된 세포에 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위하여 그러한 화합물을 감염된 조직의 위치로 표적이동시키는 전달 시스템을 설계하는데 주의하여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이타는 인간에게 사용되기 위한 투여량의 범위를 정형화 하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 농도 ×(적거나 전혀 독성이 없는) ED50을 포함하는 순환 농도의 범위에 존재한다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이러한 범위내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 치료적으로 유효한 투여량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 평가될 수 있다. 투여량은, 세포 배양에서 결정된 바와 같은 농도×IC50(즉, 증상의 중간-최대 억제를 달성하는 시험용 화합물의 농도)를 포함하는 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도를 달성하기 위하여 동물 모델내에서 정형화 될 수 있다. 그러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
4.5.4.임상 시험 동안 FRP/Wnt 치료제 효과의 모니터링
FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 또는 질환 유전 프로필에 기초하여, 최고의 임상적 이익을 나타낼 것으로 예상되는 집단을 타겟팅하는 능력은 1) 실망스러운 시판 결과를 갖는 시판 약물의 재배치; 2) 환자 아군에 특이적인 안전성 또는 효능의 한계로 인해 임상 개발이 중단된 약물 후보물질의 구제; 및 3) 가속화되고 비용이 덜 드는 약물 후보물질 개발 및 보다 최적의 약물 라벨링(예를 들어, 마커로서 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자의 사용은 유효량을 최적화하는데 유용하기 때문임)을 가능케 할 수 있다.
FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료에 의한 개체의 치료는 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 특성, 예를 들어 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질 수준 또는 활성, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 mRNA 수준, 및/또는 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 전사 수준을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이러한 측정은 치료가 유효한지 또는 조정되어야 하거나 최적화되어야 하는지를 나타낼 것이다. 따라서, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자는 임상 시험 동안 약물의 효능에 대한 마커로서 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제(예를 들어, 작용제, 길항제, 펩티도미메틱, 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 또는 본원에서 기술된 스크리닝 검정에 의해 확인되는 기타 약물 후보물질)를 사용한 피험자 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서, (i) 약제 투여전에 피험자로부터 투여전 샘플을 입수하는 단계; (ii) 투여전 샘플에서 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 발현 수준을 검출하는 단계; (iii) 피험자로부터 하나 이상의 투여후 샘플을 입수하는 단계; (iv) 투여후 샘플에서 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 단계; (v) 투여전 샘플의 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 투여후 샘플의 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및 (vi) 이에 따라 피험자에게 약제의 투여를 변화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 약제의 증가된 투여는 검출되는 수준 보다 높은 수준으로 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키는데, 즉 약제의 유효성을 증가시키는데 바람직할 수 있다. 대안적으로, 약제의 감소된 투여는 검출되는 수준 보다 낮은 수준으로 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는데, 즉 약제의 유효성을 감소시키는데 바람직할 수 있다.
또한 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제가 유해할 수 있는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키지 않는다는 것을 입증하기 위하여, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 이외의 유전자의 발현 수준을 검출하기 위해 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제의 투여 전 및 후에 피험자의 세포를 입수할 수 있다. 이것은 예를 들어 전사 프로파일링 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 생체내에서 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제에 노출된 세포로부터의 mRNA, 및 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제에 노출되지 않은 세포로부터의 mRNA가 역전사되어 수많은 유전자로부터의 DNA를 함유하는 칩에 히이브리드화될 수 있고, 이로써 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제로 치료된 세포와 치료되지 않은 세포에서 유전자의 발현을 비교할 수 있다. 예를 들어 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제가 개체에서 프로토-온코진의 발현을 자극하는 경우에, 이러한 특정 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제의 사용은 바람직하지 않을 수 있다.
4.5.5.제형 및 용도
본 발명에 따라 사용되는 약제 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 따라서, 화합물 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 용매화물은 예를 들어 주사, 흡입, 또는 통기(입 또는 코를 통해) 또는 구소, 경구, 협측, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
이러한 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 전신 및 국소 또는 국소화된 투여를 포함하는 다양한 투여 부하를 위해 제형화될 수 있다. 기술 및 제형화는 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA]에서 알 수 있다. 주사는 전신 투여의 바람직한 방법이 아니며; 경구 제형이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 국소 안과용 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어 완충제, 보존제(보존 보조제 포함), 삼투성 조절제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 편안함 증가제, 연화제, pH 조절제 및 윤활제와 함께 제형화될 수 있다. 국소적으로 투여가능한 안과용 조성물은 일반적으로 pH 4.5 내지 8로 제형화되며 26 내지 320mOsm/kg의 삼투성을 갖는다. 전신 투여를 위해, 근내, 정맥내, 복강내, 및 피하를 포함하는 주사제가 바람직하다. 주사를 위해, 본 발명의 화합물은 액체 용액, 바람직하게는 생리적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크액(Hank's solution), 또는 링거액(Ringer's solution)으로 제형화될 수 있다. 또한, 화합물은 고체 형태로 제형화되어 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태도 포함된다.
경구 투여를 위해, 약제 조성물은 통상적인 방식으로 약제학적으로 허용되는부형제, 예를 들어 결합제(예를 들어, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예를 들어, 락토오스, 미결정 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)로, 예를 들어 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당분야에 공지된 방법으로 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 사용전에 물 또는 기타 적당한 비히클에 의해 구성하기 위한 건조 생성물로 제공될 수 있다. 이러한 액체 프리퍼레이션은 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 현탁화제(예를 들어 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 에멀션화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예를 들어, 오일, 오일 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물 오일); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)으로 제조될 수 있다. 프리퍼레이션은 또한 필요에 따라 완충염, 향미제, 착색제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
경구 투여용 프리퍼레이션은 활성 화합물의 방출 제어를 제공하기 위해 적당하게 제형화될 수 있다. 협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화되는 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다. 흡입 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 편리하게 적당한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 가스를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로솔 스프레이 제공 형태로 투여될 수 있다. 가압된 에어로솔의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 투여하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 통기기에 사용되는, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 락토오스 또는 전분과 같은 적당한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
화합물은 주사, 예를 들어 단회(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 제형, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰플 또는 다용량 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클중의 현탁액, 용액, 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화 약제, 예를 들어 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용전에 적당한 비히클, 예를 들어 발열성물질이 없는 멸균수와 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
또한 화합물은 예를 들어 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 제약 기제를 함유하는 좌약 또는 유지용 관장액과 같은 직장용 조성물로 제형화될 수 있다.
전술된 제형에 부가하여, 화합물은 또는 디폿(depot) 프리퍼레이션으로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 국소적으로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 화합물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화되거나, 난용성 염과 같은 난용성 유도체로서 제형화될 수 있다. 다른 적합한 전달 시스템은 장기간에 걸쳐 약물의 국소 비관혈적 투여를 가능케 하는 마이크로스피어를 포함한다. 이 기술은 염증이나 허혈을 유발시키지 않고, 예를 들어 심장 또는 기타 기관의 임의의 선택된 부위로 관상 카테테르를 통해 주입될 수 있는 전모세관(precapillary) 크기의 마이크로스피어를 이용한다. 투여된 치료제는 이 마이크로스피어로부터 서서히 방출되어 주위 조직 세포(예를 들어, 내피 세포)에 의해 흡수된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과해야 하는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 또한, 계면활성제가 침투를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이에 의해 또는 좌약을 이용하여 이루어질 수 있다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 올리고머는 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고액, 겔 또는 크림으로 제형화된다. 치유를 가속화하기 위해 상처 또는 염증을 치료하기 위해 세척액이 국소적으로 사용될 수 있다.
임상적 세팅에서, FRP 또는 Wnt 경로 입자 유전자 전달 시스템을 임의의 많은 방법에 의해서 환자에게 도입되고 이들 각각은 당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 유전자 전달 시스템의 약제학적 제조물은, 안내 주사 또는 전신적으로 예를 들어, 정맥내 주사에 의하여 투여되고, 표적 세포의 단백질의 특이적 형질 도입은 수용체 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 서열에 기인한 유전자 전달브히클 (vehicle), 세포-타입 또는 조직-타입 발현, 또는 이들의 조합에 의해 제공되는 트랜스펙션의 특이성으로부터 우세하게 발생한다. 다른 구체예에서, 재조합 유전자의 초기 전달은 다소 국소화된 동물로의 도입으로 보다 더 제한된다. 예를 들어, 유전자 전달 브히클은 도뇨관 (참고 문헌: 미국 특허 제 5,328,471) 또는 정위 주사 (참고 문헌: Chen et al., 1994, PNAS 91: 3054-3057)에 의하여 도입된다. FRP 또는 Wnt 경로 구성성분 유전자는 예를 들어 문헌 (Dev et al., 1994, Cancer Treat Rev 20: 105-115)에 기술된 기술을 사용하는 일렉트로포레이션 또는 트랜스클러럴 (transcleral) 이온 영동법에 의해 유전자(들) 치료 구성물로 전달된다.
본 발명의 유전자 치료 구성물 또는 화합물의 약제학적 제조물은 허용되는 희석액중의 유전자 전달 시스템으로 기본적으로 구성되거나, 유전자 전달 비히클이 침지된 저속 분비 매트릭스를 포함한다. 선택적으로 완전한 유전자 전달 시스템이 재조합 세포 예를 들어 레트로바이러스 벡터로부터 손상되지 않고 생산된 경우에, 약제학적 조성물은 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함한다.
요망되는 경우, 조성물은 활성 구성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태을 함유하는 팩 (pack) 또는 디스펜서 (dispencer) 장치로 제공된다. 팩은 예를 들어 금속 또는 프라스틱 호일 (foil) 예를 들어 발포제 팩을 포함한다. 팩 또는 디스펜서는 투여를 위한 도입을 수반한다.
4.6키트
본 발명은 비정상적 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 단백질과 관련된 질환 또는 상태를 진단 또는 예방 방법 또는 치료 방법에 사용되는 키트를 추가로제공한다. 본 발명은 또한 어떤 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 치료제가 피검체에 투여되어야 하는지를 결정하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 생물학적 시료중의 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 mRNA 또는 단백질의 존재를 검출하거나 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자(들)의 동정 또는 돌연변이의 존재를 결정하기 위한 키트를 포괄한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 시료중에 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 라벨링된 화합물 또는 제제; 시료중의 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자의 양을 결정하는 수단; 및 시료중의 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자의 양을 스탠다드와 비교하는 수단을 포함한다. 화합물 또는 제제는 적절한 용기에 포장된다. 키트는 또한 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 mRNA 또는 단백질을 검출하는 키트를 사용하기 위한 지시를 포함한다.
한 가지 구체예에서, 키트는 고혈압의 치료 또는 예방용 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 길항 물질 치료제의 유효량을 암유하는 약제학적 조성물 및 지시를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 녹내장과 같은 안구 질환 또는 질병의 치료용 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 작용 물질 치료제의 유효량 및 지시를 포함한다. 일반적으로 키트는 녹내장 치료 제제용 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 작용 물질 또는 길항 물질을 포함하는 약제학적 조성물 및 지시를 포함한다. 예를 들어, 키트는 진통제용 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 작용 물질 치료제 및 지시를 포함한다.
다른 키트는 환자가 비정상적 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 활성과관련된 질병 또는 상태를 가졌거나 가질것 같은 지여부를 결정하기 위하여 사용된다. 상기 키트는 예를 들어 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자(들)의 일부 이상에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 하나 이상의 핵산 탐침, 이들의 대립 유전자 변이체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함한다.
4.7 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 단백질 및 핵산의 추가 용도
본 발명의 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 핵산은 또한 하기 분석에서 사용된다. 일 구체예에서, SEQ ID NO: 1 또는 이들의 일부를 가지는 인간 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 핵산, 또는 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자(들) 또는 이들과 하이브리드화하는 핵산은 염색체상의 위치 규명을 결정하기 위하여 사용된다. 예를 들어 연관 분석 (물리적으로 인접한 유전자들의 공동 유전)에 의하여 특이적 질병 또는 상태와 관련된 것으로 나타난 염색체 영역의 위치와 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자(들)의 염색체상 위치의 비교는, FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자가 역활을 하는 질병 또는 상태임을 의미한다. 특이적 질병에 관련된 염색체 영역의 표는 예를 들어 문헌 [V.McKusick, Mendelian Inheritance in Man (존스 홉킨스 대학 병원 웰츠 메디컬 라이브러리를 통해 입수가능함) 및 http://www3.ncbi.nim.nih.gov/Omim/ (online Mendelian Inheritance in Man)]에서 찾을 수 있다. 또한, FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자(들)은 FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자이외의 다른 유전자를 포함하는 유전자 연관 연구의 염색체 마커로서 사용된다.
유전자의 염색체상 위치 규명은 당 기술분야에 널리 공지된 수개의 방법에의해 수행된다. 예를 들어, 서던 블롯 하이브리드화 또는 체세포 하이브리드의 PCR 맵핑은 특이적 유전자가 어떤 염색체 또는 염색체 단편에 위치하는지를 결정하는 데 사용된다. 유전자를 염색체 또는 염색체 영역의 위치에 제한하는 데 유사하게 사용되는 다른 맵핑 방법은 원위치 하이브리드화, 라벨링된 플로우-분류된 염색체로 프리스크리닝 (labeled flow-sorted chromosome) 및 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 제작하는 하이브리드화에 의한 사전 선별을 포함한다.
또한, 중기 염색체에 대한 핵산 예를 들어, FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자 핵산의 원위치 하이브리드화의 형광은 핵산의 정확한 염색체 위치를 제공하는 일단계 방법이다. 상기 기술은 500 또는 600 염기와 같이 짧은 핵산으로 사용된다; 그러나 2,000 bp보다 더 큰 클론은 간단한 검출을 대한 충분한 시그날 강도로 유일한 염색체 위치에 결합하는 높은 가능성을 가진다. 상기 기술은 문헌 (Verma et al, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, 1998)에 기술되어 있다. 상기 기술을 사용하여, 유전자는 약 50 내지 500 유전자를 함유하는 염색체 영역에 위치된다.
FRP 또는 Wnt 경로 구성 성분 유전자가 특이적 질병과 관련된 함께 분리되는 염색체 영역에 위치한 것으로 보이는 경우에, 환자와 정상인간의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이가 결정된다. 환자의 모두 또는 일부의 돌연변이의 존재 및 임의의 정상인에의 부재는 돌연변이가 질병을 유발하고 질병에 기여하는 것으로 보인다.
본 발명은 또한, 임의의 방법으로 제한하지 않는 것으로 해석되는 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 모든 인용된 문헌 (본원에서 인용된 문헌, 특허,공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 참고로 본원에 통합된다. 본 발명의 수행은 당 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 적용하거나 가리킨다. 상기 기술은 문헌에 의하여 완전히 설명된다. 예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Mannual 2nd(Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989): DNA Clonning, Volume I and Ⅱ (D. N. Glover ed, 1985); Oligonucletide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Mullis et al., U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, (1984); the treatise, Methods In Enzymolory (Academic Press, Inc. N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Immunology, Volumes I-Ⅳ (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Mnipulation the Mouse Embryo (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)를 참고할 수 있다.
4.8.약리유전체학
개체(FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자의 유전적 프로파일)의 결손 또는 결함 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 또는 단백질을 초래하는 특정 변형(들)을, 단독으로 또는 동일 질병(특정 질병의 유전적 프로파일)에 기여하는 다른 유전적 결함에 대한 정보와 함께 알게 되면, "약리유전체학"의 목표인 개체의 유전적 프로파일에 대한 특정 질병의 치료를 위한 커스토마이제이션(customization)이 가능하게 된다. 예를 들어, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)의 특정 대립 유전자를 갖는 대상은 특정 질병의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있고, 또는 특정 질병의 증상 발병이 일어나기 쉽거나 그렇지 않을 수 있다. 추가로, 이러한 대상이 증상을 나타내는 경우, 이들 대상은 예를 들어 특정 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제와 같은 특정 약물에 반응하거나 반응하지 않을 수 있지만, 다른 성분에 대해서는 반응할 수 있다. 따라서, 결손 및/또는 결함 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들) 및/또는 단백질에 의해 유발되거나, 이들에 의해 기여되는 질병 또는 상태의 증상을 갖는 대상(FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자의 유전적 프로파일)의 집단으로부터의, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 유전적 프로파일(예를 들어, 특정 질병의 발병과 연관된 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)에서 변경 분류)의 생성 및 개체의 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 프로파일의 집단 프로파일과의 비교는 특정 환자 또는 환자 집단(즉, 동일한 유전적 변경을 갖는 환자의 군)에 안전하고 효과적일 것으로 기대되는 약물의 선택 또는 설계를 가능하게 한다.
예를 들어, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 집단 프로파일은, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 프로파일을 측정하므로써, 예를 들어 결손 또는 결함 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)에 의해 유발되거나 기여된 질병을 갖는 환자 집단에서 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)을 동정하므로써 수행될 수 있다. 임의로, FRP또는 Wnt 경로 성분 유전자 집단 프로파일은 추가로 1) FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 관련 질병과 관련된 증상의 중증도, 2) FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들) 발현 수준, 3) FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 mRNA 수준 및/또는 4)FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질 수준을 모니터링하고, (iii) FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들) 또는 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 경로 유전자에 존재하는 특정 유전적 변경(들)에 기초하여 집단을 나누어거나 분류하는 단계를 포함하는 여러 가지 방법을 사용하여 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 치료제에 대한 집단의 반응과 관련된 정보를 포함할 수 있다. 임의로, 또한 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 유전적 집단 프로파일은 특정 변경에서 환자가 특정 치료제에 대해 반응성인지 또는 비반응성인지를 지시한다. 이후, 이러한 정보 또는 집단 프로파일은 개체의 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 프로파일을 근거로 하여 개체가 특정 약물에 반응해야 하는 것을 예측하는데 유용하다.
바람직한 구체예에서, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 프로파일은 전사 또는 발현 수준 프로파일이고, 단계(i)는 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 단백질의 발현 수준을 단독으로 또는 동일 질병에 기여하는 것으로 공지된 다른 유전자의 발현 수준과 함께 측정하는 것으로 이루어진다. FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자 프로파일은 질병의 여러 단계에서 많은 환자에게서 측정될 수 있다.
약리유전체학 연구는 또한 유전자이식 동물을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)의 특정 대립 유전자 변이체를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전자이식 마우스를 만들 수 있다. 이들 마우스는예를 들어, 야생형 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자를 사람 FRP 또는 Wnt 경로 성분 유전자(들)의 대립 유전자로 대체하므로써 만들어질 수 있다. 이후, 특정 FRP 또는 WnT 경로 유전자 치료제에 대한 이들 마우스들의 반응이 측정될 수 있다.
4.9.유전자이식 동물
본 발명은 추가로 다양한 용도, 예를 들어, 녹내장 치료제를 확인하기 위해 사용될 수 있는 유전자이식 동물을 제공한다. 본 발명의 유전자이식 동물은 부적절하게 높은 수준의 FRP를 초래하는 핵산서열에서의 돌연변이(예를 들어, FRP의 발현을 조절하는 전사 인자를 코드화하는 유전자에서의 돌연변이)를 함유하는 사람이 아닌 동물을 포함한다. 대안으로, 유전자이식 동물은 frizzled(Fz); disheveled(Dsh); 글리코겐 신타제 키나아제 3(GSK3), 단백질 키나아제 C(APC), β-카테닌 및 HMG(high mobility group) 단백질(예를 들어, LEF/TCF(Lymphoid Enhancer Factor/T-Cell Factor))를 포함하는 Wnt 시그널링 성분에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 동물들은 예를 들어 그 발현이 Wnt 시그널링에 의해 조절되는 유전자의 잔기둥 그물 세포에서의 발현을 방해하는 표현형에 대한 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
유전자이식 동물은 또한 FRP 프로모터 또는 이의 단편의 조절하에 리포터 유전자와 같은 이식유전자를 함유하는 동물일 수 있다. 이들 동물은 예를 들어 FRP 유전자 발현을 조절하므로써와 같이 FRP의 생성을 조절하는 약물을 동정하는데 유용하다. FRP 유전자 프로모터는 예를 들어 FRP cDNA 단편을 갖는 게놈 라이브러리를 스크리닝하므로써 분리되고, 당해 공지된 방법에 따라 특징화될 수 있다.
본 발명의 범위내에 있는 또 다른 사람이 아닌 동물은, 내인성 유전자의 발현이 돌연변이되거나 "녹아웃된(knocked out)" Wnt 시그널링 성분을 코드화하는 유전자를 포함한다. 이들 동물은 Wnt 시그널링 성분의 부재가 특정 표현형을 유도할 것인지를 측정하는데 유용할 수 있다. 유전자이식 및 녹아웃 비사람 동물을 얻는 방법은 당해 널리 공지되어 있으며, 본원에 논의된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 녹내장 진단 및 진료 방법을 개발하는데 사용하기 위한 유전자이식 비사람 동물을 제공한다. 예를 들어, 특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자이식 동물은 안조직에서 FRP 유전자 발현 수준의 증가를 초래하는 이종 FRP 발현 유전자를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 안조직은 잔기둥 그물이고, FRP 과발현 세포는 잔기둥 그물 세포이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 잔기둥 그물 세포에서 FRP의 증가된 발현 수준을 갖는 유전자이식 비사람 동물은 증가된 안압(IOP)과 같은 녹내장의 특징적인 하나 이상의 증상을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자이식 동물은 녹내장 치료 화합물의 스크리닝 및 녹내장 진단의 전개를 위한 생체내 검정 시스템을 제공한다.
4.9.1동물 기재 시스템
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 이식유전자를 함유하고, 바람직하게는 (임의적이기는 하지만) 동물의 하나 이상의 세포에서 외인성 FRP 단백질을 발현하는 (이러한 동물의) 세포로 이루어진 유전자이식 동물에 관한 것이다. FRP 이식유전자는 단백질의 야생형을 코드화할 수 있거나, 작용제 및 길항제 둘 모두 뿐만 아니라 안티센스 구성물을 포함하여, 이들의 동족체를 코팅할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이식유전자의 발현 이용되는 세포, 조직 또는 발병 단계의 특정 서브셋, 예를 들어 목적하는 패턴으로 발현을 조절하는 시스 활성 서열로 제한된다. 본 발명에서, FRP 단백질의 이러한 모자이크 발현은 혈통 분석의 여러 형태에 필수적일 수 있고, 추가로 예를 들어 다르게는 정상 배내 조직의 작은 패치에서의 발병을 일괄적으로 변경할 수 있는 FRP 발현의 결핍의 효과를 평가하는 수단을 제공할 수 있다. 이를 위해, 그리고, 조직 특이적 조절 서열 및 상태 조절 서열이 특정 공간적 패턴에서의 이식유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 발현의 일시적 패턴이 예를 들어 조건 재조합 시스템 또는 원핵성 전자 조절 서열에 의해 제공될 수 있다.
이식유전자의 발현을 가능하게 하는 유전 기술은, 당업자들에게 공지되어 있는 생체내 부위 특이적 유전적 조작에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열의 유전자 재조합에 촉매작용을 하는 재조합효소의 조절된 발현을 가능하게 하는 유전 시스템을 입수할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "표적 서열"은 재조합효소에 의해 유전적으로 재조합되는 누클레오티드 서열을 말한다. 표적 서열은 양쪽에 재조합효소 인식 서열이 놓여지고, 일반적으로 재조합효소 활성을 발현하는 세포에서 절단되거나, 반전된다. 재조합효소 촉매화된 재조합 이벤트는, 표적 서열의 재조합이 대상 FRP 단백질 중 하나를 활성화 또는 억제하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 길항적 동족체 또는 안티센스 전사를 코드화하는 것과 같은 재조합 FRP 유전자의 발현을 방해하는 표적 서열의 절단은 이러한 유전자의 발현을 활성시키도록 설계될 수 있다. 이러한 단백질 발현의 방해는 프로모터 성분 또는 내부 정지코돈(internal stop codon)으로부터 FRP 유전자의 공간적 분리와 같은 여러 메카니즘으로부터 초래될 수 있다. 또한, 상기 이식유전자는, 유전자의 코딩 서열의 양쪽에 재조합효소 인식 서열이 놓여지고, 유전자의 코딩 서열이 초기에 프로모터 요소에 대해 3'에서 5' 배향으로 세포로 트랜스펙션되도록 될 수 있다. 이러한 예에서, 표적 서열의 역전은, 코딩 서열의 5' 말단을 프로모터에 의한 전사 활성화를 허용하는 프로모터 요소에 대한 배향으로 위치시키므로써 대상 유전자를 재배향시킬 것이다.
본 발명의 유전자이식 동물은, 이들의 다수 세포에 전부 포함되는데, 이러한 이식유전자는 세포 기능, 세포 성장, 괴사 및/또는 분화의 규제에 관여하는 "숙주 세포"의 표현형을 변경시킨다. 상기한 하나 이상의 이식유전자 구성물을 활용하여 본 발명의 유전자이식 유기체를 제조할 수 있기 때문에, 일반적으로 외인성 유전자 물질이라고 하는 유전자이식 유기체의 생성에 대해서 전반적으로 설명할 것이다. 하기 방법 및 물질을 활용하여 특이적인 이식유전자 서열을 유기체로 도입시키기 위해, 당업자들은 이러한 일반적인 설명을 채택할 수 있다.
예시적인 구체예에서, 박테리오파지 P1의 cre/loxP의 재조합 효소 시스템(참조: Lakso et al.(1992)PNAS89: 6232-6236; Orban et al.(1992)PNAS89: 6861-6865) 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합 효소(recombinase) 시스템(참조: O' Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355; PCT 출원 WO 92/15694)중 어느 하나를 생체내 부위-특이적인 유전자 재조합 시스템을 형성시키는데 사용할 수 있다. Cre 재조합 효소는 loxP 서열 사이에 위치한 개재된 표적 서열의 부위-특이적인 재조합을 촉진시킨다. loxP 서열은, Cre 재조합 효소가 결합되고 Cre 재조합 효소가 매개하는 유전자 재조합시에 필요한 34 염기쌍 누클레오티드 반복 서열이다. loxP 서열의 배향은 Cre 재조합 효소가 존재하는 경우(참조: Abremski et al.(1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514)에 개재되는 표적 서열이 존재하거나 역위되는지의 여부를 결정한다; loxP 서열이 직접 반복 배향되는 경우에는 표적 서열의 절단이 촉진되며, loxP 서열이 역위되어 반복 배향되는 경우에는 표적 서열의 역위가 촉진된다.
따라서, 표적 서열의 유전자 재조합은 Cre 재조합 효소의 발현에 따라 좌우된다. 재조합 효소의 발현은, 예를 들어 조직-특이적인, 진행 단계-특이적인, 외부 첨가제에 의해서 유도가능하거나 억제가능한, 규제에 의해 제어시킬 수 있는 전구체 성분으로 규제할 수 있다. 이러한 규제로 제어하면, 재조합 효소 발현이 전구체 성분에 의해서 매개되는 세포에서만 표적 서열의 유전자 재조합이 이루어질 것이다. 따라서, 재조합 FRP 단백질의 활성화 발현은 재조합 효소의 발현을 제어함으로써 규제될 수 있다.
재조합 FRP 단백질의 발현을 규제하도록 crelloxP 재조합 효소 시스템을 사용하기 위해서는, Cre 재조합 효소 및 재조합시킬 단백질 모두가 인코딩된 이식유전자를 함유하는 유전자이식 동물을 구성할 필요가 있다. "이중"으로 유전자이식 동물을 구성함으로써, Cre 재조합 효소 및 재조합 FRP 유전자 모두를 함유하는 동물을 마련할 수 있다. 이러한 동물을 마련하는 통상의 방법은, 이식유전자, 예를 들어 FRP 유전자 및 재조합 효소의 이식유전자를 각각 함유하는 2개의 유전자이식동물을 짝짓기하는 것이다.
재조합 효소로 매개되는 발현가능한 형태의 FRP 이식유전자를 함유하는 유전자이식 동물을 초기에 구성함으로써 얻어지는 이점은, 길항 물질로 작용하거나 작용 물질로 작용하는 대상 단백질이 유전자이식 동물에서 발현시키자 마자 유독할 수 있다는 가능성으로부터 비롯된다. 이러한 예에서, 대상 이식유전자가 모든 조직 내에서 미발현 상태로 존재하는 시조 개체군(founder population)이 증식되어 유지될 수 있다. 이러한 시조 개체군의 각각은, 예를 들어 하나 이상의 조직 및/또는 목적하는 일시적인 패턴으로 재조합 효소를 발현시키는 동물을 사용하여 교차시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어 길항물질로 작용하는 FRP 이식유전자가 미발현 중인 시조 개체군이 형성되면, 특수 조직 또는 특정 발달 단계에서 FRP로 매개되는 도입이 이루어지지 않아, 예를 들어 치명적인 표현형이 얻어지는 시조로부터의 후손을 연구할 수 있을 것이다.
FRP 이식유전자의 발현을 용이하게 하기 위해 동시에 발현시킬 원핵성 단백질이 필요한 원핵성 전구체 서열을 사용하여, 유사한 조건의 이식유전자를 마련할 수 있다. 예증적인 전구체 및 이에 상응하는 이식-활성화되는 원핵성 단백질이 미국 특허 제 4,833,080호에 기재되어 있다.
또한, 조건적인 이식유전자의 발현은, 유전자 인코딩된 이식-활성화되는 단백질, 예를 들어 재조합 효소 또는 원핵성 단백질이 조직으로 옮겨져서 세포 형태의 특이적인 방법으로 발현되는 유전자 치료와 유사한 방법으로 유도될 수 있다. 이 방법으로, FRP A 이식유전자는 이식-활성화제의 도입으로 전환될 때까지, 성인기로 미발현 상태로 남아있을 수 있었다.
예시적인 구체예에서, 본 발명의 "유전자이식, 인간을 제외한 동물"은 인간을 제외한 동물의 배선(germline)으로 이식유전자를 도입시킴으로써 생성된다. 다양한 발달 단계에서 배 표적 세포를 이식유전자를 도입시키는데 사용할 수 있다. 배 표적 세포의 발달 단계에 따라 조금씩 다른 방법을 사용한다. 일반적인 양호한 건강, 양호한 배 생성률, 배에서 양호한 전핵 시감도(pronuclear visibility) 및 양호한 재생성 적합성에 따라서, 본 발명을 실시하는데 사용한 임의 동물의 특이적인 주(line)를 선택한다. 또한, 반수형은 탁월한 인자가 된다. 예를 들어, 유전자이식 마우스를 생성시키고자 한다면, C57BL/6 또는 FVB 주와 같은 스트레인을 종종 사용하기도 한다[참조: Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). 바람직한 스트레인은 C57BL/6 또는 DBA/1과 같은 H-2b, H-2d, 또는 H-2q 반수형을 갖는 것들이다. 본 발명을 실시하는데 사용된 주(들)는 이들 자신을 유전자이식시키고/시키거나, 녹아웃(knockout)(즉, 하나 이상의 유전자를 부분적으로나 전체적으로 억제시킨 동물로부터 얻는 것)시킬 수 있다.
일 구체예에서, 이식유전자 구성물을 단일 단계 배에 도입시킨다. 접합자는 초미세 주사시의 가장 우수한 표적이 된다. 쥐에 있어서, 남성을 발현하는 전핵의 지름은 1 내지 2pl의 DNA 용액을 재생가능할 정도로 주사시킬 수 있는 대략 20마이크론미터의 크기에 달한다. 유전자를 운반하기 위한 표적으로서 접합자를 사용하면, 대부분의 경우 제 1 분해되기 전에 주입된 DNA가 숙주 유전자로 도입될 것이라는 주요한 이점이 있다[참조: Brinster et al. 1985)PNAS82: 4438-4442]. 결과적으로, 유전자이식 동물의 모든 세포는 도입된 이식유전자를 함유할 것이다. 이것은 일반적으로, 50% 이상의 생식세포가 이식유전자를 함유할 것이기 때문에, 이식유전자를 상기 시조로부터 비롯된 후손으로 효율적으로 전환시키는데 반영될 것이다.
일반적으로, 수정된 배는 전핵이 형성될 때까지 적합한 매질 내에서 항온배양된다. 대략 이 시간에서, 이식유전자를 포함하는 누클레오티드 서열이 하기한 바와 같이 여성 또는 남성을 발현하는 전핵으로 도입된다. 쥐와 같은 일부 종에서는, 남성을 발현하는 전핵이 바람직하다. 난자 핵 또는 접합자 여성 전핵으로 처리하기 전에, 외인성 유전자 물질을 접합자의 남성 DNA 보체에 첨가시키는 것이 가장 바람직하다. 아마도, 히스톤을 갖는 남성 DNA의 프로타민을 교체하여 여성 DNA 및 남성 DNA 보체가 결합되어 이배체 접합자의 형성을 용이하게 함으로써, 난자 핵 또는 여성 전핵이 남성 DNA 보체에 영향을 미치는 분자를 방출한다고 여겨진다.
따라서, 여성 전핵에 의해서 영향을 받기 전에, DNA의 남성 보체 또는 DNA의 임의의 다른 보체에 외인성 유전자 물질을 첨가시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 남성 전핵을 형성한 후에 가능한한 빨리, 외인성 유전자 물질을 초기 남성 전핵에 첨가시키는데, 이것은 남성 및 여성 전핵이 잘 분리되어 이들 모두가 세포막에 인접하여 위치하는 경우에 해당한다. 또한, 탈축합시키기 위해 도입시킨 후에, 외인성 유전자 물질을 정자의 핵에 첨가시킬 수 있었다. 그런 다음, 외인성 유전자 물질을 함유하는 정자를 난자에 첨가시킬 수 있거나, 탈축합된 정자를 그 직후 가능한한 빨리 첨가된 이식유전자 구성물과 함께 난자에 첨가시킬 수 있었다.
배로 이식유전자 누클레오티드 서열을 도입하는 것은, 예를 들어 초미세 주사, 전기 충격 또는 리포펙션(lipofection)과 같은 당업계에 공지된 수단으로 실시될 수 있다. 이식유전자 누클레오티드 서열을 배로 도입시킨 다음, 시간을 변화시키거나, 대용되는 숙주로의 재이식 양자를 목적으로, 배를 생체내에서 항온배양시킬 수 있다. 생체내에서 성체로 항온 배양시키는 것은 본 발명의 범주 내에 있는 것이다. 하나의 공통된 방법으로, 배를 생체 내에서 종의 종류에 따라 1 내지 7일 동안 항온배양시킨 다음, 이들을 대용되는 숙주로 재이식하는 방법이 있다.
본 발명의 목적에 대해서, 접합자는 완전한 유기체로 발달시킬 수 있는 이배체 세포를 사실상 형성하는 것이다. 일반적으로, 접합자는 배우자 또는 배우자들로부터 2개의 반수체 핵을 융합시킴으로써 자연적으로나 인위적으로 형성된 핵을 함유하는 에그를 포함할 것이다. 따라서, 배우자 핵은 자연적으로 친화성이 있는 것, 즉 분화되어 기능이 있는 유기체로 발달시킬 수 있는 생존가능한 접합자가 되는 것임에 틀림없다. 일반적으로, 정배체(euploid) 접합자가 바람직하다. 비정배체 접합자가 얻어질 경우, 어느 하나의 배우체가 생성되는 유기체의 정배체 수에 대해 하나 이상으로 염색체의 수가 변하지 않는다.
유사한 생물학적 고려 사항 이외에, 물리학적 고려 사항에 의해서도 접합자의 핵 또는 접합자 핵의 일부를 형성하는 유전자 물질에 첨가시킬 수 있는 외인성 유전자 물질의 양(예를 들어, 부피)이 결정된다. 어떠한 유전자 물질도 제거되지 않는다면, 첨가될 수 있는 외인성 유전자 재료의 양이 물리적으로 분해되지 않고 흡수되는 양에 의해 제한된다. 일반적으로, 삽입된 외인성 유전자 물질의 부피는약 10피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가로 얻어지는 물리적인 효과는, 접합자의 생존율을 물리적으로 파괴시키지 않도록 크지 않아야 한다. 생성되는 접합자의 외인성 유전자 물질을 포함하는 유전자 물질이 접합자를 기능적인 유기체로 분화 및 발달을 생물학적으로 개시시키고 유지할 수 있기 때문에, DNA 서열의 수 및 다양성에 대한 생물학적 제한은 특수 접합자 및 외인성 유전자 물질의 기능에 따라서 달라질 것이며, 이는 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
접합자에 첨가되는 이식유전자 구성물의 복사체 수는 첨가된 외인성 유전자 물질의 전량에 따라 달라지며, 이는 유전자 변형을 가능하게 하게 할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로, 단 하나의 복사체가 요구된다; 그러나, 하나의 복사체의 기능을 발현하기 위해, 일반적으로 다수의 복사체, 예를 들어 1,000 내지 20,000 복사체의 이식유전자 구성물이 활용된다. 본 발명에 있어서, 외인성 DNA 서열의 표현형의 발현을 증가시키기 위해, 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열의 하나 이상의 기능적인 복사체를 보유한다는 이점이 종종 있을 것이다.
외인성 유전자 물질이 세포, 핵 막 또는 그밖의 존재하는 세포 구조 또는 유전자 구조를 파괴하지 않는 한, 이것을 핵의 유전자 물질에 첨가시킬 수 있는 임의의 기술을 활용할 수 있을 것이다. 외인성 유전자 물질이 초미세 주사법에 의해서 핵 유전자 물질로 바람직하게 주사된다. 세포 및 세포 구조의 초미세 주사법은 당업계에 공지되어 있으며, 사용되고 있다.
표준 방법을 사용하여 재이식이 수행된다. 대개, 대용되는 숙주가 마취되고, 배가 난관으로 삽입된다. 특수한 숙주로 이식된 태아 수는 종에 따라 달라질것이나, 이는 대개 자연적으로 생성되는 종 후손의 수와 비교될 것이다.
대용 숙주의 유전자이식 자손은 적합한 방법에 의해 이식유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 적어도 일부분의 이식유전자와 상보적인 프로브를 사용하여, PCR, 서던 블롯 또는 노던 블롯에 의해 종종 달성된다. 이식유전자에 의해 코드화된 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 이식유전자 생성물의 존재를 스크리닝하기 위한 대안적인 또는 추가적인 방법으로서 사용될 수 있다. 전형적으로, DNA는 테일 조직으로부터 준비되고, 이식유전자에 대한 서돈 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안적으로, 모든 조직 또는 세포 유형이 이러한 분석에 사용될 수 있지만, 가장 높은 수준으로 이식유전자를 발현하는 것으로 여겨지는 조직 또는 세포를 서던 분석 또는 PCR을 사용하여 이식 유전자의 존재 및 발현이 시험된다.
이식유전자의 존재를 측정하기 위한 대안적이거나 추가적은 방법으로는 적합한 생화학 분석, 예컨대, 효소 및/또는 면역학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유동세포분석법 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 혈액 분석은 혈액속의 이식유전자 생성물의 존재를 검출하고, 다양한 유형의 수준의 혈액 세포 및 기타 혈액 성분에 대한 이식유전자의 영향을 평가하는데 유용할 수 있다.
유전자이식 동물의 자손은 유전자이식 동물을 적합한 파트너와 교미시키거나, 유전자이식 동물로부터 수득된 난자 및/또는 정자의 시험관 수정에 의해 얻어질 수 있다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우, 파트너는 트랜스제닉(transgenic)및/또는 녹아웃이거나 아닐 수 있으며, 파트너가 트랜스제닉이라면, 이는 동일하거나 상이한 이식유전자, 또는 이 둘 모두의 유전자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 파트너는 어미계일 수 있다. 시헌관 수정이 이용되는 경우, 수정된 배는 대용 숙주로 이식되거나 시험관내에서 인큐베이팅될거나, 둘 모두의 방식으로 처리될 수 있다. 어느 방법을 이용하더라도, 상기 설명된 방법 또는 기타 적절한 방법을 이용하여 자손에서의 이식유전자의 존재를 평가할 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 유전자이식 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 특정 구체예에서 외인성 유전 물질은 FRP 단백질(아고니스트 또는 안타고니스트), 및 안티센스 전사체, 또는 FRP 변이체의 생성물를 유도하는 DNA 서열일 것이다. 또한, 이러한 구체예에서, 서열은 전사 조정 요소, 예를 들어, 바람직하게는, 특정 유형의 세포에서 이식유전자 생성물을 발현시키는 프로모터에 부착될 수 있다.
또한, 레트로바이러스 감염은 이식유전자를 사람 이외의 동물에 유입시키는데 이용될 수 있다. 발달되는 사람 이외의 배는 배포 단계로 시험관내에서 배양될 수 있다. 이 시간 동안, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적일 수 있다(Jaenich, R. (1976)PNAS73:1260-1264). 할구의 효과적인 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 달성될 수 있다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). 이식유전자를 유입시키는데 이용되는 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 이식유전자를 운반하는 복제기능이 상실된 레트로바이러스이다(Jahner et al.(1985)PNAS82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985)PNAS82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스 생성 세포의 모노층상에서 할구를 배양하므로써 용이하고 효과적으로 달성된다(Van der Putten,supra; Stewart et al.(1987)EMBO J.6:383-388). 대안적으로, 감염은 나중 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생성 세포는 블라스토콜레(blastocoele)로 유입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 혼입이 유전자이식된 사람 이외의 동물을 형성하는 단지 일부 세포에서 발생하기 때문에, 대부분의 발견체는 이식유전자에 대한 모자이크형일 것이다. 또한, 발견체는 일반적으로 자손에서 분리될 게놈의 상이한 위치에서 다양하게 레트로바이러스에 의한 삽입된 이식유전자를 함유할 수 있다. 또한, 중간회태(midgestation) 배의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 이식 유전자를 배선으로 유입시키는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982)supra)
이식유전자 유입에 대한 제 3 유형의 표적 세포는 배 줄기 세포(ES)이다. ES 세포는 시험관내에서 배양된 미리 이식된 배로부터 수득되며, 배와 융합된다(Evans et al. (1981)Nature292:154-156; Bradley et al. (1984)Nature309:255-258; Gossler et al. (1986)PNAS83:9065-9069; and Robertson et al. (1986)Nature322-445-448). 이식유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이르스 매개된 형질도입에 의해 ES 세포로 효과적으로 유입될 수 있다. 그 후, ES 세포가 배를 점령하고, 생성된 키메릭 동물의 배선으로 유도된다. 문헌[Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474]를 참조하시오.
한 구체예에서, 동물 게놈을 변형시키기 위한 상동 재조합을 이용하는 방법인 유전자 표적화는 배양된 배 줄기 세포로의 변화부를 유입하는데 이용될 수 있다. ES 세포에서 흥미있는 FRP 유전자를 표적화하므로써, 동물의 이러한 변화부를 배선으로 유입하여 키메라를 생성시킬 수 있다. 유전자 표적화 공정은 표적 FRP 로커스에 상동인 단편을 포함하고, FRP 게놈 서열에 대한 의도된 서열 변이체(예를 들어, 삽입, 결실, 점 변이체)를 포함하는 DNA 표적화 구성물을 조직 배양 세포에 유입시키므로써 달성된다. 그 후, 처리된 세포를 정확한 표적화에 대해 스크리닝하여, 정확하게 표적화된 세포를 확인하고 분리하였다.
배 줄기 세포의 유전자 표적화는, 사실 하나 이상의 FRP 게놈 서열과의 상동 재조합시키도록 설계된 표적화 이식유전자 구성물을 사용하여 FRP 유전자 기능을 상실하게 하기 위한 수단으로서 분 발명에 의해 고찰된 방법이다. 표적화 구성물은 배열될 수 있어서, FRP 유전자 요소의 재조합시, 파저티브 선택 마커가 유전자의 코딩 서열로 삽입된다(또는 대체된다). 삽압된 서열은 FRP 유전자를 기능적으로 파괴시키는 반면, 파저티브 선택 특성을 제공한다. 전형적인 FRP 표적화 구성물은 하기에 상세히 설명되어 있다.
일반적으로, 녹아웃 동물을 생성시키는데 사용되는 배 줄기 세포(ES 세포)는 생성하려는 녹아웃 동물과 동일한 종의 세포일 것이다. 예를 들어, 마우스 배 줄기 세포는 일반적으로 녹아웃 마우스를 생성시키는데 사용될 것이다.
배 줄기 세포는 당업자에 널리 공지된 방법 예컨대, 문헌[Doetschman et al. (1985)J.Embryol.Exp. Morphol.87:27-45]에 설명된 방법에 의해 생성되고 유지된다. 모든 ES 세포주가 사용될 수 있으나, 선택된 주는 전형적으로 세포의 발달배의 배선으로 통합되고 이의 일부가 되어 녹아웃 구성물의 배선 전달을 유도할 수 있는 능력에 대해서 전형적으로 선택된다. 따라서, 이러한 능력을 갖는 것으로 여겨지는 모든 ES 세포주는 본원에 적합하다. ES 세포의 생성에 전형적으로 사용되는 한 마우스 계는 129J 계이다. 또 다른 ES 세포주는 뮤린 세포주 D3이다(아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 카탈로그 no. CKL 1934). 또 다른 바람직한 ES 세포는 WW6 세포주이다(Ioffe et al. (1995)PNAS92:7357-7361). 당업자에 공지된 방법을 사용하여 녹아웃 구성물 삽입을 위해 세포를 배양하고 준비하였다[참조: Robertson in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J.Robertson,ed. IRL Press, Washington,D.C.[1987]); by Bradley et al. (1986)Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371); and by Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY[1986]).
ES 세포로의 녹아웃 구성물의 삽입은, 예를 들어, 일렉트로포레이션, 미세주입 및 인산칼슘 처리를 포함하여 당해분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 바람직한 삽입 방법은 일렉트로포레이션이다.
세포로 삽입될 각각의 녹아웃 구성물은 우선 선형이어야 한다. 녹아웃 구성물이 벡터(하기 설명됨)로 삽입된다면, 녹아웃 구성물내가 아니라 단지 벡터 서열내에서만 절단되도록 선택된 적합한 제한 엔도누클레아제로 DNA를 분해하므로써 선형화가 달성된다.
삽입을 위해, 녹아웃 구성물은 당업자에 공지된 것으로서 선택된 삽입 방법에 적합한 조건하에 ES 세포로 첨가된다. 하나 이상의 구성물이 ES 세포로 유입되는 경우, 각각의 녹아웃 구성물이 동시에 또는 한번에 하나씩 유입될 수 있다.
ES 세포가 일렉트로포레이팅되는 경우, ES 세포와 녹아웃 구성 DNA는 일렉트로포레이션 기기를 사용하여 사용 설명서에 따라 전기 펄스에 노출된다. 일렉트로포레이션 후, ES 세포는 전형적으로 적합한 인큐베이션 조건하에서 회수된다. 그 후, 세포는 녹아웃 구성물의 존재 여부에 대해 스크리닝된다.
스크리닝은 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 마아커 유전자가 항체 내성 유전자인 경우, 예를 들어, ES 세포는 치사 농도 이외의 농도의 항체의 존재하에 배양될 수 있다. 살아남은 이러한 ES 세포는 녹아웃 구성물로 통합될 것이다. 마아커 유전자가 항체 내성 유전자 이외의 유전자라면, ES 세포 게놈성 DNA의 서던 블롯은 단지 마아커 서열로만 하이브리드화되도록 설계된 DNA 서열로 프로빙될 수 있다. 대안적으로, PCR이 이용될 수 있다. 최종적으로, 마아커 유전자가 검출될 수 있는 활성(예를 들어, b-갈락토시다아제)을 갖는 효소를 코드화하는 유전자인 경우, 효소 기질이 적합한 조건하에 첨가될 수 있으며, 효소 활성을 분석할 수 있다. 당업자는 기타 유용한 마아커들 및 제공된 세포내의 이들의 존재를 검출하는 방법에 친숙할 것이다. 모든 이러한 마아커는 본 발명을 교시하는 범위내에 포함되는 것으로서 여겨진다.
녹아웃 구성물은 ES 세포 게놈에서 여러 위치로 통합되며, 불규칙한 삽입으로 인해 각각 ES 세포 게놈의 상이한 위치로 통합될 수 있다. 삽입시 목적하는 위치는 녹아웃될 DNA 서열, 예를 들어, FRP 코딩 서열, 전사 조절 서열 등에 상보적인 위치이다. 전형적으로, 녹아웃 구성물을 취하는 약 1-5% 미만의 ES 세포가 목적하는 위치에서 녹아웃 구성물과 사실상 통합될 것이다. 녹아웃 구성물이 적합하게 통합된 ES 세포를 확인하기 위해, 총 DNA는 표준 방법을 사용하여 ES 세포로부터 추출될 수 있다. 그 후, 특정 제한 효소(들)로 분해된 게놈성 DNA에 특이적 패턴으로 하이브리드화되도록 설계된 프로브(들)로 서던 블롯상에서 프로브될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 게놈성 DNA는 특정 크기 및 서열의 DNA 단편을 증폭하도록 특이적으로 설계된 프로브로 PCR에 의해 증폭될 수 있다(즉, 적합한 위치에서 녹아웃 구성물을 함유하는 이러한 세포만이 적합한 크기의 DNA 단편을 생성시킬 것이다).
적합한 위치에서 녹아웃 구성물을 함유하는 적합한 ES 세포가 확인된 후, 세포는 배로 삽입될 수 있다. 삽입은 당업자에 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있으나, 바람직한 방법은 미세주입이다. 미세주입을 위해, 약 10-30개 세포를 마이크로피펫으로 모으고, 녹아웃 구성물을 함유하는 외래 ES 세포를 발달 배로의 통합을 허용하는 적합한 발단 단계의 배에 주입한다. 예를 들어, 실시예에 설명된 바와 같이, 형질전환된 ES 세포는 배포로 미세주입될 수 있다.
ES 세포의 삽입에 사용되는 배의 적합한 발달 단계는 종에 매우 의존적이며, 마우스에 있어서는, 약 3.5일이다. 배는 수태한 암컷의 자궁 주입에 의해 수득될 수 있다. 이를 달성하는 적합한 방법은 당업자에 공지되어 있으며, 브래들리(Bradley) 등에 의한 상기 문헌에 설명되어 있다.
발육의 라이트 스테이지(right stage)의 임의의 배가 사용하기에 적합하지만, 바람직한 배는 수컷이다. 마우스에서, 바람직한 배는 또한 ES 세포 유전자에 의해 엔코딩된 모피 색과 상이한 모피 색을 코딩하는 유전자를 가진다. 이러한 방법으로, 자손은 모자이크 모피 색(이는 ES 세포가 발육중인 배내로 혼입되었음을 가르킨다)을 살펴봄으로써 녹아웃 구성물의 존재에 대해 쉽게 스크리닝할 수 있다. 따라서, 예컨대, ES 세포주가 백색 털에 대한 유전자를 가진 경우, 선택된 배는 흑색 또는 갈색 털에 대한 유전자를 가질 것이다.
ES 세포가 배내로 도입된 후에, 배는 임신기간 동안 가임신상태의 양모(foster mother)의 자궁에 착상될 수 있다. 임의의 양모가 사용될 수 있지만, 양모는 전형적으로 양육하고 번식하는 능력, 및 새끼를 돌보는 능력에 대해 선택된다. 이러한 양모는 전형적으로 동일종의 거세된 수컷과 교미시킴으로써 준비된다. 가임신한 양모의 단계는 성공적인 착상을 위해 중요하고, 이것은 종(species) 의존적이다. 마우스에 있어서, 이러한 단계는 약 2 내지 3일의 가임신상태이다.
양모에게서 출생한 자손은 초기에 모피 색 선별 전략(상기 및 첨부한 실시예에서 기술한 바와 같이)이 사용된 모자이크 모피 색에 대해 스크리닝될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안책으로서, 자손의 꼬리 조직으로부터의 DNA를 상기 기술한 바와 같이 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하여 녹아웃 구성물의 존재에 대해 스크리닝할 수도 있다. 그런 다음 모자이크인 것으로 나타난 자손은 이들이 이들의 생식세포주내에 녹아웃 구성물을 가지고 있다고 여겨지는 경우, 동형접합 녹아웃 동물을 생성시키기 위해 서로 교배될 수 있다. 동형접합자는 상기 교배의 산물인 마우스 뿐만 아니라 공지된 이형접합자인 마우스 및 야생형 마우스로부터의 게놈 DNA의동등한 양의 서던 블로팅에 의해 확인될 수 있다.
녹아웃 자손을 확인하고 특징화하는 다른 수단들이 유용하다. 예를 들어, 노던 블롯은 녹아웃된 유전자, 마커 유전자 또는 둘 모두를 엔코딩하는 전사체의 존재 또는 부재에 대해 mRNA를 프로빙하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 웨스턴 블롯은 특정 FRP 단백질에 대한 항체, 또는 상기 유전자가 발현되는 경우, 마커 유전자 생성물에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 프로빙함으로써 자손의 여러 조직에서 녹아웃된 FRP 유전자의 발현 레벨을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, 자손으로부터의 다양한 세포에 대한 원위치 분석법(세포를 고정시키고 항체로 표지시키는 것과 같은) 및/또는 FACS(형광 활성화된 세포 분류) 분석법은 녹아웃 구성물 유전자 생성물의 존재 또는 부재를 찾기 위한 적합한 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
녹아웃 또는 파괴 유전자이식 동물을 만드는 다른 방법이 또한 일반적으로 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[참조: Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]을 참조하라. 또한 재조합효소 의존성 녹아웃은FRP-유전자의 불활성화의 조직 특이적이고/이거나 일시적인 제어가 재조합효소 서열(하기 기술함)에 의해 제어될 수 있도록, 예컨대, 표적 서열을 삽입하기 위한 동종 재조합에 의해 생성될 수 있다.
하나 이상의 녹아웃 구성물 및/또는 하나 이상의 이식유전자 발현 구성물을 함유하는 동물은 임의의 몇가지 방법으로 제조될 수 있다. 바람직한 제조 방법은 요망되는 트랜스제닉 표현형 중 하나를 각각 함유하는 일련의 포유동물을 생성시키는 것이다. 이러한 동물들을 일련의 교배, 역교배 및 선별을 통해 함께 사육하여, 궁극적으로 모든 요망되는 녹아웃 구성물 및/또는 발현 구성물을 함유하는 단일 동물을 생성시켰고, 그렇지 않으면 동물은 녹아웃 구성물(들) 및/또는 이식유전자(들)의 존재를 제외하고는 야생형과 일치하였다(유전학적으로 동일하였다).
본 발명은 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 않되는 하기 실시예에 의해 추가로 예증된다. 모든 인용된 참고문헌(본 출원 전반에 걸쳐 인용된 바와 같이 참고문헌, 부여된 특허, 공개된 특허 출원을 포함하여)의 내용을 이에 의하여 명백하게 참조로 인용하였다. 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 경우, 당업자에게 공지된 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌[참조: Molecular Cloning A Laboratory Mannual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II(D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For MammalianCells(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155(Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbood Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]을 참조하라.
본 발명은 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 않되는 하기 실시예에 의해 추가로 예증된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 인용 참고문헌(참고문헌, 부여된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동 출원중인 특허 출원을 포함하여)의 내용을 이에 의하여 명백하게 참조로 인용하였다.
5.1프리즐 관련 단백질 1(FRP-1)과 녹내장의 관련성
재료 및 방법
RNA 차별 디스플레이에 의해 확인된 프리즐 관련 단백질 cDNA 서열
5.2COS 세포에서 재조합 FRP 또는 Wnt 경로 유전자의 발현
본 예에서는 포유류 발현 시스템에서 재조합 전장 사람 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자를 생성시키기 위한 방법을 설명한다.
전장 사람 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질, 또는 가용성 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 발현 구성물은 다음과 같이 작제될 수 있다. 상기 기술한 전장 사람 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질 또는 가용성 형태의 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질을 엔코딩하는 핵산을 SEQ ID NO: 1에 기재된 서열을 기초로 하는 PCR 프라이머를 사용하는 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자를 발현시키는 사람 세포, 예컨대, 사람 잔기둥 그물 세포로부터 추출된 mRNA의 역전사(RT-PCR)에 의해 수득하였다. PCR 프라이머는 발현 플라스미드내로의 도입을 위한 적절한 제한 부위를 추가로 함유하고 있다. 그런 다음 증폭된 핵산을 1) SV40 복제 원점, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 대장균 복제 원점, 4) CMV 프로모터 다음의 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 pcDNAI/Amp(InVitrogen)와 같은 진핵세포 발현 플라스미드에 삽입하였다. 그런 다음 전장 사람 FRP를 엔코딩하는 DNA 단편 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 및 이의 3' 말단에 프레임적으로 융합되어 있는 HA 또는 myc 태그를 플라스미드의 폴리링커 영역내로 클로닝하였다. HA 태그는 앞서 기술된 바와 같이 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37, 767]. FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자에 HA 태그의 도입은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 재조합 단백질을 쉽게 검출할 수 있도록 해준다.
재조합 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자의 발현을 위해, COS 세포를DEAE-DEXTRAN 방법에 의하여 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자-HA 단백질의 발현은 안티-HA 단백질을 사용하는 방사능표지 및 면역침전법에 의해 검출될 수 있다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)]. 이를 위해, 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션시킨후 2일 동안35S-시스테인으로 표지시켰다. 그런 다음, 세포 또는 대안적으로는 배양 배지(예컨대, 가용성 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자의 경우)를 수집하고 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질을 HA 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 또한, 재조합 단백질의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출될 수 있다. 전장 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자가 막 단백질, 및/또는 분비 단백질인지를 결정하기 위해, 전장 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자 단백질을 엔코딩하는 벡터로 트랜스펙션된 세포를 계면활성제[RIPA 완충액(150 mM NaCl 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM 트리스, pH 7.5)]를 사용하여 용균시켰다[참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)]. 그런 다음 침전된 단백질을 SDS-PAGE 겔상에서 분석할 수 있다. 따라서, 세포내의 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자의 존재는 전장 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자가 막에 결합될 수 있음을 나타내며, 상층액에 FRP 또는 Wnt 경로 구성요소 유전자의 존재는 상기 단백질이 분비 단백질로서 생성되든 세포로부터의 누출에 의해 방출되든간에,가용성 형태로 존재할 수 있음을 나타낸 것이다.
등가물
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예의 많은 등가물들이 일상적인 실험을 사용한다는 것을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물들을 하기 청구항에 포함시키고자 한다.
2. 발명의 개요
한 가지 일면에서, 본 발명은 피검자가 녹내장에 걸려있는 지를 결정하거나 녹내장을 발병시킬 가능성이 있는 지를 결정하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 발명은 프리즐 관련 단백질(FRP), wingless(Wnt) 시그널링 경로 성분, Wnt 시그널링에 의해 활성화된 유전자 또는 Wnt 시그널링에 의해 활성화된 유전자의 생성물의 상대적 레벨 또는 활성을 측정하는 것을 기초로 한다. 바람직한 구체예에 있어서, 검정은 피검자로부터 수득한 잔기둥 그물 세포에 대해 수행한다. 이 방법은 (i) 프리즐 관련된 단백질(FRP-1)을 엔코딩하는 유전자, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 돌연변이; (ii) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 오발현(misexpression); 또는 (iii) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자를 조절하는 프로모터의 에러 또는 돌연변이 (상기 에러 또는 돌연변이는 비정상적 발현을 초래함) 중 하나 이상을 특징으로 하는 유전적 병변의 존재 또는 부재를 적합한 세포에서 검출하는 것을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 진단 방법은 (a) 야생형 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자로부터의 하나 이상의 누클레오티드의 결실; (b) 야생형 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자에 대한 하나 이상의 누클레오티드의 첨가; (c) 야생형 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 하나 이상의 누클레오티드의 치환; (d) 야생형 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 대량의 염색체 재배열; (e) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 메신저 RNA(mRNA) 전사체의 레벨의 변화; (f) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 mRNA의 비야생형 스플라이싱 패턴의 존재; (g) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 비정상적 레벨 또는 활성 중 하나 이상의 존재를 확인하는 것을 포함한다.
예를 들어, 유전적 병변은 (i) FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자 (야생형 또는 돌연변이체)의 센스 또는 안티센스 서열 또는 이의 단편 또는 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자와 천연적으로 관련된 5' 또는 3' 플랭킹 서열에 하이브리드화하는 올리고누클레오티드로 이루어진 프로브 및 프라이머를 제공하고; 상기 프로브 또는 프라이머를 피검자로부터 수득한 적합한 핵산 함유 생물학적 샘플과 접촉시키고; (iii) 상기 프로브 또는 프라이머가 핵산에 하이브리드화하는 것에 의해 유전적 병변의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 진단 방법 및/또는 키트는 돌연변이를 함유할 수 있는 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 하나 이상의 영역을 증폭시키는 (예를 들어, PCR 또는 LCR에 의해) 프라이머 세트 및 증폭 생성물을 정상의 야생형 코딩 서열과의 돌연변이 또는 유전자 발현 레벨의 차이에 대해 분석하는 수단을 이용한다. 또 다른 구체예에 있어서, 진단 방법 및/또는 키트는프로브를 이용하여 적합하게 엄격한 조건하에서 생물학적 샘플 중의 상보적 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있는 이의 능력을 결정하며, 여기서 야생형 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자로 이루어진 프로브가 샘플 핵산에 하이브리드화할 수 없는 것이 샘플 핵산 중의 돌연변이의 존재를 나타내거나; 돌연변이 FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자로 이루어진 프로브가 샘플 핵산에 하이브리드화할 수 있는 것이 샘플 핵산 중의 돌연변이의 존재를 나타낸다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, FRP, Wnt 시그널링 성분 또는 Wnt 시그널링에 의해 발현이 활성화되는 유전자의 단백질 레벨 또는 활성은 면역검출 및 생화학적 시험을 포함하는 다양한 방법 중 어느 하나를 이용하여 검출될 수 있다.
본원에 기술된 검정 및 키트를 사용하여 수득한 정보는 (단독으로 또는 녹내장의 발병에 기여하는 또 다른 유전적 결함 또는 환경적 인자에 대한 정보와 함께) 무증상 피검자가 녹내장에 걸려있는 지 또는 녹내장을 발병시킬 가능성이 있는 지를 결정하는 데에 유용하다. 또한, 상기 정보는 상기 질환의 예방 또는 치료에 대한 더욱 맞추어진(customized) 방법을 가능하게 해준다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 녹내장을 치료하거나 예방하기 위한 치료제를 확인하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 시험관내 또는 생체내 검정을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 치료제는 Wnt 시그널링을 촉진시킨다. 한 가지 구체예에 있어서, 상기 방법은 (a) FRP 또는 Wnt 시그널링 폴리펩티드(i), FRP 또는 Wnt 시그널링 폴리펩티드 결합 파트너(ii), 및 시험 화합물(iii)을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계 및 (b) FRP 또는 Wnt 시그널링 폴리펩티드 및 결합 단백질의 상호작용을 검출하는 단계를 필수 단계로 하는 결합 검정이다. 상기 화합물의 존재하에서의 FRP 또는 Wnt 시그널링 폴리펩티드 및 결합 단백질의 상호작용의 통계적으로 의미있는 변화(증강 또는 억제)는 Wnt 시그널링의 잠재적 아고니스트(agonist)(미메틱(mimetic) 또는 증강제) 또는 안타고니스트(antagonist)(억제제)를 나타내준다. 반응 혼합물은 세포 비함유 단백질 프리퍼레이션(preparation), 예를 들어 재구성된 단백질 혼합물 또는 세포 용해물, 배양된 세포 시스템일 수 있거나, 이는 결합 파트너를 재조합적으로 발현하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 세포일 수 있다.
또 다른 전형적인 구체예는 잔기둥 그물에서 Wnt 시그널링에 의해 조절되는 유전자의 발현 및/또는 Wnt 시그널링 속도를 촉진시키거나 증가시키는 아고니스트를 확인하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 검정을 제공한다. 한 가지 구체예에 있어서, 상기 스크리닝 검정은 고이동성 그룹(HMG) 단백질(예를 들어, 림프양 인핸서 인자/T-세포 인자)에 의해 조절되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자로 트랜스펙션된 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정하는 것을 포함한다. 리포터 유전자는 예를 들어 색, 형광, 발광, 세포 생육성, 세포 영양요구량의 경감, 세포 성장 및 약물 내성과 같은 검출성 시그널을 발생시키는 유전자 생성물을 엔코딩할 수 있다. 예를 들어, 리포터 유전자는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리 포스파타제로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 엔코딩할 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 적합한 세포(예를 들어, 잔기둥 그물세포)를 Wnt 시그널링에 관여하거나 이에 의해 조절되는 잔기둥 그물 유전자의 발현을 촉진시키는 유효량의 화합물과 접촉시킴으로써 녹내장을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 화합물은 소분자, 핵산(안티센스 또는 트리플렉스 분자 및 리보자임을 포함함), 단백질, 펩티드 또는 펩티드 미메틱일 수 있다. 특히 바람직한 화합물은 프리즐 관련 단백질(FRP) 안타고니스트이다. 특히 바람직한 안타고니스트는 세포에서 발현되는 FRP 레벨을 억제하거나 감소시키는 안티센스, 리보자임 또는 트리플렉스 분자이다. 그 밖의 바람직한 FRP 안타고니스트는 FRP가 Wnt에 결합하는 것을 감소시키거나 억제시키는 항체이다.
본 발명의 그 밖의 특징 및 이점은 하기 상세한 설명과 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.

Claims (43)

  1. 환자 샘플에서 Wnt 경로 성분 또는 프리즐드(frizzled) 관련 단백질 유전자 생성물의 비정상적 레벨 또는 생활성을 검출하는 것을 포함하여 녹내장을 진단하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 환자 샘플이 잔기둥(trabecular) 그물(meshwork) 세포 조직의 세포 또는 환자 눈물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 비정상적으로 높은 레벨이 녹내장 상태를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물이 FRP-1 핵산 또는 FRP-1 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, Wnt 경로 성분이 Wnt 유전자, 프리즐드 유전자, 글리코겐 신타제-키나제 유전자, 단백질 키나제 C 유전자, 베타-카테닌 유전자, TCF 유전자, TCF 조절되는 유전자 및 헤지호그(hedgehog) 유전자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, Wnt 경로 성분 생활성이 베타-카테닌 생활성임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 베타-카테닌 생활성이 인산화된 베타-카테닌의 레벨을 결정함으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 인산화된 베타-카테닌의 비정상적 레벨이 녹내장을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, Wnt 경로 성분 생활성이 키나제 활성임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 키나제가 글리코겐 신타제 키나제-3 또는 단백질 키나제 C 임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 글리코겐 신타제 키나제-3 활성 또는 단백질 키나제 C 활성의 비정상적 레벨이 녹내장 상태를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  12. 환자 샘플로부터 수득한 Wnt 경로 성분 엔코딩 유전자 또는 프리즐드 관련 단백질 엔코딩 유전자에서 하나 이상의 사람 다형성 대립형질을 검출하는 것을 포함하여 녹내장을 진단하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 환자 샘플이 혈액 샘플 또는 볼(cheek) 스왑(swab) 샘플임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 사람 다형성 대립형질이 FRP-1 유전자임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 사람 다형성 대립형질이 FRP-1 유전자 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, FRP-1 유전자 프로모터 다형성 대립형질이 FRP-1 유전자 생성물의 발현 증가와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  17. Wnt 경로 성분 또는 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 시험 화합물의 존재하에서 Wnt 경로 성분 또는 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 레벨 또는 생활성을 검출하는 것을 포함하여 항녹내장 화합물을 확인하는 방법으로서,
    시험 화합물의 존재하에서의 Wnt 경로 성분 또는 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 레벨 또는 생활성이 시험 화합물의 부재하에서 검출된 레벨 또는 생활성과 비교하여 증가하거나 감소한 것에 의해 상기 시험 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 시험 화합물의 존재하에서 검출된 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 레벨 또는 생활성이 시험 화합물의 부재하에서 검출된 레벨 또는 생활성과 비교하여 감소한 것에 의해 상기 시험 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 프리즐드 관련 단백질 유전자가 FRP-1 임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 시험 화합물의 존재하에서 검출된 Wnt 경로 성분의 레벨 또는 생활성이 시험 화합물의 부재하에서 검출된 레벨 또는 생활성과 비교하여 증가한 것에 의해 상기 시험 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, Wnt 경로 성분이 Wnt 유전자 생성물, 프리즐드 유전자 생성물, 글리코겐 신타제-키나제 유전자 생성물, 단백질 키나제 C 유전자 생성물, 베타-카테닌 유전자 생성물, TCF 유전자 생성물, TCF 조절되는 유전자 생성물 및 헤지호그 유전자 생성물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, Wnt 경로 성분 생활성이 베타-카테닌 생활성임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 베타-카테닌 생활성이 인산화된 베타-카테닌의 레벨을 결정함으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 시험 화합물의 존재하에서의 인산화된 베타-카테닌의 레벨이 시험 화합물의 부재하에서의 인산화된 베타-카테닌의 레벨과 비교하여 감소한 것에 의해 상기 시험 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 17항에 있어서, Wnt 경로 성분 생활성이 키나제 활성임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 키나제 활성이 글리코겐 신타제 키나제-3 활성이고, 시험 화합물의 존재하에서의 키나제 활성의 레벨이 시험 화합물의 부재하에서의 키나제 활성의 레벨과 비교하여 변화한 것에 의해 상기 시험 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 키나제 활성이 단백질 키나제 C 활성이고, 시험 화합물의존재하에서의 키나제 활성의 레벨이 시험 화합물의 부재하에서의 키나제 활성의 레벨과 비교하여 변화한 것에 의해 상기 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  28. 세포 샘플을 시험 화합물과 접촉시키고, Wnt 반응성 유전자의 레벨 또는 생활성을 측정하는 것을 포함하여 항녹내장 화합물을 확인하는 방법으로서,
    시험 화합물의 존재하에서의 Wnt 반응성 유전자의 레벨이 시험 화합물의 부재하에서의 Wnt 반응성 유전자의 레벨 또는 생활성과 비교하여 증가한 것에 의해 상기 화합물이 항녹내장 화합물임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, Wnt 반응성 유전자가 헤지호그 유전자, 인그레일드(engrailed) 유전자, Lef/tcf 조절되는 유전자, 합성 리포터 유전자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 피검자에게 Wnt 경로 성분 또는 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 레벨 또는 생활성을 모듈레이팅(modulating)하는 화합물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여, 사람 피검자의 녹내장을 치료하는 방법.
  31. 제 24항에 있어서, 화합물이 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 소분자(small molecule) 또는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 핵산이 유전자, 안티센스, 리보자임 및 트리플렉스(triplex) 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 핵산이 프리즐드 관련 단백질 유전자 핵산임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 30항에 있어서, 화합물이 프리즐드 관련 단백질 유전자 생성물의 안타고니스트임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 화합물이 유전자 요법제임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 화합물이 단백질 요법제임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 30항에 있어서, 화합물이 Wnt 경로 성분 유전자의 레벨 또는 생활성을 증가시키는 작용제(agent)임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 30항에 있어서, 화합물이 돌연변이 프리즐드 관련 단백질 유전자 또는 유전자 생성물의 안타고니스트로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 화합물이 안티센스, 리보자임 또는 삼중나선 분자임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38항에 있어서, 화합물이 소분자, 펩티드 또는 펩티도미메틱임을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 38항에 있어서, 화합물이 항체임을 특징으로 하는 방법.
  42. a) 시험 화합물이 없는 경우 프리즐드 관련 단백질과 프리즐드 관련 단백질 결합 파트너가 상호작용할 수 있는 조건하에서, 프리즐드 관련 단백질 폴리펩티드 또는 이의 생활성 단편, 프리즐드 관련 단백질 결합 파트너 및 시험 화합물을 혼합하는 단계; 및
    b) 프리즐드 관련 단백질/프리즐드 관련 단백질 결합 파트너 복합체가 시험 화합물의 존재하에서 형성되는 정도를 검출하는 단계를 포함하여 프리즐드 관련 단백질 아고니스트(agonist) 또는 안타고니스트(antagonist)를 스크리닝하는 방법으로서, 시험 화합물의 존재하에서 형성된 복합체의 양이 시험 화합물의 부재하에서 형성된 양과 비교하여 증가한 것이 시험 화합물이 프리즐드 관련 단백질 아고니스트임을 나타내고, 시험 화합물의 존재하에서 형성된 복합체의 양이 시험 화합물의 부재하에서 형성된 양과 비교하여 감소한 것이 시험 화합물이 프리즐드 관련 단백질 안타고니스트임을 나타내는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 시험 화합물로부터 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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