MXPA02002624A - Composiciones farmaceuticas y metodos de uso de proteinas secretadas relacionadas con la familia "frizzled". - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y metodos farmaceuticos para usarse en la regulacion de las actividades formadoras de huesos de un mamifero de las SFRP (proteinas secretadas relacionadas con la familia "frizzled"). Las SFRP son receptores secretados para los Wnt que son factores importantes del crecimiento de polipeptidos que se conoce que regulan procesos biologicos fundamentales, tales como polaridad de tejidos, desarrollo embrionico y tumorigenesis. Se aisla una SFRP en celulas de osteoblastos humanos y se identifican como SFRP-1 (tambien conocidos como SARP-2) y muestran que se regulan por agentes osteogenicos en las celulas hOB en una manera selectiva diferente modulando la vida de los osteoblastos/preosteocitos.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE USO DE PROTEÍNAS SECRETADAS RELACIONADAS CON LA FAMILIA "FRIZZLED". Campo de la Invención. La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la actividad formadora de los huesos. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para regular la actividad formadora de los huesos con una proteina secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP) derivada de una linea celular de osteoblastos, porciones de los mismos, asi como anticuerpos y ácidos nucleicos incluyendo antisentido, basados en la misma. .Antecedentes de la Invención. El tema de la regulación de la formación de huesos y las enfermedades relacionadas con los huesos, ha ganado recientemente una atención considerable; por ejemplo, en el área de la salud de la mujer, ha habido un foco particular en la enfermedad de la osteoporosis, relacionada con los huesos. A lo largo de la vida, existe una remodelación constante del hueso esqueletal. En este proceso de remodelado, existe un balance frágil entre la formación de huesos por osteoblastos y la resorción posterior de huesos por osteoclastos. Como una parte normal del proceso de envejecimiento, la matriz de huesos se somete a diversos cambios Ref: 136577 estructurales, la naturaleza de los cuales permanece no completamente determinada. La mayoria de los estudios sobre cambios relacionados con la edad en el hueso humano, se han dirigido hacia la obtención de cambios en el hueso a un nivel morfológico o al comparar cuantitativamente las tasas de pérdida de hueso. La identificación de los mecanismos involucrados en las enfermedades de los huesos es crucial para el entendimiento de la fisiología de los huesos y las enfermedades de los huesos. Aunque se han identificado y clonado diversos genes y familias de genes y los polipéptidos que los codifican que participan en la regulación de las células de hueso, sus funciones no han sido claramente delineadas debido a las complejidades de las trayectorias de formación del hueso. LA FAMILIA DE GENES WNT. Un grupo de genes y las proteínas codificadas por ellos, que juegan un papel importante en la regulación del desarrollo celular, es la familia Wnt de glicoproteinas. Las proteínas Wnt son una familia de factores de crecimiento que consisten de más de una docena de moléculas estructuralmente relacionadas y se involucran en la regulación de procesos biológicos fundamentales como la apoptosis, embriogénesis, organogénesis, morfogénesis y tumorigénesis (revisión en Nusse y Varmus 1992 Cell 69: 1073-1087) . Estos polipéptidos son factores multipotentes y tienen actividades biológicas similares a otras proteínas secretoras como el factor de crecimiento transformante (TGF)-ß, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento de los nervios (NGF) y proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs) . Un miembro de la familia del factor de crecimiento Wnt denominado Wnt-x, se expresa preferiblemente en el tejido óseo y de células derivadas del hueso y parece estar involucrado en la conservación del fenotipo del osteoblasto maduro (célula formadora de hueso) (PCT/US94/14708 ; WO 95/17416) . LA FAMILIA DE PROTEÍNAS "FRIZZLED". Los estudios indican que ciertas proteínas Wnt interactúan con una familia de proteínas llamadas "frizzled" que actúan como receptores de las proteínas Wnt ó como componentes de un complejo receptor Wnt (revisado en Moon y colaboradores, 1997 Cell 88:725-728 y Barth y colaboradores, 1997 Curr. Opin. Cell Biol. 9: 683-690) . Las proteínas de la familia "frizzled" contienen una secuencia de señal en la terminal amino para la secreción, un dominio rico en cisteina (CRD) que se piensa se enlaza al Wnt, siete dominios de transmembrana supuestos que se asemejan a un receptor acoplado a una proteína G, y un término carboxilo citoplásmico . El descubrimiento de la primera proteina secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP) se reporta por Hoang y colaboradores en 1996 (J. Biol. Chem. 271:26131-26137) . Esta proteína, que se llama "Frzb" por la porción rizada en el desarrollo del hueso, se purifica y clona de extractos de cartílagos particulares de bovinos con base en su capacidad para estimular la actividad condrogénica in vivo en ratas. El homólogo humano del gen de bovino también se clonó. Sin embargo, a diferencia de las proteínas "frizzled", el Frzb no contiene un dominio de trasmembrana de serpentina. Así, este nuevo miembro de la familia "frizzled" parece ser un receptor secretado para el Wnt. El cADN del Frzb codifica una proteína 325 aa/36, 000 Daltones y que se expresa predominantemente en el esqueleto apendicular. El nivel más elevado de expresión está en el desarrollo de huesos largos y corresponde a los condroblastos epifisiales; la expresión declina después y desaparece hacia el centro de osificación. Los estudios recientes indican que las SFRP participan en la apoptosis y así, algunas SFRP se han identificado como "SARP" para las proteínas secretadas relacionadas con la apoptosis. Los miembros adicionales de la familia SFRP, se han identificado también recientemente y muestran ser antagonistas de la acción Wnt. Existen actualmente al menos cinco genes humanos conocidos SFRP/SARP: SFRP-l/FrzA/FRP-l/SARP-2, SFRP-2/SDF-5/SARP-1, SFRP-3/Frzb-l/FrzB/Fritz, SRFRP-4, y SFRP-5/SARP-3 (Leimeister y colaboradores, 1998 Mechanisms of Development 75:29-42, cuyas secuencias de esta referencia se incorporan en la presente) . Aunque el papel preciso que juegan las SARP/SFRP en la apoptosis no está todavía claro, estas proteínas parece que suprimen o aumentan el proceso programado de muerte celular. En resumen, existe una gran necesidad para la identificación definitiva de objetivos para el tratamiento de enfermedades del hueso, incluyendo enfermedades de resorción del hueso tales como la osteoporosis y para la regulación de la formación de hueso en humanos. Breve Descripción de la Invención. De conformidad con la presente invención, se proporcionan métodos y composiciones farmacéuticas para regular la actividad formadora del hueso en un mamífero, que comprende una proteína secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP) o una porción reguladora de la misma. Las composiciones adicionales de la presente invención, emplean anticuerpos formados a partir de tales proteínas o porciones de los mismos, y pueden emplear alternativamente ácidos nucleicos que codifican tales proteínas o porciones de las mismas, incluyendo secuencias antisentido. En una modalidad preferida, la SFRP es de células de osteoblasto humano. Las actividades formadoras del hueso reguladas por la composición de la presente invención incluyen la regulación del crecimiento del hueso y la densidad del hueso. La SFRP tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 2 que se obtiene por la expresión de la secuencia de polinucleótido establecida en la SEQ ID NO:l. En la modalidad más preferida, la SFRP es SFRP-1 (SEQ ID NO:2).

En otro aspecto, los métodos de la presente invención incluyen métodos para el tratamiento de un trastorno de los huesos en un mamífero, particularmente un humano, que comprende las etapas de administrar la composición farmacéutica arriba descrita. Como tal, los métodos para el tratamiento de una enfermedad del hueso incluyen, pero no se limitan, a las enfermedades que comprenden el grupo que consiste de (a) una enfermedad de formación del hueso, (b) una enfermedad de resorción del hueso y (c) una enfermedad de densidad del hueso. En otro aspecto de la invención, la enfermedad del hueso es una enfermedad degenerativa del hueso en donde la enfermedad degenerativa del hueso se selecciona del grupo que consiste de la neurodegeneración, miodegeneración y enfermedades de osteodegeneración. La enfermedad de osteodegeneración se selecciona del grupo que consiste de osteopenia, osteoartritis, osteoporosis. En una modalidad adicional, la invención incluye métodos para la identificación de compuestos de prueba que regulan la actividad SFRP. En el método, los compuestos que regulan la actividad formadora de los huesos en un mamífero, se ensayan al incubar primero una muestra que comprende una SRFP en un medio de prueba que contiene el compuesto de prueba. La siguiente etapa es la determinación de la actividad SFRP, en donde un incremento en la actividad con relación a la SFRP sola, indica que el compuesto es un activador de la SFRP y una disminución en la actividad indica que el compuesto es un inhibidor de la SFRP. En una modalidad adicional, la invención incluye métodos de modulación de la señalización mediada por la Wnt en una célula, que comprende poner en contacto la célula con la SFRP arriba descrita, en donde se regula la actividad Wnt. La presente invención se refiere adicionalmente, a un método para facilitar la formación de hueso o reparar un cultivo de células de hueso, que comprende aislar las células de un cultivo de hueso, introducir un constructo recombinante que expresa la SFRP que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 2, y regresar las células dentro del cultivo de hueso. Preferiblemente, el constructo expresa una secuencia antisentido para una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una porción de la proteína SFRP. Otra modalidad se refiere a una sonda de polinucleótido capaz de hibridizarse con el polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO:l. Tal sonda se usa en un proceso de diagnóstico para la detección de un polinucleótido SFRP en una muestra derivada de un huésped mamífero, que comprende la detección de la presencia o ausencia de la SFRP en la muestra. Breve Descripción de los Dibujos. La Figura 1 muestra los resultados RADE osteogénicos que conducen al descubrimiento del cADN de la proteína secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP) del osteoblasto humano (hOB) . La figura muestra autoradiogramas de geles de una reacción en cadena de la polimerasa de despliegue diferencial (DD-PCR) a partir de los experimentos llevados a cabo con tres líneas celulares hOB (hOB-03-C5, hOB-03-CE6 y hOB-01-Cl) en tres diferentes etapas de diferenciación (etapa proliferativa, etapa de maduración, y pre-osteocítica) . La flecha señala 276 pares base (bp) del fragmento de genes hOB SFRP (esto es, el fragmento RADE) que está sobre-regulado por el tratamiento PGE2 dentro de la células hOB-03-C5 y hOB-03-CE6, pero esta sub-regulado por el tratamiento con TGF-ßl de las células hOB-01-Cl. Se puede observar también que las células hOB-01-Cl expresan altos niveles básales de este gen. Una herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) , busca este fragmento de gen contra las bases de datos públicas indicando que este cADN es homólogo con la SFRP-1 de ratón y los genes FrzA de bovino . La Figura 2 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de un poli A + ARN aislado de las células hOB-03-C5 después del tratamiento con el control, PTH, PGE2, y TGF-ßl durante 24 horas. En este experimento, el fragmento de gen hOB SFRP RADE extirpado y un cADN de la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa clonada (GAPDH) , se usaron como sondas. La flecha señala al mARN hOB SFRP (-4.4 kb) que está completamente sobre-regulado por el tratamiento con las células PGE2. La Figura 3 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de un poli A + ARN aislado de células hOB-03-C5 después del tratamiento con el control, PGE2 y TGF-ßl durante 24 horas. En este experimento, el fragmento de gen clonado hOB SFRP RADE y un cADN de GAPDH clonado se usaron como sondas. Una vez más nuevamente, el mARN de hOB SFRP se sobre-regula completamente por el tratamiento de las células con PGE2. La Figura 4 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de poli A + ARN aislado de células hOB-03-CE6 ó hOB-01-Cl después del tratamiento con el control, PTH, PGE2, y TGF-ßl durante 24 horas. En este experimento, el fragmento de gen RADE extirpado hOB SFRP y un cADN clonado del GAPDH se usan como sondas. La flecha señala al mARN de hOB SFRP que está completamente sobre-regulado por el tratamiento de la célula hOB-03-CE6 con PGE2, pero está sub-regulado por el tratamiento de las células hBO-01-C1 con PTH. También se pueden observar que las células hOB-01-Cl expresan altos niveles básales del mARN . La Figura 5 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de poli A + ARN aislado de las células hOB-01-Cl después de tratamiento con el control y TGF-ßl durante 24 horas. En este experimento, se usaron como sondas tanto el cADN hOB SFRP clonado de longitud completa (1.1 kb) y un cADN de beta-Actina clonados. Los resultados muestran que el mARN del hOB SFRP está sub-regulado por el tratamiento de las células con TGF-ßl. Una vez nuevamente, se pueden también observar que las células hOB-01-Cl expresan altos niveles básales del mARN.

La Figura 6 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de poli A + ARN aislado de 23 diferentes tejidos humanos. En este experimento, el fragmento de gen RADE hOB SFRP extirpado y el cADN clonado de beta-Actina se usaron como sondas. La flecha señala el mARN de hOB SFRP que es altamente expresado con el corazón y el riñon, moderadamente expresado en la placenta y útero, expresado a niveles inferiores en el cerebro, páncreas y otros tejidos, pero no expresado en el timo y en los linfocitos. La Figura 7 muestra un autoradiograma de un manchado Northern de poli A + ARN aislado de células similares al osteoblasto de osteosarcoma humano SaOS-2 y cultivos de tejidos separados de osteoblastos humanos normales (hOB) después del tratamiento con el control, PTH, PGE2 y TGF-ßl durante 24 horas. En este experimento, se usaron como sondas tanto el cADN hOB SFRP clonado de longitud completa como el cADN clonado de GAPDH. Los resultados muestran que las células SaOS-2 expresan niveles básales inferiores de mARN hOB SFRP que no se regulan por estos agentes. En contraste, las células hOB expresan niveles moderados de este mensaje que se sobre-regula con el tratamiento con PGE2. El análisis RT-PCR cuantitativo TaqMan de las células hOB tratadas con PGE2, indican que el mensaje de la SFRP sobre-regulada con PGE2 se nivela 10 veces. La Figura 8 muestra un autoradiograma de un manchado Southern de productos de la transcriptasa inversa (RT)-PCR de un ARN aislado de placenta humana o de células hOb-03-CE6 después del tratamiento con el control PGE2 durante 24 horas. La RT-PCR se lleva a cabo con cebadores de oligonucleótidos que son específicos para FRP-l/SARP-2 humanas, y el manchado Southern se hibridiza como una sonda interna de oligonucleótidos específica para el FRP-l/SARP-2 humano. El tamaño esperado para este producto RT-PCR fue de 1.1 kb. Los resultados muestran que (como se espera) la placenta expresa mARN FRP-l/SARP-2, y que el tratamiento con PGE2 de las células hOB-03-CE6 sobre-regula fuertemente la expresión de este mensaje. La Figura 9 muestra los resultados del experimento de viabilidad celular con las células hOB-03-C5, hOB-03-CE6 y hOB-01-Cl usando el contador de células Coulter. Los resultados se presentan como el porcentaje relativo en el control del día 0 (esto es, alrededor de 200,000 células por pozo de una placa de 6 pozos) . Los resultados de este experimento indican que las células hOB-03-C5 proliferan lentamente a 39°C en un medio que contiene suero, mientras que las células hOB-03-CE6 detienen la división pero son viables para la incubación de 6 días.

En contraste, las células hOB-01-Cl se someten a una muerte celular acelerada, que se correlaciona con la expresión basal elevada de mARN de hOB SFR.P en esta célula. . La Figura 10 muestra los resultados del experimento de viabilidad celular con las células hOB-03-C5 (Figura 10A) , células hOB-03-CE6 (Figura 10B) y células hOB-01-Cl (Figura 10C) usando el contador de células Coulter. Para estos experimentos, las células se trataron con el control PGE2 (paneles A y B) o el control y TGF-ßl (panel C) en un medio libre de suero a 39°C durante 3 ó 6 días. Los resultados se presentan como el % relativo al control en el día 0 (esto es, alrededor de 200, 000 células por pozo de una placa de 6 pozos) . Los resultados de este experimento indican que la viabilidad de la célula hOB declina con el tiempo en un medio libre de suero. Además, para las células hOB-03-C5 y hOB-03-CE6, esta velocidad de declinación se acelera por el tratamiento con PGE2. Esta velocidad enriquecida de muerte celular se correlaciona con la sobre-regulación de los niveles de ARN hOB SFRP en estas células que siguen al tratamiento de PGE2. En contraste, el tratamiento de la célula hOB-01-C1 con TGF-ßl, que sub-regula los niveles de mensaje de hOB SFRP, incrementa la viabilidad celular.

La Figura 11 muestra que el tratamiento de las células hOB-03-C5 con PGE2 induce la apoptosis o la muerte celular programada. La apoptosis se mide por citometría de flujo usando la anexina V-FITC. La Figura HA muestra que el número de células viables, que no se tiñen con anexina V o yoduro de propidio (un tinte para las células necróticas) , declina con concentraciones crecientes de PGE2. En contraste, la figura 11B muestra que el número de células apoptóticas, que tiñen la anexina V pero no al yoduro de propidio, se incrementa con concentraciones crecientes de PGE2. Similarmente, la figura 11C muestra que el número de células necróticas, que se tiñen con anexina V y yoduro de propidio se incrementa con concentraciones crecientes de PGE2. La Figura 12 muestra los resultados de otros experimentos de viabilidad celular con las células hOB-03-C5 (Figura 12A) y hOB-03-CE6 (Figura 12B) usando el contador de células Coulter. Estos experimentos se llevaron a cabo de una forma similar con aquellos detallados en la Figura 10. Sin embargo, para estos experimentos, las células se co-trataron con un control vehículo (esto es, 0.1% de etanol) ó PGE2 en ausencia o presencia de oligonucleótidos de fosforotioato dirigidos al sitio de iniciación de anti-sentido o sentido (control), para la SARP-2 humana. Los resultados se presentan como un % relativo al control del día 0 (esto es, alrededor de 200,000 células por pozo de una placa de 6 pozos) o como el % relativo al control tratado con el vehículo. Los resultados de este experimento indican que el co-tratamiento de las células hOB con el oligonucleótido anti-sentido para el SARP-2, invierte la capacidad del PGE2 para acelerar la velocidad de la muerte celular, mientras que el co-tratamiento con el oligonucleótido de sentido (control) como que no afecta en este proceso. La Figura 13A muestra los resultados de un experimento de viabilidad celular con las células hOB-01-Cl-PS-09 usando el contador de células Coulter. Para estos experimentos, se transfectaron establemente la células con cADN de hOB SFRP (esto es, SFRP-1/FRP-l/SARP- 2) , plásmido de expresión mamífero o el vector vacío (esto es, pcADN3.1). Los resultados se presentan como el % de células de control del día 0. Los resultados de este experimento indican que la sobre-expresión del hOB SFRP/SFRP-l/FRP-l/SARP-2 por las células hOB, aceleran la velocidad de la muerte celular cuando se comparan con el vector vacío que no tiene efecto en este proceso. La Figura 13B muestra el resultado de la hibridación Northern de un poli A + ARN aislado de las células de vector vacías (V) o de las células sobre-expresantes SARP-2 (S) . Este análisis demuestra que las células SARP-2 expresan substancialmente más mARN SFRP-l/FRP-l/SARP-2 que las células de vector. La Figura 14 muestra los resultados de otro experimento de viabilidad celular llevado a cabo con el vector vacío que expresa células hOB-01-Cl-PS-09 (pcADN3.1) y sub-clon de las células que sobre-expresan SFRP-l/FRP-l/SARP-2 (SARP-2 clon #1) . La Figura 14A muestra los resultados de un análisis RT-PCR cuantitativo TaqMan de ARN aislado de la células. Este análisis indica que las células SARP-2 Clon #1 expresan de 50-60 veces más mARN humano SFRP-l/FRP-l/SARP-2 que las células que expresan el vector vacío. Similarmente como se muestra en la figura 14B, las células SARP-2 del clon #1 mueren a una velocidad que es 3 veces más rápida que las células de control del vector vacío que usan el contador de células Coulter para medir el número de células. La Figura 15 es un autoradiograma de un manchado Western de extractos de células enteras aislados de células hOB-03-CE6 tratados con el control ó PGE2 durante 24 horas. El inmunomanchado se preparó en sondas con un anticuerpo monoclonal ß-catenina, que tiene un peso molecular de 92,000. Los resultados muestran que el tratamiento de las células hOB con PGE2, sub-regula los niveles de ß-catenina, que es consistente con el antagonismo de la trayectoria de señalización Wnt por hOB SFRP/SFRP-l/FRP-l/SARP-2. La Figura 16 muestra los resultados de un experimento de transfección transitorio con la células hBO-01-Cl-PS-09 (Figura 16A) y hBO-02-Cl-PS-02 (Figura 16B) . Los resultados muestran que la transfección del SARP-2 humano [h] de rata [r] o los plásmidos de expresión humano Frzb-1 sub-regulan la señalización Wnt (cuando se , comparan al control del vector vacío pcADN 3.1) en las células hOB como se miden por el ensayo del gen reportero TCF-luciferasa. Este ensayo es una medida auténtica de la señalización Wnt y la actividad nuclear de la ß-catenina. La Figura 17 resume un paradigma de separación por exclusión para agentes anabólicos del hueso usando las células hOB y hOB SFRP/SFRP-l/FRP-l/SARP-2. Este paradigma de separación por exclusión, identificaría compuestos que regulan la función SFRP-l/FRP-l/SARP-2. La Figura 18 detalla un ejemplo de un ensayo de separación por exclusión de alta producción (HTS) para los compuestos que inhiben la función SFRP-l/FRP-l/SARP-2 en células osteoblásticas/osteocíticas . Los resultados muestran que las células hOB-01-PS-09 que sobre-expresan SFRP-l/FRP-l/S.ARP-2 (células S.ARP-2 #1) mueren más rápido que las células que expresan el vector vacío (pcADN3.1) usando el ensayo de fluorescencia de ADN CyQuant. Además, un anti-suero de anti-péptidos para la SFRP-l/FRP-l/SARP-2 (SARP-2 AS), bloquea la muerte celular provocada por la sobre-expresión de este gen. La Figura 19 explica la estrategia que se usa para crear ratones agénicos SFRP-l/SARP-2. El exón 1 del gen de ratón SFRP-l/SARP-2, que codifica al dominio completo rico en cisteína (CRD) se reemplaza con el cásete de expresión para la ß-galactosidasa y la resistencia a la neomicina. Lá Figura 20 detalla un manchado Northern del poli A + ARN aislado de riñones de hembra y macho obtenidos de ratones SRFP-1 agénicos (KO) y de tipo silvestre (WT) . Este manchado muestra que los riñones WT expresan altos niveles mARN de SRFP-1 (4.4 kb) , mientras que aquellos riñones KO no expresan este gen. La Figura 21' muestra los resultados de un análisis de tomografía micro-computarizada (micro-CT) de fémures obtenidos de ratones SRFP-1 agénicos (-/-) y de tipo silvestre (+/+) de hembras (figura 21B) y machos (Figura 21A) . Cuando se comparan con los ratones de control +/+, los datos demuestran que los ratones -/- muestran parámetros crecientes de la formación de hueso (esto es, BV/TV, Tb. Th., Conn. Den., Tb. ?. y Tb. Sp . ) como se determina por este método.

La Figura 22 es un conjunto de gráficas que muestran Figura 22A la proliferación celular de las células hOB, Figura 22B la capacidad/enriquecimiento en células hOB para el tratamiento con la vitamina D3- para sobre-regular la actividad de la fosfatasa alcalina a 39°C, y Figura 22C la incapacidad de la vitamina D3 para inducir la secreción de osteocalcina de células hOB a 3 °C, como se detalla en el Ejemplo A. La Figura 23 detalla los resultados del Ejemplo A con referencia a la expresión de la expresión del mARN del receptor PTH-1; en donde la incubación de las células hOB durante 48 horas a 39°C, incrementa los niveles de mensaje en régimen permanente para el receptor PTH-1 por 7 veces cuando se compara a las células mantenidas a 34°C. La Figura 24 detalla los resultados del Ejemplo A para el efecto en el monofosfato de adenosina cíclico intracelular (cAMP) en respuesta a concentraciones crecientes de PTH 1-34 en las células hOB. La Figura 25 es una gráfica que detalla el efecto de las células hOB cuando se tratan con el glucocorticoide sintético de dexametasona, lo cual sobre-regula la actividad de la fosfatasa alcalina como se detalla en el Ejemplo A.

La Figura 26 detalla los resultados de experimentos sobre el efecto de la estimulación mecanosensorial en células hOB pre-osteocíticas, cuando se someten a una Unidad de Cepa Flexerall. Descripción Detallada de la Invención. La presente invención se refiere a un gen cuya expresión se regula por agentes osteogénicos o formadores de hueso en tres diferentes líneas celulares de osteoblastos humanos (hOB) in vitro. En un aspecto de la presente invención, la expresión de este gen se sobre-regula durante la diferenciación hOB, sugiriendo que se puede involucrar en el proceso de formación del hueso. El análisis de secuencias de ADN indica que este fragmento de gen comparte una identidad de secuencia importante con un cADN de ratón denominado proteína secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP)-l (Rattner y colaboradores, 1997 Proc, Nati. Acad. Sci. USA 94: 2859-2863) . La posterior clonación del cADN y el análisis adicional de secuencias indican que este gen, que se refiere como hOB SFRP, es idéntico al FRP-l/SARP-2 humano (Finch y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 6770-6775; Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641). La caracterización del hOB SFRP contempla su uso como un fármaco objetivo novedoso osteoporótico y en una separación por exclusión novedosa de fármaco para identificar agentes anabólicos - ii del hueso. Definiciones . El término "formación de huesos" es el proceso de síntesis y mineralización de los huesos. La célula de osteoblastos modula el proceso. El término "crecimiento del hueso" es el proceso de expansión esquelética. Este proceso sucede por una de dos formas: (1) la formación de huesos intramembranosa aparece directamente de las células de la medula ósea o mesenquimal; (2) la formación de huesos longitudinal o endiquindual aparece en donde el hueso forma cartílago. El término "osteogénesis" es un sinónimo del término formación del hueso, arriba mencionado. Los términos "proteínas secretadas relacionadas con la familia "frizzled"" ó "SFRP" es un receptor secretado de la trayectoria de señalización Wnt y muestra diversas características que lo hacen una herramienta útil para el estudio del crecimiento y diferenciación celular. La familia de genes similar a la familia "frizzled" codifica proteínas de membrana celular que tienen dominios de transmembrana con funciones desconocidas. Los términos "proteína secretada relacionada con la apoptosis" ó "SARP" son sinónimos con el término proteínas secretadas relacionadas con la familia "frizzled" ó SFRP arriba definidas. Los términos "proteínas", "péptidos" y "polipéptidos", se usan intercambiablemente y pretenden incluir moléculas SFRP producidas recombinantemente y purificadas que contienen aminoácidos acoplados linealmente a través de los enlaces péptidos. Los aminoácidos de esta invención pueden estar en la forma L ó D con tal de que se conserve la actividad biológica del polipéptido. Las proteínas SFRP de esta invención pueden también incluir proteínas que se modifican post-traduccionalmente por reacciones que incluyen glicosilación, acetilación y fosforilación. Tales polipéptidos también incluyen análogos, alelos y variantes alélicas que pueden contener derivados de aminoácidos o porciones no de aminoácidos que no afectan la actividad biológica funcional de la proteína SFRP en comparación con las proteínas que se presentan naturalmente o de tipo silvestre. El término aminoácido se refiere a los aminoácidos que se presentan naturalmente y sus derivados, tales como TyrMe y PheCl, así como otras porciones caracterizadas por la presencia de un grupo carboxilo disponible y un grupo amina. Las porciones que no son de los aminoácidos que se pueden contener en tales polipéptidos incluyen, por ejemplo, estructuras imitadoras de aminoácidos. Las estructuras imitadoras son aquellas estructuras que muestran sustancialmente el mismo arreglo espacial de los grupos funcionales que los aminoácidos, pero que no necesariamente tienen los grupos carboxilo y amino característicos de los aminoácidos. Las "muteínas" son proteínas o polipéptidos SFRP que tienen cambios menores en la secuencia de aminoácidos, provocados por ejemplo, por mutagénesis específica del sitio u otras manipulaciones; por errores en la transcripción o traducción; o que se preparan sintéticamente por diseño racional. Estas alteraciones menores resultan en secuencias de aminoácidos en donde la actividad biológica de la proteína o el polipéptido se altera en comparación a la proteína o polipéptido que se presenta naturalmente o de tipo silvestre. Ejemplos de las muteínas incluyen la SFRP-1 de la SEQ ID NO: 2 descrita en la presente. Como se usa en la presente, el término "hidrofóbico" pretende incluir aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, imitaciones de aminoácidos y porciones químicas que no son polares. Los aminoácidos hidrofóbicos incluyen Phe, Val, Trp, lie, y Leu. Como se usa en la presente, el término "aminoácido cargado positivamente" • se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, imitaciones de aminoácidos y porciones químicas que están cargadas positivamente. Los aminoácidos cargados positivamente incluyen por ejemplo Lys, Arg e His. "Purificado" cuando se refiere a una proteína o polipéptido SFRP, se diferencia de las proteínas o polipéptidos que se presentan naturalmente o nativos ya que existen en un estado purificado. Estas proteínas o polipéptidos de SFRP "purificadas", o cualquiera de las variaciones pretendidas como se describen aquí, deben significar que el compuesto o molécula está sustancialmente libre de contaminantes, asociados normalmente con el compuesto en su ambiente natural ó nativo. Los términos "sustancialmente puro" y "aislados" no pretender excluir mezclas de polinucleótidos o polipéptidos con sustancias que no se asocian con los polinucleótidos o polipéptidos en la naturaleza. Los polipéptidos, proteínas o moléculas de ácido nucleico SFRP "nativos" se refieren a aquellas SFRP recuperadas de una fuente que se presenta en la naturaleza o de "tipo silvestre". Una "composición" pretende significar una combinación de agente activo, esto es, las SFRP de la presente invención y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta detectable) o activo, tal como un adyuvante. Una "composición farmacéutica" pretende incluir la combinación de SFRP, particularmente SFRP-1 como el agente activo con un portador, inerte ó activo, haciendo a la composición apropiada para uso diagnóstico ó terapéutico in vitro, in vivo ó ex vivo. Como se usa aquí, el término "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina amortiguadora de fosfato, agua y emulsiones, tales como una emulsión agua/aceite ó aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Las composiciones pueden también incluir estabilizadores y conservadores. Para ejemplos de estabilizadores, portadores y adyuvantes, ver Martin, Remington's Pharm. Sci., ,15a Ed. (Mack Publ. Co . , Easton (1975). El término "ácido nucleico" como se refiere a las SFRP aquí descritas, significa ADN de hebra simple y doble, cADN, ADN derivado del genoma y ARN, asi como las hebras positivas y negativas del ácido nucleico que son complementos una de la otra, incluyendo el ARN antisentido. Una "molécula de ácido nucleico" es un término que se usa intercambiablemente con "polinucleótidos" y cada uno se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótido o desoxiribonucleótidos, o análogos de los mismos. También incluye tipos de modificaciones, por ejemplo etiquetas que se conocen en el arte (por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) infra.), metilación, "cierres", sustitución de uno ó más de los nucleótidos que se presentan naturalmente con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metil carbamato, etc) , aquellos que contienen porciones colgantes, tales como por ejemplo, proteínas (incluyendo, por ejemplo, nucleasa, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, etc) , aquellos con intercaladores (por ejemplo acridina, psolaren, etc) , aquellos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc) , aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido. El polinucleótido puede modificarse químicamente ó bioquímicamente, o contener bases de nucleótidos derivadas o no naturales. Los nucleótidos pueden ser complementarios al mARN que codifica a los polipéptidos. Estos nucleótidos complementarios incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos capaces de formar hélices triples y nucleótidos antí-sentidos . Los polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias diferentes a las que no se presentan naturalmente, se proporcionan también por esta invención, así como lo son las alteraciones de las secuencias de polipéptidos de tipo silvestre, incluyendo, pero no limitándose a, aquellas debidas a la eliminación, inserción, sustitución de uno o más nucleótidos o por fusión a otras secuencias de nucleótidos . Un polinucleótido SFRP se dice que "codifica" un polipéptido de SFRP si, en su estado nativo o cuando se manipula por métodos bien conocidos por aquellos con habilidad en el arte, se puede transcribir y/o traducir para producir un polipéptido o una proteína madura. Así, el término polinucleótido debe incluir, además de las secuencias codificadoras, secuencias de procesamiento y otras secuencias que no codifican a los aminoácidos de la proteína madura. La hebra anti-sentido de tal polinucleótido también codifica la secuencia. El término polinucleótido "recombinante" o ADN, se refiere a un polinucleótido que se hace por la combinación de dos segmentos de otra formas separados de la secuencia que se logra por la manipulación artificial de segmentos aislados de ADN por técnicas de ingeniería genética o por síntesis química. Al hacerlo así, se pueden unir segmentos conjuntos de ADN de las funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones . Un "análogo" de un ADN, ARN ó un polinucleótido de SFRP, se refiere a una macromolécula que se parece a los polinucleótidos que se presentan naturalmente en forma y o funciones (particularmente en la capacidad de acoplarse en un enlace hidrógeno específico de la secuencia a pares base sobre una secuencia complementaria de polinucleótidos) , pero que difiere del ADN ó el ARN en, por ejemplo, la posesión de una base no usual o no natural o una estructura alterada. Ver por ejemplo Uhlmann y colaboradores, (1990) Chemical Reviews 90:543-584. "Aislado" cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico de SFRP, significa separada de otros componentes celulares que se asocian normalmente intracelularmente con el ADN o el ARN de SFRP de tipo silvestre o nativo. "Hibridación" se refiere a reacciones de hibridación que se pueden llevar a cabo bajo condiciones de "severidad" diferentes. Las condiciones que incrementan la severidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en el arte: ver por ejemplo Sambrook y colaboradores, infra. Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de severidad creciente): temperaturas de incubación de 25°C, 37°C, 50°C, y 68°C; concentraciones de solución amortiguadora de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 X SSC, 0.1 x SSC (en donde SSC es 0.15 M NaCl y solución amortiguadora de citrato 15 mM) y su equivalente usando otro sistema de solución amortiguadora; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50% y 75%, tiempos de incubación desde 5 minutos hasta 24 horas y lavados de duración creciente, frecuencia creciente ó concentraciones amortiguadoras decrecientes. "Tm" es la temperatura de grados centígrados a la cual el 50% del dúplex de polinucleótidos se hace de hebras complementarias enlazadas por hidrógeno en una dirección antiparalela por disociados de apareamiento de bases Watson-Crick dentro de hebras simples bajo las condiciones del experimento. Tm se puede predecir según la formula estándar, por ejemplo: Tm=81.5 + 16.6 log [Na+] + 0.41 (%G/C)- 0.61 (%F)- 600/1 en donde Na + es la concentración del catión (usualmente ion de sodio) en mol/L; (%G/C) es el número de residuos G y C como un porcentaje de los residuos totales en el dúplex; (%F) es el porcentaje de formamida en la solución (peso/volumen) ; y L es el número de nucleótidos en cada hebra del dúplex. Un "dúplex estable" de polinucleótidos ó un • "complejo estable" formado entre cualquiera de dos o más componentes en una reacción bioquímica, se refiere a un dúplex o complejo que es lo suficientemente duradero para persistir entre la formación del dúplex o complejo y su detección posterior. El dúplex o complejo puede ser capaz de soportar cualquier condición que exista o se introduce en el momento de la formación y el momento de la detección, estas condiciones son una función del ensayo o reacción que se está llevando a cabo. Las condiciones de intervención que pueden estar opcionalmente presentes y que pueden desalojar un dúplex o complejo incluyen lavado, calentamiento, solutos o solventes adicionales agregados a la mezcla de reacción (tal como desnaturalizantes) , y la competencia con especies de reacción adicionales. Los dúplex o complejos estables pueden ser reversibles o irreversibles, pero deben satisfacer otros requerimientos de esta definición. Así, un complejo transitorio se puede formar en una mezcla de reacción, pero no constituye un complejo estable si se disocia espontáneamente o como resultado de una condición o manipulación recientemente impuesta introducida antes de la detección. Cuando los dúplex estables forman una configuración antiparalela entre los dos polinucleótidos de hebra simple, particularmente bajo condiciones de alta severidad, la hebras son esencialmente "complementarias".

Un polinucleótido de hebra doble puede ser "complementario" con otro polinucleótido, si un dúplex estable se puede formar entre una de las hebras del primer polinucleótido y el segundo. Una secuencia complementaria predicha de la secuencia de polinucleótido de hebra simple es la secuencia óptima de nucleótidos estándar esperada para formar el enlace de hidrógeno con el polinucleótido de hebra simple según las reglas de apareamiento de bases generalmente aceptadas. Una hebra "sentido" y una hebra "antisentido", cuando se usan en el mismo contexto, se refieren a polinucleótidos SFRP de hebra simple que son complementarios uno con el otro. Estas pueden ser hebras opuestas de un polinucleótido de hebra doble, o una hebra puede predecirse de otra de conformidad con las reglas generalmente aceptadas de apareamientos de base. A menos que se especifique o implique de otra manera, la asignación de otra hebra como "sentido" ó "antisentido" es arbitraria. Una secuencia lineal de nucleótidos SFRP es "idéntica" a otra secuencia lineal, si el orden de los nucleótidos en cada secuencia es el mismo, y sucede sin sustitución, eliminación, o sustitución material. Se entiende que las bases nitrogenosas como de purina y pirimidina con estructura similares, pueden ser funcionalmente equivalente en términos del apareamiento de bases de Watson-Crick; y la inter-sustitución de bases nitrogenosas similares, particularmente de uracil y timina, o la modificación de las bases nitrogenosas, tales como por metilación, no constituye una substitución de material. Un polinucleótido de ARN y de ADN tiene secuencias idénticas cuando la secuencia para el ARN refleja el orden de las bases nitrogenosas en el poliribonucleótido, la secuencia para el ADN refleja el orden de las bases nitrogenosas en el polidesoxiribonucleótido y las dos secuencias satisfacen el otro requerimiento de esta definición. En donde al menos una de las secuencias es un oligonucleótido degenerado que comprende un residuo ambiguo, las dos secuencias son idénticas y al menos una de las formas alternas del oligonucleótido degenerado es idéntica con la secuencia con la cual se compara. Por ejemplo, AYAAA (SEQ ID NO: 3) es idéntica a ATAAA (SEQ ID NO: 4), si AYAAA (SEQ ID NO: 5), es una mezcla de ATAAA (SEQ ID NO: 6) y ACAAA (SEQ ID NO : 7 ) . Cuando se hace la comparación entre los polinucleótidos, se entiende implícitamente que las hebras complementarias se generan fácilmente, y la hebra de sentido ó de antisentido se selecciona o predice para maximizar el grado de identidad entre los polinucleótidos que se comparan. Por ejemplo, en donde se compara uno o ambos polinucleótidos y son de hebra doble, las secuencias son idénticas si una hebra del primer polinucleótido es idéntica con una hebra del segundo polinucleótido. Similarmente, cuando se describe una sonda de polinucleótido como idéntica a su objetivo, se entiende que es la hebra complementaria del objetivo que participa en la reacción de hibridación entre la sonda y el objetivo. Una secuencia lineal de nucleótidos, es "esencialmente idéntica" o el "equivalente" a otra secuencia lineal, si ambas secuencias son capaces de hibridizarse para formar dúplex con el mismo polinucleótido complementario. Se debe entender, aunque no siempre se afirma explícitamente, que los solicitantes se refieren a una molécula específica de ácido nucleico, sus equivalentes también se pretenden. Son más preferidas las secuencias que hibridizan bajo condiciones de mayor severidad. Se entiende que las reacciones de hibridación pueden acomodar inserciones, eliminaciones y sustituciones en la secuencia de nucleótidos. Así, las secuencias lineales de nucleótidos pueden ser esencialmente idénticas, aun si alguno de los residuos de nucleótidos no corresponde o se alinea precisamente. Las secuencias que corresponden o se alinean más cercanamente a la invención aquí descrita son comparablemente más preferidas. Generalmente, una región de polinucleótido de alrededor de 25 residuos es esencialmente idéntica a otra región, si las secuencias son de al menos alrededor de 80% idénticas; más preferiblemente, son al menos alrededor de 90% idénticas; más preferiblemente, son al menos alrededor de 95% idénticas; y todavía más preferiblemente, las secuencias son 100% idénticas. Una región de polinucleótidos de 40 residuos o más, será esencialmente idéntica con otra región después de la alineación de porciones homologas si las secuencias son al menos alrededor de 75% idénticas; más preferiblemente son al menos 80% idénticas; más preferiblemente, son al menos alrededor de 85% idénticas; aun más preferiblemente son al menos alrededor de 90% idénticas; todavia más preferiblemente, las secuencias son 100% idénticas. Al determinar si las secuencias de polinucleótidos son esencialmente idénticas, se prefiere particularmente una secuencia que conserve la funcionalidad de polinucleótido al cual se compara. La funcionalidad se puede determinar por parámetros diferentes. Por ejemplo, si el polinucleótido se va usar en reacciones que involucran la hibridación con otro polinucleótido, entonces las secuencias preferidas son aquellas que hibridizan al mismo objetivo bajo condiciones similares.

En general, la Tm de un dúplex de ADN disminuye por alrededor de 10 °C por cada 1% de disminución en la identidad de secuencia para dúplex de 200 o más residuos; o por alrededor de 50 °C para dúplex de menos de 40 residuos, dependiendo de la posición de los residuos no correspondientes (ver, por ejemplo, Meinkoth y colaboradores) . Las secuencias esencialmente idénticas o equivalentes de alrededor de 100 residuos formarán generalmente un dúplex estable con cada secuencia complementaria respectiva de la otra, a alrededor de 20 °C menos que la Tm; preferiblemente, formarán un dúplex estable a alrededor de 15 °C menos; más preferiblemente, formarán un dúplex estable a alrededor de 10 °C menos; aún más preferiblemente, formarán un dúplex estable a alrededor de 5°C menos; todavía más preferiblemente formaran un dúplex estable a alrededor de la Tm. En otro ejemplo, si el polipéptido codificado por el polinucleótido es una parte importante de su funcionalidad, entonces las secuencias preferidas son aquellas que codifican polipéptidos idénticos o esencialmente idénticos. Así, las diferencias de nucleótidos que provocan una sustitución conservadora de aminoácidos se prefieren sobre aquellas que pueden provocar una sustitución no conservadora de aminoácidos y " se prefieren sobre aquellas que provocan una sustitución no conservadora, son más preferidas las diferencias de nucleótidos que no alteran la secuencia de aminoácidos, aunque son todavía más preferidos los nucleótidos idénticos. Las inserciones o eliminaciones en el polinucleótido que resultan en inserciones o eliminaciones en el polipéptido, se prefieren sobre aquellas que resultan en regiones codificadoras en la dirección 3' que salen de fase, son todavía más preferidas las secuencias de polinucleótidos que no comprenden inserciones o eliminaciones. La importancia relativa de las propiedades de hibridación y la secuencia codificada de polipéptidos de un polinucleótido, depende de la aplicación de la invención. Un polinucleótido tiene las mismas características o es el equivalente de otro polinucleótido si ambos pueden formar un dúplex estable con un tercer polinucleótido particular bajo condiciones similares de severidad máxima. Preferiblemente, además de las propiedades similares de hibridación, los polinucleótidos también codifican polipéptidos esencialmente idénticos. Los residuos "conservados" de una secuencia de polinucleótidos son aquellos residuos que se presentan sin alteración en la misma posición de dos o más secuencias relacionadas que se comparan. Los residuos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre las secuencias más relacionadas que los residuos que aparecen en otro lado en la secuencia. Polinucleótidos "relacionados" que comparten una proporción importante de residuos idénticos. Como se usa aquí, una secuencia de oligonucleótido "degenerado" es una secuencia designada derivada de al menos dos secuencias de polinucleótido originarias relacionadas como sigue: los residuos que se conservan en las secuencias originarias se conservan en la secuencia degenerada, mientras que los residuos que no se conservan en la secuencias originarias se pueden suministrar como diversas alternativas en la secuencia degenerada. Por ejemplo, la secuencia degenerada AYASA (SEQ ID NO: 8) se puede asignar de secuencias originarias ATACA (SEQ ID NO: 9) y ACAGA (SEQ ID NO: 10), en donde Y es C ó T y S es C ó G. Y y S son ejemplos de residuos "ambiguos". Un segmento degenerado es un segmento de un polinucleótido que contiene una secuencia degenerada. Se entiende que un oligonucleótido sintético que comprende una secuencia degenerada, es de hecho una mezcla de oligonucleótido cercanamente relacionado que comparte una secuencia idéntica, excepto en las posiciones ambiguas. Tal oligonucleótido se sintetiza usualmente como una mezcla de todas las combinaciones posibles de nucleótidos en las posiciones ambiguas. Cada uno de los oligonucleótidos en la mezcla se refiere como una "forma alternativa". Un "fragmento" o "inserto" de polinucleótido como se usa aquí, representa generalmente una sub-región de una forma de longitud completa, pero también se puede incluir el polinucleótido completo de longitud completa. Diferentes polinucleótidos "corresponden" uno con el otro si uno se deriva finalmente de otro. Por ejemplo, el ARN mensajero corresponde al gen del cual se transcribe. El cADN corresponde al ARN del cual se ha producido, tal como una reacción de trascripción inversa, o por síntesis química de un ADN con base en el conocimiento de la secuencia de ARN. El cADN también corresponde al gen que codifica el ARN. Los polinucleótidos también "corresponden" uno con el otro si sirven a una función similar, tal como la codificación de un polipéptido relacionado en especies diferentes, cepas o variantes que se comparan. Una "sonda" cuando se usa en el contexto de la manipulación de polinucleótidos SFRP, se refiere a un oligonucleótido que se suministra como un reactivo para detectar un objetivo potencialmente presente con una muestra de interés al hibridizarlo con el objetivo. Usualmente, una sonda comprenderá una etiqueta o un medio por el cual se pueden colocar una etiqueta, ya sea antes o posterior a la reacción de hibridación. Las etiquetas apropiadas incluyen pero no se limitan a radioisótopos, fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, colorantes, y proteínas, incluyendo enzimas. Un "cebador" es un oligonucleótido, generalmente con un grupo libre 3 '-0H que se enlaza a un objetivo potencialmente presente en una muestra de interés al hibridizar con el objetivo, y posteriormente promueve la polimerización de un polinucleótido complementario al objetivo. Los procesos de producción de copias replicadas del mismo polinucleótido, tal como PCR ó clonación de genes, se refieren colectivamente en la presente como "amplificación" ó "replicación". Por ejemplo se puede replicar el ADN de hebra simple o doble para formar otro ADN de la misma secuencia. El ARN se puede replicar por ejemplo, por una polimerasa de ARN dirigida al ARN, o por la trascripción inversa del ADN y después la ejecución de una PCR. En el último caso, la copia amplificada del ARN es un ADN con la secuencia idéntica. Una "reacción en cadena de polimerasa" ("PCR") es una reacción en la cual se hacen copias replicadas de un polinucleótido objetivo usando uno ó más cebadores, y un catalizador de polimerización tal como una transcriptasa inversa o una polimerasa de ADN, y particularmente una enzima de polimerasa térmicamente estable. Generalmente, una PCR involucra reiterativamente la formación de tres etapas: "combinación de los pares base complementarios", en la cual se ajusta la temperatura tal que los cebadores oligonucleótidos permitan formar un dúplex con el p'olinucleótido a ser amplificado; "prolongación", en la cual se ajusta de tal manera la temperatura que los oligonucleótidos que han formado un dúplex, se prolongan con una polimerasa de ADN, usando el polínucleótido al cual han formado el dúplex como plantilla; y "fusión", en la cual la temperatura se ajusta tal que el polinucleótido y los oligonucleótidos se disocian. Se repite después el ciclo hasta que se obtiene la cantidad deseada de polinucleótido amplificado. Se enseñan los métodos para PCR en la USP No. 4,683,195 para Mullís y la USP 4,683,202 para Mullís y colaboradores. Los elementos dentro de un gen incluyen, pero no se limitan a regiones promotoras, regiones enriquecedoras, regiones de enlace represor, sitos de iniciación de la transcripción, sitios de enlace a ribosomas, sitios de inicio de la traducción, regiones de codificación de proteínas, intrones y exones, y sitios de terminación para la transcripción y traducción. Una copia "antisentido" de un polinucleótido en particular se refiere a una secuencia complementaria que es capaz de enlazarse al hidrógeno para el polinucleótido y puede por lo tanto, ser capaz de modular la expresión de polinucleótidos. Estos son ADN, ARN o análogos de los mismos, incluyendo análogos que tienen estructuras alteradas como se describen arriba. El polinucleótido al cual se enlaza la copia antisentido puede estar en una forma de hebra simple o en una forma de hebra doble. Como se usa aquí, el término "unido operativamente" significa que una molécula de ADN se posiciona con relación a las secuencias de regulación necesarias, por ejemplo, un promotor o enriquecedor, tal que el promotor dirigirá la transcripción del ARN fuera de la molécula de ADN en una forma estable o transitoria. "Vector" significa una molécula de ácido nucleico auto-replicante que transfiere una molécula insertada de ácido nucleico dentro y/o entre las células huésped. El término se pretende que incluya vectores que funcionan principalmente para la replicación del ácido nucleico y los vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se pretenden vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriores. "Célula huésped" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo de célula que puede ser o ha sido " receptor de vectores o la incorporación de moléculas de ácido nucleico exógenas y/o proteínas. También se pretende incluir la progenie de una célula simple, y la progenie puede no ser necesariamente idéntica completamente (en morfología o en el complemento genómico o total del ADN) con la célula precursora original debido a una mutación natural, accidental, o deliberada. Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de enlazarse a un antígeno. Como se usa aquí, el término abarca no solamente moléculas intactas de inmunoglobulina, sino también anticuerpos anti-idiotípicos, mutantes, fragmentos, proteínas de fusión, proteínas humanizadas y modificaciones de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno de la especificidad requerida. Un "complejo de anticuerpo" es la combinación de anticuerpo (como se define arriba) y su compañero de enlace o ligando. Una "célula apropiada" para los propósitos de esta invención, es una que incluye, pero no se limita a una célula que expresa la SFRP, por ejemplo, una célula de medula ósea, preferiblemente una célula hOB. Un "equivalente biológico" de una molécula de ácido nucleico se define aquí como uno que posee una identidad esencial con la molécula de ácido nucleico de referencia.

Un fragmento de la molécula del ácido nucleico de referencia es un ejemplo de un equivalente biológico. Un "equivalente biológico" de un polipéptido o proteína SFRP es uno que retiene la misma característica que la proteína o polipéptido de referencia. También incluye fragmentos de la proteína del polipéptido de referencia. Las proteínas y polipéptidos SFRP, también se pueden obtener por síntesis química usando un sintetizador de péptidos automatizado, comercialmente disponible tal como aquellos fabricados por Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A ó 431A, Foster City, CA, y la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 2. La proteína o polipéptido sintetizado se puede precipitar y purificar además, por ejemplo por cromatografía líquida de .alto desempeño (HPLC) . De esta manera, esta invención también proporciona un proceso para sintetizar químicamente las proteínas de esta invención al proporcionar la secuencia de la proteína (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) y reactivos, tales como aminoácidos y enzimas, y unirlos junto a los aminoácidos en la orientación adecuada y secuencia lineal. Alternativamente, las proteínas y polipéptidos se pueden obtener por métodos recombinantes bien conocidos como se describe, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2da edición (Cold Spring Harbor Laboratory (1989) ) , usando, por ejemplo, la célula huésped y los sistemas de vector descritos y ejemplificados abajo. Esta invención además proporciona un proceso para la producción de una SFRP, análogo, muteína o fragmento de la misma, al hacer crecer una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína deseada, el ácido nucleico se une operativamente a un promotor de la transcripción de ARN. La proteína deseada se puede introducir dentro de la célula huésped por el uso de un constructo de genes que contiene un promotor y una secuencia de terminación para la secuencia de ácido nucleico de la proteína deseada. La célula huésped se hace crecer bajo condiciones apropiadas tales que el ácido nucleico se transcribe y traduce dentro de la proteína. En una modalidad separada, la proteína se purifica adicionalmente. Las proteínas de esta invención también se pueden combinar con diversos portadores de fase líquida, tales como soluciones acuosas o estériles, portadores farmacéuticamente aceptables, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de los solventes no acuosos incluyen propil etilen glicol, polietilen glicol y aceites vegetales. Cuando se usan para preparar anticuerpos, los portadores puede también incluir un adyuvante que es útil para aumentar no específicamente una respuesta inmune específica. Un técnico habilitado puede fácilmente determinar si se requiere un adyuvante y seleccionar uno. Sin embargo, solamente para propósitos de ilustración, los adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes incompletos y completos de Freund, sales minerales y polinucleótidos. Aplicaciones terapéuticas para las SFRP/SARP. Aunque apenas se han descubierto recientemente la familia de genes SFRP/SARP, y todavía hay mucho que aprender acerca de su biología, existen sin embargo diversas aplicaciones terapéuticas potenciales para estas proteínas. Desde que se han implicado los Wnt como proto-oncogenes, las SFRP/SARP pueden servir como supresores de tumor debido a su capacidad para antagonizar la actividad Wnt. Estas proteínas se pueden también utilizar en la regeneración de tejidos. Por ejemplo, ya que el FrzB-1 estimula la actividad condrogénica ectópica in vivo, se puede usar para acelerar la reparación de fracturas o la cicatrización de articulaciones después de un reemplazo de cadera y rodilla (solicitud de patente número WO 98/16641 Al) . Finalmente, ya que las SFRP/SARP parecen controlar la apoptosis, estas proteínas se pueden también utilizar para tratar una diversidad de enfermedades degenerativas incluyendo los desórdenes de neurodegeneración, miodegeneración y osteodegeneración. Composiciones Farmacéuticas. Esta invención también proporciona composiciones que contienen algunas de las proteínas, muteínas, fragmentos, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas, muteínas, anticuerpos ó fragmentos de las mismas, arriba mencionadas, así como vectores y células huésped que expresan tales moléculas de ácido nucleico, y una solución amortiguadora, portador o diluyente líquido o sólido aceptable. Una cantidad efectiva de uno o más ingredientes activos se usa suficiente para lograr el efecto regulatorio deseado en una actividad de formación de huesos o actividad de apoptosis. Se puede determinar una cantidad efectiva por curvas de respuesta de dosis convencionales para la actividad deseada. Cuando se usan farmacéuticamente las composiciones, se combinan con un "portador farmacéuticamente" para uso diagnóstico y terapéutico. La formulación del tales composiciones es bien conocida por las personas habilitadas en esta campo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender uno o más componentes activos adicionales y, preferiblemente, incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El componente activo adicional se puede proporcionar para trabajar en conjunto con un activo basado en una o más SFRP como se describe arriba. En modalidades alternativas, se agrega el activo adicional ya que trabaja sobre la misma enfermedad o trastorno como la SFRP pero por un modo diferente de acción de los activos que se basan en SFRP, o el activo adicional puede trabajar en otras enfermedades o trastornos presentes en un humano ó animal. Los portadores y/o diluyentes apropiados farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera de todos los solventes convencionales, medios de dispersión, rellenos, portadores sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes anti-fungales, antibacterianos, agentes retardadores de la absorción e isotónicos y similares. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador que provoca una reacción alérgica u otro efecto desfavorable en pacientes a los que se administran. Los portadores farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden además comprender cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, • conservadores o soluciones amortiguadoras, que incrementan la vida de anaquel o la efectividad de uno o más de los componentes activos de la composición. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso de los mismos en composiciones inmunogénicas de la presente invención. Estas composiciones también se pueden usar para la preparación de medicamentos para el diagnóstico y tratamiento de patologías neurodegenerativas asociadas (esto es, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, lesiones a la médula espinal), miodegenerativas (esto es, distrofia muscular, miastenia gravis, miopatías miotónicas) y trastornos osteodegenerativos (esto es, osteoporosis) . En ciertas modalidades, los anticuerpos que se enlazan a todo o una porción de una proteína SFRP se emplean en la composición para tratar cualquiera de las enfermedades o trastornos anteriores. Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden prepararse por métodos convencionales. Generalmente, se formula un anticuerpo contra una secuencia de aminoácido (a) que es específica a una proteína (o proteínas) SFRP y (b) que también es más probable de ser antigénico. Se puede seleccionar una secuencia específica para una proteína SFRP al llevar a cabo el análisis de secuencias y usando cualesquiera programas convencionales para alineación de secuencia y comparaciones de secuencias. Una secuencia de aminoácido que es hidrofílica en una o más terminaciones, preferiblemente en ambas terminaciones, se prefiere generalmente para formular los anticuerpos. Además de emplear aminoácidos que son hidrofílicos, en modalidades preferidas los aminoácidos hidrofílicos también son básicos (no ácidos) . También se puede emplear cualquier aminoácido que incremente la antigenicidad. Por ejemplo, se emplean a menudo las prolinas en la porción central de la secuencia. Se puede medir la antigenicidad por un incremento en la disminución de la cantidad de anticuerpo que se produce cuando se generan anticuerpos contra una secuencia inicial de prueba, que es específica a una o unas proteínas SFRP. En ciertas modalidades de la presente invención, se formula el anticuerpo contra una secuencia que comprende al menos 8 aminoácidos consecutivos de una o unas proteínas SFRP, y preferiblemente de una secuencia que comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos de una o unas proteínas SFRP. En modalidades adicionales preferidas, el anticuerpo se formula contra secuencias de aminoácidos que comprenden alrededor de 15 hasta 30 aminoácidos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se formula contra una secuencia que comprende los aminoácidos 217-231 de una proteína SFRP de la SEQ ID NO: 2, o variaciones en la secuencia de la misma. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar a un individuo que necesite de un crecimiento de hueso y cartílago muscular, neural facilitado, por numerosas vías, incluyendo pero no limitándose a intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal, intracraneal y tópica. La composición se puede administrar directamente a un órgano o a las células del órgano por métodos in vivo o ex vivo. Estas composiciones pueden estar en forma soluble o microparticular, o se pueden incorporar dentro de microesferas o microvesículas incluyendo micelas y liposomas . Aplicabilidad Industrial. Las composiciones arriba descritas proporcionan los componentes para un ensayo para separar por exclusión agentes, y compuestos farmacéuticos que son agonistas o antagonistas del receptor Wnt en una célula apropiada. También se anticipa que los polinucleótidos SFRP de la invención tendrán utilidad como los agentes de diagnóstico o para la detección de anormalidades genéticas asociadas con genes que codifican SFRP, o con uno o más genes involucrados en la trayectoria de señalización Wnt. Tales anormalidades genéticas incluyen mutaciones de punto, eliminaciones o inserciones de nucleótidos. Cualquiera de los diversos procedimientos de separación por exclusión genética se pueden adaptar para su uso con sondas preparadas por la presente invención, incluyendo análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , reacción en cadena de la ligasa, o PCR. Las mutaciones en este gen indican un riesgo creciente de anormalidades en desarrollo. Como se proporciona en mayor detalle abajo, las proteínas y fragmentos de la mismas son útiles en un sistema de ensayo celular in vitro libre de células para separar por exclusión agentes y compuestos farmacéuticos que inhiben o aumentan la trayectoria del receptor Wnt y la apoptosis, y para probar terapias posibles para trastornos asociados con esta trayectoria, por ejemplo, enfermedades de formación de hueso, carcinogénesis, y enfermedades cardiovasculares. También se pueden modular la embriogénesis. Se pueden usar los ensayos de separación por exclusión de fármacos para identificar activadores o inhibidores de la proteína SFRP. Por ejemplo, un incremento del crecimiento del cartílago en presencia de un medicamento comparado con la SFRP solamente, puede indicar la activación de SFRP, mientras que una disminución pueden indicar la inhibición de la actividad SFRP. Se pueden separar por exclusión una diversidad de compuestos usando métodos de la presente invención. Estos incluyen péptidos, macromoléculas, moléculas pequeñas, productos químicos y mezclas biológicas. Tales compuestos pueden ser compuestos biológicos, sintéticos, orgánicos, o inorgánicos. En la presente invención, se usan células apropiadas para la preparación de ensayos de diagnóstico, para la expresión de SFRP o para la preparación de kit de diagnóstico basados en nucleótidos. Las células se pueden hacer o derivar de levadura, hongos, de bacterias o virus. En modalidades preferidas, las células son células hOB, en particular una línea celular pre-osteocítica inmortalizada novedosa referida como célula hOB-01-Cl-PS-09 (que se deposita con la American Type Culture Collection en Manassas, Va., con la designación PTA-785) , y células de osteoblastos que tienen las características identificables de células hOB-01-Cl-PS-09 así como células de osteoblastos hechas de las mismas, por ejemplo progenie. La inmortalizada se refiere a cultivos celulares permanentemente establecidos y sustancialmente continuos con un potencial de división celular sustancialmente ilimitado. Esto es, las células se pueden cultivar sustancialmente indefinidamente, esto es, por al menos alrededor de 6 meses bajo condiciones rápidas de crecimiento, preferiblemente mucho más bajo condiciones más lentas de crecimiento, y se pueden propagar rápidamente y continuamente usando técnicas de cultivo de células de rutina. Alternativamente, las células de la presente invención se pueden cultivar por al menos alrededor de 100, 150 ó 200 doblajes de población. Estas células producen un complemento de proteínas característico de las células normales humanas osteoblásticas y son capaces de la diferenciación osteoblástica. Se pueden usar en estudios de cultivo de células de sensibilidad celular osteoblástica para varios agentes tales como hormonas, citocinas y factores de crecimiento, o en terapias de tejido. Estas células son un subclon post-senescente de la línea celular hOB-01-Cl como se describe previamente por Bodine y colaboradores 1996 Endocrinology 137:4592-4604. Ya que se reporta en la presente, las SFRP son nuevos objetivos de fármacos para la osteoporosis, ciertas modalidades se refieren a la expresión de genes o ácidos nucleicos que codifican toda o una porción de al menos una proteína SFRP. La expresión de tales ácidos • nucleicos o genes en las líneas celulares de osteoblastos humanos (hOB) se correlacionan con la muerte celular acelerada y la apoptosis. Las células hOB-01ClPS-09 de esta invención, son particularmente útiles sobre otras células hOB ya que las células actuales "-09" son células adultas de osteoblastos. Además, estas células son osteocíticas (esto es, células maduras) en comparación con otras células hOB que son a menudo osteoblásticas. Adicionalmente, las células ' hOB-01-Cl-PS-09 expresan niveles muy bajos del mensaje FRP-l/SARP-2. Consecuentemente, la línea celular hOB-01-Cl-PS-09 será una particular en el modelo in vitro para estudiar los efectos de la reintroducción de FRP-l/SARP-2 y la sobre-expresión. Otra característica importante de las células hOB-01-Cl-PS-09 es que se pueden usar para estudios de transfección transitorios y estables. Algunas de las diversas ventajas de esta célula sobre las células precursoras hOB-01-Cl son como sigue: Las células hOB-01-Cl-PS-09 son verdaderamente inmortales, se dividen de 2 a 3 veces mas rápidas a 34 °C, y todavía retienen muchas de sus características pre-osteocíticas de las células precursoras . Las células hOB-01-Cl-PS-09 serán útiles para establecer líneas celulares estables que sobre-expresen objetivos de fármacos osteoporóticos potenciales. Tales lineas celulares estables serán entonces valiosas para caracterizar estos objetivos de fármacos, así como para desarrollar separaciones y ensayos de alta producción para identificar compuestos que la regulen. Ejemplos La presente invención se describe además por los siguientes ejemplos. Los ejemplos se suministran únicamente para ilustrar la invención con referencia a las modalidades específicas. Estos ejemplos, aunque ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no señalan las limitaciones o circunscriben el alcance de la invención. Ejemplo A: Generación y análisis de células hOB Las células hOB-01-Cl son una línea celular transformada condicionalmente derivada del hueso humano adulto que muestran fielmente un fenotipo pre-osteocítico. Estas células se transformaron con un antígeno T grande sensible a la temperatura (tsA 209) y proliferan a una temperatura permitida de 34 °C cuando está activo el mutante del antígeno T; sin embargo, las células se detienen en la división a una temperatura no permisiva (> 37 °C) cuando está inactivo el mutante del antígeno T. Aunque las células hOB-01-Cl son la primera línea celular de osteocitos a establecerse y son apropiadas para la investigación exploratoria, tienen algunas desventajas para el descubrimiento de fármacos.

Como otras líneas celulares humanas transformadas de antígenos T grandes SV-40, las células hOB-01-Cl se someten a una crisis y envejecen después de 15-20 pasos en cultivo. Así, aunque se refieren a menudo como inmortales, tales líneas celulares son de hecho solamente de "vida prolongada". Las células hOB-01-Cl también proliferan lentamente en cultivo a 34 °C con un tiempo de doblaje de alrededor de una vez cada 5 a 6 días. Con objeto de superar alguno de estos inconvenientes, se establece la línea celular hOB-01-Cl-PS-09. Las células hOB-01-Cl-PS-09 se desarrollaron al pasar la línea celular precursora hOB-01-Cl más allá del punto de crisis (esto es, 15-20 pasos) hasta que se reasume la proliferación (20-25 pasos) . Las células posteriores al envejecimiento se expandieron después en cultivo y se subclonaron. Los clones se caracterizan usando un análisis de una reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) para medir los niveles de expresión del mARN del receptor de la hormona paratiroide (PTH)-l. Las células hOB-01-Cl-PS-09 se escogieron para una caracterización adicional, ya que este clon expresa el nivel más alto del mensaje del receptor PTH-1 a 39°C. Esta línea celular pasa aproximadamente 20-25 doblajes de población durante el procedimiento de expansión y clonación y ha estado pasando posteriormente más de 50 veces. Esta línea celular puede pasar cientos de veces. Así, las células hOB-01-Cl-PS-09 son verdaderamente una línea celular inmortal . Como la línea celular precursora hOB-01-Cl, las células hOB-01-Cl-PS-09 fallan al formar cultivos de monocapa y dejan espacios en las cajas de cultivo de tejido. Las células también parecen formar contactos célula a célula a través de procesos celulares extensos. Del análisis por microscopio de electrones, las células poseen proyecciones celulares como dedos que son reminiscentes de los pre-osteocitos y estos procesos forman uniones de espacios cuando hacen contacto con células adyacentes. Como con la línea celular precursora, las células hOB-01-Cl-PS-09 también expresan el antígeno T grande tsA 109 como se determina por inmunocitoquímica .

A diferencia de la linea celular precursora hOB-01- Cl, las células hOB-01-Cl-PS-09 proliferan 2 a 3 veces más rápido a la temperatura permisiva con un tiempo de doblaje de una vez cada 2-3 días (Figura 22A) . Sin embargo, como las células precursoras, las células hOB-01-C1-PS-09 detienen la división a una temperatura no permisiva (Figura 22A) . Esta observación indica que aunque las células han pasado a través del punto de crisis y se hacen inmortales, requieren todavía de un antígeno T activo para proliferación. Además, como con la línea celular precursora, las células hOB-01-Cl-PS-09 requieren la inactivación del antígeno T con objeto de mostrar un fenotipo osteocítico enriquecido. La fosfatasa alcalina y la osteocalcina son dos marcadores importantes del linaje osteocítico. Como se muestra en la Figura 22B, la capacidad del tratamiento con vitamina D3 para sobre-regular la actividad de la fosfatasa alcalina, se enriquece alrededor de 4 veces cuando se incuban las células a 39°C. Además, como se detalla en la figura 22C, la vitamina D , es incapaz de inducir la secreción de osteocalcina de las células a 34°C. Sin embargo, la producción del secosteroide sobre-regula esta proteína de matriz específica del hueso 11 veces cuando las células incuban a 39°C. Se debe observar que los niveles básales de la expresión de la alcalina fosfatasa y la secreción de osteocalcina por la células hOB-01-Cl-PS-09, son similares a la línea celular precursora. Así, morfológicamente y bioquímicamente, las células hOB-01-Cl-PS-09 se parecen a las células precursoras hOB-01—Cl y por lo tanto son confiables en un modelo in vitro para estudiar la biología humana de los pre-osteocitos . Como se mencionó arriba, la línea celular hOB-01-Cl-PS-09 se selecciona para una caracterización adicional basada en su alto nivel de la expresión mARN del receptor PTH-1. Como se muestra en la Figura 23, la incubación de las células durante 48 horas a 39°C incrementa los niveles de mensaje en régimen permanente para el receptor PTH-1 por 7 veces cuando se compara a las células conservadas a 34 °C. Ya que la expresión del receptor PTH- 1 es un marcador de la diferenciación de los osteoblastos/osteocitos, es otra indicación de que las células muestran un genotipo osteocítico más pronunciado a la temperatura no permisiva. Consistente con esta expresión aumentada del receptor PTH-1, la preincubación de las células hOB-01-Cl-PS-09 durante 48 horas a 39°C seguida por tratamiento con concentraciones crecientes del PTH-1-34 humano (hPTH-1-34) durante 10 minutos a 37 °C, genera un incremento de 5 a 6 veces dependiente de la dosis en los niveles de monofosfato de adenosina cíclica intracelular (cAMP) (Figura 24). En contraste, la preincubación de las células a 34 °C no resulta en un incremento posterior en las concentraciones de cAMP después del tratamiento con hTPH 1-34. Así, la expresión del receptor PTH-1 y la respuesta se incrementan después de la activación del antígeno T tsA-209. Una utilidad potencial de este ensayo cAMP sería la capacidad de caracterizar las actividades de los análogos ó -imitaciones de PTH en una célula objetivo importante bajo condiciones en donde los niveles de la expresión del receptor PTH-1 se alteran dramáticamente. Además de la vitamina D3 y el PTH, las células hOB-01-C1-PS-09 también responden a agentes adicionales activos del hueso: por ejemplo, glucocorticoides y factores transformantes del crecimiento (TGF)-ßl. El tratamiento de la células con el glucocorticoide sintético, dexametasona, sobre-regula la actividad de la fosfatasa alcalina aproximadamente 2 veces a 34 °C (Figura 25) y este efecto es nuevamente una vez aumentado cuando las células se incuban a 39°C. Similarmente, el tratamiento de las células con TGF-ßl recombmante humano (rh) a 39°C, resultan en una disminución dependiente de las dosis en la secreción del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) . El HGF ha demostrado actuar como un factor quimiotáctico para los osteoclastos y puede, por lo tanto, jugar un papel en la regulación de la resorción de los huesos. Una propiedad importante de los osteocitos, es la capacidad de responder a la estimulación mecanosensorial, tal como aquella que se presenta durante ejercicios de levantamiento de pesas . Un método para estimular el efecto estimulante in vitro es a través del uso de una Unidad de Cepa Flexercell (Flexcell International, Hillsborough, NC) . Para este experimento detallado en la Figura 26, la células hOB-01-Cl-PS-09 se sembraron sobre cajas de cultivo de tejidos de 6 pozos recubiertas con el colágeno BioFlex tipo I, e incubadas a 34 °C durante 24 horas. Las células se preincubaron en un medio libre de suero a 34 ó 39°C durante 34 horas adicionales, y después se sometieron a una cepa fisiológicamente diferente (3400 µE, 2 Hz, 7200 ciclos) a 37 °C usando una Unidad de Cepa Flexercell FX-3000. Después del tratamiento con la cepa, las células se incuban durante 4.5 horas, tiempo al cual se recolecta el medio acondicionado y se analiza por la presencia de óxido nítrico (NO) . Se ha reportado previamente que la estimulación mecanosensorial in vitro o el esfuerzo cortante de los osteoblastos de roedores y pollos y los osteocitos estimulan su producción de NO. Como se muestra en la Figura 26, la estimulación mecanosensorial (esto es, "Flex") de las células hOB-01-Cl-PS-09, aumentan la producción de NO por 10 hasta 18 veces. Consecuentemente, estos datos sugieren que esta línea celular será un modelo in vitro útil para estudiar los mecanismos moleculares de la estimulación mecano sensorial . Los experimentos adicionales establecen que la células hOB-01-Cl-PS-09 se pueden usar para estudios de transfección transitorios y estables. Esta línea celular se puede transfectar usando el reactivo de lipofección Tfx-20 (Promega, Madison, Wl). En tal experimento, las células se siembran dentro de placas de cultivo de tejidos de 24 pozos a densidades variables y se transfectan después con 0.25 µg/pozo de ß-galactosidasa y plásmidos de expresión de luciferasa (ADN total=0.5 µg/pozo) . Después de una incubación durante 48 horas a 34°C ó 39°C, se ensayan los Usados de células para la actividad de la ß-galactosidasa ó luciferasa. A partir de tales experimentos, los resultados establecen que los niveles de expresión de luciferasa ó ß-galactosidasa se incrementan con un número de células creciente. Además, cuando se normaliza la expresión de la luciferasa a la expresión de la ß-galactosidasa con objeto de controlar la eficiencia de la transfección, el nivel de expresión de luciferasa es de 2 a 3 veces superior cuando las células se incuban a 34 °C. Ya que la expresión de luciferasa está bajo el control del promotor SV-40, esta observación es consistente con el antígeno T tsA 209 que se inactiva 39°C. Consecuentemente, ya que estas células son inmortales y capaces de transfectarse, se pueden usar para desarrollar líneas celulares estables de sobre-expresión en un ambiente humano pre-osteocítico. Ejemplo 1: Aislado de SFRP. El fragmento del gen hOB SFRP se identifica usando tecnología RADE (siglas en inglés de análisis rápido de expresión diferencial) como se describe por Shiue 1997 Drug Develop. Res. 41:142-159, el documento del cual se incorpora en la presente. Las tres líneas de células hOB (hOB-03-C5, hOB-03-CE6 y hOB-01-Cl), que representan tres etapas distintas de la diferenciación (proliferativa, madura y preosteocítica, respectivamente) , se usan para aislar e identificar la SFRP. Las líneas de células hOB se establecen y cultivan como se describe previamente (Bodine y colaboradores, 1996 J. Bone Miner. Res. 11: 806-819; Bodine y colaboradores, 1996 Endocrinology 137: 4592-4604; Bodine y colaboradores, 1997 J. Cell. Biochem. 65: 368-387). Estas líneas de células se inmortalizan con un antígeno T grande 40 del virus de simio sensible a la temperatura (SV) , y exhiben un fenotipo transformado a la temperatura permisible (34 °C) cuando se activa el mutante del antígeno T. Sin embargo, en contraste con las células de osteosarcoma (Stein y Lian 1993 Endocrine Rev. 14: 424-442) , las líneas de células hOB son confiables a la relación proliferación/diferenciación en la temperatura no permisible (>37°C) cuando el mutante del antígeno T no está activado. Las líneas de células se siembran en placas de 150 mm a ~40,000 células/cm2 con medio de crecimiento [D-MEM/F-12 que contiene suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10% (v/v) , penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) y GlutaMAX-1 2 mM] , y se incuban durante la noche a 34 °C. Al siguiente día, se remueve el medio, las células se enjuagan con solución salina amortiguada en fosfato (PBS) , se agregan 20 ml de medio libre de suero a los platos [D-MEM/F-12 libre de fenol rojo (Gibco/BRL) que contiene albúmina de suero de bovino al 0.25 (p/v) (BSA, Pentex cristalizado, Bayer), penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) , GlutaMAX-1 2mM, ascorbato-2-fosfato 50 mM (Wako) , y 10 mM de bisulfito de sodio menadiona (vitamina K3) ] , y las placas se incuban a 39°C durante 24 horas. Al siguiente día, se remueve el medio y las células se tratan a 39°C durante 24 horas adicionales con 20 ml de medio fresco libre de suero, que contiene ya sea el vehiculo (Control) , hormona 1-34 paratiroide humana 8 nM (PTH) , prostaglandina E2 100 nM (PGE2) o factor-ßl del crecimiento transformante humano 0.1 nM (TGF-ßl). El PTH, PGE2 y TGF-ßl son agentes osteogénicos conocidos (Whitfield y Morley 1995, Trends Pharmaceut. Sci. 16:382-386; Jee y Ma 1997 Bone 21:297-304; Centrella y colaboradores, 1994 Endocrine Rev. 15:27-39). Después del periodo de tratamiento, las placas se enjuagan con PBS y se aisla el ARN celular total de las células no tratadas y tratadas, usando TRIzol de conformidad con las instrucciones de los fabricantes (GibcoBRL) . El RADE se ejecuta después con las muestras de ARN aislado como arriba; los fragmentos del gen regulados se identifican, se clonan y se secuencian. Estos experimentos identifican un total de 82 genes diferencialmente expresados. Una búsqueda BLAST (siglas en inglés de herramienta de búsqueda de alineación local básica) de las bases de datos públicas, se realiza en los fragmentos del gen obtenido por RADE; uno de los fragmentos de gen fue altamente homólogo al SFRP-1 de ratón. Este fragmento de gen se identifica durante el RADE usando el siguiente par cebador: extremo (HT11A) 3' 5?AGCTTTTTTTTTTTA-3' (cebador inverso) y extremo (H-AP1) 5' 5' -AAGCTTGATTGCC-3' (cebador delantero) , cuyas secuencias son la SEQ ID NO 11 y la SEQ ID NO 12, respectivamente. La expresión y regulación del fragmento del gen que tiene homología al cADN SFRP-1 de ratón, se confirma por el análisis de manchado Northern. Ejemplo 2: Caracterización del hOB SFRP. La Figura 1 describe un resumen de los resultados del RADE. El fragmento del gen hOB SFRP (indicado por las flechas) , se sobre-regula fuertemente por el PGE2 en las líneas de células hOB en etapa proliferativa (hOB-03-C5) y etapa de maduración (hOB-03-CE6) , y se sub-regulan por el TGF-ßl en la línea de célula pre-osteocítica (hOB-01- Cl) . Por otro lado, la expresión basal de este gen se incrementa dramáticamente en las células pre-" osteocíticas, sugiriendo que la expresión del gen hOB SFRP se enlaza al proceso de diferenciación de osteoblastos . Ejemplo 3: Análisis de Secuencia del Fragmento del Gen hOB SFRP. El fragmento del gen hOB SFRP identificado en el Ejemplo 1, arriba, que contienen 276 pares base (bp) , se clonó, secuenció, y se sometió además a una búsqueda BLAST de las bases de datos públicas. Esta búsqueda revela que este gen fue homólogo a los otros dos cADN previamente identificados. La secuencia de alineado indica que el fragmento del gen hOB SFRP comparte el 77% de identidad de secuencia al extremo 3' del gen SFRP-1 de ratón (GeneBank® Acceso #U88566; Rattner y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2859-2863). El fragmento de gen hOB SFRP también exhibe una homología significante (87%) en el extremo 3' de un cADN de bovino relacionado, llamada proteina A relacionada con la familia "frizzled" (FrzA, GeneBank® Acceso #U85945) . Adicionalmente, el fragmento del gen hOB SFRP fue muy homólogo con al menos tres etiquetas de secuencia expresadas (EST) , clon humano TM010 (GeneBank® Acceso #U54715) , supresor del tumor CA11 humano (GeneBank® Acceso #U69122) y EST de cerebro de infante humano (GeneBank® Acceso #H16753, H16861) .

Ejemplo 4: Regulación del hOB SFRP por Agentes Osteogénicos . Con objeto de confirmar la regulación de la expresión del gen hOB SFRP por diferentes agentes osteogénicos (esto es, el fragmento de ADN identificado en el Ejemplo 1, arriba), las líneas de célula hOB se trataron con PTH, PGE2 y TGF-ßl; se aisló después el ARN por hibridizaciones Northern. Los resultados se muestran en las Figuras 2 hasta 5. Los experimentos se realizan como sigue. Se siembran lineas de células hOB en placas de 150 mm, y se tratan como se describe en el Ejemplo 1, excepto que se aisla el poliAt ARN del ARN celular total usando maxi kit Oligotex mRNA como se describe por el fabricante (Qiagen) . Se realizan análisis de manchado Northern usando ya sea el corte RADE del fragmento del gen hOB SFRP, el fragmento del gen hOB SFRP clonado o el cADN del hOB SFRP de longitud completa clonado, como una sonda etiquetada al 32P (como se describe en Bodine y colaboradores, 1996, J. Bone Miner. Res. 11: 806-819, que se incorpora en la presente) . Cada una de estas sondas detecta un mensaje de 4.4-4.6 kb en las células hOB. La expresión del mARN de hOB SFRP se normaliza ya sea por mARN gliceraldehido fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o mARN ß-actina, usando las sondas 32P-ADN correspondientes. El tratamiento de las células hOB-03-C5 en etapa proliferativa con PGE2 100 nM durante 24 horas, sobre-regula completamente la expresión de un mensaje de ~4.6 kilobases pares (kb) (Figura 2), confirmando la regulación de este gen por el PGE2 . Cuando el fragmento del gen hOB SRFP clonado se usa como la sonda, se observa un mARN predominante de ~4.4 kb en las células tratadas con PGE2, confirmando que este mensaje es efectivamente el gen SFRP (Figura 3) . El mARN corresponde en tamaño al transcripto por el gen FRP-l/SARP-2 humano (Finch y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 6770-6775; Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641). El análisis de manchado Northern también confirma la sobre-regulación de la expresión del mARN hOB de SFRP en las células hOB-03-CE6 en etapa de maduración tratadas con PGE2 (Figura 4). Además, la expresión basal de este gen fue elevada en células hOB-01-Cl pre-osteocíticas . Esta expresión del nivel basal se suprime por el 35% después del tratamiento con PTH 8 nM. Adicionalmente, el tratamiento con PGE2 de las células hOB-03-CE6 en etapa de maduración, eleva la expresión SFRP hasta el nivel que se expresa basalmente por las células pre-osteocíticas, implicando que la sobre-regulación de SFRP por el PGE2 en las células osteoblásticas, se relaciona con el aumento de diferenciación celular. Por último, el tratamiento de las células hOB-01-Cl pre-osteocíticas con TGF-ßl 100 pM durante 24 horas, suprime los niveles de mARN hOB SFRP por el 80% (Figura 5) . Para confirmar que los niveles de mensaje hOB SFRP cambian con el incremento de diferenciación celular, se aisló el ARN total de las células hOB-03-C5 pre-osteoblásticas, las células hOB-03-CE6 osteoblásticas maduras, las células hOB-01-Cl pre-osteocíticas y las células hOB-05-Tl osteocíticas maduras. Los niveles de mARN SFRP básales se midieron después por RT-PCR TaqMan cuantitativa. Cuando se compararon a las células hOB-03-C5, los niveles de mensaje SFRP básales se incrementaron alrededor de 4 veces en las células hOB-03-CE6 y alrededor de 23 veces en las células hOB-01-Cl. Por otro lado, los niveles de mARN SFRP se redujeron hasta alrededor de 0.5 veces en células hOB-05-Tl. De esta manera, de las células en el linaje de osteoblastos, el pre-osteocito parece expresar los niveles más altos del mensaje hOB SFRP. Ejemplo 5: Cinética de la Expresión hOB SFRP. Se sembraron células hOB-03-C5 proliferativas en placas de 150 mm, y se trataron con concentraciones incrementadas de PGE2 durante 24 horas, o con PGE2 100 mM a varias duraciones de tiempo como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron análisis de manchado Northern poliA + ARN con el fragmento del gen RADE hOB SFRP de 276 bp extirpado, o un fragmento de gen hOB SRFP de 1.1 kb clonado como una sonda etiquetada al 32P. El tratamiento de las células hOB-03-C5 de etapa proliferativa con concentraciones incrementadas de PGE2, sobre-reguló la expresión del mARN de hOB SFRP de una manera dependiente de la dosis, con un EC50 de aproximadamente 8 nM. Similarmente, el tratamiento de las células hOB-03-CE6 maduras con concentraciones incrementadas de PGE2, también sobre-regula los niveles de mARN de hOB SFRP en una manera dependiente de la dosis, no obstante que el EC50 del PGE2 para esta respuesta, fue de alrededor de 10 veces mayor que en las células hOB-03-C5. El tratamiento de las células hOB-03-C5 con PGE2 100 nM durante 2 hasta 24 horas, sobre-regula la expresión del mARN de hOB SFRP de una manera dependiente del tiempo. Se observa un incremento significante en la expresión del gen SFRP después de 2 hasta 4 horas de tratamiento, y los niveles de mARN en régimen permanente continúan incrementándose hasta 24 horas después de la adición del PGE2 al medio de cultivo. Estos resultados sugieren que el SFRP puede ser un gen de respuesta tardía al tratamiento de PGE2 de las células hOB, e implica que puede estar bajo el control secundario de otro producto de gen. Se obtienen resultados similares con las células hOB-03-CE6 maduras, no obstante que las veces que se incrementa la expresión del mensaje hOB SFRP no es mayor de lo que fue en la hOB-03-C5. De manera similar, las células hOB-01-Cl se siembran en placas de 100 mm y se tratan durante 24 horas con concentraciones incrementadas de TGF-ßl. El ARN total se aisló después de las células, y se midió el mARN de hOB SFRP por RT-PCR cuantitativa TaqMan. El TGF-ßl suprimió la expresión del gen SFRP por aproximadamente 70% de una manera dependiente de la dosis con un IC50 de alrededor de 4 pM. Además del PGE2, el ' tratamiento tanto de las células hOB-03-C5 ó las células hOB-03-CE6 con interleucina (IL)-Iß, ácido 9-cis-retinoico o ácido todo-trans-retinoico, incrementa los niveles de mARN de hOB SFRP. Por otro lado, como con el TGF-ßl, el tratamiento de varias lineas de células hOB con PTH, proteina morfogenética del hueso (BMP) -2, factor del crecimiento similar a la insulina (IGF) -I, estradiol 17ß (17ß-E2), vitamina D3 (VD3) , dexametasona (Dex) , o suero de bovino fetal (FBS) , suprime la expresión del mensaje hOB SFRP. En general, es una buena correlación (aunque imperfecta) entre las capacidades de estos diversos agentes para tanto incrementar como reducir la expresión hOB SFRP, y su capacidad tanto para aumentar como suprimir la apoptosis oesteoblasto/osteocito (ver, por ejemplo, Manolagas 2000 Endocrine Reviews 21: 115-137). Ejemplo 6: Distribución de Tejido de hQB SFRP. Con objeto de determinar la distribución del tejido para la expresión del gen hOB SFRP, se formaron sondas para manchados Northern poli (A) + ARN de tejido humano múltiple (obtenido de Clonetech) con el fragmento del gen RADE hOB SFRP extirpado como se describe en el Ejemplo 4. Cuando el fragmento RADE se usó para formar la sonda de los manchados Northern poli (A) + ARN, se expresó un transcripto de ~4. kb por varios tejidos (Figura 6). Cuando estos resultados se normalizaron para ß-actina, la expresión SFRP se ordenó como sigue: Riñon > corazón > placenta > hígado = músculo esquelético = estómago = glándula de tiroides > glándula adrenal = testículos = útero = intestino delgado = páncreas = cerebro > tráquea = espina dorsal = próstata = colon > bazo > pulmón = ganglio linfático = médula espinal; No se observó expresión en el timo y los linfocitos sanguíneos periféricos. Este patrón de expresión es similar al del genFRP-l/SARP-2 (Finch y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sc8i. USA 94: 6770-6775; Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641) .

Ejemplo 7: Distribución de SFRP en Líneas de Células de Osteoblastos . Además de las líneas de células hOB de las cuales se identifica inicialmente la SFRP, se examinaron los modelos de osteoblastos humanos in vitro para la presencia del gen. Se obtienen células tipo osteoblasto de osteosarcoma humano SaOS-2 del American Type-Culture Collection (ATCC) y se cultivan a 37 °C en un medio modificado McCoy 5A que contienen FBS al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) y GlutaMAX-1 2mM. Similarmente, los cultivos de tejidos separados de osteoblastos humanos normales (hOBs) se establecieron de astillas de hueso canceloso como se describe previamente (Bodine y colaboradores, 1996 J. Bone Miner. Res. 11: 806-819, que se incorpora en la presente para referencia) . Las células se siembran después en placas de 150 mm y se tratan como se describe en los Ejemplos 1 y 4, excepto que las células se incuban a 37 °C en lugar de a 39°C. Se realizó un análisis de manchado Northern PoliA+ ARN usando el fragmento de gen hOB SRFP clonado de 1.1 kb como una etiqueta 32P. Las células SaOS-2 expresan niveles básales relativamente bajos de mARN SFRP que no se regulan por el tratamiento ya sea con PTH, PGE2 o TGF-ßl (Figura 7) . Es difícil cuantificar la expresión de este gen en estas células, ya que el nivel de expresión fue bajo. En contraste, las células hOB normales que expresan altos niveles básales de mensaje SFRP, y tratamiento de las células con PGE 100 nM durante 24 horas, parecen sobre-regular ligeramente los niveles de régimen permanente de este mARN (~1.3-vez). El análisis RT-PCR cuantitativo TaqMan de estas muestras de ARN indican que el PGE2 sobre-regula el SFRP 10 veces en células hOB. Debido al bajo nivel de expresión basal en células de osteosarcoma, estas células pueden no ser satisfactorias en modelos in vitro para el estudio de la regulación del gen SFRP. Ya que el gen se expresa y regula por el PGE2 en cultivos de osteoblastos humanos normales, el uso de líneas de células hOB descritas en la presente invención, se valida para modelos -de osteoblasto in vitro. El análisis de manchado Northern y el RT-PCT del ARN total aislado de un tumor de célula gigante humana de hueso, falla para detectar la expresión del mARN hOB SFRP en este tejido. Estos resultados sugieren que las células tipo osteoclastos pueden no expresar este gen. Ejemplo 8: Aislado de cADN de hOB SFRP de Longitud Completa. Ya que el fragmento del gen hOB SFRP clonado de RADE es idéntico a varios EST humanos, se realizó un análisis de la base de datos EST con objeto de ensamblar el cADN de longitud completa del gen hOB. Este análisis sugiere que el hOB SFRP fue de hecho el gen humano conocido, FRP- 1 (también llamado la proteína 2 relacionada con la apoptosis o SARP-2) . Con base en este análisis, y la observación de que el gen SFRP-1 de ratón es aparentemente homólogo al gen FRP-1 humano y el gen SARP- 2 humano (Rattner y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2859-2863; Finch y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 6770-6775; Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641) , se diseña una estrategia basada en RT-PCR para obtener el cADN de hOB SFRP de 1.1 kb de longitud completa, tanto de ARN de placenta humana como de ARN de células hOB-03-CE6 tratadas con PGE2. Se realiza el RT-PCR usando 1 µg del ARN total, cebadores que cierran la región codificada del hFRP-l/SARP-2 (cebador delantero: 5'-GCTGGGGACTGCGCCTTTTGT.3' SEQ ID NO 13: cebador inverso: 5' -CCTGCCCCCGGGAGAATCACTTA-3' SEQ ID NO 14), 35 ciclos de PCR, y el kit PCR Advantage-GC (Clonetech) de conformidad con las instrucciones de los fabricantes. Con objeto de detectar la expresión del mARN, se realiza un análisis de manchado Southern con los productos de RT-PCR usando una sonda de oligonucleótido 32P que se hibridiza específicamente a las bases 501 hasta 530 de la región codificadora hFRP-l/hSARP-2 (referida a Bodine y colaboradores, 1997 J. Cell. Biochem. 65: 368-387 para detalles experimentales concernientes a hibridaciones RT-PCR y Southern). El cADN de 1.1 kb de longitud completa para el hOB SFRP, se aisló y se sobre-reguló por tratamiento con PGE2 100 nM de las células hOB-03-CE6 durante 24 horas (Figura 8). Similarmente, el RT-PCR del ARN total aislado de células hOB-03-C5 tratadas con PGE2, identifica un cADN de 2.2 kb que se cierra desde la región 5' del cADN hFRP-l/SARP-2 hasta el fragmento RADE de 276 bp en el extremo 3' . Estos fragmentos de cADN se clonan ya sea en el vector de expresión mamífero pcADN3.1 (Invitrogen) (cADN de 1.1 kb) o el vector de clonación TA (Invitrogen) (cADN de 2.2 kb) y se secuenció. El análisis de secuencia del hOB SFRP 1.1 kb (SEQ ID NO . : 1 ) y los cADN de 2.2 kb permiten el ensamble de un cADN de 2.6 kb que incluye el sitio de inicio de transcripción en el extremo 5' y el fragmento RADE en el extremo 3' . Una búsqueda BLAST de las bases de datos públicas usando el cADN 1.1 kb indica que es esencialmente idéntico al FRP-l/SARP-2 humano. La secuencia de aminoácido deducida de la región codificada del cADN SFRP, se muestra en la SEQ ID NO. 2. La secuencia contiene una diferencia de aminoácido de la secuencia publicada para el SARP-2 humano: alanina 174 en lugar de prolina en esta posición (Melkonyan y colaboradores, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641) . Ejemplo 9: Caracterización de la Actividad Apoptótica de hOB. Ya que el gen hOB SFRP de longitud completa clonado, fue idéntico al SFRP-l/FRP-l/SARP-2 humano, el papel biológico de este gen en el hOB se investigó para determinar si el producto de gen regula la viabilidad de la célula hOB y la señalización Wnt (Figuras 9-16) . Como se muestra en la Figura 9, las células hOB se sembraron a 200,000 células/pozo en placas de 6 pozos, y se incubaron a 34°C. Al siguiente día, se enjuagó un juego de placas con PBS, tripsinado, y el número celular de línea base (y el volumen celular medio) se determinó con un multidimensionador Coulter como se describe previamente en Bodine y colaboradores, 1996 J. Bone Miner. Res. 11:806-819, que se incorpora en la presente para referencia. El otro juego de platos se colocó a la temperatura no permisible de 39°C, y se determina el número de células 6 dias después (el medio se cambió el día 3) . Las células hOB-03-C5, que están en la etapa proliferativa de diferenciación de osteoblastos, se dividen lentamente a 39°C, y el número de células se incrementa por un 60 hasta 80% después de 6 días; esta relación de división celular fue similar a los cultivos retirados de tejidos de células hOB normales (Bodine y colaboradores, 1996, Endocrinology 137: 4592-4604). En contraste, las células hOB-03-CE6 en etapa de maduración, detienen la división en la temperatura no permisible, y el número de células queda constante, mientras que las células hOB-01-Cl pre-osteocíticas mueren lentamente a 39°C de tal manera que algunas del 40% de las células quedan vivas después de 6 días. Como se nota previamente, la sobre-expresión de SARP-2 en células de cáncer de pecho MCF-7, aceleran la relación de muerte celular. Consistente con esta observación, y como se muestra en las Figuras 1, 4 y 5, la expresión del mARN SFRP-1/FRP-l/SARP-2 basal, se incrementa dramáticamente en las células hOB-01-Cl pre-osteocitas cuando se compara con las líneas de células hOB-03-C5 proliferativas y hOB-03-CE6 maduras. La hipótesis de que la sobre-regulación de la expresión del gen SFRP-l/FRP-l/SARP-2 acelera la muerte celular de hOB, mientras que la sub-regulación de la expresión del gen SFRP-l/FRP-l/SARP-2 suprime la muerte celular, se examina a continuación. Estos resultados se describen en la Figura 10. Se siembran células hOB-03-C5, hOB-03-CE6 ó hOB-01-Cl con un medio de crecimiento a alrededor de 200,000 células por pozo en placas de 6 pozos, y se incuban a 34 °C durante la noche. Al siguiente día, las placas de 6 pozos se enjuagan con PBS, se colocan en un medio de BSA, y se tratan a 39°C en ausencia o presencia de ya sea PGE2 100 nM (con objeto de sobre-regular los niveles de mARN en régimen permanente de SFRP-l/FRP-l/SARP-2; paneles A y B) , o TGF-ßl 0.01-1.0 nM (con objeto de sub-regular los niveles de mensaje de SFRP-l/FRP-l/SARP-2; panel C) . Las células incubadas en un medio libre de suero es un método común para inducir la apoptosis (Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641), y las líneas de células hOB-03-C5, hOB-03-CE6 y hOB-01-Cl, todas se detienen dividiendo y eliminando gradualmente bajo estas condiciones. Sin embargo, la relación de muerte celular se acelera significativamente cuando las células hOB-03-CE5 y hOB-03-CE6 se tratan con PGE2, de tal manera que sobre el 40% de algunas células quedan vivas después de 6 días de tratamiento. En contraste, el tratamiento de las células hOB-01-Cl con TGF-ßl, incrementa la viabilidad celular alrededor de 2 veces de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento de las células con PGE2 no solo acelera la muerte celular, sino también reduce significativamente el volumen medio celular por 10 hasta 20%. Esta observación es consistente con la inducción de apoptosis, que se conoce como el resultado de la formación de ampollas citoplásmicas, la pérdida de agua y una reducción en el volumen celular (Mesner y Kaufmann 1997 en Advances in Pharmacology, vol. 41, páginas 57-88). También consistente con la inducción de la apoptosis, el tratamiento con PGE2 de las células hOB-03-C5 resulta en la generación de fragmentos de ADN asociados con la histona. Finalmente, el tratamiento de las células hOB-03-C5 con PGE2 incrementa la anexina V (un marcador específico para la apoptosis) enlazando a la célula como se mide por la citometría de flujo (Figura 11) . Ejemplo 10: Conversión de la Inducción de Muerte Celular. La conversión de la muerte celular usando un oligonucleótido antisentido para SFRP-l/FRP-l/SARP-2 se demuestra en la Figura 12 usando hOB-03-C5 y hOB-03-CE6. Estos experimentos se realizan de manera similar a los descritos en la Figura 10. Sin embargo, para estos experimentos, las células se co-trataron ya sea con control vehículo (esto es, etanol al 0.1%) o PGE2 en ausencia o presencia de oligonucleótidos de fosforotioato dirigidos al sitio de iniciación o antisentido para SARP-2 humano. Los resultados se presentan ya sea como el % relativo el día de control 0 (esto es, ~200,000 células por pozo de una placa de 6 pozos) o como el % relativo al control vehículo tratado. Los resultados de este experimento indican que el co-tratamiento de las células hOB con el oligonucleótido antisentido para el SARP-2 revierte la capacidad del PGE2 para acelerar la relación de muerte celular, mientras el co-tratamiento con el oligonucleótido de sentido (control) no tiene efecto en este proceso. Además, el co-tratamiento de las células con PGE2 y un anticuerpo anti-péptido para SARP-2 bloquea la capacidad del PGE2 para inducir la muerte celular de hOB. Las secuencias para los oligonucleótidos sentido y anti-sentido para SFRP-l/SARP-2 humano son como sigue: Sentido: 5' -GGCATGGGCATCGGGCGC-3' (SEQ ID NO.15) Antisentido: 5' -GCGCCCGATGCCCATGCC-3' (SEQ ID NO.16) Ejemplo 11: Sobre-expresión de SFRP Acelera la Muerte Celular de hOB. La Figura 13 muestra el resultado de un experimento de viabilidad celular con las células hOB-01-Cl-PS-09 usando el contador celular Coulter. Para estos experimentos, las células se transfectaron establemente ya sea con un plásmido de expresión mamífero de cADN de hOB SFRP (esto es, SFRP-l/FRP-l/SARP-2) o el vector vacío (esto es, pcADN3.1, que se obtiene de Invitrogen de Carlsbad, CA) . Se usan técnicas de clonación estándar (ver Ausubel y colaboradores, 1997 Short Protocols en Molecular Biology, 3era edición, Wiley {Nueva York}). Los resultados se presentan como el % de células de control del día 0. Los resultados de este experimento indican que la sobre-expresión de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 por las células hOB acelera la relación de muerte celular cuando se compara al vector vacío que no tiene efecto en este proceso. Los autoradiogramas de un manchado Northern del ARN total aislado del vector vacío (v) o SFRP (S) que expresan las células, demostraron que las células hOB sobre-expresan el gen SFRP como se espera. Además, el análisis RT-PCR cuantitativo TaqMan indica que las células que sobre-expresan el SFRP, expresan 5-6 veces más mARN de SFRP que las células que expresan el vector vacío. Con objeto de mejorar la relación de muerte celular que se induce por SFRP-l/FRP-l/SARP-2, las hOB-01-Cl-PS-09 se sub-clonan se caracterizan (Figura 14) . El análisis RT-PCR cuantitativo TaqMan indica que un subclon (SARP-2, clon #1) expresa 50-60 veces más mARN de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 que las células que expresan el pcADN3.1 (vector vacío). Similarmente, las células de SARP-2 clon #1 mueren a una relación mayormente acelerada (t?/2 = 39.2 horas) en medio BSA cuando se comparan a las células que expresan el vector vacío (t?/2 = -120 horas) . Ejemplo 12: Efecto de la hOB SFRP en la Actividad Wnt. Con objeto de determinar si la sobre-regulación de la expresión del gen SFRP-l/FRP-l/SARP-2 resulta en un antagonismo de la trayectoria de señalización Wnt, se tratan células hOB-03-CE6 con PGE2, y las células resultantes se prueban con anticuerpo monoclonal de ß-catenina. La sobre-expresión de proteínas Wnt en células sobre-regula una proteína de señalización conocida como ß-catenina (revisar en Moon y colaboradores, 1997, Cell 88: 725-728; Barth y colaboradores, 1997 Curr. Opin. Cell Biol. 9:683-690; y Nusse 1997 Cell 89: 321-323). Por otro lado, la sobre-expresión de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 en células MCF-7 sub-regula los niveles de ß-catenina, que es consistente con un antagonismo de la actividad Wnt (Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. .Acad. Sci. USA 94: 13636-13641). Por lo tanto, las células hOB-03-CE6 se colocan y tratan con PGE2 como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la proteína celular total se extrae y se realiza un análisis de manchado Western para la ß-catenina usando un anticuerpo monoclonal para la proteína (Transduction Laboratories) como se describe previamente (Bodine y colaboradores, 1996 Endocrinology 137: 4592-4604; Melkonyan y colaboradores, 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13636-13641). Consistente con la sobre-regulación de los niveles de mARN establecidos con el estudio de SFRP-l/FRP-l/SARP-2, el tratamiento de las células hOB-03-CE6 con PGE2 100 nM durante 24 horas, sub-regula los niveles de proteína ß-catenina indicando un antagonismo de la actividad Wnt (Figura 15) . Además, co-transfectando el cADN de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 ya sea en células hOB-01-Cl-PS-09 ó hOB-02-Cl-PS-02, sub-regula la expresión de la TCF-luciferasa que es una medición auténtica de la señalización Wnt y la actividad nuclear de la ß-catenina (Figura 16) (por ejemplo, Bafico y colaboradores, 1999 J. Biol. Chem. 274: 16180-16187). El SFRP-l/FRP-l/SARP-2 tanto de humano como de rata, así como el Frzb-1/FrzB/Fritz, suprimen la actividad de la TCF-luciferasa en células hOB. Todas juntas, estas observaciones sugieren que una o unas proteínas Wnt prolongan la vida de los osteoblastos humanos in vitro, y que el antagonismo de la señalización Wnt por SFRP-l/FRP-l/SARP-2 promueve la muerte celular de osteoblastos. De esta manera, un inhibidor de la función SFRP-l/FRP-l/SARP-2 puede incrementar la sobrevivencia del osteoblasto/pre-osteocito, y por lo tanto aumentar la formación de huesos in vivo. Usando varios métodos para caracterizar la expresión Wnt en las células hOB (por ejemplo, RT-PCR, análisis GeneChip y clonación de cADN) , se tiene evidencia de que estas líneas de células expresan, a grados variantes, la Wnt-2B/13, -13, -4, -5A, y -11. Ninguna de estas Wnt estaría involucrada en prolongar la vida de las células hOB. La Wnt-2B/13 también se conoce como Wnt-x.

Ejemplo 13: Uso de hOB SFRP en un Método de Separación por Exclusión de Agentes Anabólicos. Se diseña un nuevo paradigma de separación por exclusión para un agente anabólico del hueso usando SFRP. Como se resume en la Figura 17, este paradigma de separación por exclusión usa las células hOB y SFRP-l/FRP-l/SARP-2 para identificar compuestos que son capaces de prevenir o retardar la muerte celular de osteoblastos. Tales compuestos actúan bloqueando la capacidad de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 para acelerar la muerte de la célula hOB. Estos compuestos se enlazan a SFRP-l/FRP-l/SARP-2 y evitan enlazarse a una proteína Wnt, o pueden enlazarse a una Wnt y evitar enlazarse a SFRP-l/FRP-l/SARP-2. Si SFRP-l/FRP-l/SARP-2 tiene actividades que son independientes del enlace Wnt (por ejemplo, enlazarse a un receptor de superficie celular) , entonces estos compuestos podrían actuar también para prevenir esta función independiente de Wnt como tal. Para el ensayo inicial del paradigma de separación por exclusión resumido en la Figura 17, los compuestos se incuban con una línea de célula hOB y SFRP-1/FRP-l/SARP-2. Este ensayo podría usar SFRP-l/FRP-l/SARP-2 purificado o parcialmente purificado, o un medio acondicionado o extractos de célula que contienen SFRP-l/FRP-l/SARP-2. La línea de célula podría ser una que exprese naturalmente niveles básales altos de SFRP-l/FRP-l/SARP-2 (por ejemplo, células hOB-01-Cl) , que sobre-expresan transitoriamente o establemente el SFRP-l/FRP-l/SARP-2 (por ejemplo, células hOB-01-Cl-PS-09) , o que expresan establemente o naturalmente el SFRP-l/FRP-l/SARP-2 de una manera condicional (por ejemplo, células hOB-03-C5 tratadas con PGE2) . Como una medición de la muerte de células hOB, podrían usarse ensayos que cuantifiquen el número celular (por ejemplo, MTT o MTS de conversión de tinte o ADN CyQuant fluorescente) o apoptosis (por ejemplo, fragmentación de ADN o enlace de anexina V) . Los kit CyQuant se adquieren de Molecular Probes (Eugene, OR) . Un ejemplo de ensayos de separación por exclusión de alto rendimiento (HTS) o inhibidores de SFRP-1/FRP-l/SARP-2, se describe en la Figura 18. Para este ensayo, se siembran ya sea un vector vacío (pcADN3.1) o células hOB-01-Cl-PS-09 que sobre-expresan el SFRP-l/FRP-l/SARP-2 (SARP-2 #1) estable, a 5000 células por pozo en placas de 96 pozos usando medio de crecimiento. Después de una breve incubación de 6 horas a 34 °C, los pozos se enjuagan con PBS y se incuban en un medio de BSA a 39 °C durante 3 días. Al final de la incubación, los pozos se enjuagan nuevamente con PBS y después se evalúan para el contenido de ADN usando el ensayo de ADN fluorescente CyQuant (Molecular Probes) . Cuando se compara con las células del vector vacío, las células que sobre-expresan el SARP-2 mueren rápidamente a 39 °C de tal manera que después de 3 días, solamente el 20-30% de las células sobrevive. En contraste, el 50-60% de las células del vector vacío sobreviven la incubación. Cuando las células que sobre-expresan el SARP-2 se tratan con un anti-suero antipéptido (AS) generado de los aminoácidos 217-231 del SFRP-l/FRP-l/SARP-2, el 50-60% de las células están vivas después de 3 días. Esto indica que la inhibición de la función de la proteína SFRP-l/FRP-l/SARP-2 previene su aceleración en la muerte de células hOB. Como controles, el suero pre-inmune no tiene efecto en las células que sobre-expresan el SARP-2, y ni el suero pre-inmune ni el inmune, afectan las células que expresan el vector vacío.

Los compuestos que bloquean la muerte de las células hOB por SFRP-l/FRP-l/SARP-2 se moverían después en ensayos adicionales in vitro. Estos ensayos miden la capacidad de estos compuestos para bloquear la muerte de las células hOB de una manera dependiente o independiente de SFRP-l/FRP-l/SARP-2, y deberían también determinar la potencia y eficacia de estos compuestos para estos efectos. Se diseñan ensayos adicionales para determinar la selectividad celular de estos compuestos para estos efectos, (por ejemplo, usando MCF-7 u otras células) , así como la especificidad de estos compuestos para SFRP-l/FRP-l/SARP-2 contra otro miembros de la familia SFRP/SARP (por ejemplo FzrB/Fritz, SARP-1, o SARP-3) . Podrían usarse también ensayos adicionales para determinar si estos compuestos regulan los eventos de señalización en dirección 3' involucrados en la apoptosis (por ejemplo, actividad de caspasa) o actividad Wnt (por ejemplo, niveles de ß-catenina y función por medio del ensayo de TCF-luciferasa) . Finalmente, los compuestos que exhiben actividades apropiadas en estos ensayos in vitro, deberían después usarse en una variedad de modelos animales para la formación de huesos, osteopenia, u osteoporosis (por ejemplo, ratas o ratones ovariectomizados) . Un compuesto que inhibe la apoptosis osteoblasto/osteocito, debería, de un modo imaginable, ser un agente anabólico del hueso, prolongando la vida de estas células y por ello ya sea incrementar la cantidad de matriz ósea que se sintetiza y mineraliza, y/o mantener la integridad del hueso. Es claro que la invención puede practicarse de otra manera a la que se describe particularmente en la descripción y ejemplos anteriormente mencionados. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de las enseñanzas de arriba, y por lo tanto están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Ejemplo 14: Desarrollo y Uso de Ratones Agénicos SFRP-1.

Como se establece en el Ejemplo 13, un compuesto que inhibe la apoptosis osteoblasto/osteocito debería, de un modo imaginable, ser un agente anabólico del hueso prolongando la vida de estas células y por ello incrementar la cantidad de matriz ósea que se sintetiza y mineraliza, y/o mantener la integridad del hueso. Con objeto de probar esta hipótesis y determinar si el SFRP- l/FRP-l/SARP-2 afecta el esqueleto, se prepararon ratones SFRP-lneg (ver Walter y colaboradores, 1999, BioTechniques 26: 1150-1160) . Quitando el gen SFRP-l/FRP-l/SARP-2 de los ratones, deberían ser consanguíneos para inhibir su función con un fármaco, y este proceso permite validar este gen/proteína como un fármaco potencial dirigido para la osteoporosis. Como se resume en la Figura 19, los ratones agénicos SFRP-1 se generan substituyendo el exón ' 1 del gen SFRP-1 de ratón con un cásete de expresión de gen resistente al fármaco neomicina/gen reportero de ß-galactosidasa. Como se muestra en la Figura 20, el análisis de manchado Northern de poli A + ARN aislado ya sea de riñones de hembra o macho (edad de 16-18 semanas) , demostraron altos ' niveles de expresión de mARN de SFRP-1 (4.4 kb) en los ratones de control de tipo silvestre (WT) , pero una ausencia completa de la expresión del gen en los ratones agónicos (KO) . Como se muestra en la Figura 21, la tomografía micro computarizada (micro-CT) se usa para caracterizar la arquitectura ósea trabecular de los fémures distales de ratones macho y hembra de control tipo silvestre (+/+) y agénicos (-/-) (para una revisión de esta técnica, ver Genant y colaboradores, 1999 Bone 25: 149-152 y Odgaard 1997 Bone 20: 315-328). En los machos de 20 semanas de edad (panel A) , los ratones tienen un 31% más volumen óseo trabecular (BV/TV) y un 8% de incremento en el espesor trabecular (Tb. Th.) cuando se comparan a los ratones de control +/+. En las hembras de 26-27 semanas de edad (panel B) , los ratones -/- tienen un incremento del 91% en la densidad conectiva trabecular (Conn. Den.), un incremento del 16% en el número trabecular (Tb. N.) y una reducción del 16% en el espaciamiento trabecular (Tb. Sp.) cuando se compara a los ratones de control +/+. De esta manera, para soportar esta hipótesis, estos resultados demuestran que el retiro del gen SFRP-1 en ratones lleva a un incremento en los parámetros de formación ósea trabecular (P. J. Meunier 1995 Bone Histomorphometry in Osteoporosis: Etiology, Diagnostic, and Management, 2da edición, B. L. Riggs y L. J. Melton III, editores, Lippincott-Raven, Filadelfia, páginas 299-318) .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Bodine, Peter V. N. American Home Products Corporation <120> COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE USO DE PROTEÍNAS SECRETADAS RELACIONADAS CON LA FAMILIA "FRIZZLED" . <130> Proteínas Secretadas Relacionadas con la Familia "Frizzled' <140> PCT/US00/25035 <141> 2000-09-13 <150> 09/394,832 <151> 1999-09-13 <160> <170> Patentln. Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2602 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 1 gatctgctgg ggactgcgcc ttttgtcccc ggaggtccct ggaagtttgc ggcgggacgc 60 gcgcggggag gcggcggagg cagccccgac gtcgcggagc acagggcgca gagccggcat 120 gggcatcggg cgcagcgagg ggggccgccg cggggcagcc ctgggcgtgc tgctggcgct 180 gggcgcggcg cttctggccg tgggctcggc cagcgagtca gactacgtga gcttccagtc 240 ggacatcggc ccgtaccaga gcgggcgctt ctacaccaag ccacctcagt gcgtggacat 300 ccccgcggac ctgcggctgt gccacaacgt gggctacaag aagatggtgc tgcccaacct 360 gctggagcac gagaccatgg cggaggtgaa gcagcaggcc agcagctggg tgcccctgct 420 caacaagaac tgccacgccg gcacccaggt cttcctctgc tagctattcg cgcccgtctg 480 cctggaccgg cccatctacc cgtgtcgctg gctctgcgag gccgtgcgcg actcgtgcga 540 gccggtcatg cagttcttcg gcttctactg gcccgagatg cttaagtgtg acaagttccc 600 cgagggggac gtctgcatcg ccatgacgaa gcccaatgcc accgaagcct ccaagcccca 660 aggcacaacg gtgtgtcctc cctgtgacaa cgagttgaaa tctgaggcca tcattgaaca 720 tctctgtgcc agcgagtttg cactgaggat gaaaataaaa gaagtgaaaa aagaaaatgg 780 cgacaagaag attgtcccca agaagaagaa gcccctgaag ttggggccca tcaagaagaa 840 ggacctgaag aagcttgtgc tgtacctgaa gaatggggct gactgtccct gccaccagct 900 ggacaacctc agccaccact tcctcatcat gggccgcaag gtgaagagcc agtacttgct 960 gacggccatc cacaagtggg acaagaaaaa caaggagttc aaaaacttca tgaagaaaat 1020 gaaaaaccat gagtgcccca cctttcagtc cgtgtttaac agattctccc gggggcaggg 1080 aattctgcag atatccagca tggggaggga gcctcgggtg gggtgggagc gggggggaca 1140 gtgccc?ggg aacccggtgg gtcacacaca cgcactgcgc gtgtcagtag tggacattgt 1200 aatccagtcg gcttgttctt gcagcattcc cgctcccttc cctccatagc cacgctccaa 1260 tccccagggt agccgtggcc gggtaaagca agggccattt agattaggaa ggcccttaag 1320 atccgcaatg tggagcagca gccactgcac aggaggaggt gacaaaccat ttccaacagc 13080 aacacagcca ctaaaacaca aaaaggggga ttgggvggaa agtgagagca agcagcaccc 1440 actacatttt gcaacttgtt ggtgaggatc tattggctga tctatgcctt tcaactagaa 1500 aattctaatg attggcaagt cacgttgttt tcaggtccag agtagtttct ttccgtctgc 1560 tttaaatgga aacagactca taccacactt acaattaagg tcaagcccag aaagtgataa 1620 gtgcagggag gaaaagtgca agtccattat gtagtagtga cagcaaaggg accaggggag 1680 aggcattgcc ttctctgccc acagtctttc cgtgtgattg tctttgaatc tgaatcagcc 1740 agtctcagat gccccaaagt ttcggttcct atgagcccgg ggcatgatct gatccccaag 1800 acatgtggag gggcagcctg tgcctgcctt tgtgtcagaa aaaggaaacc acagtgagcc 1860 tgagagagac ggcgattttc gggctgagaa ggcggtagtt ttcaaaacac atagttaaaa 1920 aagaaacaaa tgaaaaaaat tttagaacag tccagaacag tgctagtcag ggtgaattgt 1980 gaaattgggt gaagagctta cgattctaat ctcatgtttt ttccttttca catttttaaa 2040 agaacaatga caaacaccca cttatttttc aaggttttaa aacagtctac attgagcatt 2100 tgaaaggtgt gctagaacaa ggtctcctga tccgtccgag gctgcttccc agaggagcag 2160 ctctccccag gcatttgcca agggaggcgg atttccctgg tagtgtagct gtgtggcttt 2220 ccttcctgaa gagtccgtgg ttgccctaaa acctaacacc ccctagcaaa actcacagag 2280 ctttccgttt ttttctttcc tgtaaagaaa catttccttt gaacttgatt gcctatggat 2340 caaagaaatt cagaacagcc tgcctgtccc cccgcacttt ttacatatat ttgtttcatt 2400 tctgcagatg gaaagttgac atgggtgggg tgtccccatc cagcgagaga gtttcaaaag 2460 caaaacatct ctgcagtttt tcccaagtgc cctgagatac ttcccaaagc ccttatgttt 2520 aatcagcgat gtatataagc cagttcactt agacaacttt acccttcttg tccaatgtac 2580 aggaagtagt tctaaaaaaa aa 2602 <210> 2 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly He Gly Arg Ser Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Val Hly Ser Ala Ser 20 25 30 Glu Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp He Gly Pro Tyr Gln Ser 35 40 45 Gly Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp He Pro Ala Asp 50 55 60 Leu Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn 65 70 75 80 Leu Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser 85 90 95 Trp Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe 100 105 110 Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro He Tyr Pro 115 120 125 Cys Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met 130 135 140 Gln Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe 145 150 155 160 Pro Glu Gly Asp Val Cys He Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu 165 • 170 175 Ala Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu 180 185 190 Leu Lys Ser Glu Ala He He Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala 195 200 205 Leu Arg Met Lys He Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys 210 215 220 He Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro He Lys Lys 225 230 235 240 Lys Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys 245 250 255 Pro Cys His Gln Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu He Met Gly 260 265 270 Arg Lys Val Lys Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Ala He His Lys Trp Asp 275 280 285 Lys Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His 290 295 300 Glu Cys Pro Thr Phe Gln Ser Val Phe Lys 305 310 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición farmacéutica para regular la actividad formadora de huesos en un mamífero, caracterizada porque comprende al menos uno de (i) una proteína secretada relacionada con la familia "frizzled"
2. (SFRP) o una porción reguladora del mismo, (ii) un anticuerpo formado de tales proteínas o porciones de las mismas, (iii) un ácido nucleico que codifica ya sea por (i) ó (ii) , y (iv) una forma antisentido para cualquier punto de (iii) . 2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la SFRP es de células humanas de osteoblastos.
3. 3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la actividad formadora de huesos es la regulación del crecimiento óseo.
4. 4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la actividad formadora de huesos es la regulación de la densidad ósea.
5. 5. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la SFRP tiene la secuencia de aminoácido colocada en la SEQ ID NO: 2.
6. 6. Un método para tratar un trastorno óseo en un mamífero, caracterizado porque comprende las etapas de administrar una composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1-5.
7. 7. El método de tratamiento del trastorno óseo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el trastorno comprende el grupo que consiste de (a) un trastorno en la formación ósea, (b) un trastorno en la resorción ósea y (c) un trastorno en la densidad ósea.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el trastorno es un trastorno óseo degenerativo .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el trastorno óseo degenerativo se selecciona del grupo que consiste de trastornos neurodegenerativos, miodegenerativos, y osteodegenerativos .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el trastorno osteodegenerativo se selecciona del grupo que consiste de osteopenia, osteoartritis, osteoporosis.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el mamífero es un humano.
12. 12. Un método para identificar compuestos de prueba que regulan la actividad de la SFRP, los compuestos que regulan la actividad formadora de huesos en un mamífero están caracterizados porque comprenden (a) incubar una muestra que comprende SFRP en un medio de prueba que contiene el compuesto de prueba y (b) determinar la actividad SFRP, en donde un incremento en la actividad con relación al SFRP solamente, indica que el compuesto es un activador del SFRP, y una reducción en la actividad indica que el compuesto es un inhibidor del SFRP.
13. 13. Un método para modular la señalización mediada por_ Wnt en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el SFRP de conformidad con las reivindicaciones 1-5, en donde la actividad Wnt se regula.
14. 14. El método para modular la señalización mediada por Wnt de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el SFRP tiene la secuencia de aminoácido colocada en la SEQ ID NO: 2.
15. 15. Un método para facilitar la formación ósea o reparar un cultivo celular óseo, caracterizado porque comprende aislar las células de un cultivo óseo, introducir un constructo recombinante que expresa una secuencia antisentido para una secuencia de nucleótido que codifica un SFRP que tiene la secuencia de aminoácido colocada en la SEQ ID NO: 2, y regresar las células al cultivo óseo.
16. 16. Una sonda de polinucleótido capaz de hibridizarse con el polinucleótido, caracterizada porque tiene la secuencia de ácido nucleico colocada en la SEQ ID N0:1.
17. 17. Un proceso de diagnóstico para detectar un polinucleótido SFRP en una muestra derivada de un huésped mamífero, caracterizado porque comprende detectar la 1 presencia o ausencia del SFRP en la muestra utilizando la sonda de conformidad con la reivindicación 16.
18. 18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un portador o diluyente aceptable.
19. 19. Una composición para regular la actividad formadora de huesos en un mamífero, caracterizada porque comprende al menos un anticuerpo para una proteina secretada relacionada con la familia "frizzled" (SFRP) o una porción reguladora de la misma.
20. 20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende un vehículo o diluyente aceptable.
21. 21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el anticuerpo se formula contra al menos 8 aminoácidos consecutivos de una proteína SFRP.
22. 22. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el anticuerpo se formula contra al menos 10 aminoácidos consecutivos de una proteínas SFRP.
23. 23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el anticuerpo se formula contra al menos los aminoácidos 217-231 de una proteína SFRP de la SEQ ID NO 2.
24. 24. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1-4 y 18-21, caracterizada porque el SFRP tiene una secuencia de aminoácido que se obtiene por la expresión de la secuencia de polinucleótido colocada en la SEQ ID N0:1.
25. 25. Un método para identificar compuestos de prueba que regulan la actividad del SFRP, caracterizado porque los compuestos que regulan la actividad formadora de huesos en un mamífero comprenden (a) comparar la actividad de una muestra en un animal SFRPneg con la actividad en ausencia de la muestra, en donde un incremento o reducción en las actividades asociadas con el SFRP indican que el compuesto es un modulador de la actividad SFRP.
26. 26. Una célula (hOB) de osteoblasto humano inmortalizada, que expresa un antígeno de proteína T grande 40 del virus del simio mutante sensible a la temperatura, caracterizada porque la célula prolifera a alrededor de 34°, pero no prolifera a temperaturas que exceden alrededor de 37 °C, cuando se activa el mutante del antígeno T.
27. 27. La célula hOB de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque expresa una secuencia de nucleótido que codifica un polinucleótido que codifica un SFRP o fragmento del mismo.
28. 28. La célula hOB de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la hOB son células hOB-Ol-Cl-PS-09, como se depositaron con el American Type Culture Collection in Manassas, Va., con la designación PTA-785, o la progenie del mismo.
29. 29. Una población homologa de células, caracterizada porque comprende la célula hOB de conformidad con la reivindicación 26.