JP2002535956A - 物理的ストレスにより誘発される遺伝子、その発現産物およびその使用方法 - Google Patents

物理的ストレスにより誘発される遺伝子、その発現産物およびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、骨粗しょう症に関する。さらに、本発明は、物理的ストレスにより誘発される遺伝子、そのためのプローブ、そのような遺伝子を同定するためのテスト、そのような遺伝子の発現産物、例えば骨粗しょう症または骨粗しょう症を引き起こす因子あるいは過程の診断（例えばリスク測定）、治療、予防、またはコントロールにおけるそのような遺伝子および発現産物の使用；および、診断、治療、予防、またはコントロールの方法または過程、並びにそのための組成物およびそのような組成物を作成および使用する方法または過程に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、1998年5月15日に出願された、米国仮特許出願第60/085,673号に基
づき、優先権を主張する。
【０００２】 1998年5月11日に出願された米国仮特許出願第60/084,944号、および発明者と
してPaz Einat、Rami Skaliter、Orna MorおよびSylvie Luriaを指定し本出願の
代理人(Kohn&Associates Attorney Docket No.0168.00060)を任命し、米国仮特
許出願第60/084,944号に優先権を主張する1999年5月11日に出願された米国特許
出願第 号（ここでは“1999年5月11日のEinat等の米国特許出願”）にも関
連する。
【０００３】発明の分野 本発明は、骨粗しょう症に関する。さらに、本発明は、物理的ストレスにより
誘発される遺伝子、そのためのプローブ、そのような遺伝子を同定するためのテ
スト、そのような遺伝子の発現産物、例えば骨粗しょう症または骨粗しょう症を
引き起こす因子あるいは過程の診断（例えばリスク測定）、治療、予防、または
コントロールにおけるそのような遺伝子および発現産物の使用；および、診断、
治療、予防、またはコントロールの方法または過程、並びにそのための組成物お
よびそのような組成物を作成および使用する方法または過程に関する。
【０００４】 本出願はまた、RNAレベルで調節される遺伝子を同定する方法に関する。さら
に特定すると、本出願は、特定の細胞画分から得られるmRNAの分析により特異に
発現したまたは発生において調節された遺伝子配列をすばやく単離することに関
する。テストされた生物サンプルにキュー(cue)または刺激を与えた結果として
生じたこれらの画分中で見られるmRNAの相対的な発生量の変化を比較することに
より、特異に発現した遺伝子を特徴付けることができる。
【０００５】 本発明は特に、骨細胞および／または物理的ストレスとなる刺激についての方
法に関する。
【０００６】 本発明が関するこれらのおよび他の領域は、以下の記載から明らかになるであ
ろう。
【０００７】発明の背景 骨は、無機質、豊富なカルシウムおよびホスフェートを含浸するコラーゲンに
富む有機基質からなる。2つの主な骨の形態が存在し、緻密な皮質骨は骨格の外
被を形成し、海綿質または髄様骨は骨格の内腔を通る層板を形成する。これらの
2つの形態の代謝作用に対する応答および骨折の受けやすさは異なる。
【０００８】発明の目的および概要 本発明の目的には、臨床的および疫学的研究の進歩および／または病気を実際
にコントロール、予防および治療する現在の可能性のさらなる探究および拡大；
骨細胞の活性および骨の無機質と基質の形成と再造形の調節をコントロールする
因子についての知識のさらなる提供；骨粗しょう症になるリスクを測定するため
のさらなるテストの提供；および／または骨粗しょう症または骨粗しょう症を引
き起こす因子あるいは過程をコントロールするための新しい治療、予防、または
方法、のいずれか1つまたはいずれかの組合せまたは全てが含まれてもよい。
【０００９】詳細な説明 既述のように、ここには、生体中で発現がRNAレベルで調節される遺伝子を同
定する方法が開示される。
【００１０】 さらに特定すると、ここには、より大きいサンプルの一部であり、ストレス誘
発因子により未知の標的mRNAを選択的に刺激することにより発現がmRNAレベルで
少なくとも一部調節される遺伝子を同定する方法が開示される。生体は、適切な
mRNAを提供する任意の生体でよい。mRNAサンプルは、ストレス誘発因子により翻
訳において調節される遺伝子を同定するために示差分析される発現調節およびタ
ンパク質局在に基づく細胞画分に由来する。この方法は、特定のキューに応答す
る遺伝子を同定およびクローニングすることを目的とする。すなわち、本発明の
方法は、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされて、特定の病理学、
ストレス、生理的条件等、および通常は細胞または生体に影響を及ぼしてその遺
伝子発現を変化させることができる因子に応答する遺伝子を同定およびクローニ
ングすることを目的とする。
【００１１】実施例／結果 実施例／結果１：核mRNAプローブを使用する転写レベルにおける遺伝子の分析特異な翻訳 材料／方法（実施例のいくつかまたは全てに全部または一部適用してもよい） 概要 a. 供給源の組織または細胞からの全RNAのトータルmRNA有機抽出。（さら
にpolyA+mRNAの選択が含まれてもよい）。
【００１２】 b. 低張緩衝剤中における均質化による細胞（組織または細胞系から）の核
RNA溶解。RNAの遠心分離および有機抽出による核の採集。
【００１３】 c. 上述のbからの上澄みからのRNAの細胞質RNA有機抽出。
【００１４】 d. ポリリボソーム／サブポリリボソーム分別。低張緩衝剤中における均質
化による細胞の溶解、直線的なスクロース勾配上における核の除去とポリリボソ
ームの分別および勾配のそれぞれの分画からのRNAの有機抽出。
【００１５】 e. 分泌および膜コード化転写情報。
【００１６】 １． Percoll勾配上におけるRERの単離（細胞の均質化後）。
【００１７】 ２． RERを含有するミクロソームの調製。
【００１８】 ３． 洗剤による細胞の連続的な処理による膜結合ポリリボソームの単離。
【００１９】 f. 核タンパク質。異なる洗剤による細胞溶解産物の処理による細胞骨格結
合ポリリボソームの単離。
【００２０】 g. ミトコンドリア遺伝子。Percoll勾配上におけるミトコンドリアの単離
。
【００２１】 h.変化したスプライシング。直線的なスクロース勾配上における核の分離および
スプライセオソーム（タンパク質およびRNA複合体）の単離。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２１日（２００２．５．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 物理的ストレスにより誘発される遺伝子、その発現産物お
よびその使用方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、1998年5月15日に出願された、米国仮特許出願第60/085,673号に基
づき、優先権を主張する。
【０００２】 1998年5月11日に出願された米国仮特許出願第60/084,944号、および発明者と
してPaz Einat、Rami Skaliter、Orna MorおよびSylvie Luriaを指定し本出願の
代理人(Kohn&Associates Attorney Docket No.0168.00060)を任命し、米国仮特
許出願第60/084,944号に優先権を主張する1999年5月11日に出願された米国特許
出願第 号（ここでは“1999年5月11日のEinat等の米国特許出願”）にも関
連する。
【０００３】 1998年5月15日に出願された米国仮特許出願第60/085,673号、米国特許出願第6
0/084,944号、および1999年5月11日のEinat等の米国特許出願、並びに該出願中
で引用される個々の文書および参考文献は、ここで完全に引用される。文書また
は参考文献はまた、以下の本文中、参考文献中または本文中のいずれかに引用さ
れる；また、これらの文書または参考文献（“ここで引用される文書または参考
文献”）、並びにそれぞれのここで引用される文書または参考文献中で引用され
る個々の文書または参考文献は、ここで完全に引用される。1999年5月１１日のE
inat等の米国特許出願の発明の独自性は、本出願の発明の独自性に関して別のも
のではない；また、本出願の発明の独自性は、1999年5月11日のEinat等の米国特
許出願の発明の独自性に関して別のものではない。
【０００４】発明の分野 本発明は、骨粗しょう症に関する。さらに、本発明は、物理的ストレスにより
誘発される遺伝子、そのためのプローブ、そのような遺伝子を同定するためのテ
スト、そのような遺伝子の発現産物、例えば骨粗しょう症または骨粗しょう症を
引き起こす因子あるいは過程の診断（例えばリスク測定）、治療、予防、または
コントロールにおけるそのような遺伝子および発現産物の使用；および、診断、
治療、予防、またはコントロールの方法または過程、並びにそのための組成物お
よびそのような組成物を作成および使用する方法または過程に関する。
【０００５】 本出願はまた、RNAレベルで調節される遺伝子を同定する方法に関する。さら
に特定すると、本出願は、特定の細胞画分から得られるmRNAの分析により特異に
発現したまたは発生において調節された遺伝子配列をすばやく単離することに関
する。テストされた生物サンプルにキュー(cue)または刺激を与えた結果として
生じたこれらの画分中で見られるmRNAの相対的な発生量の変化を比較することに
より、特異に発現した遺伝子を特徴付けることができる。
【０００６】 本発明は特に、骨細胞および／または物理的ストレスとなる刺激についての方
法に関する。
【０００７】 本発明が関するこれらのおよび他の領域は、以下の記載から明らかになるであ
ろう。
【０００８】発明の背景 骨は、無機質、豊富なカルシウムおよびホスフェートを含浸するコラーゲンに
富む有機基質からなる。2つの主な骨の形態が存在し、緻密な皮質骨は骨格の外
被を形成し、海綿質または髄様骨は骨格の内腔を通る層板を形成する。これらの
2つの形態の代謝作用に対する応答および骨折の受けやすさは異なる。
【０００９】 骨は、生涯連続的な再造形（代謝回転、再生）を受ける。物理的および電気的
力、ホルモンおよび局所調節因子は、再造形に影響を与える。骨は、時間と空間
に関連する二つの対立する活性により再生される(Parfitt 1979)。これらの活性
−再吸収および形成−は、骨再造形単位として知られる一過性構造組織内に含有
される(Parfitt 1981)。所定の骨再造形単位内で、古い骨が破骨細胞により再吸
収される。破骨細胞により生じる再吸収された腔は、その後、骨の有機基質を合
成する骨芽細胞により新しい骨で満たされる。
【００１０】 ピークの骨の質量は、陽性の効果を有することができる食物因子および物理的
活性によって、主として遺伝学的に測定される。骨格の成長が終わる点でピーク
の骨の質量に到達し、その後骨減損が開始する。
【００１１】 骨粗しょう症において、成長中に起こる陽性の平衡と対照的に、再吸収された
腔は、完全には骨によって再び満たされない(Parfitt 1988)。骨粗しょう症、ま
たは多孔性の骨は、低質量の骨および骨組織の構造劣化により特徴付けられる進
行性のおよび慢性の病気であり、骨がもろくなり股関節部、脊柱、および手首の
骨折しやすくなる（骨の強度が減少する）。
【００１２】 骨の減損は徴候なく起こる。Consensus Development Conference(Am J Med 94
:646-50,1993)は、骨粗しょう症を「低質量の骨および骨組織の微小構造の劣化
により特徴付けられ、結果として生ずる骨のもろさおよび骨折しやすさの増加を
伴う全身性の骨格病」と定義した。
【００１３】 骨粗しょう症の一般的な種類には、閉経後の骨粗しょう症；および晩年、例え
ば70歳以降に通常起こる老年性の骨粗しょう症が含まれる；例えばここで完全に
引用される、米国特許第5,691,153号およびその中とその実行中で引用される文
献を参照。
【００１４】 米国内で2500万人以上が骨粗しょう症に冒されていると予測される(Rosen 199
7)；また、少なくとも一つの予測により、3人に1人の女性が骨粗しょう症に冒さ
れていると断言される(Keen et al.1997)。しかしながら、平均寿命が増加し、
西洋の国では、女性の17％が現在50歳を超えている；また、女性は閉経後に人生
の3分の1を生きることを期待できる。したがって、2人に1人の女性および5人に1
人の男性は結局骨粗しょう症を発現し；米国、日本およびヨーロッパの7500万人
が骨粗しょう症を有するするという予測もある。骨粗しょう症協会の世界首脳会
談(The World Summit of Osteoporosis Societies)は、世界中で2億人以上が骨
粗しょう症に冒されていると予測する。骨粗しょう症の実際の発病率は、骨が骨
折するまで状態がしばしば漸近的であるので、判断するのが困難である。米国で
年間150万を超える骨粗しょう症に関連する骨折があり、そのうち300,000が股関
節部の骨折であり、通常は入院および手術が必要であり、長期間または永久的な
障害または死さえも生じ得る。（Spangler et al.の「骨粗しょう症の遺伝的構
成要素の小雑誌」;http://www.csa.com.osteointro.html参照） さらに、年輩の女性の股関節部の骨折に相関する死亡率は20−30％であり（米
国特許第5,691,153号）；そのような股関節部の骨折を有する女性は同じ年齢の
人より10−15％死亡する可能性が大きいと報告されている。さらに、男性は女性
より股関節部の障害が少ないが、男性は障害の1年以内に死亡する可能性が女性
より25％大きい。Sprangler et al.,supra参照。また、股関節部の骨折前は独立
して生活していた患者の約25％が、１年後も長期健康介護施設に閉じこもったま
まであり；骨粗しょう症および関連する骨折の治療には年間1000億ドルかかる。
【００１５】 したがって、骨粗しょう症は、事実上全ての社会における主要な健康問題であ
る（ここに引用される、Eisman 1996;Wark 1996;米国特許第5,834,200号および
そこに引用される文献）。
【００１６】 例えばアレンドロネート(Fosamax)のようなビスホスホネート、並びにエスト
ロゲンとエストロゲンレセプターモジュレーター、プロゲスチン、カルシトニン
、およびビタミンDのHRT（ホルモン補充療法）ような骨粗しょう症の治療は、さ
らなる骨の減損および骨折の防止に役立つ。
【００１７】 特定の人が骨粗しょう症を発現するか否かを決定する因子は多数存在するであ
ろうが、骨粗しょう症の予防、コントロールまたは治療のための処置は、骨粗し
ょう症になるリスクがあるか否かを決定する。遺伝的因子は、骨粗しょう症の病
因において重要な役割を果たすといわれている（Ralston 1997;Keen et al.1997
;Eisman 1996;Rosen 1997;Cole 1998,Johnston et al.1995;Gong et al.1996;Wa
snich 1996 inter alia参照）。
【００１８】 骨の面積に依存して、骨の全変動（骨無機質密度;BMD）の50−60%が遺伝的効
果の原因であると考える者もいる(Livshits et al.1996)。しかしながら、骨無
機質密度の85%−95%までが遺伝的に決定されるかもしれない。
【００１９】 例えば、家系の歴史、双生児の研究、および人種上の因子から研究によって示
されるように、骨粗しょう症になる素因があるかもしれない（例えば、Jouanny
et al.1995;Garnero et al.1996;Cummings 1996;Lonzer et al.1996参照）。こ
れには多数の候補遺伝子が含まれるかもしれないが、ほとんどはおそらく数世代
にわたる過程である。
【００２０】 ビタミンDレセプター遺伝子(VDR)対立遺伝子の変異とBMDとの間の関連が考え
られている。ビタミンDレセプター(VDR)遺伝子座における制限酵素断片長多型性
(RFLP)は、最近、骨無機質密度(BMD)および骨減損率に相関すると考えられてい
る（例えば、Tokita et al.1996;Cole et al.1998;Eisman 1996;Keen et al.Ral
ston 1997;Fujita 1996;Houston et al.1996;Riggs et al.1995;Fleet et al.19
95;Krall et al.1995参照）。
【００２１】 コラーゲンI型アルファ遺伝子が関係している（例えば、Dalgleish 1997;Pere
ira et al.1995参照）。COLIA1およびCOLIA2遺伝子は、重要な骨タンパク質であ
るI型コラーゲンをコードし、したがって骨の質量の遺伝的コントロールにおい
てある役割を果たすかもしれない。
【００２２】 エストロゲンレセプター(ER)遺伝子の突然変異は、骨粗しょう症のいくつかの
場合に関係しているかもしれない（ER遺伝子の多型性は、いくつかの母集団にお
いてBMDと相関する）（Sano et al.1995;米国特許第5,834,200号参照）。
【００２３】 インターロイキン1(IL-1)および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)もまた
、最近の研究において骨粗しょう症の病因に関係している。これらの予炎症性サ
イトカインは、それぞれプロスタグランジン(PG)およびNOの放出を伴い、シクロ
オキシゲナーゼ(COX)および一酸化窒素シンターゼ(NOS)のいずれも誘導する。サ
イトカインは、エストロゲン／テストステロン、甲状腺ホルモンおよび1,25(OH)
2D3からのすぐれたコントロール下であるが、骨の再吸収および形成の強力な調
節因子であることが示されている。サイトカインには例えばIL-1（インターロイ
キン−1）、TNF（腫瘍壊死因子）およびIL-6（インターロイキン−6）のように
破骨細胞の骨再吸収を主として強めるものもあるのに対し、例えばTGF-ベータ（
トランスホーミング増殖因子）、IGF（インシュリン様増殖因子）およびPDGF（
血小板由来増殖因子）のように骨形成を主として強めるものもある。
【００２４】 病気を実際的にコントロール、予防および治療する現在の可能性をさらに探究
し拡大するための臨床的および疫学的研究が必要とされている。骨細胞の活性お
よび骨の無機質と基質の形成と再造形の調節をコントロールする因子についての
より深い知識が所望である。
【００２５】 さらに、高い骨の質量または骨無機質密度が低くあるいは高くなる素因を検出
するためにある遺伝的因子が有用であるかもしれないのに対し（米国特許第5,69
1,153号および同第5,834,200号参照）、骨粗しょう症になるリスクを測定するた
めのさらなるテストが必要とされ；また、骨粗しょう症または骨粗しょう症を引
き起こす因子あるいは過程をコントロールするための新しい治療、予防、または
方法が必要とされる。
【００２６】発明の目的および概要 本発明の目的には、臨床的および疫学的研究の進歩および／または病気を実際
にコントロール、予防および治療する現在の可能性のさらなる探究および拡大；
骨細胞の活性および骨の無機質と基質の形成と再造形の調節をコントロールする
因子についての知識のさらなる提供；骨粗しょう症になるリスクを測定するため
のさらなるテストの提供；および／または骨粗しょう症または骨粗しょう症を引
き起こす因子あるいは過程をコントロールするための新しい治療、予防、または
方法、のいずれか1つまたはいずれかの組合せまたは全てが含まれてもよい。
【００２７】 本発明は、物理的ストレスにより誘発される遺伝子、そのためのプローブ、そ
のような遺伝子を同定するためのテスト、そのような遺伝子の発現産物、例えば
骨粗しょう症または骨粗しょう症を引き起こす因子あるいは過程の診断（例えば
リスク測定）、治療、予防、またはコントロールにおけるそのような遺伝子およ
び発現産物の使用を提供する。したがって、本発明はさらに、診断、治療、予防
、またはコントロールの方法または過程、並びに組成物を提供する。
【００２８】 生体中で発現がRNAレベルで調節される遺伝子を同定する方法であって、スト
レス誘発因子によってより大きいmRNAのサンプルの一部である未知の標的mRNAの
翻訳を選択的に刺激し、mRNAの該サンプルを翻訳されたおよび翻訳されていない
mRNAのプールに分離し、mRNAのプールを示差分析してストレス誘発因子により翻
訳が調節された遺伝子を同定する、各工程を含む方法が開示される。ストレス誘
発因子には、病的刺激、化学的および物理的ストレッサーを含む環境刺激または
mRNA翻訳を誘発する他の刺激が含まれてもよい。ストレス誘発因子には、物理的
ストレスが含まれてもよい。サンプルには、例えば頭蓋冠細胞のような、培地中
において骨細胞であり続ける骨細胞が含まれてもよい。
【００２９】 本出願によれば、多数の可能な調節レベルで調節され得る遺伝子を同定する方
法が開示される。そのような方法には、物理的、化学的、毒性の、薬学的または
他のストレス、ホルモン、生理的障害または病気のようなキューまたは刺激に細
胞または組織をさらし；該細胞をポリソーム、核、細胞質およびスプライセオソ
ームのような画分に分別し；これらの分画からmRNAを抽出し、該mRNAを遺伝子発
現分析(GEM)のような一般に是認された体系を使用する示差分析にかける、各工
程が含まれる。
【００３０】 例えば、本出願には、核からのRNA単離を使用して、安定状態のレベルが小さ
い変化しか示さない遺伝子を単離することが開示されるが、これにより核RNAプ
ローブにより検出された場合に高い示差発現が示される。大部分のそのような遺
伝子は、転写レベルで調節される。調節の一つの種類は、細胞／組織から単離さ
れたポリソームを使用し、mRNAの安定状態のレベルが、変化しないがストレスキ
ューの投与後ポリソーム中で非常に増加する遺伝子を同定して示される。転写レ
ベルで調節される遺伝子のサブグループには、内部リボソームエントリー部位の
存在が含まれる。そのような遺伝子を同定する方法であって、細胞中で5’キャ
ップ依存性mRNA翻訳を抑制し、該細胞からmRNAのプールを集め、該mRNAのプール
を示差分析して内部リボソームエントリー部位をコードする配列を有する遺伝子
を同定する、各工程を含む方法が開示される。
【００３１】 したがって、本出願には、発現が特定のキューに応答する遺伝子を同定する方
法または過程であって、 (a)生体または組織または細胞にキューを与え、 (b)前記キューを受けた前記組織または細胞から特定の細胞分画を単離し、 (c)前記細胞分画からmRNAを抽出し、 (d)キューを受けていない対照サンプルと比較して前記mRNAサンプルを示差分析
し、キューに応答した遺伝子を同定する、 各工程を含む方法または過程が開示される。
【００３２】 細胞または組織は、培地中において骨細胞である性質を保持する骨細胞でもよ
く、キューは物理的ストレスまたはその欠乏でもよい。
【００３３】 キューは、毒素または化学的、または薬学的、または物理的ストレス、または
電流、または病原体または病的状態、またはホルモン、または特定のタンパク質
でもよい。キューはさらに、細胞の化学的治療、または細胞の照射、または細胞
の脱酸素として定義してもよい。キューはさらに、遺伝子翻訳との未知の関係の
ストレス誘発因子として定義してもよい。
【００３４】 遺伝子は翻訳レベルで同定され；遺伝子は転写レベルで調節され；遺伝子はRN
A安定性により調節され；遺伝子は核と細胞質との間のmRNA輸送速度により調節
され；遺伝子は示差スプライシングにより調節され；遺伝子はアンチセンスRNA
により調節されてもよい。
【００３５】 mRNAサンプルはさらに、mRNA半分画に分別され、示差分析されて、ここで定義
される発現調節の全レベルにおいてキューに応答する遺伝子を同定し応答のアバ
ンダンスおよび方向を決定してもよい。mRNAサンプルは、細胞質、核、ポリリボ
ソーム、サブポリリボソーム、ミクロソームまたは粗面小胞体、ミトコンドリア
およびスプライセオソーム関連mRNAからなる群から一つ以上の半分画に分別され
てもよい。
【００３６】 示差分析工程は、示差表示、表示示差分析(RDA)、抑制サブトラクションハイ
ブリダイゼーション(SSH)、遺伝子発現の連続分析(SAGE)、遺伝子発現ミクロア
レイ(GEM)、核酸チップ技術、オリゴヌクレオチドチップ技術；DNA膜アレイ；ダ
イレクトシークエンスおよびこれらの方法の組合せからなる群より選択してもよ
い。示差分析工程はさらに、翻訳レベルで調節される遺伝子を同定および測定す
るものとして定義してもよい。示差分析工程はまた、さらに、転写レベルで調節
される遺伝子を同定および測定するものとして定義してもよい。示差分析工程は
また、さらに、RNA安定性により調節される遺伝子を同定および測定するものと
して定義してもよい。示差分析工程はまた、その上さらに、核と細胞質との間の
mRNA輸送速度により調節される遺伝子を同定および測定するものとして得定義し
てもよい。示差分析工程はまた、さらに、示差スプライシングにより調節される
遺伝子を同定および測定するものとして定義してもよい。示差分析工程はその上
、さらに、分泌および膜タンパク質をコードする遺伝子を同定および測定するも
のとして定義してもよい。示差分析工程はまた、さらに、核タンパク質をコード
する遺伝子を同定および測定するものとして定義してもよい。
【００３７】 本出願にはさらに、本発明のまたは開示される方法により哺乳類中でダウンレ
ギュレートされることが示される遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞
からの欠如または減少に基づく生理的または病気の状態を発生させるリスクを測
定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、 (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法が開示される。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまた
はタンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパ
ク質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠
失またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝
子の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較から
mRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これにより
生理的または病気の状態を発生させるリスクが測定される。
【００３８】 本出願にはさらに、哺乳類中で本発明のまたは開示される方法によりアップレ
ギュレートされることが示される遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞
からの存在または増加に基づく生理的または病気の状態のリスクを測定する方法
であって、 (a)前記哺乳類の細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、 (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法が開示される。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまた
はタンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパ
ク質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠
失またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝
子の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較から
mRNAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これにより
リスクが測定される。
【００３９】 これらの「測定する」方法は、例えば生理的または病気の状態を診断するよう
な、診断方法でもよい。
【００４０】 本出願にはさらに、同定された遺伝子のmRNAまたはタンパク質の正常細胞から
の欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増加に基づく、生理的また
は病気の状態あるいはそのまたはその徴候の原因となるまたは一因となる他の因
子のための薬剤または遺伝子治療アプローチをテストする方法であって、本発明
のまたは開示される方法を含み、さらに(a’)前記薬剤または遺伝子治療を施し
、比較から関連mRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは
正常細胞からの存在または増加を測定し、これにより前記薬剤または遺伝子治療
の効力を測定する、各工程を含む方法が開示される。
【００４１】 本出願にはさらに、生理的または病気の状態を治療、予防またはコントロール
する方法であって、本発明のまたは開示される方法を含み、さらにそのためにま
たはその原因またはその徴候のために薬剤または治療を投与する工程を含む方法
が開示される。
【００４２】 本発明の薬剤または治療には、タンパク質、その機能性部分、該タンパク質ま
たはその機能性部分を発現するベクター、または該タンパク質またはその機能性
部分の抑制因子、または該タンパク質またはその機能性部分をコードする核酸の
抑制因子が含まれてもよい。
【００４３】 本発明のまたは開示される方法はさらに、 (d)前記哺乳類の細胞中の二次遺伝子mRNAのレベルまたは状態を測定し、 (e)前記哺乳類の細胞中の二次遺伝子産物により発現されるタンパク質のレベル
または状態を測定し、 (f)該mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対
応するレベルと比較する、 各工程を含んでもよい。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたはタンパ
ク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク質また
はプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が、突然変異、欠失また
はタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子の全
活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からリスク
が測定される。
【００４４】 工程(a)および／または(b)および必要に応じて(d)および／または(e)はインビ
ボで行い、および／または工程(a)および／または(b)および必要に応じて(d)お
よび／または(e)はインビトロで行ってもよい。工程(a)および必要に応じて工程
(d)における測定は、 (i)タンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子の少なくとも一部に対応す
る核酸配列および必要に応じて二次タンパク質の少なくとも一部をコードする二
次遺伝子の少なくとも一部に対応する二次核酸配列、 (ii)(i)の核酸配列に相補的な核酸配列、 または (iii)(i)または(ii)の核酸配列にハイブリダイズするプライマーまたはプライマ
ー対、 を使用することにより実施できる。
【００４５】 工程(b)および必要に応じて工程(e)の測定は、タンパク質に特異的に結合する
抗体またはその断片の使用によりおよび必要に応じて二次タンパク質に特異的に
結合する二次抗体またはその断片の使用により実施できる。
【００４６】 本発明の方法においては、刺激は物理的ストレスまたはその欠乏でもよく、サ
ンプルには培地中で特性を保持する骨細胞が含まれる。
【００４７】 本発明はさらに、遺伝子を同定する方法であって、モデルシステムからプロー
ブを調製し、DNAチップハイブリダイゼーションを分析し、示差発現を示すクロ
ーンを配列決定し、必要に応じて関心のあるクローンを全長クローニングする、
各工程を含む方法を提供する。
【００４８】 モデルシステムには、物理的ストレスを有するまたは適用される物理的ストレ
スを欠く培地中で骨細胞の性質を保持する骨細胞が含まれてもよい。骨細胞には
、頭蓋冠一次培養が含まれてもよい。
【００４９】 本発明はさらに、本発明の方法によりダウンレギュレートされることが示され
る遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少に基づき
、骨粗しょう症または低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症または物理的
ストレスを含むまたは欠く他の状態の原因または一因となる他の因子を発生させ
るリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の骨細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の骨細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【００５０】 本発明はさらに、哺乳類中で本発明の方法によりアップレギュレートされるこ
とが示される遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増
加に基づき、骨粗しょう症または低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症ま
たは物理的ストレスを含むまたは欠く他の状態の原因または一因となる他の因子
を発生させるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の骨細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の骨細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【００５１】 本発明はまた、608からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または
減少に基づき、骨粗しょう症または低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症
またはより低いレベルの骨芽細胞および軟骨細胞あるいは物理的ストレスを含む
または欠く他の状態の原因または一因となる他の因子を発生させるリスクを測定
する方法であって、 (a)前記哺乳類の骨細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の骨細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【００５２】 さらに、本発明は、哺乳類中において405からのmRNAまたはタンパク質の正常
細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増加に基づき、骨
粗しょう症を発生するリスクまたは低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症
の原因または一因となる他の因子または骨形成原細胞および軟骨形成細胞に関す
る不均衡または物理的ストレスを含むまたは欠く他の状態のリスクを測定する方
法であって、 (a)前記哺乳類の骨細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の骨細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【００５３】 さらに、本発明は、哺乳類中の274からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞か
らの存在または増加あるいは正常細胞からの欠如または減少に基づき、骨粗しょ
う症または低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症の原因または一因となる
他の因子を発生するリスクまたは骨粗しょう症または環境因子の影響を受けやす
くなる、またはリンパ系細胞が少なくなる、または骨粗しょう症、または物理的
ストレスを含むまたは欠く他の状態に向かう骨の素因の環境因子またはそれ以外
の他の遺伝的因子の影響を受けるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の骨細胞中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の骨細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【００５４】 これらの「測定する」方法は、例えば骨粗しょう症を診断する方法またはこれ
らの「測定する」方法の前口上で示される他の状態を診断する方法のような、診
断方法でもよい。
【００５５】 また、本発明はさらに、mRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減
少あるいは正常細胞からの存在または増加に基づき、骨粗しょう症あるいは骨粗
しょう症またはその徴候または物理的ストレスを有するまたは欠く他の状態の原
因または一因となる骨密度または他の因子のための薬剤または遺伝子治療アプロ
ーチをテストする方法であって、前述の本発明の任意の一つによる方法を含み、
さらに(a’)前記薬剤または遺伝子治療を施し、前記比較から関連mRNAまたはタ
ンパク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増
加を測定し、これにより前記薬剤または遺伝子治療の効力を測定する、各工程を
含む方法を提供する。
【００５６】 本発明はまた、本発明の方法により同定される他の遺伝子、例えばCMF2-224、
CMF2-45に関して、類似する方法を含む。
【００５７】 同様に、本発明はさらに、物理的ストレスを含むまたは欠乏する骨粗しょう症
または他の状態を治療、予防またはコントロールする方法であって、前述の本発
明の方法の任意の一つに従う方法を含み、さらに骨粗しょう症またはその原因あ
るいは症状のための薬剤または治療を適用する工程を含む方法を提供する。
【００５８】 さらに、本発明は、遺伝子またはその一部あるいは該遺伝子またはその一部に
より発現されるタンパク質またはその一部あるいは該タンパク質またはその一部
に結合する抗体またはその一部を含む組成物であって、前記遺伝子が本発明の方
法により同定される組成物を提供する。
【００５９】 さらに、本発明は、物理的ストレスが適用されるまたは適用される物理的スト
レスを欠く培地中で骨細胞の性質を保持する骨細胞を含む、骨粗しょう症または
物理的ストレスまたはその欠乏モデルを提供する。
【００６０】 本発明はさらに、ここで同定されるタンパク質608をコードする単離された核
酸分子またはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同一
であるポリペプチドを提供する。
【００６１】 さらに、本発明は、ここで同定されるタンパク質405をコードする単離された
核酸分子またはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同
一であるポリペプチドを提供する。
【００６２】 また、本発明は、ここで同定されるタンパク質274をコードする単離された核
酸分子またはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同一
であるポリペプチドを提供する。
【００６３】 本発明は、ヒトタンパク質608またはその機能的部分をコードする単離された
核酸分子を含む。本発明はさらに、ヒトタンパク質405またはその機能的部分を
コードする単離された核酸分子を含む。また、本発明はヒトタンパク質274また
はその機能的部分をコードする単離された核酸分子含む。特定の実施の形態にお
いて、本発明は、ここで配列番号、並びにその機能的部分により同定される単離
された核酸分子を提供する。
【００６４】 本発明はさらに、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、そのようなベ
クターを含む組成物、そのような単離された核酸分子に特異的にハイブリッド形
成するプローブまたはプライマー、およびそのような単離された核酸分子の発現
産物を含む。
【００６５】 本発明はさらに、ここでタンパク質608と同定される単離されたポリペプチド
またはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同一である
ポリペプチドを提供する。
【００６６】 本発明はまた、ここでタンパク質405と同定される単離されたポリペプチドま
たはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同一であるポ
リペプチドを提供する。
【００６７】 また、本発明は、ここでタンパク質274と同定される単離されたポリペプチド
またはその機能的部分あるいはそれに少なくとも実質的に相同または同一である
ポリペプチドを提供する。
【００６８】 本発明は、ヒトタンパク質608である単離されたポリペプチドまたはその機能
的部分、並びにヒトタンパク質405である単離されたポリペプチドまたはその機
能的部分、およびヒトタンパク質274である単離されたポリペプチドまたはその
機能的部分を含む。本発明はさらに、配列同定番号により同定されるポリペプチ
ド、並びに配列同定番号により同定される核酸分子の発現からのポリペプチド；
およびその機能的部分を含む。さらに、本発明には、本発明のポリペプチドまた
はその一部を含む組成物が含まれる。さらに、本発明は、本発明のポリペプチド
またはその機能的部分により惹起される抗体、並びにそのような抗体の機能的部
分；およびそのような抗体またはその一部を含む組成物を考慮に入れる。
【００６９】 本発明はさらに、骨粗しょう症あるいは骨粗しょう症またはその徴候または物
理的ストレスを有するまたは欠く他の状態の原因または一因となる骨密度または
他の因子を予防、治療またはコントロールする方法であって、本発明のポリペプ
チドまたはその一部を適用する工程を含み；したがって、本発明には、そのよう
な予防、治療またはコントロールのための薬剤の調製または治療におけるポリペ
プチドの使用が含まれる。
【００７０】 本発明はさらに、骨粗しょう症あるいは骨粗しょう症またはその徴候または物
理的ストレスを有するまたは欠く他の状態の原因または一因となる骨密度または
他の因子を予防、治療またはコントロールする方法であって、本発明のベクター
または本発明の核酸分子を適用する工程を含み；したがって、本発明には、その
ような予防、治療またはコントロールのための薬剤の調製または治療におけるそ
のようなベクターまたは核酸分子の使用が含まれる。
【００７１】 本発明はまた、骨粗しょう症あるいは骨粗しょう症またはその徴候または物理
的ストレスを有するまたは欠く他の状態の原因または一因となる骨密度または他
の因子を予防、治療またはコントロールする方法であって、本発明の方法または
本発明のモデルにおいて同定される遺伝子またはその機能的部分あるいはその発
現産物またはそのような発現産物またはその一部により惹起される抗体またはそ
の一部を含む組成物を適用する工程が含まれる；したがって、本発明にはさらに
、そのようなコントロール、予防または治療のための薬剤の調製または治療にお
いて、そのような遺伝子、発現産物、抗体、その一部が含まれる。
【００７２】 本発明はさらに、ポリペプチドを調製する方法であって、該ポリペプチドを本
発明のベクターまたは本発明の遺伝子あるいは本発明の方法またはモデルにおい
て同定される遺伝子、またはそのような遺伝子の一部を発現させる工程を含む方
法を提供する。
【００７３】 さらに、本発明は、本発明の方法、物質／産物、および／またはモデルを含む
骨の発達および／または骨粗しょう症の調査または研究の進歩を構想する。
【００７４】 本発明には、(a)頭蓋冠一次細胞培養に施用された物理力および(b)同じ培養に
施用されたPGE2の治療の影響下で示差発現をする遺伝子が含まれる。さらに、本
発明はカルシウム枯渇の影響を含む。したがって、示差発現をする遺伝子は、骨
粗しょう症または他の物理的ストレスまたはその欠乏に関する状態の原因となる
過程に関係することが示される。
【００７５】 本発明の方法により同定されるある遺伝子は、ここでエストロゲンに応答する
。ここに開示される方法から、本発明の方法により同定される遺伝子が応答する
化合物を同定することができる。したがって、本発明には、本発明の方法の任意
の一つにより同定される遺伝子に影響を与える方法であって、該遺伝子を含有す
る細胞を、該遺伝子が応答する化合物と接触させる；例えば、化合物をここに記
載される組成物または製剤として施用する、工程を含む方法が含まれる。したが
って、例えば、エストロゲンに応答する遺伝子に関して、本発明は該遺伝子に影
響を与える（例えば発現を刺激する、発現を抑制する等）方法であって、該遺伝
子を含有する細胞を、エストロゲンまたはその誘導体または前駆体、例えば17−
βエストラジオール等と接触させる工程を含む方法を考慮する。
【００７６】 本明細書中において、「含む」という用語は、米国特許法において有すると考
えられる意味を有する。
【００７７】 これらのおよび他の実施の形態が開示されるまたは以下の発明の詳細な説明か
ら明らかでありそれに含まれる。
【００７８】図面の簡単な説明 実施例として与えられるが、本発明を記載される特定の実施の形態に制限する
ことを意図しない以下の詳細な説明は、ここに組み込まれる添付の図面に関連し
て理解されてもよい。
【００７９】 図１Aは、ショ糖密度勾配における細胞質RNAの分別の吸光度特性を示し、吸光
度(254nmにおける)は細胞質RNAの沈降速度に対してプロットされる。
【００８０】 図１Bは、アガロースゲル上で電気泳動されエチジウムブロマイドで染色され
てRNAの分別を示す、精製されたRNAを示す。
【００８１】 図２は、トータルRNAのプローブ(Tot)を核RNAに由来するプローブ(STP)に比較
するDNAチップハイブリッド形成の結果を示す。
【００８２】 図２Aは、本発明の方法により同定される遺伝子、およびそのための配列また
はそのESTの配列を示す表である。
【００８３】 図３は、本発明の核酸分子608についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこか
らの発現産物を示し、図３は5’端方向に追加のタンパク質配列を示す点で他の6
08配列と異なる。
【００８４】 図４は、正常細胞および物理的ストレスを与えられた細胞中の標的mRNAにおけ
る本発明の核酸分子608の5’断片プローブの結果を示す。
【００８５】 図５は、本発明の核酸分子608についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこか
らの発現産物を示す。
【００８６】 図６は、本発明の核酸分子608およびそのためのプローブに関するクラスタルX
(1.64b)複合配列整合(Clustal X Multiple Sequence Alignment)を示す。
【００８７】 図７は、ヒトk562の標的トータルRNAにおけるヒト405のプローブの結果を示す
。
【００８８】 図８は、標的ラットcmf RNAにおけるヒト405のプローブの結果を示す。
【００８９】 図９および図１０は、本発明の核酸分子405についてのDNAおよびアミノ酸配列
およびそこからの発現産物を示す。
【００９０】 図１１は、本発明の核酸分子405およびそのためのプローブに関するクラスタ
ルX(1.64b)複合配列整合を示す。
【００９１】 図１２は、標的のラットの骨、ラット精巣およびヒト細胞系NB4トータルRNA供
給源におけるヒト274の8KBのプローブの結果を示す。
【００９２】 図１３は、本発明の核酸分子274についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこ
からの発現産物を示す。
【００９３】 図１４は、本発明の核酸分子274についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこ
からの発現産物を示す。
【００９４】 （例えば608についての配列図の点およびプラス／マイナス記号のような配列図
上の印は、多くのタンパク質において見られるIgG反復のような反復を示す；608
配列表中に約20のそのようなIgG反復が存在する。）詳細な説明 既述のように、ここには、生体中で発現がRNAレベルで調節される遺伝子を同
定する方法が開示される。
【００９５】 さらに特定すると、ここには、より大きいサンプルの一部であり、ストレス誘
発因子により未知の標的mRNAを選択的に刺激することにより発現がmRNAレベルで
少なくとも一部調節される遺伝子を同定する方法が開示される。生体は、適切な
mRNAを提供する任意の生体でよい。mRNAサンプルは、ストレス誘発因子により翻
訳において調節される遺伝子を同定するために示差分析される発現調節およびタ
ンパク質局在に基づく細胞画分に由来する。この方法は、特定のキューに応答す
る遺伝子を同定およびクローニングすることを目的とする。すなわち、本発明の
方法は、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされて、特定の病状、ス
トレス、生理的条件等、および通常は細胞または生体に影響を及ぼしてその遺伝
子発現を変化させることができる因子に応答する遺伝子を同定およびクローニン
グすることを目的とする。
【００９６】 本明細書は、基本的な細胞機能に関係し生体中で任意のレベルで調節される遺
伝子を同定およびクローニングする新しいアプローチを提供する。本発明の基礎
となる理論は、遺伝子発現の調節は異なるレベル（様式）でコントロールするこ
とができ、それぞれの異なる調節レベルは細胞中の特定のmRNAの分布におけるあ
る相違により維持されるということの知識に依存する。翻訳により調節される遺
伝子において、mRNAは不活性形態で細胞中に保存され、ポリソーム上では見られ
ない。適切な外部のキューの後、mRNAはポリソーム中に組み込まれて翻訳され、
コードされたタンパク質が素早く発生する。所定の時間で「活性」または「不活
性」であるmRNA母集団を比較することにより、「シフト機構(shift mechanism)
」と称される機構により調節される遺伝子を同定できる。
【００９７】 主な調節レベルが核から細胞質までのmRNAの活性輸送である遺伝子は、核中に
保存され、適切なキューでmRNAは細胞質に輸送される。キューの前後に核および
細胞質から単離されたmRNAの比較により、このようにコントロールされる遺伝子
が発見できる。核に由来するmRNAの比較により、多くの遺伝子の転写活性を直接
分析することもできる。多くの転写により活性化された遺伝子について、基底転
写活性が低い場合でもmRNAの基底レベルは細胞中に存在する。したがって、トー
タル細胞RNAが遺伝子発現の示差分析に使用される場合、増加した転写（5倍まで
）はしばしば不明確である。核RNAの使用により、基底mRNAは細胞質中で見られ
るので、多くの遺伝子の転写活性を直接測定することが可能となる。結果は、示
差発現の検出についての感度の大きな増加である。
【００９８】 mRNA安定性の調節の場合には、そのようなmRNAはキューの適用の前後に同様に
転写され、核mRNAプール中で同様に豊富となる。しかしながら、mRNAがキューの
後に安定化される場合、細胞質における発生量はより高くなるであろう。mRNAの
輸送の調節の場合には、そのようなmRNAはキューの前に高レベルで核中におよび
低レベルで細胞質中に存在すると考えられ、この状況はキューの適用後に逆にな
る。したがって、二つの調節様式の間で区別をすることは容易である。
【００９９】 本発明の方法は、翻訳レベルで調節される遺伝子；転写レベルで調節される遺
伝子；RNA安定性により調節される遺伝子；核および細胞質の間のmRNA輸送速度
により調節される遺伝子；および示差スプライシングにより調節される遺伝子の
同定を含む。すなわち、発現がmRNAレベルで少なくとも部分的にコントロールさ
れるまたは調節される遺伝子を同定することができる。
【０１００】 本発明の方法により、分泌されたタンパク質および膜タンパク質をコードする
遺伝子；核タンパク質をコードする遺伝子；ミトコンドリアタンパク質をコード
する遺伝子；および細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子が同定される。さら
に、発現がmRNAレベルでコントロールできる任意の他の遺伝子を、本発明の方法
により同定することができる。
【０１０１】 ここで用いたように、RNAとは細胞培養から単離されたRNAを称し、培養された
組織または刺激され、分化され、化学化合物に暴露された生体から単離された細
胞または組織を病原に感染させるまたは別な方法で刺激する。ここで用いたよう
に、翻訳はmRNAテンプレートにおけるタンパク質の合成として定義される。
【０１０２】 ここで用いたように、未知の標的mRNAまたは刺激因子の翻訳、転写、安定性ま
たは輸送には、病的および／またはストレス条件下で天然の組織および／または
細胞に由来する遺伝子から化学的、病原的、物理的、または他の方法でmRNA母集
団を誘発または抑制することが含まれる。いいかえれば、ストレス誘発因子また
は「ストレッサー」により遺伝子のmRNAの発現を刺激することには、サンプルか
ら細胞中で未翻訳のmRNAとして蓄えられるmRNAの翻訳を刺激または開始する外部
キュー、刺激、またはの適用が含まれる。ストレッサーは、あるmRNAの安定性を
増加させ得る、または特定のmRNAの核から細胞質までの輸送を誘発し得る。スト
レッサーはまた、遺伝子転写を誘発し得る。天然の細胞／組織中で遺伝子からの
mRNAの翻訳を刺激することに加えて、刺激には病的および／またはストレス条件
下における遺伝子の誘発および／または抑制が含まれる。本発明の方法は、刺激
またはストレッサーを使用して、ストレス誘発因子またはストレッサーにより様
々の可能なレベルで調節される未知の標的遺伝子を同定する。
【０１０３】 本発明の方法は、以前はともに使用されなかった方法論を共同作用的に統合す
る。
【０１０４】 一つの方法論には、ポリソーム、核、細胞質またはスプライセオソームに由来
するmRNAの分離したプールへの細胞mRNAの分配が含まれる。
【０１０５】 別の方法論には、示差表示のような示差分析、表示相違分析(RDA)、遺伝子発
現マイクロアレイ(GEM)、抑制差引きハイブリッド形成(SSH)(Diatchenko et al.
, 1996)、およびAffymax Technologies N.V.に譲渡されたRava et al.の米国特
許第5,545,531号により例示されるチップ技術のようなオリゴヌクレオチドチッ
プ技術およびHyseq, Incの国際特許出願公開第96/17957号により例示されるダイ
レクトシークエンスの方法により、分離したプール中で見られるmRNAの種類の相
対的な発生量を同時に比較することが含まれる。
【０１０６】 簡単に言えば、差引きハイブリッド形成は、溶液中のハイブリッド形成による
mRNAの差引きとして定義される。二つのプールに共通のRNAは、除去可能な二本
鎖を形成し、一つのプールにおいて独特のまたはより豊富なRNAを豊富にする。
示差表示は、cDNAへのmRNAの逆転写および変性プライマーによるPCR増幅として
定義される。二つのプールからの増幅産物の量の比較（電気泳動による）により
転写発生量が示される。RDA、GEM、SSH、SAGEは上述されている。
【０１０７】 翻訳調節される遺伝子を同定するために分析される特定の細胞／組織には、任
意の適切な細胞および／または組織が含まれてもよい。確立された細胞系であろ
うと細胞培養であろうとまたは暴露された生体から直接単離されようと、任意の
細胞型または組織を使用してもよい。
【０１０８】 本発明の方法により分析される細胞／組織を、生理的、化学的、環境のおよび
／または病的ストレス誘発因子またはストレッサーを使用して選択的に刺激する
または「ストレスを与える」ことにより、サンプル組織内のmRNAの翻訳を刺激し
、発現がmRNAレベルで少なくとも一部調節される遺伝子を同定する。刺激により
、アップまたはダウンレギュレーションが起こり得る。刺激の後、RNAを細胞／
組織から単離するまたは抽出する。RNAの単離は、当業者によく知られ記載され
ている技術、例えば「分子クローニング；実験マニュアル」(Cold Springs Harb
or Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)を使用して行うこ
とができる。細胞／組織からRNAを単離および抽出する他の方法を使用すること
もでき、当業者に知られるであろう(Mach et al., 1986, Jefferies et al., 19
94)。しかしながら、これらの方法論の多くのバリエーションが公表されている
。ここに記載される方法は、多くの試験の後慎重に選択した。
【０１０９】 翻訳中のmRNAはリボソームと付着しており、したがってリボソームの無い未翻
訳のmRNAとはショ糖密度勾配において異なる移動をするので、活性可能に翻訳さ
れるmRNAおよび未翻訳のままであるmRNAは、ショ糖密度勾配における分別、高速
ゲル濾過クロマトグラフィ、またはポリアクリルアミドゲルマトリックス分離(O
gishima et al., 1984, Menaker et al., 1974, Hirama et al., 1986, Mechler
, 1987, and Bharucha and Murthy, 1992)のような方法を使用して分離できる。
所定の時間に翻訳において活性のあるまたは活性の無いmRNA母集団を比較するこ
とにより、「シフト機構」により調節される遺伝子を同定することができる。
【０１１０】 ポリソーム分別および特異的分析は、転写または翻訳を特異的に抑制または修
飾し得る薬で標的細胞／組織を処理することにより容易にすることができる。そ
のような薬の例には、それぞれアクチノマイシンDおよびシクロヘキサミドがあ
る。
【０１１１】 分別を完了することにより、ポリソームの細別ができる。細別を行って、当該
技術において知られる方法により全ポリリボソームまたは膜結合リボソームの間
の識別をすることができる(Mechler, 1987)。さらに、mRNAサンプルを、当該技
術において知られる方法により以下の小区分または画分の一つ以上にさらに分け
てもよい：細胞質の、核の、ポリリボソームの、サブポリリボソームの、ミクロ
ソームのまたは粗面小胞体の、ミトコンドリアのおよびスプライセオソーム結合
mRNA。
【０１１２】 さらに特定すると、核画分は、実施例中に示されるようにCAD RNAの豊富な核
のリボ核タンパク質形態(Abundant Nuclear Ribonucleoprotein Form of CAD RN
A)(Sperling, 1984)と題される記事に示される方法を使用して得ることができ、
したがって、調節されるまたはストレス条件に反応性の遺伝子を同定する方法に
核RNAを使用することができる。さらに、特定の病状またはストレス条件に反応
性の遺伝子を同定する方法としてアンチセンスRNAを使用することができる。サ
ンプルからアンチセンスRNAを得るおよび単離するために使用する方法が要約に
おいて詳述される、Dimitrijevicにより記載される方法を使用して、アンチセン
スRNAを単離することができる。さらに、1983年にWalterおよびBlobelにより開
示された方法の改良である、実験の欄に示される本発明の方法を使用してミクロ
ソーム分画を得てもよい。
【０１１３】 トータルmRNA母集団をmRNAの分離した発現調節およびタンパク質局在プールに
単離および分割した後、これらのプールにおいて見られる多くのmRNAの種類の相
対的な発生量を、示差表示、オリゴヌクレオチドチップ、表示相違分析(RDA)、G
EM-遺伝子発現マイクロアレイ(Schena et al., 1995, Aiello et al., 1994, Sh
en et al., 1995, Bauer et al., 1993, Liang and Pardee, 1992, Liang and P
ardee, 1995, Liang et al, 1993, Braun et al., 1995, Hubank and Schatz, 1
994)および抑制サブトラクションハイブリダイゼーション(SSH)のような示差分
析技術を使用して同時に比較する。分画から単離されたRNAを、ポリA選択により
リボソームRNAを有しないmRNAにさらに精製することができる。この方法を使用
して多くのプールを分析できることに留意すべきである。すなわち、異なるスト
レッサーにさらされた異なる細胞アリコートを、互いに並びに対照サンプルと比
較することができる。
【０１１４】 ポリソーム、非ポリソーム、mRNP、核、細胞質、またはスプライセオソーム分
画に由来するRNAから作製される標識された核酸プローブ（cDNA、PCR産物または
cDNAから転写されたrRNAにおける）をプローブと使用して、Rava et al.の米国
特許第5,545,531号およびHyseq, Inc.の国際特許出願公開第96/17957号に示され
る(GEM)のような固体マトリックス様マイクロアレイ、およびクローンが電気泳
動後にブロットされるかまたは膜上に直接付着される（点ブロット）任意の種の
膜上に固定されるcDNA、ゲノムクローン、およびmRNAの種類を同定することがで
きる。
【０１１５】 ポリソームまたはポリリボソーム分画または他の分画に由来する分画をすべて
の未分別の物質に比較することは、翻訳調節の結果である発現レベルと翻訳の調
節自体から生じる発現レベルとの相違を識別するために不可欠である。ポリソー
ム分画または群には、膜結合型ポリソーム、遊離型または結合型ポリソームまた
は遊離型非結合ポリソーム群が含まれてもよい。
【０１１６】 示差（翻訳）発現した遺伝子を同定するためにポリソームの部分母集団を使用
することの重要性が実施例１に示されており、トータルmRNAを検出プローブとし
て使用した場合は熱ショック誘発下で翻訳により発現したとして多くの遺伝子は
検出されなかったが、ポリソームmRNAをプローブとして使用した場合、多くの遺
伝子が示差発現をしたとして同定された。実施例１に示されるように、ポリソー
ムmRNA分画をプローブとした場合、トータルmRNAに由来するプローブによる熱シ
ョック誘発下で多くの遺伝子が検出された。虚血病のような急性の病気について
のモデルである熱ショックにより、ポリソームプローブの重要性が示される。細
胞は不活性形態で臨界mRNAを貯蔵するので、mRNAは急性の事態においてポリソー
ム上にすぐに付着することができ（転写による産物を待つ必要無く）、翻訳され
て、細胞がストレス下で生存するために必要なタンパク質を産生する。
【０１１７】 翻訳により調節される遺伝子を同定する本発明の方法は、mRNAプールの供給源
により制限されない。したがって、本発明の方法を使用して、「シフト機構」に
より調節される病的および／またはストレス条件下で天然の細胞／組織からの遺
伝子を、並びに病的および／またはストレス条件下で誘発された／抑制された遺
伝子をクローン化することができる。病状には、病原体および外傷により起こる
病気を含む病気の状態が含まれる。ストレス条件には、病気の状態、物理的およ
び心理的外傷、および環境ストレスが含まれてもよい。示差分析の選択された方
法による分析の後、翻訳により調節されるものとして同定された遺伝子を、当業
者に知られる任意の適切なクローニング原理によりクローン化できる(Lisitsyn
and Wigler, 1993)。
【０１１８】 例えば、254nmにおける吸光度特性、図１Aに示されるような（または高速液体
クロマトグラフィまたはゲルシステムを使用する場合は別のサイズの基準）ショ
糖の密度勾配および図１Bに示されるようにアガロースゲル上における分画の電
気泳動が完了した後エチジウムブロマイドで染色される種類のRNAにより、分画
の種類が定義される場合にポリソームRNA対非ポリソームRNAのすべての可能な組
合せの示差比較をすることができる。図１Aにおいて、ポリソーム分画は、二つ
以上のリボソームが付着しているmRNAを有する分画である。この比較のための物
質および方法は、以下の実験の欄に示されている。
【０１１９】 示差比較には、それぞれの状態におけるポリソーム分画対非ポリソーム分画が
含まれてもよい。「状態」という用語は、異なる処理を受けまたは調節されて異
なる特徴を有するまたは異なる遺伝子群を発現する細胞系、一次細胞、または組
織のような同じ供給源からの細胞を意味する。例えば、このことは、分化、形質
転換、酸素欠乏、化学的処理、または放射のようなストレスの適用により達成で
きる。組合せには、例えば、 １．それぞれの（同じ密度で拡散する）またはプール内の状態のポリソーム分画 ２．それぞれの（同じ密度で拡散する）またはプール内の状態の非ポリソーム分
画 ３．それぞれの（同じ密度で拡散する）またはプール内の状態およびそれぞれの
状態内の非ポリソーム対ポリソーム ４．未分別のトータルRNAと比較可能なそれぞれの（同じ密度で拡散する）また
はプール内のそれぞれのポリソーム分画および非ポリソーム分画 が含まれてもよい。
【０１２０】 翻訳レベルで調節される遺伝子を同定するための上述される方法は、多くの用
途を有する。この方法の特別の用途は、任意の生理的または病的変化に関連する
細胞／組織中のmRNA発現のパターンにおける変化を検出するための使用である。
翻訳されたmRNA対未翻訳のmRNAを比較することにより、細胞／組織中のmRNA発現
のパターンの変化における生理的または病的キューまたはストレスの効果を観察
するおよび／または検出することができる。この方法を使用して、細胞／組織の
様々の生理的および病的活性ヘの効果または寄与を確かめるために多くのキュー
、刺激、またはストレッサーの効果を調べることができる。特に、本発明の方法
を使用して、薬または化学物質の適用前後の組織のmRNAパターンを比較すること
により個体への薬剤（薬）または他の化学物質の適用の結果を分析できる。この
分析は、翻訳調節のレベルで細胞／組織に影響を与える薬、化学物質、または他
の刺激の同定を考慮に入れている。この方法を使用して、特定のmRNAの種類が特
定の生理的または病気の状態に関連するか否かを確かめる、特に、外部刺激、す
なわち薬が翻訳レベルで調節される遺伝子に影響を与える特定の細胞／組織を確
かめることが可能である。
【０１２１】 翻訳レベルで調節される遺伝子の下位集団の同定には、内部リボソームエント
リー部位(IRES)をコードする遺伝子配列を同定し、細胞中の5’cap依存性mRNA翻
訳を抑制する一般的工程を含み、該細胞からmRNAのプールを集め、mRNAの該プー
ルを分析して内部リボソームエントリー部位をコードする配列を有する遺伝子を
同定する方法が含まれる。抑制工程はさらに、5’capに依存しないmRNA翻訳を選
択するものとして、またはポリオウィルス2Aプロテアーゼのようなプロテアーゼ
をコードする遺伝子のような遺伝子を組み込むことにより、定められる。この方
法には、遺伝子の発現をコントロールする工程が含まれてもよい。分析工程はさ
らに、示差表示分析として、または表示相違分析として、または遺伝子発現マイ
クロアレイ分析を行うものとして、定義されてもよい。この方法には、さらに翻
訳により調節されるとして同定された遺伝子をクローン化する工程が含まれても
よい。分析工程により、それぞれ同じ密度でまたはプール中で拡散するポリソー
ム分画を識別することができる。分析工程により、それぞれまたはプールとして
非ポリソーム分画を識別することができる。分析工程により、それぞれまたはプ
ール中で刺激されたポリソーム分画と非ポリソーム分画とを識別することができ
る。また、分析工程により、それぞれまたは未分別のトータルRNAプールと比較
したプール中でそれぞれのポリソーム分画と非ポリソーム分画とを識別すること
ができる。
【０１２２】 これらの方法を使用して、特定のmRNAの種類が特定の生理的または病気の状態
に関連するか否かを確かめる、特に、外部刺激、例えば薬が翻訳レベルで調節さ
れる遺伝子に影響を与える特定の細胞／組織を確かめることが可能である。
【０１２３】 したがって、ある態様において、本出願はまた、哺乳類中で本発明のまたはこ
こに開示される方法によりダウンレギュレートされることが示される遺伝子から
のmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少に基づく生理的または
病気の状態を発生させるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、 (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を開示する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１２４】 別の態様において、ここに本明細書により、哺乳類中で本発明のまたはここに
開示される方法によりアップレギュレートされることが示される遺伝子からのmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加に基づく生理的または病気
の状態のリスクを測定する方法であって、 (a) 前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、 (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法が提供される。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまた
はタンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパ
ク質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠
失またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝
子の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較から
mRNAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これにより
リスクが測定される。
【０１２５】 前記方法は、同定された遺伝子のmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如
または減少あるいは正常細胞からの存在または増加に基づく、生理的または病気
の状態あるいはそのまたはその徴候の原因となるまたは一因となる他の因子のた
めの薬剤または遺伝子治療アプローチをテストする本発明の方法であって、さら
に(a’)前記薬剤または遺伝子治療を施し、前記比較から関連mRNAまたはタンパ
ク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増加を
測定し、これにより前記薬剤または遺伝子治療の効力を測定する、各工程を含む
方法において使用することができる。
【０１２６】 同様に、さらなる態様において、ここに本明細書により、生理的または病気の
状態を治療、予防またはコントロールする方法であって、前記検出方法を含む、
該状態のためにまたはその原因またはその徴候のために薬剤または治療を施用す
る工程を含む方法が提供される。例えば、前記比較から、特定のmRNAまたはタン
パク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増加
が測定され、これによりリスクが測定され、前記薬剤または治療が施用される。
【０１２７】 本発明の方法はさらに、例えば、同じまたは同様の前記詳述を有し、 (d)前記哺乳類の細胞中の二次遺伝子mRNAのレベルまたは状態を測定し、 (e)前記哺乳類の細胞中の二次遺伝子産物により発現されるタンパク質のレベル
または状態を測定し、 (f)該mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対
応するレベルと比較する、 各工程を含む、上述される方法と類似する別のテスト方法と共に前記工程を使用
する工程を含んでもよい。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたはタン
パク質の量を意味する；「状態」という用語には、突然変異、欠失またはタンパ
ク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子の全活性に影
響を与える任意の他の修飾を受け得る遺伝子、mRNA、タンパク質またはプロモー
ター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が含まれる。
【０１２８】 欠如または減少あるいは存在または増加は、リスクと相関し得る。
【０１２９】 したがって、二次遺伝子は、本発明の方法によりまたはここに開示されるよう
に同定することができる。あるいはまたはさらに、二次遺伝子および／または追
加の工程を、他の方法、例えば、生理的または病気の状態あるいはそれに関連す
る状況または要因のリスクを測定する他の方法に従って測定できる。したがって
、そのような方法を本発明の方法と共に使用して、診断または検出体系を促進ま
たは改良することができる。
【０１３０】 本発明の方法において、工程(a)および／または(b)および必要に応じて(d)お
よび／または(e)はインビボで行い、および／または工程(a)および／または(b)
および必要に応じて(d)および／または(e)はインビトロで行ってもよい。
【０１３１】 工程(a)および必要に応じて工程(d)における測定は、 (i)タンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子の少なくとも一部に対応す
る核酸配列および必要に応じて二次タンパク質の少なくとも一部をコードする二
次遺伝子の少なくとも一部に対応する二次核酸配列、 (ii)(i)の核酸配列に相補的な核酸配列、 または (iii)(i)または(ii)の核酸配列にハイブリダイズするプライマーまたはプライマ
ー対、 を使用することにより実施できる。
【０１３２】 工程(b)および必要に応じて工程(e)の測定は、タンパク質に特異的に結合する
抗体またはその断片の使用によりおよび必要に応じて二次タンパク質に特異的に
結合する二次抗体またはその断片の使用により実施できる。
【０１３３】 テストされる生理的または病気の状態が存在しないことにより；または当該技
術において認識される任意の他の標準的な定義により、細胞は本発明の方法にお
いて「正常」と考えられる。
【０１３４】 薬剤または治療は、生理的または病気の状態のための任意の従来の薬剤または
治療でよい。あるいはまたはさらに、薬剤または治療は、本発明の方法において
検出される遺伝子の特定のタンパク質またはその機能性部分、または該タンパク
質を抑制する、例えばそれに結合する特定のタンパク質でもよい。同様に、さら
にまたはあるいは、薬剤または治療は、本発明の方法において検出される遺伝子
のタンパク質またはその機能性部分を発現するまたは該遺伝子の発現を抑制する
ベクターでもよい；また、例えば、該遺伝子に結合するおよび／またはさもなけ
れば該遺伝子の転写または翻訳を妨げるベクターでもよい。タンパク質またはそ
れを発現するベクターの適用、またはタンパク質または遺伝子発現を抑制するベ
クターの適用の選択は、例えば本発明の方法により測定されるダウンレギュレー
ションまたはアップレギュレーションに基づき（例えば骨粗しょう症モデルにお
いて）、不当な実験をせずに行うことができる。
【０１３５】 本発明のある態様において、本発明の方法における刺激は、例えば培地中にお
いて骨細胞の特徴を保持する骨細胞に関して、物理的ストレスまたはその欠乏で
ある。
【０１３６】 本発明のさらなる態様において、本発明により、主要な健康の問題である骨粗
しょう症に関する本発明の方法の適用が提供され、本発明の産物およびその使用
方法が提供される。既述のように、骨粗しょう症または多孔性の骨は、低質量の
骨および骨組織の構造劣化により特徴付けられる進行性のおよび慢性の病気であ
り、兆候無く骨が失われることがあり、骨がもろくなり股関節部、脊柱、および
手首を骨折しやすくなる（骨の強度が減少する）。
【０１３７】 骨粗しょう症は、組織学的、生化学的および運動学的に異質のものである。デ
ータにより、エストロゲンの欠乏またはカルシウムの欠乏のような原因が示され
る。
【０１３８】 カルシウムは、多くの代謝プロセスに関連する必須栄養素であり、そのリン酸
塩は、体のカルシウムの99%が存在する骨および歯に物理的な剛性を提供する。
骨格中のカルシウムは、カルシウムの貯蔵供給源として作用してカルシウム欠乏
の状態において体の代謝必要性を満たす追加の役割を有する。カルシウム欠乏は
、腸、腎臓、および皮膚を経由するカルシウムの絶対的損失により容易に誘発さ
れる。骨格の硬化を遅らせるカルシウム欠乏により、骨の流動化が起きる可能性
があり、動物において骨粗しょう症になることが示されている。
【０１３９】 さらに、骨は、主にカルシウムおよびホスフェートである無機質を含浸するコ
ラーゲンに富む有機基質からなる。2つの主な骨の形態が存在し、緻密な皮質骨
は骨格の外被を形成し、海綿質または髄様骨は骨格の内腔を通る層板を形成する
。これらの2つの形態の代謝作用に対する応答および骨折の受けやすさは異なる
。骨は、生涯連続的な再造形（代謝回転）を受ける。破骨細胞は、骨の障害の原
因である骨格中の細胞であり、他方骨芽細胞は、新しい骨を形成することができ
る。物理的および電気的力、ホルモンおよび局所調節因子は、再造形に影響を与
える。ピークの骨の質量は、陽性の効果を有することができる食物因子および物
理的活性によって、主として遺伝学的に測定される。骨格の成長が終わる点でピ
ークの骨の質量に到達し、その後骨減損が開始する。骨の質量は、このプロセス
における不均衡のために生涯を通じて減少する。
【０１４０】 世界保健機関(WHO Technical Report Series: 843, 1994)は、「正常」を、例
えば女性に関して、若い成人の対照範囲以下の1標準偏差(SD)より大きいまたは
等しい骨無機質密度(BMD)または骨無機質含有量(BMC)として特徴付け；「低い骨
質量」を、若い健康な成人、例えば女性の平均以下のBMDまたはBMC 1-2.5として
特徴付け；「骨粗しょう症」を、若い健康な成人、例えば女性の平均以下の2.5
SDより大きいBMDまたはBMCとして特徴付け；「重症の骨粗しょう症」を、若い健
康な成人、例えば女性の平均以下の2.5 SDより大きいBMDまたはBMCおよび一つ以
上の脆弱性骨折の存在として特徴付けていることに留意すべきである。この情報
および当該技術における知識から、当業者は、不当な実験をせずに「正常」細胞
を決定し使用することができる。
【０１４１】 骨芽細胞は、特に老化現象を受けやすく―破骨細胞よりも―、したがって年齢
の増加と共に陰性の骨バランスが増加する。年齢依存性の骨の減損は、減少した
カルシウム吸収、コラーゲン遺伝子中の突然変異およびTGF−ベータおよびエス
トロゲンレセプタータンパク質の多型性により、さらに悪化する。
【０１４２】 細胞は、インテグリンのような特定の細胞表面レセプターによりECM（細胞外
マトリックス）に結合する。ECMリガンドと共に、これらのレセプターは細胞内
のシグナル形質導入経路を活性化することができ、メカノケミカルトランスデュ
ーサ(mechanochemical transducers)として作用し得る。したがって、細胞とECM
との相互作用は、遺伝子発現を調節できる。一部、細胞−ECM相互作用によりコ
ントロールされる遺伝子の一つは、あるECM成分自体についての遺伝子である。
骨細胞は、物理的ひずみに応じてマトリックスを再造形し骨小柱を新しく方向付
ける。
【０１４３】 したがって、骨細胞応答の性質は、分化の状態に関連し得る。さらに、証拠に
より、プロスタグランジンは、骨組織の生理的および病的応答においてある重要
な役割を果たすようであることが示される。プロスタグランジンは、骨の再吸収
および形成を刺激するまたは抑制することができる。プロスタグランジンは、固
定により骨減損を媒介するが、プロスタグランジンE2(PGE2)は、インビボで骨形
成を刺激する。骨細胞によるプロスタグランジン産生は、物理的力、サイトカイ
ン、成長因子および全身性ホルモンにより強く調節される。培養された骨細胞に
適用された物理的刺激により、PGE2、プロスタグランジンI2(PGI2)、およびプロ
スタグランジンF2aを含む多くのプロスタグランジンの産生が増加する。内因性
のプロスタグランジン産生を妨げるインドメタシンを加えることにより、物理的
ストレス処理の効果が中和される。
【０１４４】 頭蓋冠骨から単離された細胞は、培地中で骨芽細胞の表現型を維持する。遺伝
因子は、骨粗しょう症の病因においてある重要な役割を果たす。骨無機質密度に
おける変化の85%−90%までが遺伝的に測定されることが示される。したがって、
頭蓋冠骨細胞を、本発明の方法において使用した。 (a)頭蓋冠一次細胞培養に施
用された物理力および(b)同じ培養に施用されたPGE2の治療の影響下で示差発現
をする遺伝子が含まれる。さらに、カルシウム枯渇の影響もまた示される。した
がって、示差発現をする遺伝子は、骨粗しょう、およびエルゴ(ergo)骨粗しょう
症の原因となるプロセスに関係することが示される。
【０１４５】 低エストロゲン産生の条件下（月経閉止期の女性）、並びにグルココルチコイ
ドまたは骨固定による処理のような他の条件において、骨粗しょう症の特性―強
化骨再吸収―を示す主なプロセスが起こることがよく知られている。したがって
、物理的力の施用が骨形成に対して刺激となることが考えられる。このプロセス
の模擬実験を行うために、例えば実施例２のような実施例中に記載されるように
、一次ラット頭蓋冠細胞を弾性膜上で培養し、20分間この膜と共に伸長した。遺
伝子発現パターンを物理的力の施用前後で比較した。特定の遺伝子が、物理的刺
激の後に示差調節されおよび／または示差発現されることが分かり、骨粗しょう
症モデルが有効となり；本発明の方法を使用して、遺伝子、その発現産物、その
ような遺伝子のためのプローブ／プライマー、並びに特にそのような遺伝子、発
現産物、プローブ／プライマーの使用を同定できることが示される。
【０１４６】 本発明のある態様において、遺伝子同定工程が提供される。工程には、以下の
一つ以上またはすべてを含む遺伝子同定工程が含まれる：モデルシステム（物理
的力、頭蓋冠一次培養）からプローブを調製し；DNAチップハイブリダイゼーシ
ョンを分析し；示差発現を示すクローンを配列決定し；関心のあるクローンを全
長クローニングする（クローニングは様々の既知の方法論により可能である）、
各工程を含む方法を提供する。
【０１４７】 本発明のさらに別の態様において、細胞培養において骨芽細胞または破骨細胞
の性質を保持するラット頭蓋冠細胞または別の細胞を含み、物理的または他の骨
成長／形成誘発ストレスまたは刺激あるいは骨減損誘発ストレスまたは刺激を受
ける、骨粗しょう症モデルまたは物理的ストレスまたは力、例えば骨の大量形成
により引き起こされる他の条件についてのモデルが提供される。
【０１４８】 物理的ストレスおよび骨粗しょう症に関して、運動が骨の量に非常に有益な効
果を有することが示されている。宇宙飛行士における重力ゼロの効果および多く
の運動をすべき必要性もまた、よく知られている。しかしながら、本発明者が知
る限り、骨の質量を増加させる物理的ストレスシグナルの生物学的解釈に関係す
る遺伝子を単離するための努力はこれまでなされていない。また、以下のものが
記載されている：Binderman I, Duksin D, Harell A, Katzir E, Sachs L 単離
された骨細胞からの培地中における骨組織の形成. J Cell Biol 1974 May; 61(2
):427-39; Harell A, Dekel S, Binderman I 培養された骨細胞における物理的
ストレスの生化学的効果. Calcif Tissue Res 1977 May; 22 Suppl: 202-7; Som
jen D, Binderman I, Berger E, Harell A 物理的ストレスにより誘発される骨
再造形はプロスタグランジンE2により媒介される. Biochim Biophys Acta 1980
Jan 3;627(1):91-100; Shimshoni Z, Binderman I, Fine N, Somjen D 若いラッ
トの下顎骨顆に由来する細胞培養の物理的およびホルモン性刺激. Arch Oral Bi
ol 1984;29(10):827-31; Binderman I, Shimshoni Z, Somjen D 物理的刺激の生
物学的メッセージへの翻訳に関する生化学的経路. Calcif Tissue Int 1984;36
Suppl 1:S82-5; Binderman I, Zor U, Kaye AM, Shimshoni Z, Harell A, Somje
n D 骨細胞における生化学的イベントへの物理的力の変換はホスホリパーゼA2の
活性化を伴うかもしれない. Calcif Tissue Int 1988 Apr;42(4):261-6; Binder
man I, Berger E, Fine N, Shimshoni Z, Harell A, Somjen D 骨形成原細胞に
由来する頭蓋冠: 培地中における表現型発現. Connect Tissue Res 1989;20(1-4
):41-7. 本発明の骨粗しょう症モデルまたは物理的ストレスまたは力またはその欠乏に
より引き起こされる他の状態についてのモデルには、本発明の方法および重力が
ほとんど無いまたは全く無い条件下で使用される本発明の方法の産物、例えば物
理的ストレスを施用せずにスペースシャトルのような宇宙船または建設中の宇宙
ステーションのような重力がほとんど無いまたは全く無い条件下で、例示される
または例示される方法に類似する方法のような本発明の方法の実施の結果が含ま
れる。
【０１４９】 本発明のさらなる態様は、CMF274、その発現産物、そのためのプローブ／プラ
イマー、およびそのような遺伝子、発現産物およびプライマー／プローブ、並び
に該遺伝子の機能性部分または発現産物の使用を提供する。
【０１５０】 本発明のさらなる態様は、CMF405、その発現産物、そのためのプローブ／プラ
イマー、およびそのような遺伝子、発現産物およびプライマー／プローブ、並び
に該遺伝子の機能性部分または発現産物の使用を提供する。
【０１５１】 本発明のさらなる態様は、CMF608、その発現産物、そのためのプローブ／プラ
イマー、およびそのような遺伝子、発現産物およびプライマー／プローブ、並び
に該遺伝子の機能性部分または発現産物の使用を提供する。
【０１５２】 配列の起源の種類：すべての初期配列（500bpまでの短い断片）はラットであ
った。405について、部分的に特徴付けられたmRNAの形態における相同体が発見
されたが、骨細胞中の発現について情報は公表されていない。ラットにおける研
究を行い、その機能および治療のためにヒトにおいて可能な使用（直接または間
接の）を実験した。ラットの配列が知られると、ヒト相同体の単離は当業者の範
囲内で可能である；したがって、これらの相同体は本発明の範囲内に含まれる相
同の程度に含まれるので、本明細書はヒト相同体も含むことを意図している。
【０１５３】 さらに特定すると、ここに記載される核酸分子およびそのポリペプチド、例え
ば前記核酸分子(608,405,274)およびそれから発現されたポリペプチドに関して
、本発明にはさらに、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約75%または約77
%の同一性または相同性を有し（「実質的に相同または同一」）、好ましくは少
なくとも約80%または約83%、例えば少なくとも約85%または約87%の相同性または
同一性を有し（「著しく相同または同一」）、例えば少なくとも約90%または約9
3%の同一性または相同性を有し（「非常に相同または同一」）、より好ましくは
少なくとも約95%、例えば少なくとも約97%、約98%、約99%または約100%の同一性
または相同性する（「高度に相同または同一」から「同一」まで；または約84%
から100%までの同一性は「非常に保存されている」と考えられる）単離されたお
よび／または精製された核酸分子および単離されたおよび／または精製されたポ
リペプチドが含まれる。本発明には、これらの核酸分子およびポリペプチドがこ
こにおけるまたは前記の核酸分子およびポリペプチドと同じ方法で使用できるこ
とも含まれる。
【０１５４】 ヌクレオチド配列相同性は、Myers and Millerの「整合」プログラム, (ここ
に引用される“Optimal Alignments in Linear Space”, CABIOS 4, 11-17, 198
8)を使用して測定でき、NCBIで利用できる。あるいはまたはさらに、例えばヌク
レオチドまたはアミノ酸配列に関して「相同性」または「同一性」という用語は
、二つの配列間の相同性の定量測定を示す。パーセント配列相同性は、(Nref-Nd if )*100/Nrefとして計算でき、Ndifは整合したときの二つの配列中の同一でない
残基の総数であり、Nrefは配列の一つ中の残基の数である。したがって、DNA配
列AGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列類似性を有する(Nref=8; Ndif=2)。
【０１５５】 あるいはまたはさらに、配列に関して「相同性」または「同一性」とは、二つ
の配列のより短い配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割った同一のヌク
レオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を称し、例えば、ウィンドウサイズ(w
indow size)の20ヌクレオチド、ワード長(word length)の4ヌクレオチド、およ
び4のギャップペナルティ(gap penalty)、およびコンピューターで補助する分析
を使用して、二つの配列の整合はWilbur and Lipmanアルゴリズム(ここに引用さ
れるWilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726)にしたがって測定することがで
き、整合を含む配列データの解釈は、市販されているプログラム（例えば、Inte
lligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA）を使用して都合よく行うこと
ができる。RNA配列が類似する、またはDNA配列とある程度の同一性または相同性
を有するという場合、DNA配列中のチミジン(T)は、RNA配列中のウラシル(U)と等
しいと考える（例えば図中に使用される整合を参照）。
【０１５６】 本発明の範囲内のRNA配列は、RNA配列中のウラシル(U)と等しいと考えられるD
NA配列中のチミジン(T)により、DNA配列に由来してもよい。
【０１５７】 さらにまたはあるいは、アミノ酸配列類似性または同一性または相同性は、Bl
astPプログラム(ここに引用されるAltschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 338
9-3402)を使用して測定することができ、NCBIで利用できる。以下の参考文献（
それぞれここに引用される）は、二つのタンパク質のアミノ酸残基の相対的な同
一性または相同性の比較のためのアルゴリズムを提供し、さらにまたはあるいは
、前記に関して、これらの参考文献中の内容を使用して、相同性または同一性の
パーセントを測定することができる：Needleman SB and Wunsch CD,「二つのタ
ンパク質のアミノ酸配列における類似性の調査に適用できる一般的方法」, J. M ol. Biol. 48:444-453(1970); Smith TF and Waterman MS,「バイオシーケンス(
Bio-sequences)の比較」, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981);
Smith TF, Waterman MS and Sadler JR,「核酸配列機能性領域の統計的な特徴
付け」, Nucleic Acids Res., 11:2205-2220(1983); Feng DF and Dolittle RF,
「正しい系統樹の必要条件としての進行性配列整合」, J. of Molec. Evol., 25
:351-360(1987); Higgins DG and Sharp PM,「マイクロコンピューターにおける
早く感度の高い複合的な配列整合」, CABIOS, 5:151-153(1989); Thompson JD,
Higgins DG and Gibson TJ,「Cluster W:配列計量、位置特異的ギャップペナル
ティおよび重量マトリックス選択」, Nucleic Acid Res.,22:4673-480(1994); a
nd, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O,「VAXについての配列分析プログ
ラムの包括群」, Nucl. Acids Res., 12:387-395(1984)。
【０１５８】 この方法において、開示された特定の配列に対してそのような相同性を有する
核酸分子およびポリペプチドを含むことにより、本発明はここにおける用語の範
囲内で、開示された配列に対するヒトおよび他の相同体を含むことが考えられる
。対応するヒト配列の同定および／または単離は、例えばここに定められる遺伝
子（ここに同定されるおよび／またはここに本発明の方法により同定される遺伝
子のような）またはその適切な部分、例えばここに定められる遺伝子に由来する
プライマー／プローブのハイブリダイゼーションの分析による、任意の適切な方
法でよい；例えば、そのようなプライマー／プローブによるヒトゲノムの一部の
PCR増幅および／またはここに定められる遺伝子またはその一部のヒトゲノムの
一部に対する標識されたハイブリダイゼーション分析（例えば、特にPCR、ハイ
ブリダイゼーションに関する以下の考察も参照）。
【０１５９】 さらに、ここに同定される遺伝子（例えば、405、608、274）並びにここに開
示される方法により同定される遺伝子の遺伝子産物に相同性を有するタンパク質
を含むことにより、本発明は、ここに同定される遺伝子産物、並びにここに開示
される方法により同定される遺伝子の遺伝子産物に由来する「機能性」タンパク
質であるタンパク質を含む；例えば、ここに同定されるまたはここに開示される
方法により同定される遺伝子により発現されるタンパク質の切断形態。
【０１６０】 使用に関し、本発明の遺伝子および発現産物並びにここに開示される方法によ
り同定される遺伝子およびその発現産物（そのような発現産物の「機能性」変異
、およびしたがって発現産物の機能性部分をコードするここに定められる遺伝子
の一部のようなここに定められる遺伝子の切断部分を含む）は、骨粗しょう症ま
たはそのプロセスあるいは物理的ストレス条件または欠乏または減少した物理的
ストレス条件の治療、予防またはコントロールまたは診断または観察または研究
に有用である。それらは骨密度を助ける。それらは、診断の目的に有用であるか
もしれない。それらは、高いまたは低い骨密度となる素因の測定または高骨質量
または低骨質量と関連する遺伝子関連または他の因子の測定に使用してもよい。
【０１６１】 例えば、608発現により、細胞は骨芽細胞および軟骨細胞に分化される。608の
発現産物、または608を発現する細胞またはベクターは、細胞を選択的に分化さ
せ、その結果骨密度が増加するまたは変化する。608 mRNAまたは発現のレベルの
検出および「正常な」骨障害性で無いレベルと比較することにより、誰が骨粗し
ょう症または低レベルの骨芽細胞および軟骨細胞のリスクがあるかを検出するこ
とができる。
【０１６２】 405発現は、基質石灰化を促進する分化において骨形成原細胞および軟骨形成
原細胞について特有であることにより、骨密度に強い影響を与える。405の発現
産物またはそれを発現する細胞またはベクターにより、細胞は骨形成原細胞また
は軟骨形成原細胞に分化し、その結果基質石灰化および骨密度が増加する。405
またはmRNAの発現のレベルを測定し、「正常な」レベルと比較することにより、
低骨質量または低基質石灰化または骨粗しょう症のリスクを検出できる。
【０１６３】 274は、骨髄中のリンパ系前駆体に関係している。発現により、リンパ系細胞
および骨が減少し、環境要因または骨粗しょう症の遺伝因子でないもの、例えば
骨粗しょう症の癌の原因の影響を受けやすくなる。405またはmRNAの発現のレベ
ルを測定し、「正常な」レベルと比較することにより、骨が環境要因、またはよ
り少ないリンパ系細胞、または骨粗しょう症を受けやすくなる傾向のリスクを検
出できる。
【０１６４】 さらに、本発明の方法によりアップレギュレートされ同定された遺伝子は、関
心をひく。これらの遺伝子および／またはその発現産物またはその一部、例えば
抗体またはその機能性部分またはそれに結合する他の化合物を抑制するものは、
物理的ストレスまたはその欠乏を含む骨粗しょう症またはその原因となるまたは
骨粗しょう症または他の状態を引き起こす因子の予防、コントロールまたは治療
において有用であり、該遺伝子は、抗骨粗しょう症治療または療法、並びに骨粗
しょう症またはその要因となる因子またはその原因の研究、例えば高または低骨
密度になる傾向の測定または遺伝子関連または高骨質量または低骨質量と関連す
る他の因子の測定のための標的となるかもしれない。
【０１６５】 これらの中で、三つの同定されたアップレギュレートされたRGD含有タンパク
質、ADAMTS-1および補体3自身（破骨細胞誘引の潜在的な予防）および骨形成に
おけるプログラムされた細胞死の潜在的な修飾要因としてのSARPファミリの二つ
のタンパク質（分泌されたアポトーシス関連タンパク質）が同定された。
【０１６６】 同様に、本発明の方法によりダウンレギュレートされ同定された遺伝子は関心
をひく。これらの遺伝子および／またはその発現産物および／またはその機能性
部分は、物理的ストレスまたはその欠乏を含む骨粗しょう症またはその原因とな
るまたは骨粗しょう症を引き起こす因子の予防、コントロールまたは治療におい
て有用であり、該遺伝子は、抗骨粗しょう症治療または療法、並びに骨粗しょう
症またはその要因となる因子またはその原因の研究、例えば高または低骨密度に
なる傾向の測定または遺伝子関連または高骨質量または低骨質量と関連する他の
因子の測定のための標的となるかもしれない。
【０１６７】 したがって、ある態様において、本発明は、哺乳類中で本発明の方法によりダ
ウンレギュレートされることが示される遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正
常細胞からの欠如または減少に基づき、骨粗しょう症または低いまたは高い骨密
度あるいは骨粗しょう症または物理的ストレスまたはその欠乏を含む他の状態の
原因または一因となる他の因子を発生させるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１６８】 別の態様において、本発明は、哺乳類中で本発明の方法によりアップレギュレ
ートされることが示される遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの
存在または増加に基づき、骨粗しょう症または低いまたは高い骨密度あるいは骨
粗しょう症または物理的ストレスを含むまたは欠く他の状態の原因または一因と
なる他の因子を発生させるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１６９】 既述のように、608発現により、細胞は骨芽細胞または軟骨細胞に分化する。
したがって、さらなる態様において、本発明は、608からmRNAまたはタンパク質
の正常細胞からの欠如または減少に基づき、骨粗しょう症または低いまたは高い
骨密度あるいは骨粗しょう症またはより低いレベルの骨芽細胞および軟骨細胞あ
るいは物理的ストレスを含むまたは欠く他の状態の原因または一因となる他の因
子を発生させるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの存在または増加が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１７０】 ここに記載されるように、405発現は、基質石灰化を促進する分化において骨
形成原細胞および軟骨形成原細胞について特有であることにより、骨密度に強い
影響を与える。したがって、さらなる態様において、本発明は、哺乳類中におい
て405からのmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正
常細胞からの存在または増加、例えば正常細胞からの欠如または減少に基づき、
骨粗しょう症または低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症の原因または一
因となる他の因子を発生するリスクまたは骨形成原細胞および軟骨形成原細胞に
関する不均衡または物理的ストレスを含むまたは欠く他の状態のリスクを測定す
る方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１７１】 同様に、ここに記載されるように、274は骨髄中でリンパ系前駆体に関係する
。
【０１７２】 したがって、別の態様において、本発明は、哺乳類中において274からのmRNA
またはタンパク質の正常細胞からの存在または増加あるいは正常細胞からの欠如
または減少、例えば正常細胞からの欠如または減少に基づき、骨粗しょう症また
は低いまたは高い骨密度あるいは骨粗しょう症の原因または一因となる他の因子
を発生するリスクまたは骨粗しょう症または環境因子の影響を受けやすくなる、
またはリンパ系細胞が少なくなる、または骨粗しょう症、または物理的ストレス
を含むまたは欠く他の状態に向かう骨の素因の環境因子またはそれ以外の他の遺
伝的因子の影響を受けるリスクを測定する方法であって、 (a)前記哺乳類の細胞、例えば骨細胞（例えば骨芽細胞および／または破骨細胞
）中のmRNAのレベルまたは状態を測定し、および／または (b)前記哺乳類の細胞中の対応するタンパク質のレベルまたは状態を測定し、 (c)mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対応
するレベルと比較する、 各工程を含む方法を提供する。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたは
タンパク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク
質またはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失
またはタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子
の全活性に影響を与える任意の他の修飾を受けることが含まれ、前記比較からmR
NAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少が測定され、これによりリ
スクが測定される。
【０１７３】 前記方法は、本発明のさらなる態様において、同定された遺伝子のmRNAまたは
タンパク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または
増加に基づき、骨粗しょう症または骨密度または物理的ストレスまたはその欠乏
を含む骨粗しょう症またはその徴候の原因となるまたは一因となる他の因子のた
めの薬剤または遺伝子治療アプローチをテストする本発明の方法であって、さら
に(a’)前記薬剤または遺伝子治療を施し、前記比較から関連mRNAまたはタンパ
ク質の正常細胞からの欠如または減少あるいは正常細胞からの存在または増加を
測定し、したがって前記薬剤または遺伝子治療の効力を測定する、各工程を含む
方法において使用することができる。
【０１７４】 同様に、さらなる態様において、本発明は、骨粗しょう症または物理的ストレ
スまたはその欠乏を含む他の状態を治療、予防またはコントロールする方法であ
って、前記検出方法を含む、骨粗しょう症のためにまたはその原因またはその徴
候のために薬剤または治療を施用する工程を含む方法を提供する。例えば、前記
比較から、特定のmRNAまたはタンパク質の正常細胞からの欠如または減少あるい
は正常細胞からの存在または増加が測定され、これによりリスクが測定され、前
記薬剤または治療が施用される。
【０１７５】 本発明の方法における細胞は、インビトロまたはインビボでもよくまたは任意
の適切な哺乳類、例えばヒト、飼いならされた動物、例えばペット(companion a
nimal)または家畜、またはラット、マウス等のような実験動物からでもよい；ま
た、細胞は、胎児の、成熟したまたは大人の、未成熟のまたは子供の、新生児の
、または初老の等のような哺乳類の成長の任意の段階からでもよい。
【０１７６】 CMF608に関して、本発明は、正常なラットと卵巣除去したラットとの間で発現
において相違を示さなかったが、これは必ずしもそれ自体が骨の強度についての
マーカーではないかもしれないことを示すことに留意しなければならない。同様
に、CMF405について、卵巣除去後に変化は無かった。さらに、少数の骨以外の組
織中の発現により、それ自体が必ずしもマーカーではないかもしれないことが示
される。
【０１７７】 したがって、本発明の方法はさらに、例えば、同じまたは同様の前記詳述を有
し、 (d)前記哺乳類の骨細胞中の二次遺伝子mRNAのレベルまたは状態を測定し、 (e)前記哺乳類の骨細胞中の二次遺伝子産物により発現されるタンパク質のレベ
ルまたは状態を測定し、 (f)該mRNAおよび／またはタンパク質の前記レベルまたは状態を正常細胞中の対
応するレベルと比較する、 各工程を含む、上述される方法と類似する別のテスト方法と共に前記工程を使用
する工程を含んでもよい。「レベル」という用語は、産生されたmRNAまたはタン
パク質の量を意味する；「状態」という用語には、遺伝子、mRNA、タンパク質ま
たはプロモーター／エンハンサー配列を含む転写調節因子が突然変異、欠失また
はタンパク質の翻訳後修飾を含む野生型正常遺伝子産物と比較すると遺伝子の全
活性に影響を与える任意の他の修飾を受け得ることが含まれる。
【０１７８】 欠如または減少あるいは存在または増加は、リスクと相関し得る。したがって
、二次遺伝子は、本発明の方法により同定することができる。あるいはまたはさ
らに、二次遺伝子および／または追加の工程を、例えば米国特許第5,834,200号
および／または同第5,691,153号に記載されるような他の方法に従って測定でき
る。
【０１７９】 同様に、本発明の遺伝子またはここに本発明の方法により同定される遺伝子ま
たはその一部は、遺伝子の不十分な発現または過発現あるいは遺伝子産物または
多型性における異常を検出する工程を含む高いまたは低い骨密度になる傾向を測
定する方法のような、他のまたは類似する方法の問題となり得ることは本発明の
範囲内である；例えば、米国特許第5,834,200号および同第5,691,153号参照；例
えば、本発明の遺伝子またはここに本発明により同定される遺伝子は、米国特許
第5,834,200号および同第5,691,153号の方法に類似する方法において使用できる
。
【０１８０】 本発明の方法において、工程(a)および／または(b)および必要に応じて(d)お
よび／または(e)はインビボで行い、および／または工程(a)および／または(b)
および必要に応じて(d)および／または(e)はインビトロで行ってもよい。
【０１８１】 工程(a)および必要に応じて工程(d)における測定は、 (i)タンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子の少なくとも一部に対応す
る核酸配列および必要に応じて二次タンパク質の少なくとも一部をコードする二
次遺伝子の少なくとも一部に対応する二次核酸配列、 (ii)(i)の核酸配列に相補的な核酸配列、 または (iii)(i)または(ii)の核酸配列にハイブリダイズするプライマーまたはプライマ
ー対、 を使用することにより実施できる(ここに、例えば以下のプライマー／プローブ
およびPCRおよびハイブリダイゼーション関する論文も参照)。
【０１８２】 工程(b)および必要に応じて工程(e)の測定は、タンパク質に特異的に結合する
抗体またはその断片の使用によりおよび必要に応じて二次タンパク質に特異的に
結合する二次抗体またはその断片の使用により実施できる（ここに、例えば抗体
およびその作製および使用方法に間する以下の論文も参照）。
【０１８３】 薬剤または治療は、骨粗しょう症のための任意の従来の薬剤または治療でよい
。あるいはまたはさらに、薬剤または治療は、本発明の方法において検出される
遺伝子の特定のタンパク質または該タンパク質を抑制する、例えばそれに結合す
る特定のタンパク質でもよい。同様に、さらにまたはあるいは、薬剤または治療
は、本発明の方法において検出される遺伝子のタンパク質を発現するまたは該遺
伝子の発現を抑制するベクターでもよい；また、例えば、該遺伝子に結合するお
よび／またはさもなければ該遺伝子の転写または翻訳を妨げるベクターでもよい
。タンパク質またはそれを発現するタンパク質の適用、または該タンパク質また
は該遺伝子発現を抑制するタンパク質の適用の選択は、例えば本発明の方法によ
り測定されるダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションに基づき（
例えば骨粗しょう症モデルにおいて）、不当な実験をせずに行うことができる。
【０１８４】 本発明の実施において、分子生物学における一般的方法を使用することができ
る：当該分野において知られており特定に記載されていない一般的な分子生物学
技術が、以下に記載される：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1989,1992)、およびAus
ubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons
, Baltimore, Maryland(1989)。
【０１８５】 ここに記載されるまたはここに記載される核酸分子に由来するプローブまたは
プライマーの使用において、核酸分子の正常細胞からの欠如または減少あるいは
正常細胞からの存在または増加を測定するために、または該核酸分子を増幅する
ために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してもよく、PCRプロトコル:A Guide
To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990)にある
ように一般的に都合よく実施できる。他に記載されていなければ、他の核酸技術
を含む反応および操作は、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびここに引用され
る前記の米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,1
92,659号および同第5,272,057号のような方法論に一般的に記載されるように行
う。フローサイトメトリと組み合わせたインサイチュ（細胞内）PCRを使用して
、特定のDNAおよびmRNA配列を含む細胞を検出することができる(Testoni et al,
1996, Blood 87:3822)。
【０１８６】 PCR、並びにハイブリダイゼーションにおいて、プライマーは、関心ある遺伝
子、例えば608、405または274のようなここに開示される本発明の遺伝子、また
はここに開示される方法により同定される遺伝子、またはここに定められる遺伝
子に由来するプライマーまたはプローブにより検出される対応するヒト相同体に
特異的に結合することが好ましい。このことを確実にするための一つの方法は、
他の既知の配列中で一般的に見られない遺伝子配列からプライマーを選択するこ
とである。
【０１８７】 したがって本発明はさらなる態様において、単離された核酸分子、例えばここ
に定められる遺伝子をコードするまたは少なくとも約12ヌクレオチドの長さを有
する、例えば少なくとも約15、約18、約21、約24または約27ヌクレオチドの長さ
、例えば少なくとも約30、約33、約36、約39または約42ヌクレオチドの長さを有
する、ここに定められるポリペプチド（例えば、ここに定められる遺伝子の発現
産物）、例えば、約12から約30まで、約12から約50までまたは約12から約60、ま
たは約12から約75までまたは約12から約100までまたはより長いヌクレオチドの
長さの核酸分子をコードする配列を含むDNAを提供する。これらの長さの核酸分
子は、ハイブリダイゼーションにおいて有用かもしれない；および、本発明には
さらに、そのような核酸分子を含むおよび／または発現するベクターまたはプラ
スミド、並びに例えばポリメラーゼ連鎖反応によりサンプル中においてインビト
ロまたはインビボで発現するため、またはここに定められる遺伝子またはその相
同体、例えばヒト相同体を増幅または検出するためのそのような核酸分子の使用
方法が含まれる。
【０１８８】 プローブまたはプライマーは、ここに定められる遺伝子中にあってそれに特有
の少なくとも8、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも12、13、1
4、または15、例えば少なくとも20、少なくとも23または25、少なくとも27また
は30ヌクレオチドの任意の範囲でもよい。PCRまたはハイブリダイゼーションプ
ライマーまたはプローブおよびそのための最適な長さに関して、Kajimura et al
., GATA 7(4):71-79(1990)も参照すべきである。したがって本発明は、DNAサン
プルおよびその断片のインビトロにおける増幅のためのプライマーとして使用す
るため、またはインビトロまたはインビボでDNAの一部の発現に使用するための
オリゴヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドの対を提供することを理解すべ
きである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは増幅される核酸の両側に位置する
配列に特異的にハイブリッド形成し、オリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA標的の
異なるおよび反対の鎖にハイブリッド形成する。本発明のオリゴヌクレオチドは
、好ましくは核酸分子、例えばここに定められる遺伝子、およびここに記載され
る内容に由来する。本発明の実施において用いたように、「由来する」という用
語は、核酸分子およびここに定められる遺伝子およびここに開示される内容から
のそのようなオリゴヌクレオチドの発生を含むことを意図しており、様々の代わ
りのおよび異なるオリゴヌクレオチドが調製できる。
【０１８９】 「特異的なハイブリダイゼーション」という用語は、本発明の核酸プローブが
、高ストリンジェンシーな条件下で遺伝子に由来するDNAまたはRNAに対して安定
な二本鎖ハイブリダイゼーションすることができることを意味するものとして理
解され、「高ストリンジェンシー」という用語は、当業者により理解される（例
えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Hames and
Higgins, eds., 1985,核酸ハイブリダイゼーション, IRL Press, Oxford, U.K.
参照）。ハイブリダイゼーションは、サザンブロットハイブリダイゼーション、
ノザンブロットハイブリダイゼーション、インサイチュのハイブリダイゼーショ
ンおよび、最も好ましくはPCR増幅されたDNA断片に対するサザンハイブリダイゼ
ーションを含む、確立した技術を使用して達成されることが理解されるであろう
。
【０１９０】 本発明の核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ここに提供されるまたはこ
こに提供される遺伝子配列に由来するPCRオリゴヌクレオチドプライマーの適切
な対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することにより得ることが
できる。Mullis et al.の米国特許第4,683,195号およびMullisの同第4,683,202
号参照。さらなる態様において本発明は、当該技術において知られる様々の増幅
プロトコルのいずれかを使用してインビトロで増幅するためのオリゴヌクレオチ
ドを提供する。好ましくは、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うため
のオリゴヌクレオチドを提供する。Mullis et al.の米国特許第4,683,195号およ
びMullisの同第4,683,202号参照。
【０１９１】 したがって本発明は、ここに開示される遺伝子、例えばDNAサンプルおよびそ
の断片のインビトロにおける増幅のためのプライマーとして使用するための、オ
リゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドの対を提供することが理解されるで
あろう。本発明の実施において、ここに提供されるオリゴヌクレオチドの対には
、それぞれについて約8から約30までのヌクレオチド残基を含む、二つのオリゴ
ヌクレオチドであって増幅される核酸の両側に位置する配列に特異的にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドが含まれ、該オリゴヌクレオチドはDNA標的の異
なるおよび反対の鎖にハイブリダイズすることが理解されるであろう。本発明の
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、以下に記載される核酸プライマーまたは以
下に開示される遺伝子に由来する。本発明の実施において用いたように、「由来
する」という用語は、遺伝子の核酸配列またはここに開示されるプライマーから
のそのようなオリゴヌクレオチドの発生を含むことを意図しており、様々の代わ
りのおよび異なるオリゴヌクレオチドが調製できる。特に、本発明は、核酸ハイ
ブリダイゼーションプローブの対応する配列と実質的に相補的な配列を有するオ
リゴヌクレオチドを提供する。ここで用いたように、「実質的に対応する」とい
う用語は、オリゴヌクレオチド配列のあるヌクレオチド残基が、核酸ハイブリダ
イゼーションプローブの対応する配列に対して最適に相補的でない（例えば、A-
CまたはG-T）または相補的でない（例えば、A-GまたはT-C）、配列付加、欠失お
よびミスマッチを有するオリゴヌクレオチドであって、そのようなオリゴヌクレ
オチドが遺伝子を特異的に増幅する能力を保持していることを含むことが意図さ
れる。
【０１９２】 例えば405、608または274のような核酸、およびここに開示されるおよび本発
明の配列から導き出せるプライマーのようなそれらのオリゴヌクレオチド（例え
ば、約8から30までまたはより多くの長さのヌクレオチドであり遺伝子に十分に
特異的に結合するそれぞれ開示される遺伝子の一部）は、骨粗しょう症の存在ま
たは骨粗しょう症の状態または要因を検出するための診断ツールとして有用であ
る。上述のように、そのような診断または検出反応には、本発明の核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブが含まれ、対になったオリゴヌクレオチドPCRプライマ
ーが含まれる。
【０１９３】 本発明により提供される方法には、生物サンプルのようなサンプル中で骨粗し
ょう症または骨粗しょう症の状態または要因を検出するためのブロットハイブリ
ダイゼーション、インサイチュにおけるハイブリダイゼーションおよびインビト
ロにおける増幅技術が含まれる。ここに記載される本発明の方法を使用して都合
よくスクリーニングされた適切な生物サンプルには、血液、血清、唾液および他
の体液、および他の感染の潜在的な供給源が含まれる。
【０１９４】 本発明の検出方法において、従来技術(Sambrook et al., supra)を使用して行
うアガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色およびエチジウムブロマ
イド染色されたゲルの紫外線透過、または自動または自動化検出測定に依存する
蛍光または他の標識されたプローブを使用する配列測定システムによる検出によ
り、テンプレートのDNAサンプルのインビトロにおける増幅により産生される特
定のDNA断片の産物が検出される。より大きい程度の特異性が必要とされる例に
おいて、本発明の検出可能に標識された核酸ハイブリダイゼーションプローブに
より調べられたそのようなアガロースゲルのハイブリダイゼーションを、一般的
技術(Sambrook et al., supra)を使用して行う。本発明の方法のこれらの実施の
形態のそれぞれにおいて、特定のPCR増幅されたDNA断片の十分な量を、容易に検
出されるように産生する。本発明の目的のために、「特定のPCR増幅されたDNA断
片の十分な量」という用語は、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル
の視覚化または検出可能に標識されたプローブによるブロットハイブリダイゼー
ションのオートラジオグラフィまたは他の現像のいずれかにより検出するために
必要な量を称する。
【０１９５】 特異的にPCR増幅されたDNA断片の十分な量は、特定のDNA断片の前記十分な量
を産生するために必要な多くのサイクルを行うことによりPCR増幅反応において
調製されることが理解されるであろう。特定のDNA断片の前記十分な量を産生す
るために必要なそれぞれのPCRにおけるサイクルの数は、オリゴヌクレオチドプ
ライマー、緩衝剤、塩および他の反応成分、テンプレートDNAの量およびPCRのサ
イクル時間および温度に依存することが理解されるであろう。これらのパラメー
ターの最適化は、当業者の範囲内であり、日常の実験のみで達成できる。
【０１９６】 本発明により提供される検出可能に標識されたプローブは、ビオチン、放射性
同位元素（3H、14C、35Sおよび32Pを含む）、蛍光標識（フルオレセインイソチ
オシアネート）、および抗原標識により標識される。検出可能な標識をプローブ
の合成調製中にプローブ中に組み込むことによって、プローブを標識されたヌク
レオチドを合成されたプローブ中に組み込むことにより内部標識(end-label)す
るまたは標識する。
【０１９７】 本発明はまた、本発明の核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製するため
のPCRに基づく方法を提供する。これらの実施の形態において、テンプレートDNA
には、本発明の組換え遺伝子構成物が含まれる。検出可能に標識された核酸ハイ
ブリダイゼーションプローブは、核酸インサートの位置の両側に位置する配列に
特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCR増幅を行うことに
より調製される。PCRプライマーを直接内部標識するまたは検出可能に標識され
たヌクレオチド三リン酸をプローブ核酸中に組み込むことにより、検出可能な標
識を核酸ハイブリダイゼーションプローブ中に組み込む。
【０１９８】 本発明の方法を含むPCRを、ある量、通常10ng-200ngまでのテンプレート核酸
；50-100pmoleのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー；1-1.25mMのそれぞ
れのデオキシヌクレオチド三リン酸；増幅反応の触媒に使用されるポリメラーゼ
に適切な緩衝液；および0.5-2ユニットのポリメラーゼ、最も好ましくは熱安定
性ポリメラーゼ（例えばTaqポリメラーゼまたはTthポリメラーゼ）を含む反応混
合物中で行う。
【０１９９】 したがって本発明は、さらなる態様において、骨粗しょう症またはそれに関す
る遺伝子を特異的に検出するための診断アッセイを提供する。これらの診断アッ
セイには、本発明の核酸またはその特異的にハイブリダイズする断片を使用する
、真菌類のゲノムDNAおよび／またはRNAの感度の高いアッセイのための核酸ハイ
ブリダイゼーション分析が含まれる。そのようなアッセイには、サザンブロット
、ノザンブロット、ドットブロット、スロットブロット等のような様々のブロッ
トアッセイ、並びにポリメラーゼ連鎖反応アッセイ(PCR)、逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応アッセイ(RT-PCR)、リガーゼ連鎖反応アッセイ(LCR)、および当業者に
知られる他のアッセイのようなインビトロにおける増幅アッセイが含まれる。本
発明の任意の方法を使用して検出される、制限断片長多型性アッセイ(RFLP)に類
似する診断用断片の特異的な制限エンドヌクレアーゼ分解もまた、本発明の範囲
内である。
【０２００】 これらのPCR技術は、ここに開示される他の方法、または物理的ストレスまた
はその欠乏と関連するまたは相関する他の状態と組み合わせてまたはその存在下
で使用できる。
【０２０１】 したがって、本発明は、骨粗しょう症またはそれに関する、遺伝因子を含む状
態または因子を検出および／または診断するための組成物および方法に関する。
【０２０２】 同様に、本発明の実施、例えばタンパク質検出において、免疫学における一般
的方法を使用してもよい。当該技術において知られ明確に記載されていない免疫
学における一般的方法は、通常以下のStites et al.(eds), Basic and Clinical
Immunology (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) and Mish
ell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Free
man and Co., New York (1980)の通りである。RIAおよびELIZAのような免疫学的
検定を使用して、特定のタンパク質または関心のある他の化合物の存在について
試料を当該技術において適切であると知られる場所で評価することができる。ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を本発明のアッセイにおいて使用
できる。利用できる免疫学的検定は、特許および科学文献に広く記載されている
。例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3
,850,578号；3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；同第3,901,654
号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；
同第4,098,876号；同第4,879,219号；同第5,011,771号および同第5,281,521号並
びにSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, New York, 1989参照。
【０２０３】 本発明の様々の態様、例えば検出または治療または予防方法において、抗体を
使用してもよい。免疫学的検定または本発明の実施に必要な分析の他の方法に使
用する抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換え体でもよい。都合
のよいことに、抗体は、例えば配列に基づく合成ペプチドのような免疫原または
その一部に対して調製してもよく、またはクローニング技術によって組換えによ
り調製してもよく、天然遺伝子産物および／またはその一部を単離し免疫原とし
て使用してもよい。遺伝子を本発明において前述のように同定し、遺伝子産物を
同定する。免疫原を使用して、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988 and Bo
rrebaeck, Antibody Engineering-A Practical Guide, W.H. Freeman and Co.,
1992に概して記載される当業者によく知られる一般的な抗体産生技術により抗体
を産生することができる。抗体断片はまた、抗体から調製してもよく、当業者に
知られる方法によりFab、F(abl)2、およびFvを含んでもよい。
【０２０４】 ポリクローナル抗体を産生するために、ウサギまたはヤギのような宿主を、免
疫原または免疫原断片により、通常抗原性補強剤とともに、および必要ならキャ
リアに結合して、免疫化する；免疫原に対する抗体を血清から集める。さらに、
ポリクローナル抗体は単一特異的であるので、吸収されることができる。すなわ
ち、血清は、関連する免疫原に対して吸収されることができるので、血清を単一
特異的にする交差反応抗体は血清中に残らない。
【０２０５】 モノクローナル抗体を産生するための技術には、免疫原による適切なドナー、
通常マウスの超免疫化、および細胞を産生する脾性抗体の単離が含まれる。これ
らの細胞を骨髄腫細胞のような不朽性を有する細胞に融合し、不朽性を有し必要
な抗体を分泌する融合細胞ハイブリッドを提供する。次にこの細胞を大量に培養
し、モノクローナル抗体を培養培地から使用のために採集する。
【０２０６】 組換え抗体を産生するために（通常Huston et al, 1991; Johnson and Bird,
1991; Mernaugh and Mernaugh, 1995参照）、動物、またはハイブリドーマのBリ
ンパ球を産生する抗体からのメッセンジャーRNAを逆転写して相補的DNA(cDNA)を
得る。全長または部分長でもよい抗体cDNAを増幅し、ファージまたはプラスミド
中にクローニングする。DNAは重鎖および軽鎖cDNAの部分長でもよく、リンカー
により分離されるまたは結合される。抗体、または抗体断片を、適切な発現系を
使用して発現させ、組換え抗体を得る。抗体cDNAはまた、適切な発現ライブラリ
をスクリーニングすることにより得ることができる。
【０２０７】 当該技術において知られるように、抗体を固体支持基質に結合させるまたは検
出可能な成分と結合させるあるいは両方でもよい。（蛍光または酵素的成分の結
合の一般論についてはJohnstone & Thorpe, Immunochemistry in Practice, Bla
ckwell Scientific Publications, Oxford, 1982参照。）固体支持気質への抗体
の結合もまた、当該技術においてよく知られている。（一般論についてはHarlow
& Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory P
ublications, New York, 1988 and Borrebaeck, Antibody Engineering-A Pract
ical Guide, W.H. Freeman and Co., 1992参照。）本発明で考慮される検出可能
な成分には、ビオチン、金、フェリチン、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−
ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミ
ン、トリチウム、13Cおよびヨウ素化のような蛍光、金属、酵素および放射性同
位元素標識が含まれるがこれに限定されない。
【０２０８】 抗体はまた、治療組成物における活性物質として使用でき、例えばそのような
抗体を人体に適応させてその効果を高めることができる。例えば、ここに引用さ
れるHuls et al.,「ファージ表示された抗体断片から構成される抗腫瘍活性を有
する組換えのヒトモノクローナル抗体」,Nature Biotechnology Vol. 17, No.3, March 1999、およびその中に引用される文献を参照。
【０２０９】 したがって、ここに同定されるまたはここに開示される本発明の方法により同
定される遺伝子の発現産物からの抗体は、免疫診断、並びに薬または研究におけ
るような他の商業的使用において有用である。
【０２１０】 簡単に、遺伝子またはその一部からの発現産物は、診断目的にまたは例えば治
療として発現産物またはその一部または遺伝子またはその一部の活性を妨げるた
めに有用なモノクローナルまたはポリクローナルのような抗体の産生に有用とな
る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリ
ンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基と反応し、従来の血清に由
来する抗体よりも大きい特異性を提供する。さらに、多くのモノクローナル抗体
をスクリーニングすることにより、所望の特異性、アビディティおよび同位体を
有するそれぞれの抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系により、
化学的に等しい抗体の恒常的で費用のかからない供給源が提供され、そのような
抗体の調製は容易に標準化することができる。モノクローナル抗体を産生する方
法は、当業者によく知られている、例えば、ここに引用される1989年4月1日に出
願されたKoprowski, H. et al.,米国特許第4,196,265号、および例えば上記に引
用される他の文献。
【０２１１】 モノクローナル抗体の使用は既知である。そのような使用の一つは、ここに引
用される1983年3月8日に出願されたDavid, G. and Greene, H.,米国特許第4,376
,110号に記載されている；例えば上記のここに引用される文献も参照のこと。モ
ノクローナル抗体を使用して、免疫吸着クロマトグラフィにより物質を回収する
こともできる、例えばここに引用されるMilstein, C., 1980, Scientific Ameri
can 243:66, 70；および上記のようなここに引用される文献を参照のこと。した
がって、ここに同定されるまたは本発明の方法により同定される遺伝子またはそ
の一部から発現される産物は、治療、免疫吸着クロマトグラフィ、並びに診断ま
たは検出の目的のための抗体の産生に有用である。さらに、発現産物は、抗体の
存在を検出するためのアッセイにおいて有用である。例えば、抗体または発現さ
れた産物は、米国特許第5,591,645号、同第4,861,711号、同第5,861,319号、同
第5,858,804号、および同第5,863,720号、並びに国際特許出願公開第86/04683号
、欧州特許第154 749号、国際特許出願公開第86/03839号、および欧州特許第186
799号に開示されるアッセイと類似するアッセイにおいて有用である。本発明の
実施における抗体には、機能し得る該抗体の断片、例えば完全な抗体と比較して
結合の一部（例えば大部分）またはすべてを少なくとも統計的に意味ありげに保
持する断片が含まれる；例えば、抗体は結合領域を有する断片を含む。
【０２１２】 本発明の実施における組換えタンパク質精製を含むタンパク質精製は、Marsha
k et al,「タンパク質精製および特徴付けの方法。実験室過程マニュアル。」CS
HL Press, 1996に従うまたは類似する。
【０２１３】 トランスジェニックおよびノックアウト方法に関して、本発明には、トランス
ジェニック遺伝子および多型性遺伝子動物および細胞（細胞型）モデル並びに本
発明において同定された遺伝子についてのノックアウトモデルが含まれる。これ
らのモデルは、当該技術において知られる一般的方法を使用して、米国特許第5,
487,992号、同第5,464,764号、同第5,387,742号、同第5,360,735号、同第5,347,
075号、同第5,298,422号、5,288,846号、同第5,221,778号、同第5,175,385号、
同第5,175,384号、同第5,175,383号、同第4,736,866号並びにBurke and Olson(1
991), Capecchi(1989), Davies et al.(1992), Dickinson et al.(1993), Duff
and Lincoln(1995), Huxley et al.(1991), Jakobovits et al.(1993), Lamb et
al.(1993), Pearson and Choi(1993), Rothstein(1991), Schedl et al.(1993)
, Strauss et al.(1993)に示されるように作製される。さらに、国際特許出願公
開第94/23049号、同第93/14200号、同第94/06908号、同第94/28123号もまた情報
を提供する。
【０２１４】 したがって、例えば、本発明の方法を使用して、生理的または病気の状態、例
えば608または405または274のような物理的ストレスにより引き起こされる骨粗
しょう症または他の状態に関して関心ある遺伝子を測定することができ、ここに
おけるおよび当該技術における情報（例えばここに引用される文献）を使用して
、マウスまたはラットのようなノックアウトまたはトランスジェニック動物を調
製して生理的または病気の状態、物理的ストレスにより引き起こされる骨粗しょ
う症または他の状態になりやすい動物を産生し、それにより治療またはそのため
の薬剤をテストすることができる；または生理的または病気の状態に関係する理
論およびしたがって事前の研究をテストする、例えば特に405、608および274の
ような同定された遺伝子の機能をテストすることができる。したがって、本明細
書および当該技術における知識から、マウスまたはラットまたはげっ歯類のよう
なノックアウトまたはトランスジェニック動物の調製に過度の実験は必要ではな
い。
【０２１５】 さらに、本発明の遺伝子またはその一部、例えば全長タンパク質と同じまたは
類似する作用をするタンパク質を発現する一部、または本発明の方法により同定
される遺伝子は、例えば、インビボ発現またはインビトロ発現のために大腸菌ま
たは他のベクターまたはプラスミド中で組換えにより発現させることができる。
インビボまたはインビトロで本発明のまたは本発明により同定される遺伝子また
はその一部の遺伝子産物の発現のためのベクターまたは組換え体またはプラスミ
ドを作製および／または施用する方法は、任意の所望の方法、例えば以下に開示
される方法によるまたはそれに類似する方法でもよい：米国特許第4,603,112号
、同第4,769,330号、同第5,174,993号、同第5,505,941号、同第5,338,683号、同
第5,494,807号、同第4,722,848号、国際特許出願公開第94/16716号、同第96/394
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めのプライマー」,PNAS USA 93:11307-11312,1996年10月,Andreansky et al.,「
実験的脳腫瘍の治療のための遺伝的に処理された単純疱疹ウィルスの適用」, PN
AS USA 93:11313-11318,1996年10月,Robertson et al.「Bリンパ球への遺伝子供
給のためのエプスタイン−バーウィルスベクター」, PNAS USA 93:11334-11340,
1996年10月,Frolov et al.,「アルファウィルスに基づく発現ベクター：方法お
よび適用」, PNAS USA 93:11371-11377,1996年10月, Kitson et al., J.Virol.6
5, 3068-3075,1991;米国特許第5,591,439号、5,552,143号（組換えアデノウィル
ス）, Grunhaus et al.,1992,「クローニングベクターとしてのアデノウィルス
」, Seminars in Virology (vol.3) p.237-52,1993, Ballay et al. EMBO Journ
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269, 2550-2561, Science, 259:1745-49,1993年およびMcClements et al.,「単
独でまたは組み合わせて糖タンパク質Dまたは糖タンパク質BをコードするDNAワ
クチンによる免疫化により、単純疱疹ウィルス−2病の動物モデルにおける保護
免疫性が誘発される」, PNAS USA 93:11414-11420,1996年10月、および特にDNA
発現ベクターに関する米国特許第5,591,639号、同第5,589,466号および同第5,58
0,859号。国際特許出願公開第98/33510号; Ju et al., Diabetologia, 41:736-7
39, 1998（レンチウィルス発現系）; Sanford et al.,米国特許第4,945,050号（
生きている細胞および組織中に物質を輸送する方法およびそのための装置）; Fi
schbach et al.(Intracel), 国際特許出願公開第90/01543号（トランスフェクシ
ョンされた細胞により異種タンパク質を遺伝的に発現する方法）; Robinson et
al., seminars in IMMUNOLOGY, vol.9, pp.271-283(1997)（DNAワクチン）; Szo
ka et al.,米国特許第4,394,448号（生きている細胞中にDNAを挿入する方法）;
およびMcCormick et al.,米国特許第5,677,178号（新成形の治療および予防のた
めの細胞変性ウィルスの使用）も参照。
【０２１６】 本発明においてベクターまたは組換え体により産生される発現産物は、必要に
応じて感染されたまたはトランスフェクションされた細胞から単離および／また
は精製されて、例えば患者に投与するための組成物を調製してもよい。しかしな
がら、ある例において、例えば細胞またはその一部がポリペプチドの効果を高め
る場合には、細胞からの発現産物を単離および／または精製しないことが都合が
よいかもしれない。
【０２１７】 ここでまたはここにおける方法から同定される遺伝子を発現する本発明のベク
ターまたは組換え体あるいはその一部を適切な量で投与して、適切な投薬レベル
、例えばここに記載される投薬レベル（遺伝子産物が直接に存在する）に類似す
る投薬レベルにおける発現を達成することができる。本発明のベクターまたは組
換え体を、少なくとも約103pfu；より好ましくは約104pfuから約1010pfuまで、
例えば約105pfuから約109pfuまで、例えば約106pfuから約108pfuまでの量で患者
に投与するまたは細胞を感染するあるいは細胞中にトランスフェクションするこ
とができる。プラスミド組成物において、投薬量は、遺伝子産物またはその一部
が直接存在する組成物に類似する応答を惹起するために；またはそのような組成
物中の投薬量に類似する発現を有するために、；あるいは組換え組成物によりイ
ンビボで得られる発現に類似する発現を有するために十分な量のプラスミドでな
ければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドDNAの適切な量は、1
μgから100mgまで、好ましくは0.1mgから10mgまで、例えば500マイクログラムで
もよいが、0.1mgから2mgまでまたは好ましくは1−10μgのようなより低いレベル
を使用してもよい。DNAプラスミドベクターに関してここに引用される記載を調
べて、当業者は、不当な実験をせずに本発明のDNAプラスミドベクター組成物に
ついての他の適切な投薬量を確かめることができる。
【０２１８】 ベクターを投与するための組成物は、ここに引用される記載中のそのような組
成物に関するまたは類似するあるいはここに記載される組成物、例えば薬剤また
は治療組成物等（例えば以下参照）に関するまたは類似してもよい。
【０２１９】 したがって、本発明には、ときに「遺伝子治療」と称されるインビボにおける遺
伝子発現が含まれる。遺伝子治療は、関心のある遺伝物質（例えばDNAまたはRNA
）を宿主中に移入して、遺伝的または後天性の病気または表現型を治療するまた
は予防することに関してもよい。使用されるまたは標的遺伝子として同定される
特定の遺伝子は、前記のように同定される。関心のある遺伝物質は、インビボに
おける産生が所望である産物（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまた
は機能性RNA）をコードする。例えば、関心のある遺伝物質は、治療上の価値を
有するホルモン、レセプター、酵素、ポリペプチドまたはペプチドをコードでき
る。通常、「遺伝子治療」(Advances in Pharmacology 40, Academic Press, 1997
)参照。
【０２２０】 遺伝子治療のための二つの基本的アプローチにより、（１）半ビボおよび（２
）インビボにおける遺伝子治療が発展した。半ビボの遺伝子治療において、細胞
を患者から除去し、培養中にインビトロで治療する。通常、機能性の置換性遺伝
子を、適切な遺伝子供給媒体／方法（トランスフェクション、相同組換え体など
）により細胞中に導入し、必要な発現型およびその後変化した細胞を培養液中で
拡大し、宿主／患者に戻す。これらの遺伝的に再移植された細胞は、インサイチ
ュでトランスフェクションされた遺伝子を産生することが示された。インビボに
おける遺伝子治療において、標的細胞は被検者から除去されず、移入される遺伝
子は宿主内でインサイチュで宿主生体の細胞中に導入される。あるいは、宿主遺
伝子が不完全である場合、遺伝子はインサイチュで修復される(Culver, 1998)。
これらの遺伝的に変化した細胞は、インサイチュでトランスフェクションされた
遺伝子産物を産生することが示されている。
【０２２１】 遺伝子発現媒体は、異種核酸を宿主細胞中に供給／運搬することができる。発
現媒体には、当該技術において知られるように細胞選択的方法で核酸のターゲテ
ィング、発現および転写をコントロールする要素が含まれてもよい。遺伝子の5
’UTRおよび／または3’UTRはしばしば、発現媒体の5’UTRおよび／または3’UT
Rにより置換されることに留意すべきである。したがって、ここに用いたように
発現媒体には、必要に応じて、ここに順に示される5’UTRおよび／または3’UTR
が含まれなくてもよいおよび特定のアミノ酸コード領域のみが含まれてもよい。
【０２２２】 発現媒体は、異種物質の転写をコントロールするプロモーターを含んでもよく
、選択的転写を可能にする構成性または誘導性プロモーターのいずれかでもよい
。必要な転写レベルを得るために必要なエンハンサーが必要に応じて含まれても
よい。エンハンサーは通常、コード配列（シスの）と隣接して作用しプロモータ
ーにより示される基礎的な転写レベルを変化させる任意の非翻訳DNAである。発
現媒体にはまた、ここに記載される選択遺伝子が含まれてもよい。
【０２２３】 当該技術内の様々の既知の方法の任意の一つによりベクターを細胞または組織
中に導入してもよい。そのような方法は通常、Sambrook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989
, 1992)、Ausubel et al., Current Ptorocols in Molecular Biology, John Wi
ley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)、Chang et al., Somatic Gene Ther
apy, CRC Press, Ann Arbor, MI(1995)、Vega et al., Gene Targeting, CRC Pr
ess, Ann Arbor, MI(1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors
and Their Uses, Butterworths, Boston MA(1988) and Gilboa et al(1986)、
並びにここに引用される他の文書（上記参照）に記載されており、例えば安定し
たまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレー
ションおよび組換えウィルスベクターによる感染を含んでもよい。さらに、中枢
神経系を含むベクターについて米国特許第4,866,042号および陽陰選択方法につ
いて米国特許第5,464,764号および同第5,487,992号参照。
【０２２４】 感染による核酸の導入により、他の列挙された方法以上の多くの利点が提供さ
れる。感染性の性質のために、より高い効率を得ることができる。さらに、ウィ
ルスは非常に分化しており、通常特定の細胞型において感染し増殖する。したが
って、それらの天然の特異性を使用して、ベクターの目標をインビボでまたは組
織または細胞の混合培養内で特定の細胞型にすることができる。ウィルスベクタ
ーを特定のレセプターまたはリガンドで修飾して、レセプターにより媒介される
イベントを通して標的特異性を変化させることができる。
【０２２５】 組換え配列を導入および発現するDNAウィルスベクターの特定の例は、アデノ
ウィルス由来ベクターAdenop53TKである。このベクターは、陽性または陰性選択
のためのヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(TK)および所望の組換え配列につい
ての発現カセットを発現する。このベクターを使用して、上皮起源の多くの癌を
含むアデノウィルスレセプターおよび他のレセプターを有する細胞を感染させる
ことができる。このベクター並びに同様の所望の機能を示す他のレセプターを使
用して、細胞の混合個体群を治療することができ、細胞、組織またはヒト被験者
のインビトロまたは半ビボ培養が含まれてもよい。
【０２２６】 追加の特徴をベクターに加えて、安全性を保障するおよび／または治療の有効
性を高めることができる。そのような特徴には例えば、組換えウィルスにより感
染された細胞に対する陰性の選択をするために使用できるマーカーが含まれても
よい。そのような陰性の選択マーカーの例は、抗生ガンシクロビルに選択性を与
える上述のTK遺伝子である。したがって、抗生物質を加えることによる誘発性自
殺を提供するので、陰性の選択は感染をコントロールすることができる方法であ
る。そのような保護により、例えば、ウィルスベクターまたは組換え配列の変化
した形態を産生する突然変異が生ずる場合には、細胞形質転換が起こらないこと
が保証される。特定の細胞型に発現を制限する特徴が含まれてもよい。そのよう
な特徴には例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節エレメント
が含まれる。
【０２２７】 さらに、組換えウィルスベクターは、側性感染およびターゲティング特異性の
ような利点を提供するので、所望の核酸のインビボにおける発現に有用である。
側性感染は、例えばレトロウィルスの生活周期に固有であり、単一の感染された
細胞が近隣の細胞から分離し感染させる多くの後代ビリオンを産生する方法であ
る。その結果、大きい領域が急速に感染され、その多くは原ウィルス粒子によっ
て最初は感染されなかった。これは、感染物質が娘後代にのみ広がる感染の垂直
型と対照的である。側方に広がることができないウィルスベクターを産生しても
よい。この特性は、示された遺伝子を所定の数の標的化細胞中に導入することが
所望の目的である場合に有用である。
【０２２８】 上述のように、ウィルスは、多くの場合において宿主防御機構を回避するため
に発展した非常に分化した感染物質である。通常、ウィルスは、特定の細胞型に
おいて感染し増殖する。ウィルスベクターのターゲティング特異性は、特異的に
所定の細胞型を標的とし、それにより組換え遺伝子を感染された細胞に導入する
天然の特異性を利用する。本発明の方法において使用されるベクターは、標的と
される所望の細胞型に依存し、当業者にとって既知であろう。例えば、乳癌を治
療する場合、そのような上皮細胞に特異的なベクターが使用される。同様に、造
血系の病気または病的状態を治療する場合、血球およびその前駆体、好ましくは
造血細胞の特定の型に特異的なウィルスベクターが使用される。
【０２２９】 レトロウィルスベクターを、感染性粒子として機能するまたは感染の単一の初
期ラウンドのみを受けるように構成することができる。前者の場合、ウィルスの
ゲノムを修飾し、すべての必要な遺伝子、調節配列およびパッケージングシグナ
ルを維持して新しいウィルスタンパク質およびRNAを合成させる。これらの分子
を合成すると、宿主細胞は、RNAを感染のさらなるラウンドを受けることができ
る新しいウィルス粒子にパッケージングする。ベクターのゲノムを処理して、所
望の組換え遺伝子をコードするおよび発現する。非感染性ウィルスベクターの場
合、通常ベクターゲノムを突然変異して、RNAをウィルス粒子中に入れるのに必
要なウィルスパッケージングシグナルを破壊する。そのようなシグナルなしでは
、形成される任意の粒子は、ゲノムを含まず、したがって感染のその後のラウン
ドを進行することができない。ベクターの特定の型は、意図される適用に依存す
る。実際のベクターも既知であり、当該技術内で容易に得られるまたはよく知ら
れる方法を使用して当業者により構成することができる。
【０２３０】 組換えベクターは、多くの方法で投与してもよい。ウィルスベクターを使用す
る場合、例えば、進行には標的特異性を利用することができ、したがって病気の
部位において局所的に投与される必要はない。しかしながら、局所投与によりよ
り早くより効果的な治療を提供することができ、投与は、例えば被験者への静脈
または皮下注射により行うことができる。骨髄液へのウィルスベクターの注入を
、特に神経変性病の場合に投与の方法として使用できる。注入後、ウィルスベク
ターは、感染に適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。
【０２３１】 投与の代わりの方法は、病気または病的状態の部位における局所的な直接の接
種または該部位に栄養を供給する脈管系または骨髄液への接種によってもよい。
希釈効果がなく、したがって大部分の標的細胞で発現を達成するために必要な投
与量がより少なくなるので、局所投与は都合がよい。さらに、接種された領域で
すべての細胞を感染させるベクターを使用できるので、局所接種は、投与の他の
形態で必要とされるターゲティング必要条件を軽減することができる。接種され
た領域内の特定の集合の細胞においてのみ発現が所望である場合、該所望の集合
に特異的なプロモーターおよび調節エレメントを使用して、この目的を達成する
ことができる。そのような非ターゲティングベクターは、ウィルスベクター、ウ
ィルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどでもよい。リポソームのようなト
ランスフェクション媒体を使用して、上述の非ウィルスベクターを接種された領
域内の宿主細胞中に導入することができる。そのようなトランスフェクション媒
体は、当業者に知られている。
【０２３２】 本発明のベクターは、ここに示される遺伝子、並びに例えばプロモーターのよ
うな、発現のために該遺伝子に機能可能に結合した調節エレメントを含んでもよ
い；調節エレメントまたはプロモーターは、細胞またはその前駆体中の発現のた
めに、本発明またはここに記載されるあるいはここに引用される試験において使
用できる、例えば、調節エレメントまたはプロモーターは、骨芽細胞または破骨
細胞あるいはその前駆体のような骨細胞中の発現のためでもよい。
【０２３３】 遺伝子産物（ここに示される遺伝子：ここにまたは本発明の方法により同定さ
れる遺伝子またはその一部からの産物）および／または抗体またはその一部およ
びアゴニストまたはアンタゴニスト（集合的なまたは個々の「治療」）、および同
じものを含む組成物、並びに遺伝子産物を発現するベクターを有する組成物の供
給は、本明細書および当該技術における知識から不当な実験をせずに行うことが
できる。
【０２３４】 本発明により、ここに示される遺伝子、またはその一部、例えばその機能性部
分をコードする一部を有する発現ベクター、並びにここに同定される遺伝子に基
づく治療を含む組成物、例えば発現産物またはその機能性部分あるいはそれに対
する抗体またはその機能性部分および／またはアゴニストまたはアンタゴニスト
を含む組成物が提供される。（したがって、ここに示される遺伝子には、全長発
現産物の機能性部分を発現する一部が含まれる）。本発明の治療およびベクター
は、良好な医学診療にしたがって投与および投薬され、個々の患者の臨床状態、
投与の部位および方法、投与の計画、患者の年齢、性別、体重、患者の人種、お
よび薬学または獣医学の技術における当業者に知られる他の因子を考慮に入れる
。
【０２３５】 したがって、本発明の目的のために薬学的に「効果的な量」は、当該技術におい
て知られる考察により定められる。この量は、当業者により適切な方法として選
択されるように、改良された生存率またはより早い回復、あるいは例えば骨粗し
ょう症の症状および他の指標の改善または除去、例えば骨密度における改善を含
む改良を達成するために効果的でなければならないが、これに限定されない。
【０２３６】 適切な場合には、本発明の治療は薬剤であり、したがって様々の方法で投与で
きる。これらの治療は、発現産物および／またはその一部および／または抗体お
よび／またはその一部としてまたは薬学的に許容できる塩として投与できる、お
よび単独でまたは薬学的に許容できるキャリア、賦形薬、補助薬および賦形剤、
並びに他の活性成分（例えば、ここに記載されるような、本発明の方法からの他
の発現産物、その一部、抗体、その一部、および／または他の治療）と組み合わ
せる活性成分として使用できる。経口的に、皮下的にまたは静脈内、動脈内、筋
肉内、腹腔内、および鼻腔内投与並びにくも膜下および注入技術を含む非経口的
に、化合物を投与することができる。
【０２３７】 治療のおよび／またはここに示される遺伝子を発現するベクターの移植組織も
有用である。治療される患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳類である。薬学
的に許容できるキャリア、賦形薬、補助剤および賦形剤並びに移植組織キャリア
は通常、本発明の活性成分と反応しない不活性の、非毒性固体または液体充填剤
、賦形剤または被包物質を称する。移植組織を骨の近くに配置し、骨成長を刺激
するまたは骨密度を増加させることができる。治療に関する本発明の実施におい
て使用できる移植組織または緩効性システム、またはここに示される遺伝子を発
現するベクターに関しては、米国特許第4,150,108号、同第4,329,332号、同第4,
331,652号、同第4,333,919号、同第4,389,330号、同第4,489,055号、同第4,526,
938号、同第4,530,840号、同第4,542,025号、同第4,563,489号、同第4,675,189
号、同第4,677,191号、同第4,683,288号、同第4,758,435号、同第4,857,335号、
同第4,931,287号、同第5,178,872号、同第5,252,701号、同第5,275,820号、同第
5,478,564号、同第5,540,912号、同第5,447,725号、同第5,599,852号、同第5,60
7,686号、同第5,609,886号、同第5,631,015号、同第5,654,010号、同第5,700,48
5号、同第5,702,717号、同第5,711,968号、同第5,733,566号、同第4,938,763号
、同第5,077,049号、同第5,278,201号、同第5,278,202号、同第5,288,496号、同
第5,324,519号、同第5,324,520号、同第5,340,849号、同第5,368,859号、同第5,
401,507号、同第5,419,910号、同第5,427,796号、同第5,487,897号、同第5,599,
552号、同第5,632,727号、同第5,643,595号、同第5,660,849号、同第5,686,092
号、同第5,702,716号、同第5,707,647号、同第5,717,030号、同第5,725,491号、
同第5,733,950号、同第5,736,152号、同第5,744,153号、同第5,759,563号、およ
び同第5,780,044号、欧州特許出願第0537559号, Shan et al(J. Controlled Rel
ease, 1993, 27:139-147), Lambert and Peck(J. Controlled Release, 1995, 3
3:189-195)、およびShivley et al(J. Controlled Release, 1995, 33:237-243)
に記載されている。
【０２３８】 ヒトは通常、マウスまたはここに例示される他の実験動物よりも長く治療され
ることに留意すべきであり、治療は病気の過程の長さおよび薬の有効性に比例し
た長さを有する。投与量は、単一の投与量または数日間の複合的な投与量でもよ
いが、単一の投与量が好ましい。したがって、不当な実験をせずに、本明細書お
よび当該技術における知識からの技術により、例えばラット、マウスなどの動物
実験からヒトへスケールアップすることができる。
【０２３９】 投与量は、単一の投与量または数日間の複合的な投与量でもよい。治療は通常
、病気の過程の長さおよび薬の有効性および治療される患者の種類に比例する長
さを有する。
【０２４０】 本発明の治療またはベクターを非経口的に投与する場合、通常、均一な投与量
の注入可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で調製される。注入に適切な
薬剤には、無菌性水溶液または分散および無菌性の注入可能な溶液または分散に
再構成するための無菌性粉末が含まれる。キャリアは、例えば水、エタノール、
ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリ
コールなど）、それらの適切な混合物、および野菜油を含む溶媒または分散媒質
でもよい。
【０２４１】 例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な
粒子のサイズの維持によりおよび界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持
できる。綿実油、ゴマ油、オリーブオイル、大豆油、ヒマワリ油、またはピーナ
ツ油およびイソプロピルミリステートなどのエステルのような非水溶性賦形剤を
、複合組成物のための溶媒系として使用してもよい。
【０２４２】 さらに、抗菌性防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む組成物の
安定性、無菌性、および等張性を増加させる様々の添加物を加えてもよい。様々
の抗菌性および抗真菌性物質、例えばパラベンス(parabens)、クロロブタノール
、フェノール、ソルビン酸などにより、微生物の作用を確実に防止することがで
きる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張性物質が含まれること
が好ましい。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収
を遅延させる物質の使用により、注入可能な薬剤形態の吸収を延長することがで
きる。しかしながら、本発明によると、使用される任意の賦形剤、希釈剤、また
は添加剤は、化合物と反応を起こさない必要がある。
【０２４３】 必要な量の適切な溶媒中で本発明の実施に使用される化合物を、所望のように
、様々の他の成分と混合することにより、無菌性の注入可能な溶液を調製するこ
とができる。
【０２４４】 例えば治療物および／またはベクターを含む本発明の薬剤は、様々の賦形剤、
補助薬、添加剤、および賦形薬のような任意の親和性キャリアを含む注入可能な
形態で患者に投与することができる；または本発明において使用される化合物は
、緩効性皮下移植またはモノクローナル抗体、ベクターによる供給、イオン導入
、ポリマーマトリクス、リポソーム、およびマイクロスフェアのような標的化供
給系の形態で非経口的に患者に投与することができる。本発明において有用な供
給系の例には、5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,4
87,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196;および4,475,196が含ま
れる。多くの他のそのような移植、供給系、およびモジュールは、当業者によく
知られている（例えば上述の、ここに引用される文献も参照）。
【０２４５】 本発明において使用される化合物の薬理学的製剤を、患者に経口的に投与して
もよい。錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどで
化合物を投与する従来の方法が使用できる。経口的にまたは非経口的に供給し、
生物学的活性を維持する既知の技術が好ましい。
【０２４６】 ある実施の形態において、本発明の製剤は、初めに投与し、その後さらに投与
することにより維持してもよい。例えば、本発明の製剤を、あるタイプの組成物
で投与し、その後異なるまたは同じタイプの組成物でさらに投与してもよい。例
えば、本発明の製剤を静脈注射により投与して、血液レベルを適切なレベルにす
ることができる。その後、患者の状態に依存しておよび上述に示されるように、
投与の他の形態が使用できるが、患者のレベルを経口投薬形態により維持する。
【０２４７】 投与される量は、治療される患者について変化し、1日に体重の約100ng/kgか
ら体重の100mg/kgまでおよび好ましくは1日に10pg/kgから10mg/kgまで変化する
。例えば、本明細書および当該技術における知識から、投薬量は当業者により容
易に確かめられる。したがって、当業者は、組成物中のおよび本発明の方法にお
いて投与される遺伝子産物および必要に応じた添加物、賦形剤、キャリアおよび
／または補助薬の量を容易に測定することができる。通常、補助薬または添加剤
は、食塩加リン酸緩衝液中の0.001から50wt%までの溶液として使用され、遺伝子
産物または活性成分は、約0.0001から約5wt%まで、好ましくは約0.0001から約1w
t%まで、最も好ましくは約0.0001から約0.05wt%までまたは約0.001から約20wt%
まで、好ましくは約0.01から約10wt%まで、および最も好ましくは約0.05から約5
wt%までのような、マイクログラムからミリグラムまでのオーダーで存在する。
もちろん、動物またはヒトに投与される任意の組成物およびその成分について、
および投与の任意の特定の方法について、以下のものを測定することが好ましい
；例えばマウスのようなげっ歯類などの適切な動物モデルにおいて致死量(LD)お
よびLD50を測定することによる毒性；および、例えばELISAおよび／またはRFFIT
分析による血清のタイトレーションおよびその分析による、適切な応答を惹起す
る組成物の投与量、その中の成分の濃度および組成物を投与するタイミング。そ
のような測定には、当業者の知識、本明細書およびここに引用される文献から不
当な実験を必要としない。また、系列投与の時間は、不当な実験をせずに確かめ
ることができる。
【０２４８】 本発明の治療物および／またはベクターを含む組成物の例には、開口部、例え
ば口、鼻、肛門、膣、経口、胃内、粘膜（例えば舌下、歯槽、歯肉、嗅覚または
呼吸粘膜）などのための液体製剤、懸濁液、シロップまたはエリキシルのような
投与；および、無菌性懸濁液またはエマルジョンのような非経口的、皮下、皮内
、筋肉内または静脈投与（例えば注射可能な投与）のための製剤が含まれる。そ
のような組成物は、滅菌水、生理的塩類溶液、グルコースなどのような適切なキ
ャリア、希釈剤または賦形剤と混合してもよい。組成物は、凍結乾燥してもよい
。組成物は、投与の経路および所望の製剤に依存して、加湿薬または乳化剤、pH
緩衝剤、ゲル化または粘性増強添加剤、保存薬、着香剤、着色剤などのような補
助剤を含んでもよい。ここに引用される、”REMINGTON’S PHARMACERTICAL SCIE
NCE”, 17th edition, 1985のような標準書を調べて、不当な実験をせずに適切
な製剤を調製できる。
【０２４９】 本発明の組成物は、選択されたpHに緩衝剤で処理される等張性水溶液、懸濁液
、エマルジョンまたは粘性組成物のような液体製剤として都合よく提供される。
消化管吸収が好ましい場合、本発明の組成物は、持続性であるかまたは液体充填
、例えばゼラチンにより被覆された液体を有し、それによりゼラチンは胃内で溶
解して消化管に供給される「固体」製剤を含む、丸剤、錠剤、カプセル、カプレッ
トなどの「固体」形態でもよい。鼻または呼吸（粘膜）投与が所望の場合、組成物
はある形態でもよく、圧搾スプレーディスペンサー、ポンプディスペンサーまた
はエアロゾルディスペンサーにより投薬されてもよい。エアロゾルは通常、炭化
水素による圧力下である。ポンプディスペンサーは好ましくは、調節された投与
量または、特定の粒子サイズを有する投与量を投薬することが好ましい。
【０２５０】 本発明の組成物は、特に経口的に投与された場合に、より興味を引くために薬
学的に許容できる香りおよび／または色を有してもよい。粘性組成物は、ゲル、
ローション、軟膏、クリームなどの形態でもよく（例えば経皮的投与のため）、
通常は十分な量の肥厚剤を含むので、粘性は約2500から6500cpsまでであるが、1
0,000cpsまでのより粘性の組成物を使用してもよい。粘性組成物は、好ましくは
2500から5000cpsまでの粘性を有するが、該範囲を超えると投与がより困難にな
る。しかしながら、該範囲を超えた場合、組成物はほぼ固体またはゼラチン形態
であり、経口摂取のための嚥下丸剤として容易に投与される。
【０２５１】 液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製が容易で
ある。さらに、液体製剤は、特に注射または経口により、動物、子供、特に小さ
い子供、および丸剤、錠剤、カプセルなどを飲み込むのが困難な、または投薬量
が多い人に投与するのにより都合がよい。他方、粘性組成物は、適切な粘性範囲
内で調製することができ、胃の内層または鼻粘膜のような粘膜とのより長い接触
時間を提供することができる。
【０２５２】 適切なキャリアおよび他の添加物の選択は、投与の適格な経路および特定の投
薬形態、例えば液体投薬形態（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたは他の
液体形態に調製される場合）、または固体投薬形態（例えば、組成物が丸剤、錠
剤、カプセル、カプレット、持続性形態または液体充填形態に調製される場合）
の性質に依存することは明らかである。
【０２５３】 溶液、懸濁液およびゲルは通常、抗原、リポタンパク質および必要に応じて補
助剤に加えて、大量の水（好ましくは精製された水）を含む。pH調製剤（例えば
NaOHのような塩）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、保存剤、加湿剤、ゼリー化剤
、（例えばメチルセルロース）、色および／または香りのような少量の他の成分
が存在してもよい。組成物は、等張性でもよい、すなわち、血液および涙と同じ
浸透圧を有してもよい。
【０２５４】 本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、またはブドウ糖、ホウ酸
、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機または有機溶質のよ
うな他の薬学的に許容できる物質を使用して達成できる。ナトリウムイオンを含
有する緩衝剤には、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【０２５５】 組成物の粘性は、薬学的に許容できる肥厚薬を使用して選択されたレベルに維
持することができる。容易におよび経済的に得ることができ、取り扱いやすいの
で、メチルセルロースが好ましい。他の適切な肥厚薬には、例えば、キサンタン
ガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマ
ーなどが含まれる。肥厚薬の好ましい濃度は、選択される物質に依存する。重要
なことは、選択された粘性を達成する量を使用することである。粘性組成物は通
常、そのような肥厚薬の添加により溶液から調製される。
【０２５６】 ここに述べたように、薬学的に許容できる保存薬を使用して、組成物の貯蔵寿
命を増加させることができる。ベンジルアルコールが適切であるが、例えばパラ
ベン、チメロサール、クロロブタノール、または塩化ベンザルコニウムを含む様
々の保存薬を使用してもよい。保存薬の適切な濃度は、全重量に基づき0.02%か
ら2%までであるが、選択される物質に依存して適切に変化してもよい。
【０２５７】 遺伝子産物および必要に応じた補助薬または添加剤に関して化学的に不活性で
あるように組成物の成分を選択しなければならないことを当業者は認識するであ
ろう。このことは、化学および薬学の原理における当業者に何の問題もないであ
ろう、または本明細書およびここに引用される文献から、標準書を参照すること
によりまたは簡単な実験により（不当な実験を含まない）問題の発生を容易に防
止できる。
【０２５８】 本発明の組成物は、一般に是認される方法の後に成分を混合することにより調
製される。例えば選択される成分をブレンダー、または他の標準装置中で簡単に
混合して、濃縮された混合物を産生し、その後水または肥厚薬およびpHをコント
ロールするための緩衝剤または張度をコントロールするための追加の溶質を加え
ることにより最終濃度および粘性に調製してもよい。通常pHは約3から7.5までで
よい。特定の患者または動物の年齢、性別、体重および状態、および投与に使用
される組成物形態（例えば固体対液体）のような因子を考慮に入れて、医学およ
び獣医学における当業者によく知られる投薬量でおよび技術により組成物を投与
することができる。ヒトまたは他の哺乳類に対する投与量は、本明細書、ここに
引用される文献、以下の実施例から当業者により不当な実験をせずに測定できる
。
【０２５９】 最初の投与およびブースター投与量にまたは系列投与に適切な養生もまた変化
し、最初の投与後に投与が行われることを含む；しかし、それにもかかわらず、
本明細書、ここに引用される文献、および以下の実施例から、当業者により確か
められる。
【０２６０】 したがって、本発明には、さらなる態様において、ここに同定される遺伝子ま
たは本発明の方法において同定される遺伝子の遺伝子産物またはその機能性断片
を含む治療組成物を調製する方法、並びに骨密度を増加させ、骨粗しょう症を治
療、予防またはコントロールする、または物理的ストレスにより生ずる状態を緩
和するあるいは本発明の組成物、またはここに同定される遺伝子または本発明の
方法において同定される遺伝子の遺伝子産物、またはその機能性断片、あるいは
そのような遺伝子を発現するベクターの投与を含む骨成長を誘発する方法が含ま
れる。
【０２６１】 これに関連しておよび本明細書に亘って用いたように、「機能性」とは、タンパ
ク質が、ここに同定される遺伝子または本発明の方法により同定される遺伝子の
タンパク質遺伝子産物の一次構造配座の一部またはすべてを有し、天然供給源か
ら単離されるかまたはタンパク質合成方法の原核または真核発現の産物であるこ
とを特徴とする全長タンパク質遺伝子産物と同じまたは類似する方法で骨細胞の
発達に寄与する生物学的特性を有することを意味する。該タンパク質は、ここに
開示される配列または本発明の方法により同定される遺伝子の遺伝子産物または
アミノ酸欠失、置換、挿入、付加および／またはアミノ酸配列の置換による前記
遺伝子産物の任意の断片または誘導体のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有す
る。「機能性」タンパク質には、抗体反応のような特異的免疫応答；例えば全長タ
ンパク質により惹起された抗体への結合、を産生する前記タンパク質またはその
一部の能力も含まれる。
【０２６２】 さらに、本発明およびその実施の形態により、物理的ストレスまたはその欠乏
により生ずるまたはそれらを因子として有する骨粗しょう症および状態に関して
さらなる研究および知識における進歩および補助が提供され、骨組織の発達およ
び維持への洞察が提供される。本発明およびその実施の形態により、例えば実際
の予防および治療のための現在の可能性をさらに探究し拡大することを可能にす
るさらなる臨床的および疫学的研究における進歩および補助が提供される。さら
に、本発明およびその実施の形態により、骨細胞活性をコントロールする因子お
よび物理的ストレスまたはその欠乏を含む骨粗しょう症または他の状態の原因の
理解に根本的に寄与する骨無機質およびマトリクス形成および再造形の調節のよ
り深い知識が提供される。例えば、本発明により、インビトロにおける研究のた
めの骨粗しょう症または物理的ストレスまたはその欠乏モデルが提供される。こ
の理解により、現在の治療が臨床的に評価されていても、より合理的な治療の選
択および評価が可能となる。さらに、本発明のモデルを経て本発明により、例え
ば骨粗しょう症および／または成長または形成あるいは骨細胞活性の過程に関す
る遺伝子を発見することが可能となる。発見されたすべての新しい遺伝子により
、生命のすべての態様を決定する複合的な分子のイベントがより解明される。遺
伝子の機能および経路および構造のこの複雑なネットワークにおけるその位置お
よび役割の解明により、生命の問題に置ける他の部分が解決される。したがって
、教育上のおよび研究上の関係は非常に密接である。ときに遺伝子は、治療／診
断分野よりもこの点においてより大きな恩恵を有する。
【０２６３】 本発明の説明のためにおよびさらなる記載として与えられる以下の実施例から
、本発明およびその多くの利点がより理解される。
【０２６４】実施例／結果 実施例／結果１：核mRNAプローブを使用する転写レベルにおける遺伝子の分析特異な翻訳 材料／方法（実施例のいくつかまたは全てに全部または一部適用してもよい） 概要 a. 供給源の組織または細胞からの全RNAのトータルmRNA有機抽出。（さらに
polyA+mRNAの選択が含まれてもよい）。
【０２６５】 b. 低張緩衝剤中における均質化による細胞（組織または細胞系から）の核R
NA溶解。RNAの遠心分離および有機抽出による核の採集。
【０２６６】 c. 上述のbからの上澄みからのRNAの細胞質RNA有機抽出。
【０２６７】 d. ポリリボソーム／サブポリリボソーム分別。低張緩衝剤中における均質
化による細胞の溶解、直線的なスクロース勾配上における核の除去とポリリボソ
ームの分別および勾配のそれぞれの分画からのRNAの有機抽出。
【０２６８】 e. 分泌および膜コード化転写情報。
【０２６９】 １． Percoll勾配上におけるRERの単離（細胞の均質化後）。
【０２７０】 ２． RERを含有するミクロソームの調製。
【０２７１】 ３． 洗剤による細胞の連続的な処理による膜結合ポリリボソームの単離。
【０２７２】 f. 核タンパク質。異なる洗剤による細胞溶解産物の処理による細胞骨格結
合ポリリボソームの単離。
【０２７３】 g. ミトコンドリア遺伝子。Percoll勾配上におけるミトコンドリアの単離。
【０２７４】 h. 変化したスプライシング。直線的なスクロース勾配上における核の分離
およびスプライセオソーム（タンパク質およびRNA複合体）の単離。
【０２７５】 細胞抽出物の調製：細胞を遠心分離した。ペレットをPBSで洗浄し、再び遠心
分離した。細胞を、低張性溶解緩衝剤(HLB: 20mM TrisHCl pH=7.4; 10mM NaCl;
3mMgCl2)により1充填赤血球量の４倍量に再び懸濁した。細胞を氷上で5分間イン
キュベートした。1.2% Triton X-100および0.2Mスクロースを含有するHLBの1×P
CVを加えた。細胞を、Dounceホモジナイザー（B乳棒による5ストローク）により
均質化した。細胞溶解産物を、4℃で10分間2300gで遠心分離した。上澄を新しい
チューブに移した。10mg/mlのヘパリンを含有するHLBを、1mg/mlのヘパリンの最
終濃度まで加えた。NaClを0.15Mの最終濃度まで加えた。上澄を液体N2中で急速
凍結した後−70℃で凍結させたまたはすぐに使用した。
【０２７６】 スクロース勾配分別：HLB中で0.5Mから1.5Mスクロースまでの直線状スクロー
ス勾配を調製した。ポリアロマーチューブ(14×89mm)を使用した。細胞抽出物の
0.5から1.0mlまでを勾配上に載せた。細胞を4℃で110分間36,000RPMで遠心分離
した。ISCO密度分別機(Density Fractionator)を使用して、分画を収集し、吸収
特性を記録した。
【０２７７】 RNA精製：0.5％までSDSをおよび0.1mg/mlまでプロテイナーゼKを加え、30分間
37℃でインキュベートした。等量のフェノール＋クロロホルム(1:1)で抽出した
。水相を1倍量のクロロホルムで抽出し、0.3MまでのNa-アセテートおよび2.5倍
量のエタノールを加え−20℃で一晩インキュベートすることによりRNAを沈殿さ
せた。10分間遠心分離し、上澄を吸引し、RNAペレットを、滅菌したジエチルピ
ロカーボネート（以下「DEPC」と称される）DEPC処理された水に溶解した。
【０２７８】 ミクロソームの調製：可能な新しい組織および細胞を使用する場合、凍結させ
ない。乳鉢および乳棒により液体窒素中で組織を粉末にし、その後4mlの緩衝剤A
/1 gr組織を使用して均質化した（緩衝剤Aは、250mMのスクロース、50mMのTEA、
50mMのKOAc pH7.5、6mMのMg(Oac)2、1mMのEDTA、1mMのDTT、0.5mMのPMSFである
。PMSFは、緩衝剤を作製する前にエタノール中で作製し、かき混ぜながら緩衝剤
に滴下した。これを15分間攪拌し、その後DTTを加えた）。新鮮な器官を数分間
緩衝剤A中で洗浄し、その後断片に切断し均質化した。約5mlの緩衝剤A／5×108
細胞を加え、均質化した。次にこれを氷上で5−10分間、またはそれぞれの組織
の必要に応じて均質化した。混合物を50mlチューブに移した後、4℃で10分間、
揺動バケットローターマシン(swinging bucket rotor machine)中で遠心分離し
た。次に、できるだけペレットを避けて上澄をSorvallチューブに移し、1mlの緩
衝剤でペレットを再び洗浄し、前記のように遠心分離した。二つのペレットを化
合し、このようにして核分画を確立した。化合物を溶解し、Tri-試薬（細胞から
のサンプルの場合通常2mlのTri-試薬）でペレットを処理して核RNAを抽出した。
化合した第1および第2の上澄を4℃で10分間10000gで遠心分離した。また、上澄
をチューブに移し、氷上で保存した。ペレットを再び1mlの緩衝剤で洗浄し、100
00gで10分間遠心分離し、二つのペレットを前記のように化合し、このようにし
てミトコンドリアペレットを確立した。また、ペレットをTri-試薬（通常細胞に
より1ml）で処理し、ミトコンドリアRNAを抽出した。次に、緩衝剤A＋1.3Mスク
ロースから作製されるスクロースクッション(cushion)を含有して低温超遠心分
離チューブを調製した。該クッションの体積は、上澄の1/3であった。1:3のクッ
ション対上澄の割合でクッションに上澄を加えた。一対のチューブをはかりにか
けて釣り合わせ、20−30mgの違いは許容される。Ti60.2ローター(45,000rpm)に
よりチューブを140,000g、4℃で2.5時間遠心分離した。上澄の2相が見えた場合
、赤い相だけを（可能なら）細胞質分画としてsorvallチューブに移した。透明
な上澄を吸引した。分離できない場合または相の違いが目に見えない場合、すべ
ての上澄を細胞質分画として採取し、TE（10mMのTris-HCl pH8.0、1mM EDTA）に
よりスクロースを希釈する。ペレット中には、目に見え、透明なまたは黄色がか
ったミクロ−ソームが存在した。RNA抽出のために、細胞質分画を37℃で30分間
、1%SDS、0.1mg/mlプロテイナーゼKで処理した。その後、−80℃での凍結が可能
である。RNAをフェノール：クロロホルムの組合せにより抽出し、0.3MのNa-アセ
テート、1μlのグリコーゲン、および等量のイソプロパノールにより沈殿させた
。O’N沈殿が可能であり、氷上で30分間達成することができる。抽出物を20分間
10000gで回転させ、その後RNAペレットを70％エタノールで洗浄した。ペレット
を乾燥させ、その後水に溶解させた。次にミクロソームを0.1MのNaCl/1% SDS溶
液（小さいペレットには通常1mlで十分である）で溶解させ、フェノール：クロ
ロホルムの組合せにより抽出した（プロテイナーゼK処理はしない）。その後RNA
の精製を、塩を加える必要がない以外は細胞質分画についてと同じ方法で行った
。
【０２７９】 核および細胞質RNAの調製： 125mM KCl-30mM Tris-塩酸塩(pH7.5)-5mM マグネ
シウムアセテート-1mM 2-メルカプトエタノール-2mMリボヌクレオシドバナジル
錯体(2)-0.15mMスペルミン-0.05mMスペルミジンにより半融合性のプレートを4℃
で洗浄し、プレートから集めた細胞を同じ緩衝剤で二度洗浄した。約108の細胞
を、2.5mlの膨張緩衝剤（KCl濃度が10mMであることを除いて洗浄緩衝剤と同じ）
中で10分間膨張させ、Dounceホモジナイザー（B乳棒）の20ストロークで溶解し
、25％のグリセロールを含有する等量の膨張緩衝剤上に乗せ、400×gおよび4℃
で5分間遠心分離した。細胞溶解により放出されたCAD配列の90％を含有する上澄
の上層を、細胞質分画と称した。核ペレットを、2mlの膨張緩衝剤-25%グリセロ
ール-0.5%Triton X-100で一度および2mlの膨張緩衝剤で一度洗浄した。
【０２８０】 核RNP。上述のように調製された108の細胞からの核を、1mlの10mM Tris-塩酸
塩(pH8.0)-100mM NaCl-2mM MgCl2-1mM 2-メルカプトエタノール-0.15mMスペルミ
ン-0.05mMスペルミジン-10mMリボヌクレオシドバナジル錯体(2)-1mlにつき100U
の胎盤RNアーゼ阻害剤(Amersham Corp.)中に懸濁し、4℃において20gでKonresマ
イクロ超音波細胞粉砕機の最大パワー設定で分解した。細菌のtRNA(2mg)を加え
て塩基性タンパク質(9)を吸収させ、混合物を1分間遠心分離した（Eppendorf微
小遠心分離）。上澄を、mM Tris-塩酸塩-100mM NaCl-2mM MgCl2-2mMリボヌクレ
オシドバナジル錯体中で15から45％までのスクロース勾配に適用し、40,000rpm
および4℃で90分間Beckman SW41ローター中で遠心分離した。硫酸ドデシルナト
リウムを0.5％まで加え、37℃で2時間プロテイナーゼK(200μg/ml)で処理し、フ
ェノールで抽出し、エタノールで沈殿させることにより、RNAを勾配から回収し
た。
【０２８１】 アンチセンスRNAの調製：トータル細胞RNAを抽出した。RNAプールの一部を膜
上に固定し、オリゴデオキシヌクレオチドを3’端にライゲーションした後に別
の一部をcDNAに転化させた。cDNA合成に、ビオチン化された相補的なオリゴを使
用することにより、「マイナス」鎖をストレプタビジンでコーティングされた磁
気ビーズに固定することができる。オリゴの第二のセットを、RNAの先の5’端で
cDNAにライゲーションする。結合した鎖からプラス鎖を溶出し、膜結合RNAにハ
イブリダイズさせる。使用されたcDNAは同じRNAの極性を有するので、相補的RNA
に結合できるcDNA配列のみを保持する。PCR増幅およびその後のPCR断片のクロー
ニングの後、配列を分析した。クローニングされた配列が正しく同定されるか否
かをテストするために、センスおよびアンチセンス方向にプローブを作製する。
陽性クローンを構造的におよび機能的に特徴付ける。この方法を実施するために
、アンチセンスRNAによりコピー数を調節するプラスミドR1を含有する細菌株（
大腸菌）の使用を開始した。以前の研究により、R1のアンチセンス(CopA)および
標的RNA(CopT)の両方が細胞内で同定されている。可能なら、この方法を使用し
て他の器官におけるアンチセンスRNAシステムをスクリーニングする。
【０２８２】示差分析 示差表示：逆転写： 5分間70℃まで加熱し氷上で冷却することにより、2μgの
RNAを、6.5μlの体積で1pmolのオリゴdTプライマー(dT)18とアニーリングした。
2μlの反応緩衝剤(×5)、1μlの10mM dNTP混合物、および0.5μlのSuperScript
II逆転写酵素(GibcoBRL)を加えた。反応は42℃で1時間行った。70μlのTE(10mM
Tris pH=8; 0.1mM EDTA)を加えることにより反応を停止した。示差表示に使用し
たオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは実質的に、Delta RNAフィンガー
プリントキット(Clonetech Labs. Inc.)に記載されるものである。構造：5’ CA
TTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTXY 3’（配列番号：）の9の”T”オリゴヌクレオチ
ドが存在する。構造：3’ ATTAACCCTCACTAAA”TGCTGGGGA” 3’（配列番号：）
の10の”P”オリゴヌクレオチドが存在し、括弧の間の9または10ヌクレオチドは
任意の配列を示し、それぞれの”P”オリゴにつき1つ、10の異なる配列（配列番
号：）が存在する。
【０２８３】 増幅反応：それぞれの反応を、50μM dNTP混合物、それぞれのプライマーから
1μM、1×ポリメラーゼ緩衝剤、1単位のポリメラーゼ(Beohringer Mannheim)、2
μCi[α-32P]dATPおよび1μl cDNAテンプレートを含有する20μl中で行う。サイ
クル条件は、：95℃で3分間、その後94℃で2分間、40℃で5分間、68℃で5分間を
3サイクルであった。この後、94℃で1分間、60℃で2分間、68℃で2分間を27サイ
クル行った。68℃で7分間インキュベーションし、20μlの配列決定停止溶液(95%
ホルムアミド、10mM NaOH、0.025%ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシ
アノール)を加えることにより反応を終了させた。
【０２８４】 ゲル分析：3−4μlを5％の配列決定ポリアクリルアミドゲル上に乗せ、遅い色
素（キシレンシアノール）が底から約2cmになるまでサンプルを2000ボルト／40
ミリアンペアで電気泳動させた。ゲルを濾紙に移し、真空で乾燥させX線フィル
ムにさらした。
【０２８５】 示差バンドの回収：様々のプール間で任意の差を示すバンドを乾燥したゲルか
ら切り出し、微小遠心分離チューブ中に配置した。50μlの滅菌水を加え、チュ
ーブを5分間100℃まで加熱した。示差表示に使用したのと同じプライマーを使用
して49μlのPCR反応物に1μlを加え、94℃で1分間、60℃で1分間および68℃で1
分間の30サイクルでサンプルを増幅した。10μlをアガロースゲル上で分析して
視覚化し、増幅が成功したことを確認した。
【０２８６】代表的な示差分析 逆転写：2μgのpolyA＋選択されたmRNA以外は上述のようである。二本鎖cDNA
の調製：以前の工程からのcDNAをアルカリで処理して、mRNAを除去し、沈殿させ
20μlの水に溶解させた。5μlの緩衝剤、2μlの10mM dATP、48μlまでの水およ
び2μlのターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)を加えた。
反応物を37℃で2−4時間インキュベートした。5μlのオリゴdT(1μg/μl)を加え
、60℃で5分間インキュベートした。5μlの200mM DTT、10μlの10×切片緩衝剤(
100mM MgCl2, 900mM Hepes, pH6.6)16μl dNTP(1mM)、および16UのKlenowを加え
、混合物を室温で一晩インキュベートして二本鎖cDNAを産生した。100μlのTEを
加え、フェノール／クロロホルムで溶出した。DNAを沈殿させ50μlの水に溶解さ
せた。
【０２８７】 代表例の産生：3μlのDpnII反応緩衝剤20VおよびDpnIIを25μlのcDNAに加える
ことによりDpnIIを有するcDNAを切断し、37℃で5時間インキュベートした。50μ
lのTEを加えフェノール／クロロホルムで抽出した。CDNAを沈殿させ、10ng/μl
の濃度まで溶解させた。
【０２８８】 この方法において、以下のオリゴヌクレオチドを使用した： R-Bgl-12 5’ GATCTGCGGTGA 3’（配列番号：） R-Bgl-24 5’ AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA 3’（配列番号：） J-Bgl-12 5’ GATCTGTTCATG 3’（配列番号：） J-Bgl-24 5’ ACCGACGTCGACTATCCATGAACA 3’（配列番号：） N-Bgl-12 5’ GATCTTCCCTCG 3’（配列番号：） N-Bgl-24 5’ AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA 3’（配列番号：） R-Bgl-12およびR-Bgl-24オリゴをTesterおよびDriver：1.2μgのDpnII切断され
たcDNAにライゲーションさせた。それぞれのオリゴからの4μlおよび5μlのライ
ゲーション緩衝剤×10を60℃で10分間アニーリングした。2μlのリガーゼを加え
、16℃で一晩インキュベートした。140μlのTEを加えることによりライゲーショ
ン混合物を希釈した。R-Bgl-24プライマーおよび2μlのライゲーション産物を使
用して200μlの体積で増幅を行い、それぞれのサンプルについて20のチューブで
繰り返した。Taq DNAポリメラーゼを加える前に、チューブを3分間72℃まで加熱
した。PCR条件は以下のようであった：72℃で5分間、95℃で1分間および72℃で3
分間の20サイクル、その後72℃で10分間。
【０２８９】 4つの反応物すべてを化合し、フェノール／クロロホルムで溶出し、沈殿させ
た。増幅したDNAを0.5μg/μlの濃度まで溶解させ、すべてのサンプルをプール
した。
【０２９０】 サブトラクション：上述のようにTester DNA(20μg)をDpnIIで切断し、1.2％
のアガロースゲル上で分離した。DNAをゲルから抽出し、R-オリゴについて上述
のようにJ-Bgl-12およびJ-Bgl-24オリゴに2μgをライゲーションさせた。ライゲ
ーションされたTester DNAを、TEで10ng/μlまで希釈した。Driver DNAをDpnII
で切断し、0.5μg/μlの最終濃度まで再び精製した。40μgのDriver DNAを0.4μ
gのTester DNAと混合する。フェノール／クロロホルムで抽出を行い、70％のエ
タノールによる二度の洗浄を使用して沈殿させ、4μlの30mM EPPS pH=8.0, 3mM
EDTA中にDNAを再び懸濁させ、35μlの鉱油をかぶせた。98℃で5分間変性させ、6
7℃に冷却し、1μlの5M NaClをDNAに加えた。67℃で20時間インキュベートした
。400μlのTEを加えることによりDNAを希釈した。
【０２９１】 増幅：200μlの最終体積でサブトラクションされたDNAの増幅は以下のようで
ある：緩衝剤、ヌクレオチドおよび20μlの希釈されたDNAを加え、72℃まで加熱
し、Taq DNAポリメラーゼを加えた。72℃で5分間インキュベートし、J-Bgl-24オ
リゴを加えた。95℃で1分間、70℃で3分間の10サイクルを行った。72℃で10分間
インキュベートした。4つの別々のチューブで増幅を繰り返した。増幅したDNAを
フェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させ、4つのチューブのすべてを40μl
の0.2XTE中で化合し、以下のようにMung Beanヌクレアーゼで切断した：20μlの
DNAに4μlの緩衝剤、14μlの水および2μlのMung Beanヌクレアーゼ（10単位／
μl）を加えた。30℃で35分間インキュベートし、最初の示差産物(First Differ
ential Product)(DPI)を得た。
【０２９２】 driverにおける反復サブトラクションハイブリダイゼーションおよびPCR増幅
：N-BglオリゴヌクレオチドおよびJ-Bglオリゴヌクレオチドを使用し、それぞれ
1:400(DPII)および1:40,000(DPIII)の異なる割合である。示差産物をBAM HI部位
でBluescriptベクター中にクローニングし、それぞれのクローンを分析した。
【０２９３】 正常条件下の代わりに低酸素(<1%酸素)下で4時間および低酸素下で16時間、実
験細胞を培養した。細胞を採収し、細胞から調製された核から（核RNA）または
分別されていない細胞の抽出物から（トータル細胞RNA）RNAを抽出した。
【０２９４】 図２は、核RNAから調製されたプローブ(STP)がトータル細胞RNAプローブ(Tot)
より高い示差発現を与える方法を示す。VEGF（血管内皮成長因子）、Glut1（グ
ルコーストランスポーター1）およびグリコーゲンシンターゼをコードするコン
トロール遺伝子は、低酸素ストレスにより誘発されることが知られている。核プ
ローブ中で観察される誘発のレベルは、トータルプローブにおいて示されるより
ずっと高く、実際に知られる誘発のレベルにずっと近い。3つの新しい遺伝子RTP
241、RTP 262およびRTP779は、低酸素による著しい誘発を示す。また、核プロ
ーブにより示される誘発レベルはずっと高く、RTP779について示されるように、
5倍まで高かった。これらの遺伝子の誘発をノザンブロット法により分析した場
合、核プローブは再び実際の状態にずっと近かったのに対し、トータルプローブ
は著しい過小評価を与えることが分かった。
【０２９５】 遺伝子RTPi-66およびRTP2I-72により、トータルプローブでは異なって現れな
い示差発現した遺伝子を、核プローブで検出できることが示される。
【０２９６】 ヌクレオリン(Nucleolin)およびトロンボスポンジン(Thrombospondin)につい
ての遺伝子によって、ダウンレギュレートされたmRNAについても核プローブはず
っと感受性であり、ずっと高いレベルの示差発現値を与えることが示される。
【０２９７】 最後に、リボソームタンパク質L17および細胞質ガンマ−アクチンについての
遺伝子は、低酸素ストレスに応答しない遺伝子として知られる。核プローブおよ
びトータルプローブは、誘発が起こらないことを示す。
【０２９８】 実施例／結果２：示差発現特性 チップ： 使用したマクロアレイ（チップ）を以下のように調製した。サブトラ
クション実験を、CLONTECH SSHキット(K 1804-1)を使用してラット骨芽細胞（頭
蓋冠）で行った。細胞に20分間物理的ストレスを与え、物理的ストレスを与えて
いない「正常な」細胞と比較した。767誘発配列および606減少配列を選択し、チ
ップ上にプリントした。
【０２９９】 プローブ： トータルRNA 細胞： 17−19日間たったラットの胚に由来する一次頭蓋冠培養分析のリスト ：
【表１】 インドメタシンおよび物理力により処理した頭蓋冠 一次細胞培養は、17−19日間経ったラットの胚に由来した。培養は、骨膜を含
む頭蓋冠のトリプシン−EDTA切断により調製した。細胞培養を、5−6日間10％FC
Sを有するMEM培地中でコンフルエンシー(confluency)に達するまで培養した。
【０３００】 この時20μgのインドメタシンを含有する10マイクロリットルを、4mlの培地を
有する培養皿に加えた。20分後皿を機械的に活性化した。機械的活性化は例えば
、細胞培養皿の外表面に接着された2つの固いアクリル性樹脂に取りつけられた
矯正伸縮スクリューの伸縮により行う。伸縮により皿は不可逆的に変形する。イ
ンドメタシンで処理せず機械的に活性化していない同じ培養をポジティブコント
ロールとした。
【０３０１】 原理は、機械的活性化によりプロスタグランジンのde novo合成が刺激される
からである。インドメタシンはプロスタグランジンの合成を抑制する。
【０３０２】 物理的力により活性化されたCaの存在下で培養された頭蓋冠 Caの存在下で培養した頭蓋冠を、コンフルエンシーにおいて機械的に活性化す
る装置により活性化した。培養を上述のように調製した。細胞を、細胞の接種か
らコンフルエンシーおよび機械的活性化まで、通常1mMのカルシウムを含むMEM培
地中で培養した。
【０３０３】 物理的力により処理されたCaの不存在下で培養された頭蓋冠 細胞を、カルシウムのないMEM培地中で培養した。10%のFCS（2.5Mのカルシウ
ムを含有する血清）からなるので、この培地中のカルシウムは0.25mMであった。
3−4日後、培地を正常なカルシウム濃度を含む通常のMEMに換えた。
【０３０４】 この実験の原理は、主にプロスタグランジン合成および活性のような機械的活
性化の浸出機構はカルシウム依存性であるからである。低カルシウムにおける培
養により繊維芽細胞の増殖が抑制され、培養液中の骨芽細胞が増殖および分化さ
れる。したがって、方法は、低カルシウム培地で開始し、3−4日後正常なカルシ
ウム培地(1mM Ca)に変えることにより増殖を促進する。
【０３０５】 プロスタグランジンPGE2で処理した頭蓋冠 一次頭蓋冠細胞を、両方の実験においてPGE2で処理した（いずれも異なる日付
に調製され、同じく処理された同様の一次培養である）。
【０３０６】 PGE2処理は、合計500ngのPGE2からなる10マイクロリットルのPGE2を加える（
により処理する）ことによりコンフルエンシーに達した培養組織で行った。30分
後細胞を集め、−70℃で保存した。
【０３０７】 原理：PGE2処理は、機械的活性化の効果に似ているとされている。
【０３０８】 この実験の結果は、図２Aの表および配列に示される。以下に記載されるよう
に、特に、新しい配列CMF608、CMF405およびCMF274が同定された（図２A−14も
参照）。
【０３０９】 骨粗しょう症（または物理的ストレス）モデル（頭蓋冠細胞培養組織）物理的刺激の後に異なって調節された／異なって発現された遺伝子 細胞外マトリックス、膜内外および分泌タンパク質 ： テネイシン コラーゲン XII トロンボスポンジン 1 ADAMTS-1 C3補体成分 アルファ−2−マクログロブリンレセプター フィブロネクチン 結合組織成長因子 エンドセリン変換酵素 アルファ−2u ミクログロブリン関連タンパク質 RB13-6アポトーシスの調節に関係する遺伝子 SARP1 シトクロムオキシダーゼサブユニット1 グルタミル−システインシンテターゼ細胞内脂肪酸代謝に関係する遺伝子 3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ 酵母ERG3相同体 および酵母ERG25相同体 ステアロイル−CoAデサチュラーゼ細胞骨格調節に関係する遺伝子 AHNAK フィラミン シントロフィン(syntrophin)1水分チャンネルの調節に関係する遺伝子 アクアポリン(aquaporin)1新しい遺伝子または機能を有しない既知の無名の遺伝子 非常に変化したアミノ酸配列 DEST274（CMF274；図２A−14参照） DEST405（CMF405；図２A−14参照） DEST608（CMF608；図２A−14参照）同定された遺伝子の全体的な概要 テネイシンは、縮合中正常な骨の発達において発現がアップレギュレートされ
る細胞外マトリクス糖タンパク質である。関節軟骨細胞の発生および機能にも関
係する。テネイシンは骨芽細胞により分泌されるが、無機質化骨マトリクスには
存在しない。アルカリ性ホスファターゼ活性およびコラーゲンXII（骨芽細胞分
化の標識）の発現は、テネイシン依存性である（抗テネイシンRNAによりダウン
レギュレートされる）。テネイシンの発現は物理的ストレスに応じて著しく増加
し、そのプロモーター（チキン中）はシス作用性「菌種応答性」エレメントを含
むことが示される。
【０３１０】 発現が物理的ストレス（すなわち中皮細胞の液体剪断または延伸ストレス）に
より調節されることが知られている別のタンパク質は、エンドセリンである（不
活性中間体から活性エンドセリン分子を産生するエンドセリン変換酵素は、本発
明のスクリーンにおいてアップレギュレートされる）。骨中で、エンドセリンは
、破骨細胞の分化、機能およびおそらく生存のIL-6媒介物質の骨芽細胞IL-1に誘
発される産生を刺激する。エンドセリンへのレセプターは、リガンド結合により
骨芽細胞で示される（オートクラインループ）。骨細胞中の主要なエンドセリン
情報伝達経路は、ホスホリパーゼA、C、およびDの活性化、細胞内および細胞外
貯蔵からのCaフラックスの刺激およびチロシンキナーゼの活性化によるリン脂質
代謝回転の刺激である。エンドセリンはまた、骨芽細胞中で他の要因（すなわち
PH刺激されたCaの一過性の増強）により惹起されるカルシウムシグナリングを調
節する。エンドセリンへの表現型応答には、オステオカルシンおよびオステオポ
ンチンメッセージの刺激（本明細書参照）、破骨細胞の抑制およびプロスタグラ
ンジン依存性吸収の刺激が含まれる。
【０３１１】 チャンネル特性を示す一つのタンパク質がアップレギュレートされることが分
かった。それは、腎臓、脳、心臓、目、内耳のような多くの液体を分泌し吸収す
る組織において発現される水分チャンネルタンパク質である、アクアポリン１で
ある。そのプロモーターは、グルココルチコイド応答性エレメントを含有し、デ
キサメタゾン処理に応じて活性化することができる。アクアポリン−１発現の誘
発を、心肺バイパスおよび再灌流の後アップレギュレートされる遺伝子のサブト
ラクションクローニングにより検出した。しかしながら、炎症伝達物質（すなわ
ちICAM-1、E-セレクチン、IL-8）と比較して誘発を示した。唯一の骨結合を内耳
中のアクアポリン分子の局在性で見つけたが、この局在性は、内耳機能が液体恒
常性に大きく依存していることにより容易に説明できる。耳において、タンパク
質は骨と密接に関連していることが分かった−多くの細胞では骨性迷路の内表面
となり、他の細胞では骨性の位置にない。
【０３１２】 AHNAK（別名：神経芽細胞分化因子、デスモイキン(desmoykin)）−神経芽細胞
腫細胞中で異なって抑制される（失われる）ものとして当初同定された700kDの
タンパク質。該タンパク質は最初核タンパク質として同定された。しかしながら
、「デスモイキン」の名の下に再発見されると、非細胞性の限局化が膜にあるこ
とが報告された（デスモソームの位置において）。AHNAK様の反復が、別のタン
パク質VAP-1−ウニ類の卵で発見された新しい高分子量のタンパク質−で発見さ
れた。これは、ミクロソーム膜分画に関連する周辺膜に位置する。VAP-1のAHNAK
様の反復内に、RNP1およびRNP2タイプの結合配列が存在する（AHNAKについても
同じことが言える）。したがって、物理的ストレスに応じて骨組織において観察
される分泌タンパク質の発現における一般的増加により、ミクロソーム分画に局
在するRNA結合タンパク質のアップレギュレーションが必要となるかもしれない
。
【０３１３】 フィラミン（非筋肉タイプ）、ABP-280は、膜−細胞骨格相互作用の安定化に
おいて重要な役割を果たす。皮質性F−アクチンネットワークを膜糖タンパク質
に結合させる主な方法を提供するのは、二量体のアクチン架橋タンパク質である
。一つのフィラミン分子は、1,000までのアクチン分子を架橋することができる
。この能力により、フィラミンは、現在知られている最も強力なアクチン架橋物
質となる。
【０３１４】 シントロフィン１は、ジストロフィンとの複合体で見られる細胞内外因性膜タ
ンパク質の多重遺伝子族の一員である。この特定のシントロフィンは、一酸化窒
素(NO)シンターゼとの複合体でも示された（筋肉組織において）。相互作用は、
両方のタンパク質で見られるPDZ領域により媒介されるようであるが、この複合
体の形成はおそらくジストロフィン依存性である。NOは、特に、前炎症性のサイ
トカイン、物理的ストレスおよび性ホルモンのような種々の刺激に応答する骨組
織の再造形におけるサイトカイン効果の媒体として、骨の代謝に関係することが
知られている。エストロゲンおよび物理的ストレスはいずれも、構成一酸化窒素
シンターゼを活性化することによりNO産生を増加する。高濃度のNOは、破骨細胞
の形成を抑制することによりおよび成熟破骨細胞の再吸収機能を抑制することに
より骨再吸収を抑制するのに対し、低いNO濃度は、骨再吸収を増加させ、正常な
破骨細胞機能に不可欠であるかもしれない。他方、破骨細胞の増殖および分化も
また、高いNO濃度により抑制される。
【０３１５】 トロンボスポンジン１は、細胞接着、拡散、増殖、および遊走に関連する450k
Dの接着性糖タンパク質である。これは当初は血小板および内皮細胞から単離さ
れていたが、十分に無機質化していない胎児骨膜下の類骨および新生児の／若い
（成長中の）骨の無機質化骨マトリクスにも局在する。TSP-1は、骨および血小
板の30kDのタンパク質であるオステオネクチンと特異的に相互作用し得る。この
複合体形成は、Ca依存性である。骨形成不全において、オステオネクチンのレベ
ルは減少するのに対し、トロンボスポンジンの産生は増加する。トロンボスポン
ジンの発現は、骨芽細胞分化のマーカーである（アルカリ性ホスファターゼおよ
びアルファ−1−コラーゲンとともに）。デキサメタゾン処理により、培養され
た骨芽細胞におけるトロンボスポンジンのレベルが増加する（グルココルチコイ
ドが骨粗しょう症を誘発する）。対照的に17−ベータエストラジオールは、トロ
ンボスポンジン発現を誘発する。トロンボスポンジン−1遺伝子発現は、インビ
トロにおいて血管周囲細胞分化中に修飾される（血管周囲細胞は、微細血管の基
底膜内に埋め込まれた細胞であり、血管形成に関連すると考えられているが、骨
原性の表現型に分化することができる）。小節形成中に著しく増加し、小節の無
機質化が起こると減少する。TSP-1は、そのような無機質化小節の内量から除外
される。
【０３１６】 いくつかのトロンボスポンジン遺伝子でないものは、トロンボスポンジンモチ
ーフを含有することがわかった（トロンボスポンジンの細胞結合領域）。それら
の一つはまら、メタロプロテイナーゼ−ジスインテグリンファミリ（本発明のス
クリーニングにおいてアップレギュレートされた遺伝子として同定される）−AD
AMTS-1に属する。これは最初、カケゲニック(cachegenic)（インビボで）コロン
26腺癌系統において選択的に発現される遺伝子としてクローン化された。これは
、膜内外領域を有しない推定の分泌タンパク質である。ADAMTS-1は、6つのタン
パク質モジュールを含有する：プロ−、メタロプロテイナーゼ、ジスインテグリ
ン様、TSPタイプ1モチーフ、スペーサー、C−末端モチーフ。
【０３１７】 タンパク質を含有する別のTSP-モチーフは、プロペルジン−TSPモチーフ結合
を通して補体系の別経路のC3nBb酵素複合体を安定化させる血漿糖タンパク質で
ある。関心を引くことは、これらのモチーフも末端補体成分C6-C9に見られる。
【０３１８】 C3補体成分は、ビタミンDに応答して骨芽細胞および骨髄由来間質細胞により
産生され、破骨細胞への単核食細胞の分化を調節する。骨と異なりC3血清濃度は
、ビタミンD欠乏マウスにおいて影響を受けないので、この効果は骨に特異的で
ある。正常なマウスにおいて、C3タンパク質は、頭蓋冠の骨膜領域においておよ
び骨幹端中の骨柱の表面上に主に局在する。無機質化した骨表面上のC3堆積によ
り、この部位への単核破骨細胞の動員(recrutement)が媒介される。生物液中で
、アルファ−2−マクログロブリン（そのレセプターは本発明のスクリーニング
でアップレギュレートされることが分かっており、このレセプターは骨髄マクロ
ファージにより発現されることが知られるので、おそらく破骨細胞前駆体もアル
ファ−2−レセプター陽性である）との複合体中の活性化されたC3は、IL-1を結
合する。IL-1が破骨細胞形成の刺激因子の一つおよび抑制因子が骨損失を著しく
減少させる卵巣除去マウスの治療法として考えられているということには価値は
ない。エストロゲン消失後の増加した破骨細胞増殖もまた、IL-6により媒介され
る。両方のサイトカイン発現は、エストロゲン遮断後にインビボおよびインビト
ロでアップレギュレートされる。
【０３１９】 エストロゲンは直接投与される骨吸収は骨細胞のアポトーシスを誘発すること
が証明されたと考えられる。他方、エストロゲンは骨芽細胞によるTGF−ベータ1
産生を誘発し、次に抗−TGF−ベータ抗体は破骨細胞のエストロゲン誘発された
アポトーシスを抑制し得る。この点を考慮すると、SARP1アップレギュレーショ
ンの発見は特に関心がある。SARPは、分泌アポトーシス−関連タンパク質のファ
ミリーである。SARP1は、最初アポトーシス耐性に関連する静止細胞から集めら
れた条件培地の成分として同定された。他方SARP2は、アポトーシス感作を誘発
する。構造的にはSARPは、ちぢれたタンパク質のCRDと相同であるが膜内外領域
を有しないシステインに富む領域(CRD)を有する。
【０３２０】 シトクロムオキシダーゼサブユニット1のアップレギュレーションは、例えば
増加したNOレベルにより系において媒介される物理的ストレスまたは酸化的スト
レス／アポトーシスの結果である。
【０３２１】 DEST(ACC#AA177798)は、コンティグ(contige)構造の後ろで、グルタチオン(GS
H)合成における律速酵素であるグルタミル−システインシンテターゼについての
cDNAコードに属することがわかった。そのアップレギュレーションは、前述の場
合と同様にストレス状態に関連し得る。他方、骨が低無機質状態である患者にお
けるGSH減少（抗酸化系の低活性）と関連する一つの臨床作業が存在する。
【０３２２】 TGF−ベータ１は、結合組織増殖因子（CTFG、cef10、fisp12、cyrol1、ベータ
IG-M1、ベータIG-M2、nov-プロトオンコジーン）発現の一次誘発因子として知ら
れている。後者は、4つの別個の構造モジュールを含有し、それぞれはフォンウ
ィルブランド因子、スリット、トロンボスポンジン、繊維性コラーゲン、IGF−
結合タンパク質およびムチンのような他の細胞外タンパク質中の明確な領域に相
同である。CTGF発現は、TGF−ベータによって誘発されるが、BMP2（骨形態形成
因子2）によっても、および傷の修復中に誘発される。胚形成においては、CTGF
発現は、肢、肋骨、前脊椎、軟骨頭蓋および頭蓋顔面要素（メッケル軟骨）を含
む軟骨要素の増殖中に見られる。したがって、CTGF転写は、中胚葉および外胚葉
起源の軟骨細胞の分化に関連する。培養液中では、CTGFは軟骨細胞中で発現する
が骨芽細胞中では発現しない。軟骨内骨化における可能な役割は、BMP2への応答
のために停止する。繊維芽細胞において、CTGF発現は、アルファ−1−コラーゲ
ン、アルファ−5−インテグリンおよびフィブロネクチンのアップレギュレーシ
ョンを起こす。
【０３２３】 ステロイド合成に関連することが知られるいくつかの酵素は、物理的ストレス
に応答して本発明の系において転写により高められることがわかった。これには
、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ（3アセチル
−CoA分子からのコレステロール合成の連鎖における第1律速酵素）、酵母ERG3相
同体−ステロール−C5−デサチュラーゼおよび酵母ERG25相同体−メチル−ステ
ロール−オキシダーゼ（いずれもらのステロールからのコレステロールの形成に
おいてある役割を果たす）が含まれる。コレステロールは、エストロゲンおよび
ビタミンD3合成のための基礎であることは価値がない。アップレギュレートされ
たことが分かった脂肪酸代謝経路に属する一つの追加の酵素は、ステアロイル−
CoAデサチュラーゼであり、飽和基質をD9−不飽和オレオイル−CoAに転換する。
いずれの化合物も、細胞膜を構成するリン脂質の合成に関連する。興味深いこと
に、エストロゲンおよびアンドロステロンは、飽和反応のエンハンサーであるこ
とが知られている。
【０３２４】 アルファ−2uミクログロブリン−関連タンパク質（好中球ゼラチナーゼ関連リ
ポカリン(lipocalin)前駆体−NGAL）は、小さい疎水性分子（例えばレチノール
）を結合しリガンドを特異的な細胞外レセプターに供給することができる小さい
細胞外タンパク質を囲むリポカリンスーパーファミリーに属する。これらの多く
は、細胞恒常性の調節に関係する。NGALは、細胞活性化に基づく特異的な好中球
の顆粒から分泌されるタンパク質として同定され、SV-40誘発された有糸分裂反
応においてアップレギュレートされる24p3タンパク質と同一である。興味深いこ
とに、NGAL発現は、neu誘発された実験哺乳類腫瘍では増加するがras誘発された
ものでは増加しない。NGALは、インビトロで反応性プロモーターエレメントを通
してデキサメタゾンによりアップレギュレートされ得る。インビボでは、上皮細
胞におけるNGALの誘発は、炎症性および腫瘍性の結腸直腸の病気において観察さ
れたが、正常な結腸では観察されなかった。リポカリンのうち、NGALは、プロス
タグランジンH2からのプロスタグランジンD2の合成の原因であるリポカリン型プ
ロストグランジン−D−シンターゼに最も似ている。しかしながら、NGALは、プ
ロスタグランジン−D−シンターゼ機能に重要な特定のCys残基（位置65）がない
ために酵素活性を有するとは考えられない。二つのタンパク質間の構造類似性は
おそらく、同じ染色体位置における両方の遺伝子の密集した局在から生じている
。骨におけるNGALの機能については何もわかっていない。
【０３２５】 さらに、二つの既知（RBI3-6抗原および高電荷アミノ酸配列ACC#X59131）であ
るが属性機能を有しないおよび三つの新しいタンパク質274、405および608は、
本発明のモデルにおいてアップレギュレートされることがわかった。
【０３２６】 RBI3-6は、同じ名前のモノクローナル抗体により選択的に認識される細胞表面
の130kDaの糖タンパク質である。RBI3-6は、ある発癌性物質を用いた処理による
悪性転換を非常に受けやすいグリア細胞のサブセットの表面抗原である。このタ
ンパク質は、ヒトおよびネズミ血漿細胞膜タンパク質PC-1、ヌクレオチドピロホ
スファターゼ／アルカリ性ホスホジエステラーゼ(phospohdieterase)に関連し、
5’−ヌクレオチダーゼ活性を有する。しかしながら、PC-1と異なり、RB13-6はR
GD−配列を含有する。後者は、インテグリン−相互作用タンパク質の性質である
。
【０３２７】 いわゆる高電荷アミノ酸配列(ACC#X59131)は、315アミノ酸の無名のオープン
リーディングフレームによりコードされる推定のタンパク質である。これはデー
タベース中の任意のタンパク質に大きな相同性を有しない。荷電アミノ酸は、Se
rおよびThrまたはSerおよびPro残基のいずれかを有するクラスターに見られる。
2つの顕著なアルファ−ヘリックス−1つは塩基性および1つは酸性−が、C-末端
の近くに位置する。
【０３２８】 274（新しい遺伝子）：ラット頭蓋冠始原細胞培養において、物理的圧力によ
りこの遺伝子の発現が約3倍アップレギュレートされたことが分かった。これは
、マイクロアレイ分析およびノザンハイブリダイゼーションにより検出された。
ラットの頭蓋冠において、この遺伝子は約9Kbの単一のRNA種として発現される。
しかしながら、他のラット組織供給源からのRNAサンプルへのノザン分析の拡張
により、おそらく274は組織特異的方法で二者択一的にスプライシングされるこ
とがわかった。あるいは、異なる組織において異なる発現をする274遺伝子に密
接に関連する遺伝子のファミリーが存在する。様々の長さ（通常、9Kbまたは少
し短い）の転写物は、ラットの小腸、骨格筋、肺、腎臓、眼、脳、結腸および精
巣に見られた。最も高い発現レベルは、精巣、眼および腎臓で見られた。複合発
現パターンを骨において観察した：9Kbおよび4Kb以上の2つの強い転写物および1
.8Kb、0.5Kbおよび0.3Kbの3つの弱い転写物。興味深いことに、ヒトに由来する
リンパ細胞系NB4を同じプローブにハイブリダイズさせると、これらの3つの弱い
転写物は強く現れ、骨特異的な2つの強い転写物は明らかではなかった。このこ
とはおそらく、3つの短い転写物の起源が骨髄中に少量存在するリンパ球系前駆
体にあることを示す。
【０３２９】 cDNAライブラリーを、物理的刺激の後に頭蓋冠細胞から抽出したRNAから調製
した。5291bpの274特異的RACE産物を合成し、配列決定した（図２A−14参照）。
公開データベースとの比較により、274は無名のヒトcDNA KIAA0462のラット相同
体（アミノ酸レベルで98％同一）であることが示された。この配列は、7150bpの
長さであり、2300アミノ酸タンパク質をコードすることができる6900bpのオープ
ンリーディングフレームを含む。このフレームは、5’から開いており、N末端配
列がないことを示す。オープンリーディングフレームは、ヒトKIAA0462配列に比
較してさらに900bp分5’方向に伸長しているが、タンパク質の始まりにはまだ到
達しない。ヒト配列情報に基づき、本発明者は6.8Kbの長さのヒト特異的RACEコ
ンティグを合成することができた。推定のKIAA0462タンパク質は、データベース
中に直接の類似体を有しない。これは、ショウジョウバエ増殖性ディスクタンパ
ク質に弱い類似性を有するとして同定されたC.elegans増殖性タンパク質(AF0031
40)にわずかに(26%)似ている。既知でないタンパク質機能領域も同定された。KI
AA0462推定タンパク質の位置165から188までの間の24の疎水性アミノ酸伸長は、
その潜在的な膜内外位置をほのめかす。
【０３３０】 インサイチュハイブリダイゼーション分析（以下で、さらなる実施例において
より詳細に説明する）：正常なラットの骨および卵巣除去された（骨粗しょう症
の）ラットから得られた骨において、遺伝子274は緻密な骨の内表面を覆う内張
細胞中でおよび骨髄中で正常なラットの長骨において発現されることを示す予備
的な結果が与えられた。正常な小柱骨において、骨髄で特異的なシグナルが検出
された。骨粗しょう症の骨は、274−陰性であるかまたは著しく減少したシグナ
ルを示した。
【０３３１】 CMF274は、巨大なタンパク質をコードすると考えられる。この遺伝子は、骨特
異的であるようである。骨において、多くの区画中で発現される。骨芽細胞中で
発現するが内張細胞中では発現しない。この遺伝子は、より成熟した細胞で発現
される点で他の2つと異なると考えられる。
【０３３２】 CMF274に関しては、Xu et alにより議論がなされている、「カルモジュリンに
対する網膜標的には、シナプス伝達に関連するタンパク質が含まれる」、J Biol
Cham 273(47):31297-307(1998)。Xuは、ショウジョウバエ中のCMF274の相同体
となり得る、いわゆる「カロシン(calossin)」に関連させる。Xu et al.は、マ
ウスESTへの相同性およびタンパク質が進化中に保存されることを示す。マウスE
STは、CMF274のマウス相同体に由来してもよい。しかしながら、Xu et al.にお
いて、マウス遺伝子は特徴付けされず、Xu et al.によっては骨との関係は明ら
かでない。
【０３３３】 CMF274は、カルモジュリン結合領域および2つのジンクフィンガー領域を含む
いくつかの関心のある領域を含有する。第1は重要なカルシウムセンサーカルモ
ジュリンに結合する能力を意味し、第2はDNA結合能力を意味する。この組合せに
より、CMF274は骨生物学の中心態様：カルシウムの量の感知、および下流遺伝子
の発現を変化させる核シグナルへの翻訳、に関係するという提案が支持されるジ
ンクフィンガー結合領域(CRD1)の一つは、アポトーシスに必要なタンパク質であ
るレクイエム(Requiem)により同定されるジンクフィンガーファミリーに最も類
似するということに留意することが重要である(Xu et al)。
【０３３４】 405（新しい遺伝子）：ラット頭蓋冠始源細胞培養において、この遺伝子の発
現がマイクロアレイ分析およびノザンブロットにより検出されるように物理的刺
激に応答してダウンレギュレートされることが分かった。単一の9Kb転写物は、
この組織中で検出された。しかしながら、ラット組織ブロットにハイブリダイズ
すると、同じプローブにより、骨、脳、結腸、小腸、精巣、卵巣、子宮、心臓、
腎臓、肝臓、胃、胸腺、脾臓、膀胱、脂肪組織および乳腺において偏在して発現
する主要な5Kbの転写物が検出された。
【０３３５】 部分的な405ラットcDNAクローンを、RACE技術によりラット頭蓋冠cDNAライブ
ラリーから単離し、配列決定した。これは、3684bpを含有し、そのうち3000は3
’端から閉じているオープンリーディングフレームを構成する（図２A−14参照
）。公開データベースとの比較により、遺伝子405はヒトの無名のcDNA配列KIAA0
183およびAF055017のラット相同体であることが示された。興味深いことに、後
者のcDNAは、KIAA0183推定アミノ酸配列の位置2384−2483に対応する294bp（98
アミノ酸）断片を欠失している。ラット405相同体はこの領域を含有している。
【０３３６】 したがって、遺伝子405は二者択一的なスプライシングを受けることが示され
る。KIAA0183cDNAクローンをGenbankから得て、ヒト組織RNAブロットによるハイ
ブリダイゼーションについてのプローブとして使用した。ラット組織の場合、5K
bの転写物が検出された。しかしながら、ヒトにおいてはその発現はラットのよ
うに異なる組織間で一様に妨げられていなかった。最高レベルは、初期胚、およ
び成人の精巣、胎盤、卵巣、舌、腸において検出された。弱い9Kbの転写物（主
要な5Kbのものと共に）が見られたヒト起源の唯一のRNAは、K562初期骨髄性前駆
体細胞系からのRNAであった。
【０３３７】 KIAA0183cDNAクローンは、N末端のない1062アミノ酸オープンリーディングフ
レームを示す。利用できる配列は膜内外領域を有しない。他方、4つの構造サブ
ドメインは容易に同定できる：N末端、高電荷アルファ−ヘリックス領域、Ser-P
roに富むスペーサー領域、C末端高電荷アルファ−ヘリックス領域、およびRNA結
合タンパク質領域におけるこの構成物中に密集することが知られる、Ser、Pro、
Gly、およびArg−アミノ酸に富むテール領域。中間のスペーサー領域は、インテ
グリンへのレセプターとして作用することが知られるRGDモチーフを含有する。
既知のタンパク質に対して大きな相同性は見られなかった。わずかな断片相同性
を示したものの中には、FUS/TLS RNA結合タンパク質（核輸出）および様々の種
類のコラーゲンがある。
【０３３８】 したがって、CMF405と同様にヒトcDNAの全配列も存在する。骨における発現の
パターンは、骨芽細胞および軟骨細胞分化との関連を示す。このタンパク質中に
おけるRGDモチーフの存在は、インテグリンへの応答との関連を示す。いくつか
の他の組織での発現は、より広い機能を示す。
【０３３９】 608（新しい遺伝子）：ラット頭蓋冠始原細胞培養において、物理的圧力によ
りこの遺伝子の発現が約3倍アップレギュレートされたことが分かった。これは
、マイクロアレイ分析およびノザンハイブリダイゼーションにより検出された。
ラットの頭蓋冠において、この遺伝子は約9Kbの単一のRNA種として発現される。
【０３４０】 ハイブリダイゼーションシグナルは、精巣、結腸、腸、腎臓、胃、胸腺、肺、子
宮、心臓、脳、肝臓、眼、およびリンパ節を含む異なる組織供給源からいかなる
他のラットのRNAでも検出されなかった。
【０３４１】 部分的な608ラットcDNAクローンを、RACE技術によりラット頭蓋冠cDNAライブ
ラリーから単離し、配列決定した。RACEコンティグは4007bpの長さであり、3’
から閉じている3356bpのオープンリーディングフレームを含有する。公開データ
ベースとの比較により、配列相同性は示されなかった。608cDNAと類似するいく
つかのヒトESTクローンが存在する。推定タンパク質の一次構造により、Igスー
パーファミリーに帰することができる。
【０３４２】 インサイチュハイブリダイゼーションにより（以下の実施例でより詳細に説明
される）、遺伝子608の発現は、正常な小柱骨からの骨髄中で見られたが、骨粗
しょう症のものでは見られなかった。
【０３４３】 CMF608に関して、本発明者は、おそらく細胞外マトリックスの一部である大き
いタンパク質をコードすることを発見した。この遺伝子は、骨芽細胞分化の支持
に積極的に関連し得る。再造形が生ずる領域を定めるという別の選択もある。そ
のような仮説は、破骨細胞作用を方向付ける役割と矛盾せず、したがって小分子
による抑制のための標的となり得る。
【０３４４】 正常な骨形成において、骨芽細胞の活性化により、破骨細胞前駆体または成熟
破骨細胞を骨形成の部位に誘導して骨再吸収の過程を開始する様々の因子が分泌
される。正常な骨形成においては、両方の機能が平衡している。いずれかの側へ
の不平衡により、大理石骨病（骨芽細胞機能が圧倒する）または骨粗しょう症（
破骨細胞機能が圧倒する）が引き起こされる。
【０３４５】 既知の骨芽細胞活性化因子−物理的力による刺激のうち本発明のモデルにおい
て実際に投与される。原理の証明として、転写アップレギュレーションにより物
理的ストレスに対して応答することが知られるいくつかの遺伝子の増加した発現
が見られた。これには、テネイシン、エンドセリンおよびトロンボスポンジンが
含まれる。メッセージをコードする水チャンネルのアップレギュレーションも、
この機構に関連するようである。
【０３４６】 発現がアップレギュレートされた遺伝子は、活性化された骨芽細胞により発現
されるもの（すなわち補体C3）またはアップレギュレーションが論理的に関連す
る以下のものである： １）物理的ストレスは構成NO−シンターゼを活性化する（NOはバイン(bine)構
築において重要な役割を果たす。）筋肉では、この酵素はシントロフィン1との
複合体で見られる。後者は、本発明のスクリーニングでアップレギュレートされ
ることがわかった。したがって、これは骨におけるNO−シンターゼ活性化にも関
連し得る。
【０３４７】 ２）骨芽細胞により分泌されるいくつかのタンパク質、例えばオステオポンチ
ンは、破骨細胞により強く発現されるインテグリンレセプターヘのRGDにより媒
介される結合によるは骨細胞誘導に関係する。この特異的なタンパク質は本発明
のスクリーニングで同定されなかったのに対し、DEST405およびRB13-6を含む他
のRGD−含有タンパク質は本発明のスクリーニングで同定されたので、これは重
要ではない。
【０３４８】 ３）破骨細胞を誘導する追加のタンパク質複合体は、C3補体の複合体である。
そのような複合体は、糖タンパク質−プロペルジンを含有するトロンボスポンジ
ンモチーフにより血漿中で安定化されることが知られている。既知の機能を有し
ないタンパク質を含有する別のトロンボスポンジンモチーフ−ADAMTS-1は、アッ
プレギュレートされることが分かった。これは骨においてC3補体の安定化に関係
し得る。
【０３４９】 証拠のいくつかの系により、物理的ストレスによってアポトーシス（NO、シト
クロムオキシダーゼサブユニット1）およびアンチアポトーシス（SARP1、グルタ
ミル−システインシンテターゼ）シグナリングが産生されることが示される。
【０３５０】 興味深いことに、本発明者は、物理的力に応じて、ステロイド合成を潜在的に
誘導する化学反応の連鎖を調節するいくつかの酵素がアップレギュレートされる
ことを認めた。骨において、これらのステロイドはエストロゲン様機能を有する
ことが、少なくとも2つの観察により考えられる：第1−ステアロイル−CoA−デ
サチュラーゼのアップレギュレーション（この酵素の活性の上昇はエストロゲン
依存性であることが知られている）；および第2−主にTGF−ベータ−1により細
胞中で誘発される、すなわちエストロゲンにより骨芽細胞中で誘発されることが
知られている結合組織増殖因子のアップレギュレーション。そのような関連によ
り、エストロゲンおよび物理的力の共通の抗骨粗しょう症作用が説明される。エ
ストロゲンは、直接（培養された破骨細胞に投与されて）およびTGF−ベータ−1
に依存した態様で骨粗しょう症アポトーシスを誘発するというのは価値がない。
【０３５１】 骨粗しょう症、骨粗しょう症予防、治療、またはコントロールに関連する、あ
るいは骨粗しょう症、その予防、治療またはコントロールの認識を進める研究ま
たは調査に関連するおよび／または骨増殖／形成の研究または調査に関連するお
よび／または骨増殖／形成に関連する疾患、状態、徴候などを扱うための遺伝子
には、3つの新しい遺伝子DEST274、405、608、並びにRG13-6（RGD含有タンパク
質）、メタロプロテイナーゼADAMTS-1、および骨形成においてプログラムされた
細胞死の修飾因子を潜在的に含むSARPファミリーのタンパク質（分泌されたアポ
トーシス関連タンパク質）が含まれる。
【０３５２】 さらに、ここに述べるように、この実施例は、細胞に物理的ストレスを与えず
に行うことができる；例えば、減少重力または無重力条件下で、物理的ストレス
を与えないモデルを発生させる；および、それにより同定されるその様なモデル
および遺伝子が本発明に含まれる。
【０３５３】 実施例／結果３：インサイチュハイブリダイゼーションによるCMF608遺伝子発現 CMF608遺伝子の発現のパターンを、卵巣除去したおよび擬似手術したラットか
らの骨の部分におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより調べた。300
−350gの体重のメスのウィスターラットを通常の麻酔の下で卵巣除去した。対照
ラットを同じように手術したが、卵巣を切除しなかった−擬似手術。
【０３５４】 手術の3週間後、ラットを犠牲にし、脛骨をひざ関節とともに切除した。骨を3
日間4%のパラホルムアルデヒドに固定し、次に5%蟻酸および10%ホルマリンを含
有する溶液中で4日間脱石灰化した。脱石灰化した骨を3日間10%のホルマリンに
予め固定し、パラフィン中に埋め込んだ。
【０３５５】 発生中の骨におけるCMF608遺伝子の発現のパターンを調べるために、異所性の
骨形成のモデルを使用した。ラットの骨髄細胞を、ラットの脛骨から調製した無
機質化した骨マトリックスの円柱に供給した。円柱を成熟したラットに皮下移植
した。3週間後ラットを犠牲にし、移植組織を脱石灰化し、脛骨について上述さ
れるのと同様にパラフィン中に埋め込んだ。
【０３５６】 6μmの切片を調製し、インサイチュのハイブリダイゼーション工程にかけた。
ハイブリダイゼーション後、切片を核追跡エマルジョン(nuclear track emulsio
n)に浸漬し、4℃で3週間感光させた。オートラジオグラフを現像し、ヘマトキシ
リン−エオシンで染色し、明視野のおよび暗視野の照度を使用して顕微鏡下で調
べた。
【０３５７】 CMF608遺伝子発現の細胞および組織特異性のさらなる査定のために、インサイ
チュハイブリダイゼーション研究を、成熟したラット組織の多様なサンプルを含
有する多組織ブロックの切片において行った。CMF608発現の発達パターンを、12
.5、14.5および16.5日間の妊娠後の(dpc)段階のマウス胚の矢状縫合切片におい
て調べた。
【０３５８】 長骨のハイブリダイズした切片の顕微鏡による研究によって、CMF608プローブ
ハイブリダイゼーションの特異なパターンが示された。ハイブリダイゼーション
シグナルは、切片を通していくつかの位置で見られる繊維芽細胞様細胞中で主に
見られた。これらの細胞の顕著な蓄積は、骨幹端中の骨膜モデリングの領域、お
よび骨幹中の緻密骨の積極的な細胞系の領域で見ることができる：骨髄と骨内膜
骨芽細胞との間の境界においておよび骨膜中で、また骨が細胞と密接して。骨幹
および骨端中の緻密骨においてフォルクマン管を満たす脈管周囲結合組織もまた
発現細胞を含有する。癌性の骨内でおよび骨髄中でハイブリダイゼーションは見
られない。このハイブリダイゼーションのパターンにより、CMF608の発現を示す
細胞は先在する骨の再造形の領域と関連するが一次軟骨内骨化には関係しないこ
とが示される。
【０３５９】 増殖板(growth plate)のレベルにおいて、発現細胞は、LaCroixの軟骨繊維輪
に見ることができる。この繊維輪を、繊維芽細胞および軟骨細胞に分化すること
ができる残留間葉細胞であると考える研究者もいる。この点に関して、CMF608を
発現する単一の細胞が骨端の軟骨中に見ることができることは注目すべきである
。これらの発現細胞は、骨端の外側区（ときにLaCroixの輪の非常に近く）内の
細胞および関節表面を覆う扁平細胞である。関節軟骨および増殖板のすべての軟
骨細胞中の多くの細胞は、CNF608の発現を示さない。卵巣除去によっては、骨組
織中のCMF608発現の強度およびパターンは変化しなかった。
【０３６０】 異所性の骨の切片において、CMF608についてのハイブリダイゼーションシグナ
ルを、無機質化された結合組織マトリックス内に分散したまたは未成熟の骨のこ
の組織と骨芽細胞との間の境界に集中したいくつかの繊維芽細胞様細胞中で見る
ことができる。
【０３６１】 骨および軟骨におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより示されたCM
F608遺伝子の発現のパターンによって、その発現が2つの骨格細胞型−骨が細胞
および軟骨細胞に分化できるいくつかの骨格組織エレメントを標識するというこ
とを推測できる。これらの細胞の末端分化は、CMF608発現のダウンレギュレーシ
ョンにより達成されると考えられる。後者の考えは、ラット胎児の頭蓋冠骨から
単離された骨形成原細胞の一次培養におけるCMF608発現の特有の時間パターンに
より支持される。これらの培養において、インビトロにおける1および2週間のイ
ンキュベーションの後細胞の大多数でインサイチュハイブリダイゼーションによ
り発現が示された。骨化の徴候を示す3および4週間後の培養液は、発現細胞を含
有しない。重要なことは、成熟した生体中の骨格組織についてのこの遺伝子発現
の高い特異性を示すCMF608プローブに対してハイブリダイズされる多組織ブロッ
クの切片でハイブリダイゼーションシグナルが見られなかったことである。
【０３６２】 胚の切片のインサイチュハイブリダイゼーション研究により、12.5dpcにおい
て胚体に亘っていくつかの位置で間葉細胞中に弱いハイブリダイゼーションシグ
ナルを認識することができることが示された。最も顕著なシグナルは、頭部で見
られる：嗅上皮を囲み鼻尖の表面上皮の下に存在する隙間の多い間葉組織中。頭
部中の他の間葉組織もまたハイブリダイゼーションシグナルを示す：底蝶形骨原
基の非軟骨性部分および下顎骨中の歯提（歯の原基）を囲む間充織中。
【０３６３】 体幹において発現は、胸腰領域中のより発達しない椎骨原基において検出でき
る。ハイブリダイゼーションシグナルはここで、硬節の凝縮した部分を標識する
。体幹中でハイブリダイゼーションシグナルを示す別の領域は、胸の体壁の腹側
の部分において間葉細胞の薄い層に含まれる。
【０３６４】 発生の後期の段階−14.5および16.5dpcにおいて、プローブCMF608はハイブリ
ダイゼーションシグナルを与えない。したがって、胚発生中、CMF608遺伝子は少
なくともいくつかの間葉細胞および骨格形成細胞により一過性に発現される。こ
の発現は、発生の後期の段階でダウンレギュレートされる。後期の胚および発生
の出生後段階のより詳細な研究により、骨組織におけるCMF608を発現する細胞の
出現のタイミングが明らかになる。
【０３６５】 実施例／結果4：インサイチュハイブリダイゼーションによるCMF608遺伝子発現 CMF405遺伝子の発現のパターンを、卵巣除去したおよび擬似手術したラットか
らの骨の部分におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより調べた。300
−350gの体重のメスのウィスターラットを通常の麻酔の下で卵巣除去した。対照
ラットを同じように手術したが、卵巣を切除しなかった−擬似手術。
【０３６６】 手術の3週間後、ラットを犠牲にし、脛骨をひざ関節とともに切除した。骨を3
日間4%のパラホルムアルデヒドに固定し、次に5%蟻酸および10%ホルマリンを含
有する溶液中で4日間脱石灰化した。脱石灰化した骨を3日間10%のホルマリンに
予め固定し、パラフィン中に埋め込んだ。
【０３６７】 発生中の骨におけるCMF405遺伝子の発現のパターンを調べるために、異所性の
骨形成のモデルを使用した。ラットの骨髄細胞を、ラットの脛骨から調製した無
機質化した骨マトリックスの円柱に供給した。円柱を成熟したラットに皮下移植
した。3週間後ラットを犠牲にし、移植組織を脱石灰化し、脛骨について上述さ
れるのと同様にパラフィン中に埋め込んだ。
【０３６８】 6μmの切片を調製し、インサイチュのハイブリダイゼーション工程にかけた。
ハイブリダイゼーション後、切片を核追跡エマルジョン(nuclear track emulsio
n)に浸漬し、4℃で3週間感光させた。オートラジオグラフを現像し、ヘマトキシ
リン−エオシンで染色し、明視野のおよび暗視野の照度を使用して顕微鏡下で調
べた。
【０３６９】 CMF405遺伝子発現の細胞および組織特異性のさらなる査定のために、インサイ
チュハイブリダイゼーション研究を、成熟したラット組織の多様なサンプルを含
有する多組織ブロックの切片において行った。CMF405発現の発達パターンを、12
.5、14.5および16.5日間の妊娠後の(dpc)段階のマウス胚の矢状縫合切片におい
て調べた。
【０３７０】 骨：CMF405遺伝子についてのハイブリダイゼーションシグナルは、擬似手術し
た動物からの長骨の切片において異なる細胞型に亘って広範に広がっている：軟
骨、骨髄および骨。
【０３７１】 増殖板において、ハイブリダイゼーションシグナルは、増殖性から肥大性軟骨
までの移行帯に集中しており、最も進行した増殖性軟骨細胞および最も若い肥大
性軟骨細胞は発現を示す。若い増殖性軟骨細胞および成熟した肥大性軟骨細胞の
多くは、ハイブリダイゼーションシグナルを示さない。関節軟骨の軟骨細胞は、
ハイブリダイゼーションシグナルを示さない。
【０３７２】 骨髄内のいくつかの（だがすべてではない）造血細胞は、はっきりしたハイブ
リダイゼーションシグナルを示す。ヘマトキシリン−エオシンで染色した脱石灰
化した切片の未分化組織によっては発現する細胞の種類を同定することはできな
い。
【０３７３】 骨組織内でハイブリダイゼーションシグナルは、骨幹端(methaphysis)（癌性
の骨）中の一次海綿体(spongiosa)および二次海綿体に局在する骨芽細胞に見る
ことができる。骨幹の（緻密）骨中の骨髄腔およびフォルクマン管の表面を覆う
骨芽細胞もまたハイブリダイゼーションシグナルを示す。扁平骨内層細胞および
破骨細胞は骨のどの部分でも発現されない。
【０３７４】 卵巣除去によっては、CMF405発現の強度およびパターンは変化しなかった。異
所性の骨において、ハイブリダイゼーションシグナルは未成熟の骨の骨芽細胞中
に主に集中する。このシグナルは弱く、骨マトリックスに埋め込まれた骨芽細胞
には存在しない。
【０３７５】 成熟した骨格組織中のCMF405遺伝子のハイブリダイゼーションのパターンによ
り、その発現は強いマトリックス石灰化を進行中の分化の中間段階である骨形成
原細胞および軟骨形成細胞に特徴的である。
【０３７６】 組織発現：CMF405プローブを多組織ブロック切片にハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイゼーションシグナルは、多くの器官および組織中の上皮細胞に主に見
ることができ、成熟組織における子の遺伝子の広い発現が示される。
【０３７７】 様々の強度のハイブリダイゼーションシグナルを、消化器系の上皮内層に見る
ことができる。弱いハイブリダイゼーションシグナルは、食道の重層扁平上皮の
基底細胞中に見ることができる。弱いシグナルは、胃底の表面上皮により示され
る。幽門胃において、粘膜膜孔の内側を覆う細胞により強いハイブリダイゼーシ
ョンシグナルがおよび表面上皮によってより弱いシグナルが示される。薄い腸に
おいて、発現する細胞は陰窩および腺に局在するのに対し、絨毛性上皮はハイブ
リダイゼーションシグナルを示さない。同様のパターンは、結腸上皮で観察され
る：弱いハイブリダイゼーションシグナルを、陰窩のみで見ることができ、絨毛
では見られない。消化管の種々の部分に亘るハイブリダイゼーションのこのパタ
ーンにより、消化器系におけるCMF405の発現は主に上皮細胞を積極的に増殖する
ことに制限されているようであり、上皮細胞の非増殖性区画（腸の食道または絨
毛上皮の基底上層）への移行はCMF405発現のダウンレギュレーションを伴うとい
うことが考えられる。
【０３７８】 泌尿生殖器系において、弱いおよび拡散したシグナルを腎臓の髄質部分に見る
ことができる。弱いハイブリダイゼーションシグナルは、腎臓の腎杯、尿管およ
び膀胱により示される。ハイブリダイゼーションシグナルは、輸精管内の基底細
胞でも見られる。マイクロオートラジオグラフの低い解像度では、発現する細胞
を精原細胞またはセルトリ細胞として明確に同定することができない。
【０３７９】 皮膚のすべての表皮層は毛嚢のすべての層にも局在する。
【０３８０】 強いおよび一様なハイブリダイゼーションシグナルをリンパ系器官：胸腺、脾
臓およびリンパ節で見ることができる。
【０３８１】 陽性のハイブリダイゼーションを眼の切片において得た：強いシグナルが角膜
上皮により示される。網膜は神経節細胞層を除くすべての層に亘ってより弱いハ
イブリダイゼーションシグナルを示す。
【０３８２】 ハイブリダイゼーションシグナルは脳では見ることができない。
【０３８３】 12.5、14.5および16.5dpcの胚の切片のインサイチュハイブリダイゼーション
研究により、12.5および14.5dpcの胚の体に亘って強いおよび実質的に一様なハ
イブリダイゼーションシグナルが示された。これにより、発生のこれらの段階に
おけるすべての細胞の種類はCMF405遺伝子を発現することが示される。16.5dpc
段階により、いくつかの細胞において発現が低下するため、発現のパターンは成
熟した組織におけるものに近づくが成体において発現を示さないいくつかの組織
がハイブリダイゼーションシグナルを示すと考えられる。
【０３８４】 実施例／結果５：インサイチュハイブリダイゼーションによるCMF274遺伝子の発
現 ひざ関節の切片へのCMF274プローブのハイブリダイゼーションにより、骨、軟
骨および骨髄組織に亘る広い発現が示された。ハイブリダイゼーションシグナル
は、造血骨髄細胞中で見られる。好酸球系列の細胞におけるシグナルの蓄積が明
らかである。脱石灰化された切片の未分化組織では、すべての骨髄性エレメント
が発現するわけではないのは明らかであるが、他の発現する細胞の種類を同定す
ることはできない。
【０３８５】 軟骨細胞は、増殖板のすべての領域に亘って弱いハイブリダイゼーションシグ
ナルを示す。骨端の関節軟骨において発現は検出されない。
【０３８６】 骨組織内でハイブリダイゼーションシグナルは、骨幹端（癌性の骨）中の一次
海綿体および二次海綿体に局在する骨芽細胞に見ることができる。骨膜および骨
内膜の骨芽細胞および骨幹の（緻密）骨中のフォルクマン管の骨芽細胞もまた、
ハイブリダイゼーションシグナルを示す。扁平骨内層細胞および破骨細胞は骨の
どの部分でも発現しない。卵巣除去によっては骨組織におけるCMF274発現の強度
およびパターンは変化しなかった。
【０３８７】 CMF274プローブを、多組織ブロック切片および12.5、14.5および16.5dpcマウ
ス胚の切片にハイブリダイズさせた。これらの切片ではハイブリダイゼーション
シグナルは見られなかった。
【０３８８】 実施例／結果６：インサイチュハイブリダイゼーションによるCMF2-45(SARP)遺
伝子発現 CMF2-45(SARP)遺伝子についてのハイブリダイゼーションシグナルは、擬似手
術した動物からの長骨の切片において種々の細胞の種類で見られた：軟骨、骨髄
および骨。すべての発現する細胞の種類において、ハイブリダイゼーションシグ
ナルのレベルはやや低い。
【０３８９】 増殖板において、ハイブリダイゼーションシグナルは増殖性軟骨細胞を示すの
に対し、肥大性軟骨細胞はほとんどまたは全くシグナルを示さない。骨端中の関
節軟骨の軟骨細胞は、ハイブリダイゼーションシグナルを示さない。
【０３９０】 骨組織中のハイブリダイゼーションシグナルは、癌性の骨および緻密骨のすべ
ての区画に位置する骨芽細胞を完全に示す；一次および二次海綿体、骨膜、骨内
膜およびフォルクマン管。骨内層細胞および破骨細胞はハイブリダイゼーション
シグナルを示さない。
【０３９１】 骨髄内のいくつかの（だがすべてではない）造血細胞は、はっきりしたハイブ
リダイゼーションシグナルを示す。ヘマトキシリン−エオシンで染色した脱石灰
化した切片の未分化組織によっては発現する細胞の種類を同定することはできな
い。
【０３９２】 異所性の骨においてハイブリダイゼーションシグナルは、未成熟の骨の骨芽細
胞において見ることができる。骨芽細胞の他にも、結合組織に亘って分散した繊
維芽細胞様細胞もハイブリダイゼーションシグナルを示す。これらの発現する繊
維芽細胞様細胞のいくつかは、骨芽細胞と近接して見ることができる。
【０３９３】 実施例／結果７：インサイチュハイブリダイゼーションによるCMF2-224(Rb13-6)
発現 RB13-6(GenBank Accession No.:Z47987)のインサイチュハイブリダイゼーショ
ン研究により、長骨の種々の区画に位置する骨芽細胞においてこの遺伝子の発現
が示された：骨幹端中の癌性の骨の一次および二次海綿体中および骨幹中の緻密
骨の骨内膜およびフォルクマン管内。弱いハイブリダイゼ−ションシグナルを骨
髄の骨髄性細胞中にも見ることができる。異所性の骨の移植組織内の発生中の未
成熟の骨の骨芽細胞もハイブリダイゼーションシグナルを示す。重要なことは、
卵巣除去されたラットの長骨の切片においておよび卵巣除去されたラットに移植
した異所性の骨の切片においてハイブリダイゼーションシグナルは示されなかっ
た。この結果により、骨芽細胞および骨髄細胞中のRB13-6の発現はエストロゲン
依存性であることが示される。RB13-6遺伝子産物の骨芽細胞機能の調節および骨
粗しょう症の発生への関連を明らかにするにはさらに研究が必要である。
【０３９４】 多組織ブロックの切片におけるさらなるインサイチュハイブリダイゼーション
研究により、明らかな上皮細胞型およびリンパ系組織におけるRB13-6遺伝子の発
現が示された。発現細胞は、気管支の上皮内層、薄い腸の絨毛用（すなわち成熟
したおよび非増殖性の）上皮、子宮の管腔のおよび腺状の上皮、唾液腺の腺房お
よび腺管の上皮において見ることができる。発現の低レベルを示す非常に弱いハ
イブリダイゼーションシグナルが、肝臓および腎臓で見られた。肝臓の発現は、
肝細胞に亘って一様の様である。腎臓においては単一の発現細胞を、ヘンレのル
ープの厚い上向部に見ることができる。
【０３９５】 リンパ系組織内で、強く発現するリンパ球がリンパ節の髄質領域に集中してい
る。少数の発現細胞を脾臓に見ることができる：濾周囲帯（赤色と白色の髄質の
間の境界領域）およびリンパ球の脈管周囲凝集において。胸腺では発現細胞は見
られなかった。
【０３９６】 このように本発明の好ましい実施の形態を詳細に記載したが、添付の特許請求
の範囲により定められる本発明は上述の詳細な説明に記載される特定の細部によ
り限定されるべきではなく、本発明の意図および範囲から離れずに明らかな変化
が可能であることを理解すべきである。
【０３９７】参考文献
【表２】 遺伝子発現のアンチセンスRNAコントロールは多くの細菌において示されてい
るのに対し、真核生物においては少数のケースしか知られていない。今日までに
同定されたすべてのアンチセンスRNAは、偶然に見つかっている。したがって、
本発明者の目的は、天然発生アンチセンスシステムを目標にして同定する新しい
方法を開発することである。この方法は、非常に長い一続きのヌクレオチドに亘
るアンチセンスと標的RNAとの間の相補正に基づく。使用される方法は、ここに
簡単に記載される。トータル細胞RNAが抽出される。RNAプールの一部は膜上に固
定され、別の一部は3’端へのオリゴデオキシヌクレオチドのライゲーションの
後cDNAに転換される。ビオチニル化された、cDNA合成のための相補的オリゴの使
用により、ストレプタビジン−被覆された磁気ビーズへの「マイナス」鎖の固定
が可能となる。オリゴの第2のセットを、RNAの前方の5’端にライゲーションす
る。プラス鎖を結合鎖から溶出し、膜結合RNAにハイブリダイズさせる。使用さ
れたcDNA鎖は同じ極性のRNAを有するので、RNAに相補的に結合できるcDNA配列だ
けが保持される。PCR増幅およびその後のPCR断片のクローニングの後、配列分析
を行う。クローニングされた配列が正しく同定されるか否かをテストするために
、センスおよびアンチセンス方向でプローブを産生する。陽性クローンを、構造
および機能により特徴付ける。この方法を実施するために、アンチセンスRNAに
よりコピー数を調節するプラスミドR1を含有する細菌菌株（大腸菌）の使用を開
始した。前記の作業により、R1のアンチセンス(CopA)および標的RNA(CopT)が細
胞内で同定された。所望なら、この方法はその後、他の生体におけるアンチセン
スRNAシステムのスクリーニングに使用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ショ糖密度勾配における細胞質RNAの分別の吸光度特性を示す図
【図１Ｂ】 アガロースゲル上で電気泳動されエチジウムブロマイドで染色されてRNAの分
別を示す、精製されたRNAを示す図
【図２】 トータルRNAのプローブ(Tot)を核RNAに由来するプローブ(STP)に比較するDNA
チップハイブリッド形成の結果を示す図
【図２Ａ】 本発明の方法により同定される遺伝子およびそのための配列またはそのESTの
配列を示す表
【図２Ａ−１】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−２】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−３】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−４】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−５】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−６】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−７】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−８】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−９】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１０】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１１】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１２】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１３】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１４】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図２Ａ−１５】 図２Ａに示す遺伝子の配列
【図３Ａ】 本発明の核酸分子608についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図３Ｂ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｃ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｄ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｅ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｆ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｇ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｈ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｉ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｊ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｌ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｍ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｎ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｏ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｐ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｑ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｒ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｓ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｔ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｕ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｖ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｗ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｘ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｙ】 図３Ａの配列の続き
【図３Ｚ】 図３Ａの配列の続き
【図３ＡＡ】 図３Ａの配列の続き
【図４】 正常細胞および物理的ストレスを与えられた細胞中の標的mRNAにおける本発明
の核酸分子608の5’断片プローブの結果を示す図
【図５Ａ】 本発明の核酸分子608についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図５Ｂ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｃ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｄ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｅ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｆ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｇ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｈ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｉ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｊ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｌ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｍ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｎ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｏ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｐ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｑ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｒ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｓ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｔ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｕ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｖ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｗ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｘ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｙ】 図５Ａの配列の続き
【図５Ｚ】 図５Ａの配列の続き
【図６Ａ】 本発明の核酸分子608およびそのためのプローブに関するクラスタルX(1.64b)
複合配列整合を示す図
【図６Ｂ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｃ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｄ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｅ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｆ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｇ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｈ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｉ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｊ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｌ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｍ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｎ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｏ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｐ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｑ】 図６Ａの配列の続き
【図６Ｒ】 図６Ａの配列の続き
【図７】 ヒトk562の標的トータルRNAにおけるヒト405のプローブの結果を示す図
【図８】 標的ラットcmf RNAにおけるヒト405のプローブの結果を示す図
【図９Ａ】 本発明の核酸分子405についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図９Ｂ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｃ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｄ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｅ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｆ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｇ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｈ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｉ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｊ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｌ】 図９Ａの配列の続き
【図９Ｍ】 図９Ａの配列の続き
【図１０Ａ】 本発明の核酸分子405についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図１０Ｂ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｃ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｄ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｅ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｆ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｇ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｈ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｉ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｊ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｌ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｍ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｎ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｏ】 図１０Ａの配列の続き
【図１０Ｐ】 図１０Ａの配列の続き
【図１１Ａ】 本発明の核酸分子405およびそのためのプローブに関するクラスタルX(1.64b)
複合配列整合を示す図
【図１１Ｂ】 図１１Ａの続き
【図１１Ｃ】 図１１Ａの続き
【図１１Ｄ】 図１１Ａの続き
【図１１Ｅ】 図１１Ａの続き
【図１１Ｆ】 図１１Ａの続き
【図１２】 標的のラットの骨、ラット精巣およびヒト細胞系NB4トータルRNA供給源におけ
るヒト274の8KBのプローブの結果を示す図
【図１３Ａ】 本発明の核酸分子274についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図１３Ｂ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｃ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｄ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｅ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｆ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｇ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｈ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｉ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｊ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｌ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｍ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｎ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｏ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｐ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｑ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｒ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｓ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｔ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｕ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｖ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｗ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｘ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｙ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３Ｚ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＡＡ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＢＢ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＣＣ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＤＤ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＥＥ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＦＦ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＧＧ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＨＨ】 図１３Ａの配列の続き
【図１３ＩＩ】 図１３Ａの配列の続き
【図１４Ａ】 本発明の核酸分子274についてのDNAおよびアミノ酸配列およびそこからの発現
産物を示す図
【図１４Ｂ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｃ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｄ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｅ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｆ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｇ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｈ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｉ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｊ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｌ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｍ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｎ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｏ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｐ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｑ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｒ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｓ】 図１４Ａの配列の続き
【図１４Ｔ】 図１４Ａの配列の続き
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
【図２】
【図２Ａ】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ａ−３】
【図２Ａ−４】
【図２Ａ−６】
【図２Ａ−７】
【図２Ａ−８】
【図２Ａ−９】
【図２Ａ−１０】
【図２Ａ−１１】
【図２Ａ−１２】
【図２Ａ−１３】
【図２Ａ−１４】
【図２Ａ−１５】
【図３Ａ】
【図４】
【図５Ａ】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図１０Ａ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 スカリター，ラミ イスラエル国 ネス−ジオナ ハバニム ストリート 117／10 (72)発明者 フェインステイン，エレナ イスラエル国 レホヴォット ハハガナ ストリート 12／29 (72)発明者 フェアマン，アレクサンダー イスラエル国 ブネイ アイイッシュ ヘ アラウ 2024／36 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA03 CA04 CA12 DA03 EA04 HA14 4B063 QA01 QA12 QQ02 QQ43 QQ53 QQ58 QR32 QR55 QR62 QS34

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 発現が特定のキューに応答する遺伝子を同定する方法であっ
    て、 (a)生体または組織または細胞にキューを与え； (b)前記キューを受けた前記組織または細胞から特定の細胞分画を単離し； (c)前記細胞分画からmRNAを抽出し； (d)キューを受けていない対照サンプルと比較して前記mRNAサンプルを示差分析
    し、キューに応答した遺伝子を同定する、 各工程を含み、前記組織または細胞が、培地中において骨細胞であり続ける骨細
    胞を含むことを特徴とする方法。
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