ES2314448T3 - Derivados de pirimidina-2,4-diona como antagonistas del receptor de la hormona de liberacion de la gonadotropina. - Google Patents

Derivados de pirimidina-2,4-diona como antagonistas del receptor de la hormona de liberacion de la gonadotropina. Download PDF

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Abstract

Compuesto que tiene la siguiente estructura (Ver fórmula) o un esteroisómero, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en la cual: R1a, R1b y R1c son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C1 - 4, hidroxi o alcoxi, o R1a y R1b tomados juntos forman -OCH2O- o -OCH2CH2-; R2a y R2b son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, trifluorometilo, ciano o -SO2CH3; R3 es hidrógeno o metilo; R4 es fenilo o alquilo C3 - 7; R5 es hidrógeno o alquilo C1 - 4; R6 es -COOH o un isóstero de ácido; y X es alcanodiilo C1 - 6 opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo C1 - 6. en el cual "Isóstero de ácido" significa un resto seleccionado entre tetrazol, 3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona, [1,2,4]-oxa-diazol- 3-ona, 1,2-dihidro-[1,2,4]-triazol-3-ona, 2H-[1,2,4]-oxadiazol-5-ona, triazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, imidazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, [1,2,4]-oxadiazolidina-3,5-diona, [1,2,4]-tiadiazolidina- 3,5-diona, imidazolidina-2,4-diona, imidazolidina-2,4,5-triona, pirrolidina-2,5-diona y pirrolidina-2,3,5-triona, y -C(=O)NHSO2NRaRb, -C(=O)NHSO2Rb, -C(=O)NHC(=O)NRaRb y -C(=O)NHC(=O)Rb, donde Ra es hidrógeno o alquilo C1 - 4 y Rb es alquilo C1 - 4.

Description

Derivados de pirimidina-2,4-diona como antagonistas del receptor de la hormona de liberación de la gonadotro-
pina.
Antecedente de la invención Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a antagonistas del receptor de la hormona de liberación de la gonadotropina (GnRH), y al uso de los mismos para la preparación de un medicamento para tratar trastornos en un animal de sangre caliente.
Descripción de la técnica relacionada
La hormona de liberación de la gonadotropina (GnRH), también conocida como hormona de liberación de la hormona de luteinizante (LHTH), es un decapéptido (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2) que desempeña un papel importante en la reproducción humana. Se libera GnRH a partir del hipotálamo y actúa sobre la glándula pituitaria para estimular la biosíntesis y liberar la hormona luteinizante (LH) y la hormona de estimulación de los folículos (FSH). La LH liberada a partir de la glándula pituitaria es responsable de la regulación de la producción de esteroides gonadales tanto en los machos como en las hembras, mientras que FSH regula la espermatogenosis en los machos y el desarrollo folicular en las hembras.
Por su importancia biológica, los antagonistas y agonistas sintéticos a GnRH han sido el foco de una atención considerable, particularmente en el contexto del cáncer de próstata, cáncer de seno, endometriosis, leiomioma uterino (fibroides), cáncer de ovarios, hiperplasia prostática, terapia de reproducción asistida y pubertad precoz (The Lancet 358: 1793-1803, 2001; Mol. Cell. Endo. 166:9-14, 2000). Por ejemplo, se han usado los agonistas de GnRH, tal como leuprorelina (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leyu-Arg-Pro-NHEt) para tratar tales afecciones. Tales agonistas parecen funcionar uniéndose al receptor de GnRH en las gonadotropinas pituitarias, induciendo de este modo la síntesis y la liberación de gonadotropinas. La administración crónica de agonistas de GnRH merma las gonadotropinas y consecuentemente regula a la baja el receptor, dando como resultado la supresión de hormonas esteroideas después de algún periodo de tiempo (por ejemplo, del orden de 2-3 semanas después del inicio de la administración
crónica).
Por el contrario, se cree que los antagonistas de GnRH suprimen gonadotropinas desde el principio, y de este modo han recibido mayor atención a lo largo de las dos últimas décadas. A fecha de hoy, algunos de los principales obstáculos para el uso clínico de tales antagonistas han sido su biodisponibilidad relativamente baja, y los efectos laterales adversos causados por la liberación de histamina. Sin embargo, se han reseñado diversos antagonistas peptídicos con propiedades de liberación baja de histamina, aunque todavía se deben liberar por vías de liberación sostenida (tales como inyección subcutánea o pulverización intranasal) debido a su biodisponibilidad limitada.
A la vista de las limitaciones asociadas a los antagonistas peptídicos de GnRH, se han propuesto una serie de compuestos no-péptidicos. Por ejemplo, Cho et al., (J. Med. Chem. 41 :4190-4195, 1998) revela tieno[2,3-b]piridin-4-onas para su uso como antagonistas del receptor de GmRH; las patentes de los Estados Unidos número 5,780,437 y 5,849,764 enseñan índoles sustituidos como antagonistas del receptor de GnRH (como en las publicaciones PCT WO 97/21704, 98-/55479, 98/55470, 98-/55116, 98/55119, 97/21707, 97/21703 y 97/21435), la publicación PCT WO 96/38438 revela diazepinas tricíclicas como antagonistas del receptor de GnRH, las publicaciones PCT WO 97/14682, 97/14697 y 99/09033 revelan derivados de quinolina y tienopiridina como antagonistas de GnRH; las publicaciones PCT WO 97/44037, 97/44321 y 97/44339 enseñan quinolin-2-onas sustituidas como antagonistas del receptor de GnRH; y la publicación PCT 99/33831 revela algunos compuestos bicíclicos que contienen nitrógeno fusionados sustituido con fenilo como antagonistas del receptor de GnRH. Las recientes publicaciones PCT WO 02/066459 y WO 02/11732 revelan el uso de derivados de indol y nuevos derivados de pirolidina bicíclicos y tricíclicos como antagonistas de GnRH, respectivamente. Otras publicaciones recientes PCT que revelan compuestos y su uso como antagonistas de GnRH incluyen WO 00/69859, WO 01/29044, WO 01/55119, WO 03/013528, WO 03/011870, WO 03/001841, EO 03/011839 y WO 03/011293. Yun-Feu-Zhu et al., revelan en J. Med. Chem. 2003, 46, 2023-2026, un antagonista de GnRH.
Aunque se han hecho progresos considerables en este campo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de antagonistas del receptor de GnRH de pequeñas moléculas efectivos. Hay igualmente una necesidad de composiciones farmacéuticas que contengan tales antagonistas del receptor de GnRH, así como procedimientos relacionados con el uso de los mismos para tratar, por ejemplo, afecciones relacionadas como las hormonas sexuales. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas. Por consiguiente la presente invención proporciona la materia objeto definida en las reivindicaciones 1 a 51.
\newpage
Breve sumario de la invención
En resumen, esta invención se refiere generalmente a los antagonistas del receptor de la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH), así como a procedimientos para su preparación y su uso, y a composiciones farmacéuticas que los contienen. Más específicamente, los antagonistas del receptor de GnRH de esta invención son compuestos que tienen la siguiente estructura general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
que incluye esteroisómeros, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la cual R_{1a}, R_{1b}, R_{1c}, R_{2a}, R_{2b}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y X son tales como se definen más adelante.
Los antagonistas del receptor de GnRH de esta invención tienen una utilidad en un gran intervalo de aplicaciones terapéuticas, y se pueden usar para tratar diversas afecciones relacionadas con las hormonas sexuales tanto en hombres como en mujeres, así como en un mamífero en general (también denominado en la presente memoria descriptiva como un "sujeto"). Por ejemplo, tales afecciones incluyen endometriosis, fibroides uterinas, la enfermedad de los ovarios policísticos, hirsutismo, pubertad precoz, neoplasia dependiente de esteroides gonadales tales como cánceres de próstata, de pecho y ovario, adenomas gonadotropos pituitarios, apnea del sueño, síndrome del colón irritable, síndrome premenstrual, hipertrofia prostática benigna, contracepción e infertilidad (por ejemplo terapia de reproducción asistida tal como la fertilización in vitro). Los compuestos de esta invención también son útiles como adjunto al tratamiento de deficiencia de la hormona del crecimiento y baja estatura, y para el tratamiento de lupus eritematoso sistémico. Los compuestos también son útiles en combinación con andrógenos, estrógenos, progesteronas y antiestrógenos y antiprogesteronas para el tratamiento de la endometriosis, fibroides, y en la contracepción, así como en combinación con un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un antagonista del receptor de angiotensina II, o un inhibidor de renina para el tratamiento de los fibroides uterinas. Además, se pueden usar los compuestos en combinación con bisfosfonatos y otros agentes para el tratamiento y/o la prevención de trastornos de calcio, fosfato y del metabolismo de los huesos, y en combinación con estrógenos, progesteronas y/o andrógenos para la prevención o el tratamiento de la pérdida ósea o síntomas hipogonadales tales como sofocos durante la terapia con antagonistas
de GnRH.
Los compuestos de la presente invención, además de su actividad de antagonistas del receptor de GnRH, poseen una interacción reducida con las principales enzimas metabólicas en el hígado, concretamente las enzimas Citocromo P450. Esta familia de enzimas, que incluye los subtipos CYP2D6 y CYP344, es responsable del metabolismo de fármacos y toxinas que conducen a su disposición a partir del cuerpo. La inhibición de estas enzimas puede conducir a afecciones con peligro para la vida donde la enzima no puede llevar a cabo esta función.
Una cantidad eficaz de un antagonista del receptor de GnRH se puede administrar en forma de una composición farmacéutica, a un mamífero que lo necesita. De este modo, en otra realización más, se revelan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más antagonistas del receptor de GnRH de esta invención en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.
\newpage
Descripción detallada de la invención
Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere generalmente a compuestos útiles como antagonistas del receptor de la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH). Los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (I):
2
o un esteroisómero, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
en la cual:
\quad
R_{1a}, R_{1b} y R_{1c} son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxi o alcoxi, o R_{1a} y R_{1b} tomados juntos forman -OCH_{2}O- o -OCH_{2}CH_{2}-;
\quad
R_{2a} y R_{2b} son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, trifluorometilo, ciano o -SO_{2}CH_{3};
\quad
R_{3} es hidrógeno o metilo;
\quad
R_{4} es fenilo o alquilo C_{3-7};
\quad
R_{5} es hidrógeno o alquilo C_{1-4};
\quad
R_{6} es -COOH o un isóstero de ácido; y
\quad
X es alcanodiilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo C_{1-6}.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos anteriores tienen el siguiente significado:
"Alquilo C_{1-6}" significa un hidrocarburo alifático de cadena recta o ramificada, monocíclico o cíclico, saturado o insaturado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los alquilos de cadena recta saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentilo y ciclohexenilo. Los alquilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (denominados respectivamente "alquenilo" o "alquinilo"). Los alquenilos de cadena recta o ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3.-metil-1-butinilo.
"Alquilo C_{1-4}" significa un hidrocarburo de cadena recta o ramificada, monocíclico o cíclico que contiene de 1 a 4 átomos de carbono. Los alquilos de cadena recta representativos incluyen n-propilo, n-butilo, n-hexilo, mientras que los alquilos ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, Los alquilos cíclicos representativos incluyen ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo,
"Alquilo C_{3-7}" significa un hidrocarburo de cadena recta o ramificada, monocíclico o cíclico, que contiene de 3 a 7 átomos de carbono. Los alquilos de cadena recta representativos incluyen n-propilo, n-butilo, n-hexilo, mientras que los alquilos ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo. Los alquilos cíclicos representativos incluyen ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo
"Alcanodiilo C_{1-6}" significa un alquilo C_{1-6} divalente a partir del cual alcanodiilo C_{1-6} de dos hidrógeno significa un alquilo C_{1-6} divalente a partir del cual se toman juntos dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de diferentes átomos de carbono tales como -CH_{2}-, CH_{2}CH_{2}-, CH_{2}CH_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{2}-, CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH_{2}-.
"Halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo, típicamente flúor y cloro.
"Hidroxi" significa -OH.
"Alcoxi" significa -O-(C_{1-6}alquilo)
"Ciano" significa -CN.
"Isóstero de ácido" significa un resto que exhibe propiedades similares al ácido carboxílico, y que tiene un pKa inferior a 8 y preferiblemente inferior a 7, seleccionado entre tetrazol, 3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona, [1,2,4]-oxadiazol-3-ona, 1,2-dihidro-[1,2,4]-triazol-3-ona, 2H-[1,2,4]-oxadiazol-5-ona, triazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, imidazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, [1,2,4]-oxadiazolidina-3,5-diona. [1,2,4]-tiadiazolidina-3,5-diona, imidazolidina-2,4-diona, imidazolidina-2,4,5-triona, pirrolidina-2,5-diona y pirrolidina-2,3,5-triona, y -C(=O)NHSO_{2}NR_{a}R_{b}, -C(=O)NHSO_{2}R_{b}, -C(=O)NHC(=O)NR_{a}R_{b} y -C(=O)NHC(=O)R_{b}, donde R_{a} es hidrógeno o alquilo C_{1-4} y R_{b} es alquilo C_{1-4}.
En una realización, R_{4} es fenilo y los antagonistas de GnRH representativos de la presente invención incluyen los compuestos que tienen la siguiente estructura (II).
3
En otra realización, R_{4} es alquilo C_{3-7} y los antagonistas de GnRH representativos de la presente invención incluyen los compuestos que tienen la siguiente estructura (III).
4
En una realización más específica de la estructura (III), alquilo C_{3-7} es un alquilo C_{3-7} de cadena recta o ramificado tal como butilo como se representa mediante la estructura (IV), o es un alquilo C_{3-7} cíclico tal como ciclohexilo como se representa mediante la estructura (V):
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5 
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En otra realización, R_{1a}, R_{1b} y R_{1c} son hidrógeno, alcoxi y halógeno, respectivamente. Un modelo de sustitución representativo incluye 2-halo-3-alcoxifenilo. Los grupos alcoxi representativos incluyen metoxi y etoxi, mientras que los restos halógeno representativos incluyen flúor y cloro.
En una realización alternativa, R_{1a}, y R_{1b} tomados juntos forman -CH_{2}O- tal como 2,3-metilenodioxi.
En otra realización, R2a y R2b son hidrógeno, trifluorometilo, halógeno o -SO_{2}CH_{3}. Un modelo de sustitución representativo incluye R_{2a} como halógeno en la posición 2 y R2b como hidrógeno, trifluorometilo, halógeno o
-SO_{2}CH_{3} en la posición 6.
Otras realizaciones incluyen aquellos en los cuales R_{5} es H o metilo; R_{6} es -COOH, y/o X es -CH_{2}CH_{2}-,
-CH_{2}CH_{2}CH_{2}- o CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-.
Los compuestos de la presente invención se pueden preparar por técnicas conocidas de síntesis orgánica, incluyendo los procedimientos descritos más en detalle en los Ejemplos. En general, los compuestos de estructura (I) anterior se pueden fabricar mediante los siguientes esquemas de reacción, en los cuales todos los substituyentes son tal como se definen anteriormente a menos que se indique otra cosa.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema de reacción 1
6 
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Se puede reducir un benzonitrilo apropiadamente sustituido usando un reactivo apropiado tal como borano en THF a la amina correspondiente y a continuación se forma urea 1. La ciclación con un reactivo tal como dicetona proporciona el compuesto 2 que se puede bromar con bromuro en ácido acético, N-bromosuccimida u otro agente de bromación para proporcionar el compuesto 3. La alquilación proporciona el compuesto 4 y la condensación de Suzuki con un ácido borónico o éster de ácido borónico proporciona el compuesto 5 La desprotección de la amina protegida usando un reactivo típico (tal como ácido trifluoroacético en cloruro de metileno en el caso de un grupo Boc) proporciona el compuesto 6 que se puede alquilar o condensar con un aldehído mediante condiciones de aminación reductora para proporcionar un compuesto de fórmula 7. Es posible modificar el orden de las diversas etapas de aminación reductora, alquilación, bromación y condensación de Suzuki para proporcionar los compuestos de la presente
invención.
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Esquema de reacción 2
7
En una variante del Esquema 1, el compuesto 4 es sometido a desprotección para proporcionar el compuesto 8 que en condiciones de Suzuki proporciona el compuesto 6. El grupo -X-R_{6} se puede añadir por alquilación, aminación reductora u otra reacción para proporcionar el compuesto 7.
Esquema de reacción 3
8
El éster de ácido fenilacético sustituido 9 (fabricado a partir del ácido correspondiente o comprado) y el reactivo tal como dimetilformamida dimetilacetal se condensan para proporcionar 10. La ciclación con urea proporciona un compuesto de fórmula 11. La alquilación usando, por ejemplo, un bromuro de bencilo sustituido proporciona 12 el cual se puede alquilar con un haluro de alquilo apropiado, pude experimentar una reacción de acoplamiento de Mitsonobu con un alcohol apropiado, o puede reaccionar con un mesilato o sulfonato para proporcionar 5.
Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar generalmente como el ácido libre o la base libre. Alternativamente, los compuestos de esta invención se pueden usar en forma de sales de adición de ácido o base. Las sales de adición de ácido de los compuestos amino libre de la presente invención se pueden preparar por procedimientos bien conocidos en la técnica, y se pueden formar a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos orgánicos apropiados incluyen los ácidos maléico, fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, metanosufónico, acético, glicólico, glutámico y bencenosulfónico. Los ácidos inorgánicos apropiados incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico. Las sales de adición de base incluyen las sales que se forman con anión alcalino e incluyen las sales formadas con cationes orgánicos e inorgánicos tales como las elegidas entre los metales alcalinos y alcalinotérreos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, magnesio, bario y calcio), así como el ión de amonio y los derivados sustituidos del mismo (por ejemplo, dibencilamonio, bencilamonio, 2-hidroxietilamonio). De este modo, se entiende que el término "sal farmacéuticamente aceptable" de estructura (i) comprende cualquiera y todas las formas de sal aceptables.
Respecto de los estereoisómeros, los compuestos de estructura (I) pueden ser centros quirales y se puede dar como racematos, mezclas racémicas y como enantiómeros o diastereómeros individuales. todas las formas isoméricas de este tipo se incluyen dentro de la presente invención incluyendo las mezclas de las mismas. Además, algunas formas cristalinas de los compuestos de estructura (I) pueden existir como polimorfos, los cuales se incluyen en la presente invención. Además, algunos de los compuestos de la estructura (I) también pueden formar solvatos u otros solventes orgánicos. Tales solvatos se incluyen también dentro del alcance de esta invención.
La efectividad de un compuesto como antagonista del receptor de GnRH se puede determinar mediante diversas técnicas de ensayo. Unas técnicas de ensayo bien conocidas en el campo incluyen el uso de células pituitarias cultivadas para medir la actividad de GnRH (Vale et al., Endocrinology 91:562-572, 1972) y la medición de unión de radioligando a membranas pituitarias de rata (Perrin et al., Mol, Pharmacol. 23-44-51, 1983) o a membranas de células que expresar receptores clonados como se describe más adelante. Otras técnicas de ensayo incluyen (pero no se limitan a) mediciones de los efectos de los antagonistas del receptor de GnRH sobre la inhibición del flujo de calcio estimulado por GnRH, la modulación de la hidrólisis de fosfoinositol, y las concentraciones circulantes de gonadotropinas en el animal castrado. A continuación se llevan a cabo las descripciones de estas técnicas, la síntesis de ligando radiomarcado, el empleo de ligando radiomarcado en radioinmunoensayo, y la medición de la efectividad de un compuesto como antagonista del receptor de GnRH.
Inhibición de Liberación de LH estimulada por GnRH
Los antagonistas de GnRH apropiados son capaces de inhibir la unión específica de GnRH a su receptor y antagonizar actividades con GnRH. Por ejemplo, la inhibición de liberación de LH estimulada por GnRH en ratas inmaduras se puede medir según el procedimiento de Vilches-Martínez (Endocrinology 96: 1130-1134, 1975). En resumen, se administró a ratas Spraque-Dawley macho de 25 días un antagonista de GnRH en solución salina u otra formulación apropiada por alimentación forzada oral, inyección subcutánea o inyección intravenosa. Esto va seguido de inyección subcutánea de 200 ng de GnRH en 0,2 ml de solución salina. Treinta minutos después de la inyección, los animales fueron decapitados y se recogió la sangre del tronco. Después de la centrifugación, se almacenó el plasma separado a -20ºC hasta la determinación de las concentraciones de LH y/o FSH por radioinmunoensayo (véase más adelante).
Ensayo de cultivo de células pituitarias anteriores de rata de antagonista de GnRH
Las glándulas pituitarias anteriores se recogen a partir de ratas hembra Sprague-Dawley de siete semanas y las glándulas recogidas se digieren con colagenasa en un matraz de dispersión durante una hora y media a 37ºC. Después de la digestión con colagenasa, las glándulas se digieren, además, con neuraminidasa durante 9 minutos a 37ºC. El tejido digerido se lava entonces con BSA al 1%/medios de McCoy 5A, y las células lavadas se suspenden en FBS al 3%/BSA al 0,1%/medio de Macoy 5A y se depositan sobre placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a una densidad de células de 40.000 células por pocillo en 200 \mul de medio. A continuación las células se incuban a 37ºC durante 3 días. Para el ensayo de un antagonista de GnRH, las células incubadas se lavan primeramente con BSA al 0,1%/medio de McCoy 5ª una vez, seguido de la adición de la muestra de ensayo más 1 nM de GnRH en 200 \mul de BSA al 0,1%/medio de McCoy 5A en pocillos triplicados. Cada muestra se somete a ensayo a niveles de 5 dosis para generar una curva de dosis-respuesta para la determinación de la potencia sobre la inhibición liberación de LH y/o FSH estimulada por GnRH. Después de 4 horas de incubación a 37ºC, se recoge el medio y el nivel de LH y/0 FSH segregado en el medio se determina por RIA.
Ensayos de unión a membranas 1
Las células transfectadas estable o transitoriamente son vectores de expresión del receptor de GnRH se recogen, se vuelven a suspender en sacarosa al 5% y se homogeneizan usando un homogeneizador Polytron (2x15 s). Se eliminan los núcleos por centrifugación (3000 x g durante 5 minutos), y el sobrenadante se centrifuga (20.000 x g durante 30 minutos, 4ºC) para recoger la fracción de membrana. La preparación de membrana final se vuelve a suspender en tampón de unión (Hepes 10 mM (pH 7,5), NacL 150 mM y BSA al 0,1%) y se almacena a -70ºC. Las reacciones de unión se llevan a cabo en un conjunto de placas de filtración de 96 pocillos Millipore MultiScreen con membranas de GF/C revestida con polietilenimina. La reacción se inicia añadiendo las membranas (40 \mug de proteína en 130 ul de tampón de unión) a 50 \mul de péptido de GnRH marcado [^{125}] (\sim 100.000 cpm) y 20 \mul de competidor a concentraciones variables. La reacción se termina después de 90 minutos aplicando vacío y lavando (2 veces) con solución salina de tampón fosfato. La radiactividad unida se mide usando el recuento de centelleo. (Packard Topcount) o eliminando los filtros de la placa y recuento de gamma directo.. Los valores K_{j} se calculan a partir de los datos de unión de competición usando regresión con mínimos cuadrados no lineales que usan el paquete de software Prism (GraphPad software).
Ensayos de unión de membrana 2
Para ensayos adicionales de unión de membrana, se recolectan células HEK293 transfectadas de manera estable golpeando matraces de cultivo de tejido contra una superficie firme y se recogen por centrifugación a 100 x g durante 5 minutos. Los sedimentos de célula se vuelven a suspender en sacarosa al 5% y se homogeneizan usando un homogeneizador Polytron durante dos etapas de homogeneización de 15 segundos. Los homogenizados de células se centrifugan entonces durante 5 minutos a 3000 x g para eliminar los núcleos, y el sobrenadante se centrifuga posteriormente durante 30 minutos a 44.000 x g para recoger la fracción de membrana. El sedimento de membrana se vuelve a suspender en tampón de unión a GnRH (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCL 150 mM y BSA al 0,1%) y las alícuotas se congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80ºC. El contenido de proteínas de la suspensión de membrana se determina usando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA).
Los ensayos de unión a radioligando competitivos con preparaciones de membrana se llevan a cabo en placas de filtración de 96 pocillos Millipore con filtro de membrana de GF/C que no se pre-revisten con 200 \mul de polietilenimina al 0,1% (Sigma, St. Louis. MO). Antes de su uso, las placas se lavan 3 veces con solución salina de tampón fosfato. Se añade la fracción de membrana en tampón de unión a GnRH (130 \mul que contiene 25 \mug de proteína para receptores humanos o macacos o 12 \mug para receptores ratas) a los pocillos junto con 20 \mul de ligando de competición a concentraciones variables. La reacción de unión se inicia añadiendo radioligando (0,1 nM en 50 \mul de tampón de unión a GnRH). Se deja que la reacción proceda durante 90 minutos sobre un agitador de plataforma a temperatura ambiente y a continuación se termina colocando la placa de ensayo sobre un distribuidor de vacío Millipore (Millipore, Bedford, M). Aspirando el disolvente y lavando los pocillos dos veces con 200 \mu de solución (PBS) salina de tampón fosfato y hielo frío. Los filtros en los pocillos se eliminan y cuentan en un contador gamma. Los valores K_{j} se calculan a partir de cada una de las curvas de unión de competición usando regresión con mínimos cuadrados no lineales y se corrigen para la concentración de radioligandos usando la ecuación de Cheng-Prusoff (Prism, GraphPad Software, San Diego), asumiendo una afinidad de radioligando de 0,5 nM. Los calores medios de K_{j} se calculan a partir del antilogaritmo de la media de los valores de pKj para cada par de ligandos receptores.
Ensayos de unión a membrana 3
Las células RBL del receptor de GnRH humanas transfectadas estables se cultivan por confluencia. El medio se elimina y la monocapa de células se lava una vez con DPBS. Se añade una solución de EDTA =,5 mM/PBS (libre de Ca^{++}, Mg^{++}) a la placa en la cual a continuación se incuba a 37ºC durante 10 minutos. Las células se sacan golpeando suavemente los matraces. Las células se recogen y sedimentan por centrifugación a 800 g durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de células se vuelve a suspender a continuación en tampón [DPBS (KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KCl 2,7 mM y NaCl 138 mM) suplementado con MgCl_{2} 10 mM, EGTA 2 mM, pH = 7,4 con NaOH)]. A continuación se lleva a cabo la lisis celular usando una célula de presión y aplicando N_{2} a una presión de 62,067 bares (900 psi) durante 30 minutos a 4ºC. Las células no rotas y los residuos mayores se eliminan por centrifugación a 1.200 g durante 10 minutos a 4ºC. A continuación el sobrenadante de membrana celular se centrifuga a 45.000 g y el sedimento de membrana resultante se vuelve a suspender en tampón de ensayo y se homogeneiza sobre hielo usando un homogeneizador de tejido. Las concentraciones de proteína se determinan usando el kit Coomasi Plus Protein Reagen (Pierce, Rockford, OL) usando albúmina de suero bovino como norma. Los sedimentos se establecen en alícuotas y se almacenan a -80ºC hasta su uso. Los análisis de valoración que usan un intervalo de concentraciones de proteína determinaron que la concentración de proteína óptima ha de ser 15 \mug por concentración final de pocillo.
Las placas de filtro GF/C Unifilter (Perkin Elmer, Boston, MA) se preparan con una solución de polietilenimina al 0,5% enagua destilada durante 30 minutos. Los filtros se preenjuagan con 200 \mul por pocillo de PBs, BSA al 1% (Fracción V) y Tween-20 al 0,01%, pH = 7,4) usando una recogedora de células (Unifilter-96 Filternate; Packard). Las membranas se recolectan mediante filtración a vacío rápida y se lavan 3 veces con 250 \mu de tampón de hielo frío (PBS, Tween-20 al 0,01%, pH = 7,4). Las placas se secan con aire, se añade 50 \mul de fluido de centelleo (Microscint 20, Packard), y se vigila la radiactividad de la placa usando un TopCount NCT (Packard Instruments, OL).
Los experimentos de unión se llevan a cabo en tampón que contiene HEPES 10 mM, NaCl 150 mM y BSA al 0,1%, pH = 7,5. La membrana se incuba con 50 \mul de [125]His^{5}, D-Tyr^{6}GnTH (concentración final de 0,2 nM) y 50 \mul de competidores de moléculas pequeñas a concentraciones que varían entre 30 pM y 10 \muM para un volumen total en cada pocillo de 200 \mul. Las incubaciones se llevan a cabo durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se termina por filtración rápida sobre filtros GF/C como se ha descrito anteriormente. El ajuste de curvas se lleva a cabo usando Excel Fit Software (IDBS) Emeryville, CA). Los valores K_{i} se calculan usando el procedimiento de Cheng y Prusoff (Cheng and Prusoff, 10973) usando un valor Kd de 0,7 nM para el radioligando que se determinó previamente en los experimentos de unión por saturación.
Medición de flujo CA^{++}
Para determinar la inhibición del flujo de calcio estimulado por GnRH en las células que expresan el receptor de GnRH humano, se siembra una placa de 96 pocillos con células RBL trasfectadas de manera estable con el receptor de GnRH humano a una densidad de 50.000 células/pocillo y se deja que se unan durante una noche. Las células se cargan durante 1 hora a 37ºC en el siguiente medio: DMEM con HEPES 20 mM, FPS al 10%, 2 \muM de Fluo-4, ácido plurónico al 0,02% y probenecida. Los pocillos se lavan 4 veces con tampón de agua (sal equilibrada de Hanks, HEPES 20 mM, probenecida 2,5 mM) después de cargar, dejando 150 \mu en el pocillo después del último lavado. Se diluye la GnRH en BSA al 0,1% que contiene tampón FLIPR (sal equilibrada de Hanks, HEPES 20 mM) a una concentración de 20 nM y se dispensa dentro de una placa de 96 pocillos (baja unión a proteína). Se preparan diversas concentraciones de antagonistas en BSA al 0,1%/tampón FLIPR en una tercera placa de 96 pocillos. La medición de fluorescencia debida al flujo de Ca^{++} estimulado por GnRH (50 \mul de 20 nM o 4 nM final) se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante sobre un sistema FLIPR (Molecular Devices FLIPR384 system, Sunnyvale, CA), seguido de una incubación de 1 minuto con 50 \mul de antagonista a concentraciones variables.
Ensayos de hidrólisis de fosfoinositol
Se modifica el procedimiento a partir de los protocolos publicados (W. Zhou et al., J. Biol. Chem. 270(32), pp. 18853-18857, 1995). En resumen, las células RBL transfectadas establemente con receptores de GnRH humanos se siembran en placas de 24 pocillos a una densidad de 200.000 células/pocillo durante 24 horas. Las células se lavan una vez con medio libre de inositol que contiene FBS dializado al 10% y a continuación se marcan con 1 uCi/ml de [myo-^{3}H]-inositol. Después de 20-24 horas, las células se lavan con tampón (140 nM de NaCl, KCl 4 mM, HEPES 20 mM, Glucosa 8,3 mM, Macl_{2} 1 mM, CaCl_{2} y HSA al 0,1%) y se tratan con péptido de GnRH nativo en el mismo tampón con o sin diversas concentraciones de antagonista y LiCl 10 mM durante 1 hora a 37ºC. Las células se extraen con ácido fórmico 10 mM a 4ºC durante 30 minutos y se cargan sobre una columna Dowex AG1-X8, se lavan y se eluyen con formiato de amonio 1 M y ácido fórmico 0,1 M. El eluado se cuenta en un contador de centelleo. Los datos del ensayo de hidrólisis de fosfoinositol se indican usando regresión con mínimos cuadrados no lineales y por el programa Prism (GraphPad, GraphPad Software, San Diego, CA), a partir del cual se calcula de relación de dosis. La indicación lineal de Schild se genera a partir de las relaciones de dosis obtenidas en cuatro experimentos independientes por regresión lineal, y se usa el corte X para determinar la afinidad del antagonista.
Estudios de animales castrados
Los estudios de animales castrados proporcionan un ensayo in vivo sensible para los efectos de antagonista de GnRH (Andrology 25: 141-147, 1993). Los receptores de GnRH en la glándula pituitaria median la liberación de LH estimulada por GnRH en circulación. La castración da como resultado niveles elevados de LH en circulación debido a la reducción de la realimentación negativa de esteroides gonadales que da como resultado una mejora de la liberación de LH estimulada por GnRH. Por consiguiente, la medición de la supresión de niveles de LH en circulación en macacos castrados se puede usar como medida in vivo sensible del antagonismo de GnRH. Por lo tanto, los macacos macho se castran quirúrgicamente y se deja que se recuperen durante 4 semanas en cuyo momento están presente niveles elevados de LH. A los animales se les administra entonces el compuesto de ensayo como dosis oral o intravenosa y se toman en serie muestras de sangre enserie para la medición de LH. Las concentraciones de LH en suero de estos animales se pueden determinar por técnicas de inmunoensayo o bioensayo (Endocrinology 107: 902-907, 1980).
Preparación de radioligando de GnRH
El análogo de GnRH se marca mediante el procedimiento cloraminna-T. A 10 \mug de péptido en 20 \mul de tampón fosfato de sodio 0,5 M, pH 7,6, se añade 1 mCi de Na^{125}I, seguido de 22,5 \mug de cloramina-T en 15 \mul de tampón fosfato de sodio 0,05 M y se centrifuga durante 20 segundos. La reacción se detiene por la adición de 60 \mug de metabisulfito de sodio en 30 \mul de tampón fosfato de sodio 0,05 M y se elimina el yodo libre pasando la mezcla de reacción a través de un cartucho C-8Sep-Pak (Millipore Corps., Milford, MA). El péptido se eluye con un pequeño volumen de acetonitrilo al 80%/agua. El péptido marcado recuperado se purifica a continuación por HPLC de fase inversa sobre una columna analítica Vydac C-18 (The Separations Group, Hesperia, CA) sobre un sistema de HPLC de gradiente Beckman 334 usando un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1%. El péptido radiactivo purificado se almacena en BSA al 0,1%/acetonitrilo al 20%/TFA al 0,1% a -80ºC y se puede usar hasta 4 semanas.
RIA de LH y FSH
Para la determinación de los niveles de LH, cada medio de muestra se somete a ensayo por duplicado y todas las diluciones se hacen con tampón RIA (tampón fosfato de sodio 0,01 M/NaCl 0,15 M/BSA al 1%/NaN_{3} al 0,01%, pH 7,5) y el kit de ensayo se obtiene a partir del Nation Hormone and Pituitary Program respaldado por NIDDK. A un tubo de ensayo de polietileno de 12 x 75 mm se añaden 100 \mul de medio de muestra diluido 1:5 o estándar de rLH en tampón RIA y 100 \mul de rLH marcado^{[125I]} (\sim30.000 cpm) más 100 \mul de anticuerpo anti-rLH de conejo diluido 1:187.000 y 100 \mul de tampón RIA. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante una noche. Al día siguiente, se añaden 100 \mul de IgG anticonejo de cabra diluido 1:20 y 100 \mul de suero de conejo normal diluido 1:1000 y la mezcla se incuba durante 3 horas más a temperatura ambiente. Los tubos incubados se centrifugan entonces a 3.000 rpm durante 30 minutos y se elimina el sobrenadante por aspiración. El sedimento restante en los tubos se cuenta en un contador gamma. El RIA de FSA se hace de manera similar al inmunoensayo para LH con sustitución del anticuerpo de LH por el anticuerpo de FSH diluido 1:30.000 y el rLH marcado por el rFSH marcado.
Actividad de antagonistas del receptor de GnRH
La actividad de los antagonistas del receptor de GnRH se calcula típicamente a partir del CI50 como la concentración de un compuesto necesario para desplazar el 50% del ligando radiomarcado desde el receptor de GnRH, y se indica como un calo "K_{j}" calculado por la siguiente ecuación:
9
donde L = radioligando y K_{D} = afinidad del radioligando para el receptor (Cheng and Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:3099, 1973). Los antagonistas del receptor de GnRH de esta invención tienen un K_{j} de 100 \muM o menos. En una realización preferida de esta invención los antagonistas del receptor de GnRH tienen un K_{j} inferior a 10 \muM o más preferiblemente inferior a 1 \muM, e incluso más preferiblemente inferior a 0,1 \muM (es decir, 100 nM). Con este fin, todos los compuestos específicamente revelados en los ejemplos tienen K_{j} inferiores a 100 nM en uno o más de los ensayos de unión a membrana 1 a 3 anteriores.
La capacidad de los antagonistas de GnRH para inhibir las enzimas principales de metabolización de fármacos en el hígado humano, en concreto, las CYP2D6 y CYP3A4, se puede evaluar in vitro según un procedimiento fluorimétrico basado en placas de valoración descrito por Crespi et al. (Anal Biochem. 248: 188-190; 1997). AMMC (es decir, 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcoumarina) y BFC (es decir, 7-benciloxi-4-(trifluorometil)coumarina) a una concentración igual a Km (es decir, la concentración de sustrato que produce una mita de la velocidad máxima) se usan como sustratos marcadores para CYP2D6 y CYP3A4, respectivamente. En resumen, Se incuba CYP2D6 o CYP3A4 recombinante con sustrato marcador y el sistema de generación de NADPH (constituido por NADP + 1 mN, glucosa-6-fosfato 46 mM y 3 unidades (ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenada) a 37ºC, en ausencia o presencia de 0,03, 0,09, 0,27, 0,82, 2.5, 7,4, 22, 67 y 200 \muM de un antagonista de GnRH de muestra. Las reacciones se detienen por la adición de un volumen igual de acetonitrilo. La proteína precipitada se elimina por centrifugación y el fluido sobrenadante transparente se analiza utilizando un fluorímetro de placa de valoración. Los antagonistas de GnRH de la presente invención tienen preferiblemente G_{j} superiores a 250 nK, más preferiblemente superiores a 1 \muM y más preferiblemente superiores a 5 \muM.
Como se ha mencionado anteriormente, los antagonistas del receptor de GnRH de esta invención tienen utilidad sobre un gran número de aplicaciones terapéuticas, y se pueden usar para tratar diversas afecciones relacionadas con las hormonas sexuales tanto en hombres como en mujeres, así como en los mamíferos en general. Por ejemplo, tales afecciones incluyen endometriosis, fibroides uterinas, la enfermedad de los ovarios policísticos, hirsutismo, pubertad precoz, neoplasia dependiente de esteroides gonadales tales como cánceres de próstata, de pecho y ovario, adenomas gonadotropos pituitarios, apnea del sueño, síndrome del colón irritable, síndrome premenstrual, hipertrofia prostática benigna, contracepción e infertilidad (por ejemplo terapia de reproducción asistida tal como la fertilización in vitro).
Los compuestos de esta invención también son útiles como adjunto al tratamiento de deficiencia de la hormona del crecimiento y baja estatura, y para el tratamiento de lupus eritematoso sistémico.
Los compuestos también son útiles en combinación con andrógenos, estrógenos, progesteronas y antiestrógenos y antiprogesteronas para el tratamiento de la endometriosis, fibroides, y en la contracepción, así como en combinación con un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un antagonista del receptor de angiotensina II, o un inhibidor de renina para el tratamiento de los fibroides uterinas. Además, se pueden usar los compuestos en combinación con bisfosfonatos y otros agentes para el tratamiento y/o la prevención de trastornos de calcio, fosfato y del metabolismo de los huesos, y en combinación con estrógenos, progesteronas y/o andrógenos para la prevención o el tratamiento de la pérdida ósea o síntomas hipogonadales tales como sofocos durante la terapia con antagonistas de GnRH.
En otra realización de la invención, se revelan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más antagonistas del receptor de GnRH. Para el fin de administración, los compuestos de la presente invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un antagonista del receptor de GnRH de la presente invención y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antagonista del receptor de GnRH está presente en la composición en una cantidad que es efectiva para tratar un trastorno particular, es decir, en una cantidad suficiente para conseguir actividad antagonista del receptor de GnRH, y preferiblemente con toxicidad aceptable por el paciente. Típicamente las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir un antagonista del receptor de GnRH en una cantidad de entre 0,1 mg y 250 mg por dosificación dependiente de la vía de administración, y más típicamente de entre 1 mg y 60 mg. Las concentraciones y dosificaciones apropiadas se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica.
Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la técnica. Para las composiciones formuladas como soluciones líquidas, los vehículos y/o diluyentes aceptables incluyen solución salina y agua estéril, y pueden opcionalmente incluir antioxidantes, tampones, bacteriostatos y otros aditivos comunes. Las composiciones se pueden formular también como píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos que contienen, además de un antagonista del receptor de GnRH diluyentes dispersantes y tensioactivos, aglomerantes y lubricantes. El experto en la técnica puede, además, formular el antagonista del receptor de GnRH de una manera apropiada, y según las prácticas aceptadas, tal como las reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990.
La presente invención se refiere a un procedimiento para tratar afecciones relacionadas con hormonas sexuales tal como se menciona anteriormente. Tales procedimientos incluyen administrar un compuesto de la presente invención a un animal de sangre caliente en una cantidad suficiente para tratar la afección. en este contexto, "tratar" incluye la administración profiláctica. Tales procedimientos incluyen la administración sistémica de un antagonista del receptor de GnRH de esta invención, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica como se ha mencionado anteriormente. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, la administración sistémica incluye procedimientos de administración orales y parenteral. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas apropiadas de antagonistas del receptor de GnRH, incluyen polvos, gránulos, píldoras, comprimidos y cápsulas así como líquidos, jarabes, suspensiones y emulsiones. Estas composiciones también pueden incluir saborizantes, conservantes, agentes de suspensión, espesantes y emulsionantes, y otros aditivos farmacéuticamente aceptables. Para la administración parenteral, los compuestos de la presente invención se pueden preparar en soluciones acuosas de inyección, que pueden contener, además del antagonista del receptor de GnRH, tampones, antioxidantes, bacteriostatos y otros aditivos comúnmente empleados en tales soluciones.
El siguiente ejemplo se proporciona a título ilustrativo, no limitativo. En resumen, los antagonistas del receptor de GnRH de esta invención se pueden someter a ensayo por los procedimientos generales revelados anteriormente, mientras que los siguientes Ejemplos revelan la síntesis de compuestos representativos de esta invención.
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Ejemplos A. Procedimientos de HPLC para analizar las muestras
Tiempo de retención t_{R}, en minutos.
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Procedimiento 1
Cromatografía de fluidos supercríticos- Espectrometría de masa (CFS-EM)
Columna: 4,6 mm Deltabond Cyano 5 \muM de Thermo-hypersil-keystone
Fase móvil: Dióxido de carbono de grado CFS y metanol de grado óptimo con un modificador de dietilmalonato de disodio 1 mM
Temperatura: 50ºC
Presión: 120 bares
Caudal: 4,8 ml/minuto
Gradiente: metanol al 5-55% durante 1,7 minuto y se mantiene al 55% durante 0,8 minutos y a continuación vuelve al 5% en 0,1 minuto para un ciclo total de funcionamiento de 2,6 minutos.
Procedimiento 2
HPLC-EM
Columna: Waters ODS-AQ, 2,0 x 50 mn
Fase móvil: A = agua con ácido trifluoroacético al 0,05%, B) acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05%
Gradiente: A al 95/B al 5% a A al 5%/B al 95% durante 13,25 minutos y mantiene A al 5%/B al 95% durante 2 minutos y a continuación vuelve a A al 95%/B al 5% durante 0,25 minutos.
Caudal: 1 ml/minuto
Longitud de onda de UV: 220 y 254 nM
Procedimiento 3
HPLC-EM
Columna: BHK Lab ODS-O/B 4,6 x 50 mn, 5 \mum
Fase móvil: A = agua con ácido trifluoroacético al 0,05%, B) acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05%
Gradiente: A al 95/B al 5% durante 0,5 minutos, a continuación a A al 90%/B al 10% durante 0,05 minuto de A al 90%/B al 10% a A al 5%/B al 95% durante 18,94 minutos, a continuación A al 1%/B al 99% durante 0,05 minuto y mantiene A al 1%/B al 99% durante 2,16 minutos y a continuación vuelve a A al 95%/B al 5% durante 0,50 minuto.
Caudal: 2,5 ml/minuto
Longitud de onda de UV: 220 y 254 nM
Procedimiento 4
HPLC-EM
Columna: Waters ODS-AQ, 2,0 x 50 mn
Fase móvil: A = agua con ácido trifluoroacético al 0,05%, B) acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05%
Gradiente: A al 95/B al 5% a A al 10%/B al 90% durante 2,25 minutos y mantiene A al 10%/B al 90% durante 1,0 minuto y a continuación vuelve a A al 95%/B al 5% durante 0,1 minuto.
Caudal: 1,0 ml/minuto
Longitud de onda de UV: 220 y 254 nM
Procedimiento 5
HPLC-EM
Columna: Agilent, Zorbax SB-C18, 5 M, 4,6 x 250 mm
Fase móvil: A = agua con ácido trifluoroacético al 0,05%, B) acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05%
Gradiente: A al 95/B al 5% a A al 5%/B al 95% durante 50 minutos y a continuación A al 5%/B al 95% a A al 1%/B al 99% durante 0,1 minuto y a continuación mantiene A al 1%/B al 99% durante 0,8 minuto y vuelve a A al 95%/B al 5% durante 0,2 minuto, mantiene tal gradiente durante 4 minutos.
Caudal: 2,0 ml/minuto
Longitud de onda de UV: 220 y 254 nM
Procedimiento 6
(HPLC-EM)
Columna: Phenomenex Synergi 4 \mu Max-RP 80A, 50,0 x 2,0 mm
Fase móvil: A = agua con ácido trifluoroacético al 0,025%, B) acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,025%
Gradiente: A al 95/B al 5% durante 0,25 minuto, a continuación a A al 95%/B al 5% a B al 95%/A al 5% durante 13 minutos, manteniéndose A al 95%/B al 5% a B al 95%/a al 5% durante 1 minutos y a continuación vuelve a A al 95%/B al 5% durante 0,25 minuto.
Caudal: 1,0 ml/minuto
Longitud de onda de UV: 220 y 254 nM
Ejemplo 1 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]- 6-metil-pirimidina-2,4-(1H,3H)-diona
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Etapa 1A
Preparación de 2-fluoro-6-(trifluorometil)bencilamina 1a
A 2-fluoro-6-(trifluorometil(benzonitrilo (45 g, 0,238 mmol) en 60 ml de THF se añadió I M NH_{3}:THF lentamente a 60ºC y la solución resultante se mantuvo a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió metanol (420 ml) lentamente y se agitó satisfactoriamente. A continuación los disolventes se evaporaron y el residuo se dividió entre EtOAc y agua. Se secó la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación proporcionó 1a en forma de aceite amarillo (46, g, 0,238 mmol). EM (CI) m/z 194,0 (MH^{+}).
Etapa 1B
Preparación de N[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]urea 1b
A 2-fluoro-6-(trifluorometil)bencilamina 1a (51,5 g, 0,267 mmol) en un matraz se añadió urea (64 g, 1,07 mmol), HCL (conc., 30,9 mmol, 0,373 mmol) y agua (111 ml). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 6 horas. La suspensión amarilla resultante se enfrió a temperatura ambiente, y a continuación se enfrió con hielo y se filtró para proporcionar un sólido amarillo. La recristalización con 400 ml de EtOAc proporcionó 1b en forma de sólido blanco (46,2 g, 0,196 mmol). EM (CI) m/z 237,0 (MH^{+}).
Etapa 1C
Preparación de 1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1c
Se añadió Nal (43,9 g, 293 mmol) a N-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]urea 1b (46,2, g, 19,6 mmol) en 365 ml de acetonitrilo. La mezcla resultante se enfrió en un baño de agua con hielo. Se añadió dicetena (22,5 ml, 293 mmol (lentamente mediante un embudo de goteo seguido de la adición de TMSCI (32,2 ml, 293 mmol) de la misma manera. La suspensión amarilla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente lentamente y se agitó durante 20 horas. LC-EM mostró la desaparición del material de partida. A la mezcla amarilla se añadió 525 ml de agua y se agito una noche. Después de otras 20 horas de agitación, se filtró el precipitado mediante embudo de Buchnner y se lavó el sólido amarillo con agua y EtOAc para proporcionar 1c en forma de sólido blanco (48,5 g, 16 mmol) ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 2,15 (s, 3H), 5,37 (s, 2H), 5,60 (s, 1H), 7,23-7,56 (m, 3H), 9,02 (s, 1H), EM (CI) m/z 303,0 (MH^{+}).
Etapa 1D
Preparación de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1d
Se añadió bromo (16,5 g, 0,32 mmol) a 1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1c (48,5, g, 0,16 mol) en 145 ml de ácido acético. La mezcla resultante se hizo transparente formándose a continuación el precipitado en una hora. Después de 2 horas agitando, el sólido amarillo se filtró y lavó con EtOAc frío obteniéndose un sólido casi blanco. el filtrado se lavó con NaHCO_{3} saturado y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación proporcionó un sólido amarillo que se lavó con EtOAc para proporcionar un sólido amarillo claro. Los dos sólidos se combinaron para proporcionar 59,4 g de 1d (0,156 mol) total. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 2,4 (s, 3H), 5,48 (s, 2H), 7,25-7,58 (m, 3H), 8,61 (s, 1H), EM (CI) m/z 380,9 (MH^{+}).
Se fabricó 5-bromo-1-[2-,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1d.1 usando el mismo procedimiento.
Etapa 1E
Preparación de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-3-[2(R)-terc-butoxicarbonil-amino-2-feniletil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1e
A 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1d (15 g, 39,5 mmol) en 225 ml de THF se añadió N-t-Boc-D-fenilglicinol (11,7 g, 49,2 mmol) y trifenilfosfina (15,5 g, 59,1 mmol), seguido de la adición de di-terc-butil azodicarboxilato (13,6 g, 59,1 mmol). La solución amarilla resultante se agitó durante una noche. Los volátiles se evaporaron y el residuo se purificó por gel de sílice 3:7 EtOAc/Hexano para proporcionar 1e en forma de sólido blanco (23,6 g, 39,4 mmol) EM (CI) m/z 500,0 (MH^{+}-Boc).
Etapa 1F
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6- metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1f
A 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-3-[2(R)terc-butoxicarbonil-amino-2-feniletil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1e (15 g, 25 mmol) en 30 ml/90 ml de H_{2}O/dioxano en un tubo de presión se añadió ácido 2-fluoro-3-metoxifenilborónico (4,25 g, 25 mmol) y carbonato de sodio (15,75 g, 150 mmol). El gas N_{2} se hizo borbotear durante 10 minutos. Se añadió Tetrakis(trifenilfosfina)paladio (2,9 g, 2,5 mmol), se selló el tubo y la mezcla resultante se calentó con agitación a 90ºC durante una noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, el precipitado se eliminó por filtración. Se eliminaron los volátiles por evaporación y el residuo se dividió entre EtOAc/NaHCO_{3} saturado. El disolvente orgánico se evaporó y el residuo se cromatografió con 2:3 EtOAc/Hexano para proporcionar 13,4 g (20,8 mmol, 83%) de un sólido amarillo.
Este sólido amarillo (6,9 g, 10,7 mmol) se disolvió en 20 ml/20 ml de CH_{2}Cl_{2}/TFA. La solución amarilla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los volátiles se evaporaron y el residuo se dividió entre EtOAc/NaHCO saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación proporcionó 1f en forma de aceite amarillo (4,3 g, 7,9 mmol, 74%).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 2,03 (s, 3H), 3,72-4,59 (m, 2H), 5,32-5,61 (m, 2H), 6,74-7,56 (m, 11H), EM (CI) m/z 546,0 (MH^{+}).
Se fabricó 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,
4(1H,3H)-diona 1f.1 usando el mismo procedimiento descrito en este ejemplo.
Etapa 1G
Preparación de 3-[2(R){etoxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri- fluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1g
Al compuesto 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1f (5 g, 9,4 mmol) en 100 ml de acetonitrilo se añadió etil 4-bromobutirato (4 ml, 28,2 mmol) y base de Hunig (1,6 ml, 9,4 mmol). Después de calentar a reflujo a 95ºC durante una noche, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y los volátiles se eliminaron. El residuo se cromatografió con 10:10:1 EtOAc/Hexano/Et_{3}N para proporcionar 1g en forma de aceite amarillo (3,0 g, 4,65 mmol), EM (CI) m/z 646,2 (MH^{+}).
Etapa 1H
Preparación de 3-[2(R){hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri- fluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1-1
El compuesto 3-[2(R)-{etoxicarbonilpropil-amino}2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluoro-
metil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1g (2,6 g, 4,0 mmol) se disolvió en 30 ml/30 ml de THF/agua. El sólido NaOH (1,6 g, 40 mmol) se añadió y la mezcla resultante se calentó a 50ºC durante una noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los volátiles se evaporaron. Se añadió ácido cítrico a la solución acuosa hasta un pH = 3. La extracción con EtOAc seguido de la evaporación de disolvente proporcionó un gel blanco. El gel se pasó a través de una columna macroporosa fuerte de intercambio catiónico Dowex MSC-1 para convertirse en sal de sodio. La liofilización proporcionó el sólido blanco 1-1 en forma de sal de sodio (1,58, 2,47 mmol).H NMR (CD_{3}PD) \delta 1,69-1,77 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,09-2,19 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 2,49-2,53 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 3,88 (s, 3H), 4,15-4,32 (m, 3H), 5,36-5,52 (m, 2H), 6,60-7,63 (m, 11H), HPLC-EM (CI) m/z 632,3 (MH^{+}), t_{R} = 26,45, (procedimiento 5).
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior.
11
12
Etapa 1I
Preparación de 3-[2(R)-{N-metil-N-hidroxicarbonilpropil-amino}2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1-4
13
Al compuesto 1-1 (0,045 mmol) se añadió 1 ml de MeOH, formaldehído (0,0475 mmol) seguido de la adición de BH_{3} 8M:Piridina (0,0475 mmol). Después de una noche agitando, el compuesto 1-4 se purificó por LC-EM preparativa. HPLC-EM (CI) m/z 646,5 (MH^{+}), t_{R} = 2,231, (procedimiento 4).
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior
14
15
Ejemplo 2 3-[2(R)-hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-]2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil- pirimidina-2,4(1H,3H)-diona
16
Etapa 2A
Preparación de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-3-[2(R)-amino-2-feniletil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 2a
Se disolvió 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-3-[2(R)-terc-butoxicarbonil-amino-2-feniletil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1e en 20 ml/20 ml de CH_{2}CH_{2}/TFA. La solución amarilla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los volátiles se evaporaron y el residuo se dividió entre EtOAc/NaHCO_{3} saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4.} La evaporación proporcionó 2a en forma de aceite amarillo.
Etapa 2B
Preparación de 5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-3-[2(R)-amino-2-feniletil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 2b
Al compuesto 2a (40 mg, 0,08 mmol) en 0,25 ml/0,75 ml de H_{2}O/dioxano en un vial de 4 ml se añadió ácido 2-clorofenilborónico (0,12 mmol) y carbonato de sodio (51 mg, 48 mmol, 6 eq). Se sometió a borboteo el gas de nitrógeno a través de la solución durante 1 minuto y se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (9,24 mg, 0,008). La mezcla resultante se selló y se calentó a 90ºC durante una noche. Después de enfriarse a temperatura ambiente, se eliminó el precipitado por filtración y se purificó por LC-EM preparativa para proporcionar 2b.
Etapa 2C
Preparación de 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 2-1
Al compuesto 2b (0,03 mmol) en 1 ml de MeOH, se añadió semialdehído succínico (0,03 mmol) seguido de la adición de BH_{3} 8M:Piridina (0,03 mmol). después de una noche agitando, el compuesto 2.1 se purificó por LC-EM preparativa. EM (CI) m/z 618,2 (MH^{+}), t_{R} = 1,005 (procedimiento 1).
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior.
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17 
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18
Ejemplo 3 3-[2(R)-{2-[5-tetrazoilpropil]amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-]2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6- metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona
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Etapa 3A
3-[2(R)-{3-cianopropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6- metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 3a
El compuesto 1f (110 mg, 0,2 mmol) se disolvió en acetonitrilo (5 ml) y se añadió diisopropiletilamina (52 g, 0,4 mmol), seguido de la adición de 4-bromobutironitrilo (90 g, 0,6 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 16 horas. Los volátiles se evaporaron y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (sílice, MeOH al 5%/CH_{2}Cl_{2} para proporcionar el compuesto 3a (115 mg, 94%), EM (CI) m/z 613,3 (MH^{+}).
Etapa 3B
3-[2(R)-{2-{5-tetrazoilpropil]-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 3-1
Se añadió a una solución de 3a (38 g, 0,06 mmol) en tolueno (5 ml) tributinazida (42 mg, 0,12 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a 100ºC durante 14 horas. La mezcla se enfrió, se dividió entre EtOAc y NaOC 1 N y la fase orgánica se lavó con HCl 1 N y salmuera. La fase orgánica se secó (sulfato d sodio), y se evaporó, y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sílice, MeOH al 7%/CH_{2}Cl_{2} para proporcionar el compuesto 3-1 (10 mg, 25%), HPLC-EM (CI) m/z 656,2 (MH^{+}). t_{R} = 2,128 min, (procedimiento 4).
Ejemplo 4 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-ciclohexiletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-]2,6-difluorobencil]-6-me- til-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona
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Etapa 4A
Preparación de terc-butil 1-ciclohexil-2-hidroxietilcarbamato 4a
Se enfrió una solución de N-(t-butoxicarbonil)ciclohexilglicina (2,0 g, 7,77 mmol) en THF anhidro (10 ml) a 0ºC. Se añadió solución de borano (1 M en THF, 15,5 ml, 15,5 mmol) lentamente y la mezcla de reacción se inactivó con MeOH (5 ml), los volátiles se evaporaron y el residuo se dividió entre agua y EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHCO/agua, salmuera, se secó (sulfato de sodio), y se evaporó para proporcionar terc-butilo 1-ciclohexil-2-hidroxietilcarbamato 4a (1,26 g, 66,7%), EM (CI) m/z 144,2 (MH^{+}-Boc).
Etapa 4B
Preparación de 5-bromo-3-[2(R)-terc-butoxicarbonil-amino-2-cicloexiletil]-1-[2,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4b
Se trató una solución de terc-butil 1-ciclohexil-2-hidroxietilcarbamato 4a (638 mg, 2,62 mmol) en THF (10 ml) con 5-bromo-1-(2,6-difluorobencil)-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 1d.1 (869 mg, 2,62 mmol) y trifenilfosfina (1,03 g, 3,93 mmol) a temperatura ambiente, entonces se introdujo el di-tercbutilazodicarboxilato (906 mg, 3,93 mmol). La mezcla de reacción se agitó entre NaHCO_{3} saturado/H_{2}O y EtOAc. La fase orgánica se secó (sulfato de sodio), se evaporó, y se purificó por cromatografía ultrarrápida (sílice, EtOAc al 25%/hexanos) para proporcionar el compuesto 4b (1,39 g, 95,4%), EM (CI) m/z 456,1 (MH^{+}-Boc).
Etapa 4C
Preparación de 3-[2(R)-terc-butoxicarbonil-amino-2-cicloexiletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluoro- bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4c
Se añadió a 5-bromo-3[2(R)-terc-butoxicarbonil-amino-2-cicloexiletil]-1-[2,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4b (1,0 g, 1,79 mmol) en benceno/EtOH/dimetileter de etilenglicol (20/2/22) ácido 2-fluoro-3-metoxifenilborónico (382 mg, 2,24 mmol) y Ba(OH)_{2} saturado/agua (\sim0,5 M, 15 ml). La mezcla de reacción se desoxigenó con N2 durante 10 minutos, se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (208 mg, 0,18 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante una noche bajo atmósfera N2. La mezcla de reacción se dividió entre salmuera y EtOAc. La fase orgánica se secó (sulfato de sodio), se evaporó, y se purificó por cromatografía ultrarrápida (sílice, EtOAc al 30%/hexanos) para proporcionar el compuesto 4c (348 mg, 32,3%), EM (CI) m/z 502,2 (MH^{+}-Boc).
Etapa 4D
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-cicloexiletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4d
Al compuesto 4c (300 mg, 0,5 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió TFA (2 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los volátiles se evaporaron y el residuo se dividió entre NaHCO_{3} saturado/agua y EtOAc. La fase orgánica se secó (sulfato de sodio), se evaporó, se purificó por HPLC de fase inversa (columna C-18, ACB al 15-75%/agua) para proporcionar el compuesto 4d. EM (CI) m/z 502,2 (MH^{+}).
Etapa 4E
Preparación de 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-cicloexiletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4-1
A una solución del compuesto 4d (10 mg, 0,02 mmol) en metanol se añadió semialdehído succínico (15 mg, solución acuosa al 15%), seguido de la adición de borano/piridina (8 M, 3 \mul). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los volátiles se evaporaron y el residuo se purificó directamente sobre placa de TLC preparativa eluyendo MeOH al 7%/CH_{2}Cl_{2} para proporcionar el compuesto 4-1 (5 mg). EM (CI) m/z 588,3 (MH^{+}).
Se sintetizó 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-cicloexiletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri-
fluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 4-2 usando el mismo procedimiento y el mismo intermediario 1d.
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior.
21 
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22
Ejemplo 5 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-]2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidi- na-2,4(1H,3H)-diona
23
Etapa 5A
Preparación de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 5a
Se trató una suspensión de 5-bromouracilo (31,0 g) en 300 ml de dicloroetano con N,O-bis(trimetilsilil)cetamida (80 ml). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, se añadió bromuro de 2-fluoro-6-(trifluorometil(bencilo (50 g) y la mezcla de reacción se calentó durante una noche bajo nitrógeno. La reacción se enfrió, se inactivó con MeOH, y se dividió entre diclorometano y agua. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó (sulfato de sodio), y se evaporó para proporcionar un sólido. El producto en bruto se trituró con éter, se filtró y se lavó con éter tres veces proporcionando 40,7 g de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina 2,4(1H,3H)-diona, 5a. EM (CI) m/z 366,0, 368,0 (MH^{+}).
Etapa 5B
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 5b
Se trató una solución de 5-bromo-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 5a (19,2 g, 52,3 mmol) en THF (180 ml) con N,(t-butiloxicarbonil)-D-\alpha-fenilglicinol (13,6 g, 57,5 mmol) y trifenilfosfina (20,6 g, 78,5 mmol) a temperatura ambiente, a continuación se introdujo di-terc-butilazodicarboxilato (18,0 g, 78,5 mmol) en diversas porciones durante 5 minutos. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, se añadió THF adicional (90 ml) y la mezcla se calentó a 50ºC. Se añadió HCl concentrado (34,6 ml, 418 mmol), y la mezcla de reacción se agitó a 50ºC durante 40 minutos. Después de la dilución con acetato de etilo (100 ml), el sólido se filtró, se lavó con acetato de etilo adicional (100 ml), y se secó para proporcionar el compuesto 5b (26,9 g, 98%) en forma de polvo blanco. EM (CI) m/z 485,0, 487,0 (MH^{+}).
Etapa 5C
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina- 2,4(1H,3H)-diona 5c
Al compuesto 5b (10,45 g, 20 mmol) en dioxano/agua (180/20 ml) se añadió ácido 2-clorofenilborónico (6,26 g, 40 mmol) y Na_{2}CO_{3} (12,72 g, 120 mmol). La mezcla se desoxigenó con N_{2} durante 15 minutos, se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (=) (2,31 g, 2 mmol) y se calentó la mezcla de reacción a 90ºC durante 16 horas. La reacción se dividió entre EtOAc y H_{2}O. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se concentró y se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos/trietilamina 500/500/6 a 800/200/7 para proporcionar el compuesto 5c (7,26 g, 70%) en forma de espuma blanca. EM (CI) m/z 518,0, 520,1 (MH^{+}).
Etapa 5D
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina- 2,4(1H,3H)-diona 5d
Se mantuvo a reflujo una mezcla del compuesto 5c (4,1 g, 7,93 mmol), etil 4-bromobutirato (3,6 ml, 23,79 mmol) y K_{2}CO_{3} (2,2 g, 15,86 mmol) en MeCN (80 ml) durante 16 horas. Se eliminó MeCN, y el residuo se dividió entre EtOAc y H_{2}O. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se concentró y se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos/trietilamina 400/600/7 para proporcionar el compuesto 5d (2,5 g, 50%) en forma de jarabe amarillento. EM (CI) m/z 632,2, 634,2 (MH^{+}).
Etapa 5E
Preparación de 3-[2(R){hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil) bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 5-1
Al compuesto 5b (2,4 mg, 3,8 mmol (se añadió THF (30 ml) y H_{2}O (30 ml) seguido de NaOH (1,588 g, 39,7 mmol). La mezcla se agitó a 50ºC durante 16 horas. El THF se eliminó a vacío, la solución acuosa se lavó con éter, se enfrió a 0ºC, la neutralización con ácido cítrico acuoso al 10% (16,0 ml, 40,6 mmol) proporcionó un precipitado, que se lavó con H_{2}O y se secó para proporcionar el compuesto 5-1 (1,88 g, 82%)) HPLC-EM (CI) m/z 604,1, 606,1 (MH^{+}), t_{R} = 2,511 (procedimiento 4), t_{R} = 26,98 (procedimiento 5).
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior.
24 
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25 
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Ejemplo 6 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 
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26 
\newpage
Etapa 6A
Preparación del compuesto metil (2-clorofenil)acetato 6a
Al ácido 2-clorofenilacético (1,04 g, 6 mmol) en meOH (25 ml) se añadió ácido sulfúrico (6 gotas) y la solución se puso a reflujo durante 16 horas. Después de la concentración, se recogió el residuo en acetato de etilo y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado, H_{2}O y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar metil (2-clorofenil)acetato 6a (1,08 g, 97,5%) en forma de aceite amarillento. GCEM (EI) m/z 184, 186 (M^{+}).
Etapa 6B
Preparación del compuesto metil 2-(2-clorofenil)-(dimetil-amino)acrilato 6b
27
Se puso a reflujo una solución de metil (2-clorofenil)acetato 6a (1,08 g, 5,85 mmol) en DMFDMA (10 ml, 70,8 mmol) durante 16 horas. Después de la evaporación, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/3 a ½ para proporcionar en primer lugar metil (2-clorofenil)acetato no reaccionado 6a (0,67 g, 62%) y a continuación metil 2-2clorofenil)-3-(dimetil-amino)acrilato 6b (0,38 g, 27%; 71% basado en el material de partida recuperado) en forma de jarabe incoloro. EM (CI) m/z 240,2, 242,2 (MH^{+}).
Etapa 6C
Preparación de 5-(2-clorofenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6c
A una mezcla de metil 2-(2-clorofenil)-3-(dimetil-amino)acrilato 6b (0,26 g, 1,08 mmol) urea (0,2 g, 3,26 mmol) y Nal (0,49 g, 3,26 mmol) en acetonitrilo (5 ml) se añadió TMSCI (0,41 ml, 3,26 mmol). La mezcla resultante se puso a reflujo durante 16 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió NaOH 1,0 M (8 ml). La solución resultante se agitó durante 20 horas y se eliminó a vacío acetonitrilo. L solución acuosa se lavó con éter, se enfrió en baño de hielo y se neutralizó con HCl 1 N (8 ml). El precipitado se filtró, lavó con H_{2}O adicional, y se secó para proporcionar 5-(2-clorofenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6c (0,16 g, 66%) en forma de sólido blanco. EM (CI) m/z 222,9, 224,9 (MH^{+}).
Etapa 6D
Preparación de 5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6d
A una suspensión de 5-(2-clorofenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6c (0,16 g, 0,72 mmol) en acetonitrilo (5 ml) se añadió bis(trimetilsilil(acetamida (0,36 ml, 1,44 mmol), y la solución resultante se puso a reflujo durante 1,5 horas. Después de enriarse a temperatura ambiente, se añadió bromuro de 2-fluoro-3-trifluorometilbencilo (0,22 g, 0,86 mmol), y se reanudó el reflujo durante 16 horas. La reacción se inactivó añadiendo MeOH (5 ml) y se agitó durante dos joras. Después de la concentración, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/1 para proporcionar 5-(2-clorofenil)-1-[fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6d (0,25 g, 87%) en forma de sólido blanco. EM (CI) m/z 398,9, 400,9 (MH^{+}).
Etapa 6E
Preparación de 3-[2(R)-{tercbutoxicarbonil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6e
Una mezcla de 5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6d (125 mg,
0,32 mmol), K_{2}CO_{3} (130 mg, 0,96 mmol) y N-(t-butoxicarbonil)-D-\alpha-fenilglicinol mesilato (0,2 g, 0,64 mmol) en DMF (3 ml) se calentó a 75ºC durante 16 horas. La reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con H_{2}O y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 2/2 para proporcionar el compuesto 6e (144 mg, 74%) EM (CI) m/z 518,0, 520,0 (MH^{+}-Boc).
Etapa 6F
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4 (1H,3H)-diona 6f
A una solución del compuesto 6e (0,144 g, 0,23 mmol) en DCM (1 ml) se añadió TFA (0,5 ml, 6,5 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de la concentración, el residuo se recogió en DCM y se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado. La fase acuosa se extrajo con DCM_{.} Las orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron para proporcionar el compuesto 6f (0,12 g). EM (CI) m/z 518,0, 520,1 (MH^{+}).
Etapa 6G
Preparación de 3-[2(R)-hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil) bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 6-1
Una solución del compuesto 6f (0,1 g, 0,19 mmol) y semialdehído succínico (155 en peso de la solución en agua; 0,13 ml, 0,21 mmol) en MeCN se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió complejo de borano piridina ((8 M; 72 \mul) y se agitó durante 16 horas. Después de la concentración se purificó en primer lugar sobre una placa TLC preparativa, y a continuación por LCEM preparativo para proporcionar el compuesto 6-1.HPLC- EM (CI) m/z 604,1, 606,1 (MH^{+}). t_{R} = 26,98 (procedimiento 5), t_{R} = 2,511 (procedimiento 4).
Ejemplo 7 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona
28
Etapa 7A
Preparación de 2-cloro-3-metoxibenzaldehído 7a
A una suspensión de 3-hidroxibenzaldehído (0,12 g, 160 mmol) en HOAC (40 ml) se añadió cuidadosamente tBuOCI (20 ml, 176 mmol) con agitación. La reacción se volvió una solución transparente y fuertemente exotérmica. Se dejó enfriar y se agitó durante 16 horas, dando como resultado un precipitado blanco. El sólido se filtró, se lavó con H_{2}O y se secó para obtener 2-cloro-3-hidroxibenzaldehído (13,77 g, 55%), GCEM (EI) m/z 156 (M^{+}).
A una solución de 2-cloro-3-metoxibenzaldehído (4,55 g, 29 mmol) en DMF (30 ml) se añadió K_{2}CO_{3} (4,8 g, 34,9 mmol) seguido de Mel (2,7 ml, 43,6 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de la concentración a vacio, se recogió el residuo en acetato de etilo, se lavó con H_{2}O, salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentró. La purificación por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/5 proporcionó 2-cloro-3-metoxibenzaldehído 7a (4,68 g, 94%) en forma de aceite incoloro, que se solidificó al detenerse GCEM (EI) m/z 170, 172 (M^{+}).
Etapa 7B
Preparación de 2-cloro-1-metoxi-3-[2-(metilsulfonil)-2-(metilsulfinil)vinil]benceno 7b
A una solución de 2-cloro-3-metoxibenzaldehído 7a (4,65 g, 27,3 mmol) y metil (metiltio)metil sulfoxido (4,34 ml, 43,9 mmol) en THF (25 ml) se añadió una solución metanólica al 40% de Triton B (6,2 ml, 13,6 mmol) y la solución resultante se puso a reflujo durante 16 horas. Después de eliminar el THF, el residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, H_{2}O y salmuera, a continuación se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentró. La purificación por cromatografía de columna sobre gel de sílice con diclorometano proporcionó 2-cloro-1-metoxi-3-[2-(metilsulfonil)-2-metilsulfinil)vinil]benceno 7b (3,61 g, 48%) en forma de aceite amarillo. GCEM (EI) m/z 225, (M^{+}-CI-16), 210, (M^{+}-CI-OMe).
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Etapa 7C
Preparación de etil (2-cloro-3-metoxifenil)acetato 7c
A una solución de 2-cloro-1-metoxi-3-[2-(metilsulfonil)-2-(metilsulfinil)vinil]benceno 7b (3,58 g, 12,9 mmol) en etanol (20 ml) se añadió una solución etanólica 5 M de HCl (5,2 ml) y la solución resultante se puso a reflujo durante 3 horas. Después de la evaporación, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con diclorometano para proporcionar etil (2-cloro-3-metoxifenil)acetato 7c (2,78 g, 94%) en forma de aceite amarillo. GCEM (EI) m/z 228, 230, (M^{+}).
Etapa 7D
Preparación de etil 2-(2-cloro-3-metoxifenil)-3-(dimetil-amino)acrilato 7d
Una solución de etil (2-cloro-3-metoxifenil)acetato 7c (2,78 g, 12 mmol) en DMFDMA (16 ml, 120 mmol) se puso a reflujo durante 16 horas. Después de la evaporación el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos ½ a 1/1 para proporcionar etil (2-cloro-3-metoxifenil)acetato sin reaccionar 7c (1,8 g, 65%) en primer lugar y a continuación de etil 2-(2-cloro-3-metoxifenil)-3-(dimetil-amino)acrilato 7d (1,1 g, 32%; 90% basado en material de partida recuperado) en forma de jarabe amarillo. EM (CI) m/z 284,0, 286,0 (MH^{+}).
Etapa 7E
Preparación de 5-(2-cloro-3-metoxifenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7e
A una mezcla de etil 2-(2-cloro-3-metoxifenil)-3-(dimetil-amino)acrilato 7d (1,7 g, 6 mmol), urea (1,08 g, 18 mmol) y Nal (2,7 g, 18 mmol) en acetonitrilo (20 ml) se añadió TMSCI (2,3 ml, 18 mmol). La mezcla resultante se puso a reflujo durante 16 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió NaOH 1,0 M (30 ml). La solución resultante se agitó durante 20 horas y se eliminó a vacío acetonitrilo. La solución acuosa se lavó con éter, se enfrió en baño de hielo y se neutralizó con HCl 1 N (30 ml). El precipitado se filtró, lavó con H_{2}O adicional, y se secó para proporcionar 5-(2-cloro-3-metoxifenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7e (1,24 g, 82%) en forma de sólido amarillo pálido. EM (CI) m/z 253,1, 255,1 (MH^{+}).
Etapa 7F
Preparación de 5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7f
A una suspensión de 5-(2-cloro-3-metoxifenil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7e (2,2 g, 8,7 mmol) en acetonitrilo (25 ml) se añadió bis(trimetilsilil(acetamida (4,3 ml, 17,4 mmol), y la solución resultante se puso a reflujo durante 1,5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se añadió bromuro de 2-fluoro-3-trifluorometilbencilo (2,7 g, 10,5 mmol), y se reanudó el reflujo durante 16 horas. La reacción se inactivó añadiendo MeOH (25 ml) y se agitó durante dos horas. Después de la concentración, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/1 para proporcionar 5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7f (3,3 g, 88%) en forma de sólido blanco. EM (CI) m/z 429,0, 431,0 (MH^{+}).
Etapa 7G
Preparación de 3-[2(R)-{tercbutoxicarbonil-amino}-2-fenil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorome- til)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7g
Una mezcla de 5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7f (75 mg, 0,175 mmol), K_{2}CO_{3} (72 mg, 0,525 mmol) y N-(t-butoxicarbonil)-D-\alpha-fenilglicinol mesilato (0,11 g, 0,35 mmol) en DMF (2 ml) se calentó a 75ºC durante 16 horas. La reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con H_{2}O y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 2/3 para proporcionar el compuesto 7g (82 mg, 72%) en forma de sólido blanco. EM (CI) m/z 548,0, 550,0 (MH^{+}-Boc).
Etapa 7H
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7h
El compuesto 7g (2,7 g, 4,2 mmol) se disolvió en acetonitrilo (10 ml) y se añadió TFA (14 ml, 175 mmol)d, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4,5 horas. Después de la concentración, el residuo se recogió en DCM y se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado. La fase acuosa se extrajo con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron para proporcionar el compuesto 7h (2,2 g, 96%). EM (CI) m/z 548,0, 550,0 (MH^{+}).
Se preparó 3-[2(R)-lamino-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-
diona 7h.1. por sustitución del material de partida apropiado usando los procedimientos anteriormente proporcionados.
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Etapa 7I
Preparación de 3-[2(R)-{etoxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri- fluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7i
A una solución del compuesto 7h (2,0 g, 3,65 mmol) en DMF (8 ml) se añadió Na_{2}CO_{3} (0,47 g, 4,38 mmol) seguido de etil 4-bromobutirato (0,83 ,l, 5,48 mmol) La mezcla se calentó a 95ºC durante 1,5 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se dividió entre acetato de etilo y H_{23}O. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos/trietilamina 500/500/5 para proporcionar el compuesto 7i (1,29 g) en forma de sólido blanco. EM (CI) m/z 662,2, 664,2 (MH^{+}).
Etapa 7J
Preparación de 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri- fluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7-1
Al compuesto 7i (0,7 g, 1,06 mmol) se añadió THF (6 ml) seguido de NaOH (0,157 g, 4, 24 mmol). La mezcla se agita 50ºC durante 16 horas. Se eliminó el THF a vacío, la solución acuosa se lavó con éter, y se enfrió a 0ºC. La neutralización con ácido cítrico acuoso al 5% (6,0 ml, 4,7 mmol) proporcionó un precipitado, que se recogió y se purificó, además, por cromatografía de columna sobre gel de sílice con MeOH/DCM/trietilamina 8/100/2 para proporcionar el compuesto 7-1 (0,56 g, 84%) en forma de sólido blanco. HPLC- EM (CI) m/z 634,2, 636,2 (MH^{+}). t_{R} = 24,925 (procedimiento 5).
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Ejemplo 8 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)ben- cil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 
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29 
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Etapa 8A
Preparación de 3-[2(R)-{terc-butoxicarbonil-amino}-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(tri- fluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 8a
A una solución de N,(t-butiloxicarbonil)-D-\alpha-leucinol (1,21 g, 5,57 mmol) en piridina (6 ml) se añadió cloruro de tosilo (1,6 g, 8,35 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, se diluyó con EtOAc, y se lavó secuencialmente con HCl 1 N, H_{2}O NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se concentró y se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/3 para proporcionar éster de [3-metil-1-[[[(4-metilfenil)sulfonil]oxi]metil]butil]-1,1-dimetiletil carbámico (1,66 g, 80%), EM (CI) m/z 272,2 (MH^{+}-Boc).
Una mezcla de 5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 7f (56 mg, 0,13 mmol), K_{2}CO_{3} (754 mg, 0,39 mmol) y éster de [3-metil-1-[[[(4-metilfenil)sulfonil]oxi]metil]butil]-1,1-dimetiletil carbámico (97 mg, 0,26 mmol) en DMF (2 ml) se calentó a 95ºC durante 16 horas. La reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con H_{2}O y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos 1/1 para proporcionar éster de [3-metil-1-[[[(4-metilfenil)sulfonil]oxi]metil]butil]-1,1-dimetiletil carbámico (30 mg, 54%) y el compuesto 8a (30 mg, 37%), EM (CI) m/z 528,0, 530,0 (MH^{+}-Boc).
\newpage
Etapa 8B
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 8b
A una solución de compuesto 8a (30 mg, 0,048 mmol) en DCM (1 ml) se añadió TFA (0,1 ml, 1,3 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de la concentración, el residuo se recogió en DCM y se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado. La fase acuosa se extrajo con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron para proporcionar 8b. EM (CI) m/z 528,0, 530,0 (MH^{+}).
Etapa 8C
Preparación de 3-[2(R)-{etoxicarbonilpropil-amino}-1-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6- (trifluorometil)bencil]midina-2,4(1H,3H)-diona 8c
A una solución de compuesto 8b (25 mg, 0,048 mmol) en DCM (1 ml) se añadió K_{2}CO_{3} (21 mg, 0,15 mmol) seguido de etil 4-bromobutirato (0,015 ml, 0,1 mmol). La mezcla se calentó a 95ºC durante 16 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se dividió entre acetato de etilo y H_{2}O. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos/trietilamina 500/500/5 para proporcionar el compuesto 8c, EM (CI) m/z 642,2, 644,2 (MH^{+}).
Etapa 8D
Preparación de 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6- (trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 8-1
Al compuesto 8c(10 mg, 0,016 mmol) se añadió THF (0,3 ml) y H_{2}O (0,3 ml) seguido de NaOH (6,4 mg, 0,16 mmol). La mezcla se agitó a 50ºC durante 16 horas, y se purificó por LCEN preparativo para proporcionar el compuesto 8-1, EM (CI) m/z 614,1, 616,1 (MH^{+}), t_{R} = 6,550 min (procedimiento 6).
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Ejemplo 9 3-[2(R)-{2-[1-(5-tetrazoil)propil]amino}2-feniletil]5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 
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30 
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Etapa 9A
Preparación de 3-[2(R)-{2-[3-cianopropil]-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 9a
Una solución de 7h.1 (2,59 g, 5 mmol) en CH_{3}CN (25 ml) se añadió amina de diisopropiletilo (2,61 ml, 15 mmol), seguido de la adición de 4.bromobutironitrilo (2,22 ml, 15 mmol). La mezcla de reacción se puso a reflujo durante 16 horas. Los volátiles se evaporaron y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (sílice, MeOH al 4%/CH_{2}Cl_{2}) para proporcionar el compuesto 9a (2,62 g, 95,5%). EM (CI) m/z 549,1, (MH^{+}).
\newpage
Etapa 9B
Preparación de 3-[2(R)-{2-[5-tetrazoilpronil]-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluoroben- cil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 9-1
A una solución de 9a (274 mg, 0,5 mmol) en DMF (5 ml) se añadió azida de sodio (97 mg, 1,5 mmol) y cloruro de amonio (120 mg, 2,25 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110ºC durante 12 horas. La mezcla se enfrió, se dividió entre EtOAc y NaHCO_{3}/agua, se lavó con salmuera, se secó (sulfato de sodio) y se evaporó. el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (sílice, MeOH al 6%/CH_{2}Cl_{2}) para proporcionar el compuesto 9-1 (52 mg, 17,6%).HPLC-EM (CI) m/z 592,3, (MH^{+}), t_{R} = 2,150 (procedimiento 4).
Ejemplo 10 3-[2(R)-amino-2-feniletil]5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H, 3H)-diona
31
Etapa 10A
Preparación de 3-[2(R)-tercbutoxicarbonil-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2,6-difluorobencil]- 6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 10a
A una solución de compuesto 1f-1 (28 g, 56 mmol) en diclorometano (200 ml) se añadió una solución de di-terc-butildicarbonato (12 g, 56 mmol) en diclorometano (100 ml) gota a gota a través de un embudo de adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a vacío para producir el producto deseado 10a en forma de un sólido amarillo claro (33 g, 56 mmol, 100%). HPLC-EM (CI) m/z 496,1 (M+H^{+}-Boc), t_{R} = 3,052 (procedimiento 4).
Etapa 10B
Preparación de 3-[2(R)-tercbutoxicarbonil-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metiltio- bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 10b
A una solución de compuesto 10a (33 g, 56 mmol) en DMSO seco (100 ml) se añadió tiometoxido de sodio (4,0 g, 56 mmol) en nitrógeno). La mezcla de reacción se calentó a 100ºC bajo nitrógeno durante 1 hora. Se añadió otro equivalente de 0,28 de tiometoxido de sodio (1,1 g, 16 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a 100ºC bajo nitrógeno durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió y se dividió entre etil éter y agua. La fase orgánica se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada, se secó con sulfato de sodio, se filtro y se concentró. El producto bruto se purificó con una cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluido con acetato de etilo al 50% en hexano para producir el compuesto 10b en forma de un sólido amarillo pálido (27 g, 44 mmol, 78%). HPLC-EM (CI) m/z 524,1(M+H^{+}-Boc), t_{R} = 3,134 (procedimiento 4). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 1,38 (s, 9H), 2,07 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 4,07 - 4,13 (m, 1H), 4,29 - 4,39 (m, 1H), 5,30 - 5,53 (m, 2H), 5,79 - 5,85 (m, 1H), 6,80 - 6,91 (m, 2H), 6,70 (dd, 1H), 7,06 - 7,15 (m, 2H), 7,22 - 7,41 (m, 6H).
Etapa 10C
Preparación de 3-[2(R)-tercbutoxicarbonil-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 10c
A una solución de compuesto 10b (27 g, 44 mmol) en diclorometano anhidro (400 ml) se añadió ácido 3-cloroperoxibenzoico (mCPBA, 30 g, 180 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se dividió entre diclorometano y agua. La fase orgánica se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada y salmuera, se secó con sulfato de sodio, se filtro y se concentró. El producto bruto se purificó con una cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyéndose con acetato de etilo al 50% en hexano para producir el compuesto de producto deseado 10c en forma de un sólido amarillo pálido (15 g, 24 mmol, 53%). HPLC-EM (CI) m/z 556,0 (M+H^{+}-Boc), t_{R} = 2,941 (procedimiento 4). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 1,38 (s, 9H), 2,27 (s ancho, 3H), 3,48 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 4,01 - 4,15 (m, 1H), 4,24 - 4,40 (m, 1H), 4,95 - 5,05 (m, 1H), 5,58 - 5,68 (m, 2H), 6,85 - 6,91 (dd, 1H), 7,02 (dd, 1H), 7,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,19 - 7,55 (m, 7H), 7,97 (d, J = 7,6 Hz, 1H).
Etapa 10D
Preparación de 3-[2(R)-amino-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6-metil- pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 10-1
A una solución de compuesto 10c (10 g, 15 mmol) en diclorometano anhidro (60 ml) se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 16 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró y se dividió entre acetato de etilo y solución de NaOH acuosa diluida. La fase orgánica se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada y salmuera, se secó con sulfato de sodio, se filtro y se concentró para producir 10-1 en forma de un sólido de color canela (8,0 g, 14 mmol, 94%) HPLC-EM (CI) m/z 556,2 (M+H^{+}), t_{R} = 2,354 (procedimiento 4).) ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 2,25 (s, 3H), 3,42 (s, 1,5H), 3,91 (s, 1,5H), 3,92 (s, 1,5H), 3,98 - 4,22 (m, 2H), 4,33 - 4,38 (m, 1H), 5,60 (s ancho, 2H), 6,80 - 6,89 (m, 1H), 6,80 - 6,89 (m, 1H), 6,97 - 7,03 (m, 1H), 7,11 - 7,17 (m, 1H), /,22 - 7,37 (m, 6H), 7,46 - 7,54 (m, 1H), 7,95 (dd, 1H).
Ejemplo 11 3-[2(R)-{2-[1-(5-tetrazoil)propil]amino}-2-feniletil]5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6- metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona
32
Etapa 11A
Preparación de 5,5'-[2,4,8,10-tetraoxaspiro[5,5]undecano-3,9-diilbis(etano-2,2-diil)]bis-1H-tetrazol
33
Se suspendieron 3,9-bis(2-cianoetil)-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5,5]undecano (5,38 g, 20 mmol), azidotrimetilsilano (10,6 ml, 80 mmol) y óxido de estaño de dibutilo (2,48 g, 4 mmol) en 40 ml de tolueno y 40 ml de dioxano y se calentó a reflujo durante 18 horas. Ka reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con 100 ml de hexano. El precipitado sólido se recogió, se lavó con hexano (2 x 30 ml) y se seco al aire. El sólido se suspendió en 100 ml de solución de carbonato sódico al 5%, se añadió suficiente acetato de etilo para disolver la mayor parte del sólido, y la mezcla se agitó durante 1 hora. Las fases se separaron, la fase acuosa se lavó con acetato de etilo (2 x 100 ml), y las fases orgánicas se volvieron a extraer con carbonato sódico al 5% (1 x 50 ml). Las fases acuosas se combinaron, se acidificaron a pH 7 con ácido clorhídrico concentrado, se filtro a través de Celite, y se acidificó a pH 3. Se recogió el sólido, se lavó con agua (2 x 50 ml) y acetona (2 x 50 ml) y se secó a vacío para proporcionar 5,5'-[2,4,8,10-tetraoxaspiro[5,5]undecano-3,9-diilbis(etano-2,2-diil)]bis-1H-tetrazol 11a (4,71 g, 67%). ^{1}H NMR (300 MHz, DNSO-d_{6}) \delta 4,56 (t, 2H, J = 5 Hz), 4,28 (dd, 2H, J = 9, 2 Hz), 3,58 (d, 2H, J = 11 Hz), 3,57 (dd, 2H, J = 11,25 Hz), 3,36 (d, 2H, J = 11Hz), 2,94 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,97 (dt, 4H, J = 8, 4 Hz).
Etapa 11B
Preparación de 3-[2(R)-{2-[1-(5-tetrazoil)propil]-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona 11-1
Se suspendieron una muestra de 25 mg de 5,5'-[2,4,8,10-tetraoxaspiro[5,5]undecano-3,9-diilbis(etano-2,2-diil)]bis-1H-tetrazol 11a (70 \mumol) y ácido p-toluenosulfónico (20 mg, 100 \mumol) en 1 ml de agua y se calentó a 80ºC durante 18 horas. La solución se enfrió y se añadió al compuesto 10-1 (20 mg, 50 \mumol) disuelto en 1 ml de etanol y 17 ul de trietilamina (100 \mumol). A continuación se añadió el complejo de borano-piridina (24 \mul, 240 \mumol) y la mezcla se agitó 0,24 horas hasta que cesó el borboteo. Los volátiles se eliminaron y el residuo se recogió en 2 ml de acetato de etilo y se lavó con agua (1 x 0,5 ml). La fase de acetato de etilo se evaporó y se purificó por LC/EM preparativa para proporcionar 11-1 (5 mg, rendimiento del 12%).
Los siguientes compuestos se sintetizaron según el procedimiento anterior.
34 
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35

Claims (51)

1. Compuesto que tiene la siguiente estructura
36
o un esteroisómero, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
en la cual:
\quad
R_{1a}, R_{1b} y R_{1c} son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxi o alcoxi, o R_{1a} y R_{1b} tomados juntos forman -OCH_{2}O- o -OCH_{2}CH_{2}-;
\quad
R_{2a} y R_{2b} son idénticos o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, trifluorometilo, ciano o -SO_{2}CH_{3};
\quad
R_{3} es hidrógeno o metilo;
\quad
R_{4} es fenilo o alquilo C_{3-7};
\quad
R_{5} es hidrógeno o alquilo C_{1-4};
\quad
R_{6} es -COOH o un isóstero de ácido; y
\quad
X es alcanodiilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo C_{1-6}.
en el cual "Isóstero de ácido" significa un resto seleccionado entre tetrazol, 3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona, [1,2,4]-oxadiazol-3-ona, 1,2-dihidro-[1,2,4]-triazol-3-ona, 2H-[1,2,4]-oxadiazol-5-ona, triazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, imidazol sustituido con un grupo sulfonilo o sulfoxido, [1,2,4]-oxadiazolidina-3,5-diona, [1,2,4]-tiadiazolidina-3,5-diona, imidazolidina-2,4-diona, imidazolidina-2,4,5-triona, pirrolidina-2,5-diona y pirrolidina-2,3,5-triona, y -C(=O)NHSO_{2}NR_{a}R_{b}, -C(=O)NHSO_{2}R_{b}, -C(=O)NHC(=O)NR_{a}R_{b} y -C(=O)NHC(=O)R_{b}, donde R_{a} es hidrógeno o alquilo C_{1-4} y R_{b} es alquilo C_{1-4}.
2. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{1a} es halógeno.
3. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{1b} es alcoxi.
4. Compuesto según la reivindicación 3 en el cual R_{1b} es metoxi.
5. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{1c} es halógeno.
6. Compuesto según la reivindicación 5 en el cual R_{1c} es fluoro o cloro.
7. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{2a} es halógeno.
8. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{2a} es hidrógeno, halógeno -SO_{2}CH_{3}.
9. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{3} es hidrógeno.
10. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{3} es metilo.
11. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{4} es fenilo.
12. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{4} es alquilo C_{3-7}.
13. Compuesto según la reivindicación 12 en el cual alquilo C_{3-7} es ciclopentilo o ciclohexilo.
14. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{5} es H o metilo.
15. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{6} es -COOH.
16. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual R_{6} es isóstero de ácido.
17. Compuesto según la reivindicación 16 en el cual el isóstero de ácido es tetrazol-5-ilo.
18. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual X es alcanediilo C_{1-6} de cadena lineal.
19. Compuesto según la reivindicación 18 en el cual el alcanediilo C_{1-6} de cadena lineal es -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-.
20. Compuesto según la reivindicación 19 en el cual el R_{4} es fenilo.
21. Compuesto según la reivindicación 20 en el cual el R_{1a} y R_{2b} son halógeno.
22. Compuesto según la reivindicación 21 en el cual el R_{3} es metilo.
23. Compuesto según la reivindicación 21 en el cual el R_{3} es hidrógeno.
24. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual X es alcanediilo C_{1-6} de cadena ramificada.
25. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual el compuesto es 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(3-isopropilfenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-(ciclohexil)etil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-
fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-6-metil-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona, o 3-[2(R)-{2-[1-(5-tetrazoil)propil]-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-metilsulfonilbencil]-6-metil-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona.
26. Compuesto según la reivindicación 1 en el cual el compuesto es 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonil-
propil-amino}-2-feniletil]-5-(2-fluoro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4((1H,3H)-
diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-cloro-3-metilfenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)ben-
cil]-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-clorofenil)-1-[2-fluoro-6-(metilsulfonil)bencil]-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona, 3-[2(R)-{hidroxicarbonilpropil-amino}-2-feniletil]-5-(2-cloro-
3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4((1H,3H)-diona, o 3-[2(R)-{hidroxicarbonil-propil-
amino}-2-(isobutil)etil]-5-(2-cloro-3-metoxifenil)-1-[2-fluoro-6-(trifluorometil)bencil]-pirimidina-2,4((1H, 3H)-diona.
27. Compuesto según la reivindicación 15, en el cual R_{1a} es halógeno y R_{1b} es alcoxi.
28. Compuesto según la reivindicación 27, en el cual R_{2a} es halógeno y R_{2b} es halógeno o trifluorometilo.
29. Compuesto según la reivindicación 28, en el cual R_{3} es metilo.
30. Compuesto según la reivindicación 15, en el cual X es alcanediilo C_{1-6} de cadena lineal.
31. Compuesto según la reivindicación 30, en el cual R_{4} es fenilo; ciclohexilo o ciclopentilo.
32. Compuesto según la reivindicación 31, en el cual R_{5} es hidrógeno o metilo.
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33. Compuesto según la reivindicación 15 en el cual:
R_{1a} es halógeno;
R_{1b} es alcoxi,
R_{2a} es halógeno
R_{2b} es halógeno o trifluorometilo;
R_{3} es metilo; y
X es alcanediilo C_{1-6} de cadena lineal.
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34. Compuesto según la reivindicación 16 en el cual:
R_{1a} es halógeno;
R_{1b} es alcoxi,
R_{2a} es halógeno
R_{2b} es halógeno o trifluorometilo;
R_{3} es metilo; y
X es alcanediilo C_{1-6} de cadena lineal.
\vskip1.000000\baselineskip
35. Compuesto según la reivindicación 33, en el cual R_{4} es fenilo, ciclohexilo o ciclopentilo, y R_{5} es hidrógeno.
36. Compuesto según la reivindicación 35, en el cual R_{1b} es metoxi, R_{2a} es fluoro y R_{2b} es trifluorometilo.
37. Compuesto según la reivindicación 36, en el cual X es (-CH_{2}CH_{2}CH_{2})-.
38. Compuesto según la reivindicación 36, en el cual R_{4} es fenilo.
39. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 15, 25, 26, 32, 33, 34 y 38 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
40. Uso de una cantidad efectiva de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 15, 25, 26, 32, 33, 34 y 38 o una composición farmacéutica según la reivindicación 39 para la preparación de un medicamento para antagonizar la hormona de liberación de gonadotropina en un sujeto que lo necesita.
41. Uso de una cantidad efectiva de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 15, 25, 26, 32, 33, 34 y 38 o una composición farmacéutica según la reivindicación 39 para la preparación de un medicamento para tratar una afección relacionada con las hormonas sexuales de un sujeto que lo necesita.
42. Uso según la reivindicación 41 en el cual la afección relacionada con las hormonas sexuales es cáncer, hipertrofia prostática benigna o mioma del útero.
43. Uso según la reivindicación 42 en el cual el cáncer es cáncer prostático, cáncer de útero, cáncer de pecho o adenomas gonadotropos pituitarios.
44. Uso según la reivindicación 43 en el cual el cáncer es cáncer prostático.
45. Uso según la reivindicación 41 en el cual la afección relacionada con las hormonas sexuales es endometriosis, enfermedad de los ovarios policísticos, fibroides uterinas o pubertad precoz.
46. Uso según la reivindicación 45 en el cual la afección relacionada con las hormonas sexuales es endometriosis.
47. Uso según la reivindicación 41 en el cual la afección relacionada con las hormonas sexuales es fibroides uterinas.
48. Uso de una cantidad efectiva de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 15, 25, 26, 32, 33, 34 y 38 o una composición farmacéutica según la reivindicación 39 para la preparación de un medicamento para tratar la infertilidad de un sujeto que lo necesita.
49. Uso de una cantidad efectiva de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 15, 25, 26, 32, 33, 34 y 38 o una composición farmacéutica según la reivindicación 39 para la preparación de un medicamento para tratar lupus eritematoso, síndrome de colon irritable, síndrome premenstrual, hirsutismo, baja estatura o trastornos del sueño de un sujeto que lo necesita.
50. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 en forma de sal de litio, sodio, potasio, magnesio y calcio.
51. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 en forma de sal de sodio.
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