UA124104C2 - Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування - Google Patents

Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA124104C2
UA124104C2 UAA201812547A UAA201812547A UA124104C2 UA 124104 C2 UA124104 C2 UA 124104C2 UA A201812547 A UAA201812547 A UA A201812547A UA A201812547 A UAA201812547 A UA A201812547A UA 124104 C2 UA124104 C2 UA 124104C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
tau protein
sequence under
Prior art date
Application number
UAA201812547A
Other languages
English (en)
Inventor
Ян Торлєіф Педерсен
Ян Торлеиф Педерсен
Крістіан Керґор
Кристиан Кергор
Ларс Естерґор Педерсен
Ларс Эстергор Педерсен
Айоджі Абдур-Рашид Асуні
Айоджи Абдур-Рашид Асуни
Ніна Хелен Росєнквіст
Нина Хелен Росенквист
Юстус Клаус Альфред Дехзель
Карстен Юхль
Лєна Таґмосє
Лена Тагмосе
Мауро Маріґо
Мауро Мариго
Томас Єнсен
Томас ЕНСЕН
Сьорен Хрістенсен
Сёрен Христенсен
Лоран Дейвід
Лоран Дейвид
Хрістіана Вольбрахт
Христиана Вольбрахт
Лоне Хелбо
Original Assignee
Х. Луннбек А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Х. Луннбек А/С filed Critical Х. Луннбек А/С
Publication of UA124104C2 publication Critical patent/UA124104C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Abstract

Винахід стосується моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з фосфорилованим сериновим залишком 396 в патологічному гіперфосфорилованому (PHF) тау-білку (pS396) з покращеною афінністю, а також їх застосування в лікуванні хвороби Альцгеймера і інших таупатій.

Description

Винахід стосується моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з фосфорилованим сериновим залишком 396 в патологічному гіперфосфорилованому (РНЕ) тау-білку (ре396) з покращеною афінністю, а також їх застосування в лікуванні хвороби Альцгеймера і інших таупатій.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до нового класу моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з фосфорилованим сериновим залишком 396 в патологічно гіперфосфорилованому (РНЕ) тау-білку (р5396), а також до способів застосування цих молекул і їх тау-зв'язувальних фрагментів в лікуванні хвороби Альцгеймера і таупатій.
Посилання на перелік послідовностей
Ця заявка містить один або декілька переліків послідовностей згідно з параграфами 1.821 і наступними розділу 37 СЕН, які розкриті на машинопрочитуваних носіях (назва файлу: 1049-
МО-РСТ РІМАЇ. 5725 І.М, створений 13 червня 2017 року і має розмір 65 кБ), при цьому даний файл включений в даний опис шляхом посилання у його повному обсязі.
Рівень техніки
Вікові нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Альцгеймера (АЮ) і деменція, в даний час є однією з найбільших суспільних проблем. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров'я вартість лікування осіб старшого віку продовжуватиме підвищуватися, і кількість діагностованих випадків деменції потроїться до 2050 року (М/опа Неайй Огоапігайоп апа АІ2нєїтег"5 бізеазе Іпіегпайопа!І-5іаїшев Вероп (2012) ОЕМЕМТІА: А рибіїс Неайй ргіогіу,
М/НО). Першими засобами лікування АО були модулятори вивільнення нейромедіаторів, такі як інгібітори ацетилхолінестерази, і модулятори ММОА-рецепторів. Ці терапевтичні засоби стали доступними на рубежі тисячоліть і як і раніше утворюють основу полегшення симптомів дефіцитів пам'яті, пов'язаних з деменцією і АЮ. Проте, ці лікарські засоби не впливають цілеспрямовано на першопричини АО - накопичення агрегатів В-амілоїдного (АВ) пептиду і тау- білка і асоційовану з ним втрату нейронних синапсів і нарешті нейронів.
Довгострокові широкомасштабні дослідження осіб старшого віку (М/єїпег, М.МУ. єї а! (2014)
АРМІ опіїпе: пир:/Лумли.айдпі-іпто.ого/; Вгеїеіег, М.М. еї аї. (1992) Меигоерідетіоіоду 11 Зиррі 1, 23- 28; І ашпег, 1.9). (1992) Мешйигоерідетіоіоду 11 Зиррі 1, 2-13) разом з крупними повногеномними дослідженнями асоціацій (І атрбенті, 9.0. еї аї. (2013) Маї. Сепеї. 45, 1452-1458) показали, що АЮ є неоднорідною комбінацією форм деменції, де до 10 відсотків пацієнтів із запущеною формою
Ар не мають патології амілоїдного пептиду (Стагу, У.Е. еїа!І. (2014) Асіа Мешйгораїної. 128, 755- 766). Додатково, фундаментальні патологоанатомічні дослідження, проведені Вгаак 5 Вгаак
Ко) (Вгаак, Н. апа Вгаак, Е. (1996) АстаМейгоЇ. Зсапа. Биррі 165, 3-12), продемонстрували чітку кореляцію між ступенем патології нейрофібрилярних клубків і когнітивним статусом перед розтином. Ці спостереження підкріплювалися декількома дослідниками (Ме!5оп, Р.Т. єї аї. (2012)
У. Мешигораїної. Ехр. Меийгої. 71, 362-381) і в недавніх довгострокових дослідженнях біомаркерів, які указують на те, що рівні тау-білка і фосфорилованого тау-білка в цереброспінальній рідині (С5Е) підвищуються впродовж ранніх і пізніх стадій захворювання (дасК, С.В., Ук. єї аї. (2013)
Ї апсеї Меишго!. 12, 207-216).
Як вказано вище, тау-білок, асоційований з мікротрубочками, і його гіперфосфорилований варіант утворюють основну складову внутріклітинних нейрофібрилярних клубків, які є однією з головних характерних особливостей АЮ. Додатково, певні варіанти гена тау-білка асоційовані з сімейними формами лобно-скроневої деменції (ЕТО). Поява патології тау-білюа при А відбувається відповідно до чітко вираженого просторового патерну, починаючи з енторинальної кори з подальшим переходом в гіпокампальні зони їі зони кори (Вгаак, Н. апа Вгаак, Е. (1996)
Асіа Мешгої. Зсапа. 5иррі 165, 3-12). Конкретна стадія патології тау-білка також добре корелює з когнітивними здатностями (Меїізоп, Р.Т. еїаІ. (2012) У. Мешигораїйо!ї. Ехр. Меийгої. 71, 362-381;
Вгаак, Е. єї а. (1999) Єиг. Агоен. Рзусніаїгу Сіїіп. Мешгозсі. 249 Зиррі 3, 14-22). Узяті разом, ці дані складають основу гіпотези, що спирається на те, що тау-білок грає певну роль в АЮ. Вона має на увазі, що внутріклітинне накопичення тау-білка приводить до руйнування мікротрубочок і колапсу дендритних шипиків. В результаті цього порушується комунікація між нейронами і наступає загибель клітин. Недавно також було показано, що тау-білок сам по собі може утворювати ендопатогенні молекули, які можуть сприяти розповсюдженню нейродегенерації від однієї клітини до наступної (Сіахадиега, ЕК. єї а). (2009) Маї. Сеї! Віої. 11, 909-913).
Ї. Тау-білок як ендопатоген
Сіамадиега і співавтори продемонстрували, що тау-білок сам по собі може діяти як ендопатоген (Сіаухадиега, Е. єї аї. (2009) Маї. Сеї! Віої. 11, 909-913). Екстракти головного мозку, отримувані при низькій швидкості центрифугування, виділяли з трансгенних по тау-білюку мишей
РЗО15 (Айеп, В. еї а!. (2002) У. Мешйговсі. 22, 9340-9351), розбавляли і ін'єктували в гіпокамп і зони кори молодих мишей АЇ 7217. Миші АЇ 217 є трансгенною по тау-білку лінією мишей, у яких розвивається тільки пізня патологія (Ргобвї, А. еї аі. (2000) Асіа Мешигораїної. 99, 469-481). У підданих ін'єкції мишей АЇ717 швидко розвивалася патологія щільних філаментів, і введення бо імуновиснажених екстрактів головного мозку від мишей РЗОЇ15 або екстрактів від мишей дикого типу не індукувало патологію тау-білка. Фракціонування екстрактів головного мозку на розчинний (51) і нерозчинний в саркозилі (РЗ) тау-білок (Запага, М. еї аї. (2013) У. АІ2Неітегв. рів. 33, 249-263) і їх ін'єкція мишам АЇ 717 продемонстрували, що фракція РЗ найбільшою мірою здатна індукувати патологію. Вона містить велику частину внутріклітинного гіперфосфорилованого філаментозного тау-білка. Патологію в більшості випадків також можна було індукувати при ін'єкції екстрактів РЗО15 в головний мозок мишей дикого типу, але МЕТ не утворювалися. У подальших дослідженнях Сіамадиеєга і співавтори показали, що людський тау- білок, екстрагований посмертно з тканини головного мозку з іншими таупатіями (хворобою аргірофільних зерен (АС), прогресуючим над'ядерним паралічем (РБ5Р) і кортикобазальною дегенерацією (СВО)), також може індукувати патологію тау-білка в моделі АЇ 717 (Сіаладиега, РЕ. еї аї. (2013) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. 0.5.А. 110, 9535-9540). З моменту представлення цих даних повідомлялося про деякі інші моделі затравлювальної дії і рознесення тау-білка (АНнтео, 7. вї аї. (2014) Асіа Мепйгораїної. 127, 667-683; МаїКег, І.С. еїаі. (2013) УАМА Мешгаї. 70, 304-310).
Основний висновок цих досліджень вказує на механізм, за допомогою якого патогенний тау- білок у внутріклітинних включеннях секретується з клітини в периплазматичний простір.
Матеріал патологічного тау-білка потім транспортується по оболонці синаптичних пухирців як в антероградному, так і в ретроградному напрямі і згодом поглинається сусідніми клітинами шляхом об'ємного ендоцитозу. Цей механізм пояснює, чому рознесення патології, спостережуване при захворюванні у людини, слідує чітко вираженому анатомічному патерну.
Вельми цікаво, що периферичне введення патологічного тау-білка може прискорювати формування патології тау-білка у мишей АЇ 717 (Сіамадиега, РЕ. єї а). (2014) Асіа Меигораїної. 127, 299-301). Цей механізм рознесення може пояснювати розповсюдження захворювання при інших протеїнопатіях (Соеєдей, М. еї аї. (2010) Ттепав Мешцгозсі. 33, 317-325; Зідигаввоп, Е.М. єї а!. (2002) Ттепаз Мої. Мед. 8,411-413).
ЇЇ. Молекули тау-білка
Виявлення того, що тау-білок може діяти як ендопатоген, спонукало до пошуку "патогенних молекул", на які можна було б цілеспрямовано впливати в рамках потенційних методів інтервенційної терапії.
Ген тау-білка, що асоціюється з мікротрубочками (МАРТ), розташований в хромосомі 17
Зо людського генома і експресує шість ізоформ тау-білка в головному мозку дорослої людини. Ці ізоформи утворюються в результаті альтернативного сплайсингу екзонів 2, З і 10 з 16 екзонів в гені МАРТ. Екзони 2 і З експресують повтор з 29 амінокислот, а екзон 10 експресує додатковий домен, що зв'язується з мікротрубочками. В результаті цього ізоформи тау-білка міститимуть 0, 1 або 2 М-кінцеві повтори і З або 4 С-кінцеві домени, що зв'язуються з мікротрубочками (тау- білок ЗА або 4Н). Зазвичай експресуються шість ізоформ тау-білка. Найбільш довга (2М4Е) і найбільш коротка (ОМЗЕ) ізоформи складаються з 441 і 352 амінокислот, відповідно (Коїагома,
М. еї аї. (2012) Іпі. У. АІ2Неїтегв. Оів. 2012, 731526). М-кінцевий виступаючий домен тау-білка (2М48В8) складається з багатого гліцином "хвоста" з 44 амінокислот і залишків 45-102, що охоплюють дві висококислі ділянки (М1, М2-домени). У залишках 151-243 виявлено дві ділянки, багаті проліном (РІ, Р2-домени). Решту білка складають чотири домени, що зв'язуються з мікротрубочками (АВ1-В4), за якими розташована коротка С-кінцева ділянка.
Тау-білок є розчинним і високолабільним стосовно фосфорилування білком. Приблизно 20 відсотків або 85 амінокислотних залишків в найбільш довгій ізоформі тау-білка є потенційними (бег, ТНг або Туг) сайтами фосфорилування. Експериментально спостерігалося, що приблизно половина з них фосфорилюється (Напдег, О.Р. еї аІ. (2009) Ттепа5 Мої. Мей. 15, 112-119;
Назедамжа, М. еї аї. (1992) 9. Віої. Спет. 267, 17047-17054), і що сайти фосфорилування групуються навколо кінцевих залишків доменів, що зв'язуються з мікротрубочками. Тау-білок піддається динамічному фосфорилуванню і дефосфорилуванню в ході клітинного циклу. Він повинен дисоціювати від мікротрубочок, щоб забезпечити проходження мітозу. Його головною роллю в постмітотичних клітинах (диференційованих нейронах) є дія як стабілізатора мікротрубочок, що забезпечує оптимальний аксональний транспорт. Він може асоціюватися з мікротрубочками тільки в своїй головним чином дефосфорилованій формі, тому фосфорилування виступає як безпосередній перемикач асоціації з мікротрубочками/дисоціації від мікротрубочок в нейроні. За нормальних умов цитозольний тау-білок в середньому містить два фосфориловані сайти. У матеріалі парних спіральних філаментів щонайменше 7-8 сайтів є фосфорилованими (Напоег", О.Р. єї а! (2009) Ттепа5 Мої. Мед. 15, 112-119; Назедама, М. еї аї. (1992) У. Вісі. Спет. 267, 17047-17054). Парні спіральні філаменти гіперфосфорилованого тау- білка є ключовою характерною особливістю хвороби Альцгеймера (Козвік еї. аІ. (1986) РМАБ, 86, 4044-4048), в імуноцитохімічному аналізі матеріалу головного мозку людини з Ар бо спостерігається чітко виражена зміна рухливості гіперфосфорилованого тау-білка.
Дослідження тау-більа за допомогою традиційних структурних методик, таких як рентгенівська кристалографія або ЯМР-спектроскопія, було важким, що відображає його метастабільну природу. Такі дослідження проводилися головним чином стосовно фрагментів доменів нефосфорилованого білка. Єдине до теперішнього часу структурне дослідження повнорозмірного тау-білка (2М4А) за допомогою ЯМР-спектроскопії виявило, що білок містить тільки рідкі фрагменти стабільної вторинної структури (МиКгазси, М.О. еї а). (2009) Рі о5. Віо). 7, е34). Цей аналіз указує на те, що вторинна структура пептидного остову має високу схильність приймати структуру В-аркуша. Перші 200 залишків остову є значно більш впорядкованими, ніж
С-кінець, що охоплює домени, що зв'язуються з мікротрубочками. Наявність великої кількості специфічних взаємодій дальнього порядку в білку в розчині указує на те, що він існує в сильно невпорядкованому стані розплавленої глобули (Опдивпі, М. апа М/ада, А. (1983) РЕВЗ І еї. 164,21-24).
У матеріалі клубків були ідентифіковані продукти розщеплювання тау-білка протеазами, що утворюються, зокрема, під дією каспази і кальпаїну (Азр 13, СИи391 і Азр421) (Сатрьіїйп, Т.О. єї аї. (2003) Ргос. Маї. Асад. 5сі. 0.5.А. 100, 10032-10037). Зокрема, усікання по Азр421 детально вивчалося із застосуванням антитіла СЗ до тау-білка, яке зв'язується з вільним кінцем Азр421.
Було висунуто припущення, що це усікання є ранньою подією в патогенезі АЮ, що асоціюється з індукцією апоптозу (деСаїїдпоп А. еї а!. (2010) Майте 464, 1201-1204). М-кінцеве розщеплювання по Авр 13 і С-кінцеве розщеплюванню по (311391 вважаються за пізні події в патогенезі (деСаїїдпоп А. єї аї. (2010) Маште 464, 1201-1204; Оеїобеї, Р. єї а. (2008) Ат. 9. Раїйо!. 172, 123- 131). Нещодавно в С5Е від пацієнтів з АО і РОР був ідентифікований додатковий М-кінцевий фрагмент (залишки 1-224), і була висунута гіпотеза, що він є раннім маркером захворювання і особливо патогенним (05 14/092539; Відні, У. еї аї. (2014) МеийгобіоІ. Адеїпд, 1-17). Про аналогічний фрагмент, що утворюється в результаті розщеплювання кальпаїном, повідомляли інші групи (Ееїтеїга, А. апа Відіо, Е.Н. (2011) Мої. Мед. 17, 676-685; Неїіпеске, ..В. єї аї. (2011)
РІ о5. Опе. 6, е23865).
Було висунуто припущення, що, окрім гіперфосфорилування і фрагментації тау-білка, посттрансляційне ацетилування (Сопеп, Т.. єї аі. (2011) Маї. Соттип. 2, 252; Міп, ЗМУ. евї аї. (2010) Мепгоп 67, 953-966) і О-СсІсСМАцилування (7Ни, У. єї аї. (2014) 9. ВіоЇ. Снет.) є процесами,
Зо що визначають патологію, при формуванні патології клубків, що асоціюється з АЮ.
І. Види імунотерапії із застосуванням тау-білка
Види імунотерапії традиційно розділяються на пасивні і активні підходи до вакцинації. При активному підході до вакцинації патогенний засіб або його інактивовану патогенну форму вводять пацієнтові шляхом ін'єкції, і імунна система викликає імунну відповідь. Це запускає дозрівання В-клітин, що виробляють високоафінні антитіла до введеного антигену або клітинну відповідь на нього. При пасивному підході до вакцинації запуску імунної системи уникають шляхом інфузії антитіла, специфічного до антигену. Власна система очищення організму потім видаляє зв'язаний з антитілом ліганд.
Абб Іттипе надає моноклональне мишаче антитіло до фосфосерину-409 тау-білка.
Визначали профіль антитіл до антигенів тканини головного мозку людини з АО і контрольної тканини головного мозку, і їх відбирали на підставі їх здатності до розпізнавання патології клубків. Обидва гуманізовані варіанти двох антитіл ПАСІ-36-286-АБ1 і НПАСІ-36-ЗА8-АБІ1 зв'язуються з епітопом тау-білка в межах амінокислот 401-418 (МО 2013/151762).
Група Родег Міїзс! виділила аутоантитіла до тау-білка від немолодих здорових індивідуумів без ознак дегенеративної таупатії. Було виділено ряд антитіл із застосуванням повнорозмірного рекомбінантного людського тау-білка (2М4В) для виявлення антитіл, специфічних до тау-білка. їх потім піддавали скринінгу стосовно їх здатності до розрізнення ізолятів тау-білка від хворих і здорових індивідуумів. Три провідні антитіла 4Е4, 4АЗ і 2482 були описані в патентній літературі (МО 2012049570; 005 2012087861). Картування їх епітопів указує на те, що всі вони розпізнають амінокислоти в межах ділянки зв'язування з мікротрубочками і в С-кінцевому напрямку від нього в положеннях від М339 до КЗ369. Ці антитіла не проявляють будь-яку фосфоспецифічність.
С2М Оіадповзіїсх фокусується головним чином на розробці засобів діагностики для раннього виявлення нейродегенеративного захворювання. Отримували антитіла до повнорозмірного людського і мишачого тау-білка. Ідентифікували вісім і п'ять антитіл, що розпізнають, відповідно, людський і мишачий тау-білок (Уапатапага, К. єї аї!. (2013) Мешйгоп 80, 402-414). Три антитіла з різними показниками кінетики зв'язування відбирали для оцінювання іп мімо. А саме це були
На9З.3, Н.9З.4 ії Нув.5, які розпізнають, відповідно, залишки 306-320, 7-13 і 25-30 тау-білка, при цьому останнє (Н.у8.5) є специфічним до людського тау-білка. Антитіла також відбирали на підставі їх здатності до попередження перенесення патології в оригінальному репортерному бо аналізі механізму дії трансцелюлярного розповсюдження патології тау-білка (Запаеєтв, Ю.М. єї а! (2014) Мешгоп 82, 1271-1288; Кіоцигу, М. еїаІ. (2012) 9. Віої. Спет. 287, 19440-19451). Їх оцінювання в дослідженнях з тривалою і.с.м. ін'єкцією у трансгенних мишей РЗО15 продемонструвало їх здатність до зменшення рівнів гіперфосфорилованого тау-білка, визначену за забарвлюванням в імуногістохімічному аналізі оброблених мишей.
Антитіла Реїег Оаміє5 спочатку розробляли як засоби діагностики, які можуть забезпечувати встановлення відмінностей між патологічним і нормальним тау-білком в матеріалі головного мозку з АО і контрольним матеріалом головного мозку (Стеепрегу, 5.2. апа Оамієв, Р. (1990)
Ргос. Маї!. Асад. сі. 0.5.А. 87, 5827-5831). Оцінювання терапевтичної корисності антитіл РНЕ1 і
МСІ1 було продемонстровано на мишах РЗО15 ї УРМІ З (РЗО1І) (Воша|апдоці, А. еї аї. (2011) 9.
Мецгоспет. 118, 658-667; СпНаї, Х. еї а!. (2011) 9. ВіоІ. Спет. 286, 34457-34467; С'Абгато, С еї аї. (2013) Ріо5. Опе. 8, еб2402). РНЕТ розпізнає лінійний епітоп фосфорилованого тау-білка (ре396, ре404), тоді як МС1 є конформаційно-залежним антитілом, яке розпізнає структурний епітоп тау-білка, для якого потрібно дві окремі частини лінійної послідовності, епітоп в межах залишків 46-202 і С-кінцевий епітоп між залишками 312-342 (дісна, С.А. евї а)ї. (1997) 9. Мешговсі.
Вез. 48, 128-132). Ін'єкція цих двох антитіл в дослідженнях з тривалою 12-13-тижневою імунізацією приводила до істотного зменшення патології спинного мозку і стовбура головного мозку серед інших ділянок головного мозку, що перетворювалося на ослаблення рухового дефіциту, спостережуваного у цих мишей. (Б'Абгато, С. єї а!. (2013) РІ о5. Опе. 8, еб2402). іІРегіап/Вгізіо! Меуєтв ЗацібЬ розробили антитіла до тау-білка, направлені на передбачувані патологічні молекули тау-білка, що складаються з М-кінцевого фрагмента тау-білка (еТаи: залишки 1-224), які сприяли гіперактивності в культурах нейронів з індукованих плюрипотентних стволових клітин. Був розроблений портфель антитіл, але отримання характеристик було сфокусовано на антитілах ІРМОО1 ії ІРМОО2, які розпізнають М-кінцевий епітоп в межах залишків 9-18. Відповідно, ці антитіла виявляють підвищені рівні тау-білка в СЕ від пацієнтів зі встановленою стадією АЮ і РОР, які можуть бути ранньою ознакою захворювання. Ін'єкції антитіл мишам УРМІ З (РЗО11) іп мімо приводили до часткового усунення прогресуючих рухових дефіцитів (05 14/092539).
Еіпаг бідигав5оп розробив першу програму, що демонструє ефективність імунотерапії на основі застосування тау-білка. Для імунізації мишей УРМІ З (РЗОТІ) застосовували активну
Зо вакцину, що складається з пептиду тау-білка 379-408 Іре396, ре404| разом з ад'ювантом Адіи-
Ріпо5. У цьому дослідженні спостерігали виражене зменшення патології тау-білка у мишей, оброблених вакциною, в порівнянні з контрольними тваринами. Також виявляли ослаблення рухового фенотипу, пов'язаного з таупатією. Його ефективність підтверджували в іншій мишачій моделі (піаш/Р51), що функціонує без дії мутантного тау-білка (Воціа|аподоці, А. еї а. (2011) ААІС 2011 (7, іввце 4, Буррієтепі єдп) р. 5480-5431; Сопоадоп, Е.Е. еї аї. (2013) 9. Віої. Снет. 288, 35452-35465; СИ, у. еї а! (2013) 9. Віої. Спет. 288, 33081-33095).
У Ргоїйепа оцінили три антитіла до тау-білка у трансгенних по тау-білку мишей КЗ691І (КЗ) і в мишачій моделі РЗО1Ї. Антитіла з різними властивостями відбирали для оцінювання іп мімо. Два ре404-специфічні антитіла з різними ізотипами (ДСК ії ІдЯс2а/К) або загальне (панспецифічне) антитіло до тау-білка (Ід4Сс1/К) ін'єктували в рамках парадигми тривалого дослідження. Мишей
КЗ69І обробляли шляхом щотижневих ін'єкцій протягом 21 тижня, починаючи з віку З тижнів, а мишей РЗОТІ обробляли протягом 7 місяців шляхом щотижневих ін'єкцій, починаючи з віку 4 місяців. У мишей КЗ, оброблених антитілом Ідсга/К до рб404, спостерігали зменшення кількості позитивних по тау-білюу нейрофібрилярних включень. Обидва ро404-специфічні антитіла були здатні зменшувати рівні ре422-позитивного тау-білка, тоді як у мишей, оброблених панспецифічним антитілом до тау-білка, зменшення не спостерігалося. Ці дослідження дозволяють припустити, що: 1) очищення від тау-білка може залежати від ізотипу антитіла, і 2) може бути важливою цілеспрямована дія на молекули тау-білка, що мають відношення до захворювання, оскільки загальне антитіло до тау-білка було не здатне зменшувати рівні гіперфосфорилованого тау-білка (РСТ/0О52014/025044).
Автори цього винаходу несподівано виявили, що антитіла, специфічні до фосфорилованого серинового залишку 396 тау-білка (р5396), є ефективними в моделях захворювань; у цьому полягає відмінність від антитіл з попереднього рівня техніки, які розпізнають головним чином тау-білки, фосфориловані як по залишку 396, так і по залишку 404, фосфориловані тільки по залишку 404 або по іншим залишкам тау-білка.
Автори цього винаходу розробили антитіла, які додатково характеризуються значною специфічністю і селективністю стосовно патологічного людського тау-білка. Антитіла за цим винаходом демонструють набагато вищий ступінь специфічності і селективності стосовно патологічного людського тау-білка в порівнянні з непатологічним тау-білюком, ніж антитіла з бо МО2013/050567 (див. фігуру 1 з МО 2013/050567). Утворення антитіл з МО 2012/045882, які, як повідомлялося, характеризуються специфічним зв'язуванням, викликалося у відповідь на амінокислотні послідовності з 6-9 залишками з амінокислот 393-401, 396-401, 394-400 ії 393-400 тау-білка. Це контрастує з антитілами за цим винаходом, утворення яких відбувається у відповідь на патогенний гіперфосфорилований тау-білок, що містить довшу амінокислотну послідовність, описану в даному описі.
Додатково, антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом демонструють багато переважних ознак, таких як здатність розрізняти патологічний і непатологічний людський тау-білки і, зокрема, до зв'язування з тау-білюом, що асоціюється з альцгеймерівською (АЮ) патологією. У електрофізіологічних дослідженнях антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом були додатково здатні усувати зменшені парне полегшення і мимовільний мініатюрний збуджувальний синаптичний струм (тЕРБЗОС).
СУТЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід відноситься до моноклональних антитіл і їх епітопзв'язувальних фрагментів, здатних специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком серину 396 людського тау-білка (ізоформи 2М4НВ) (ЗЕО ІЮ МО: 1). Антитіла додатково характеризуються своєю здатністю розрізняти фосфориловані залишки 396 і 404, так що вони практично не зв'язуються з фосфорилованим залишком 404.
Антитіла за цим винаходом є селективними стосовно патологічного тау-білка у присутності непатологічного, але при цьому фосфорилованого, тау-білка. Антитіла за цим винаходом здатні викликати селективне виснаження клубків тау-білка з патологічного тау-білка у присутності нормального тау-білка. Без обмеження будь-якою конкретною теорією вважають, що виснаження клубків тау-білка, що містять тау-білок, який був фосфорилований в положенні 396 тау-білка, попереджає затравлювальну дію патологічного тау-білка з утворенням клубків тау- білка. Відповідно, один аспект цього винаходу відноситься до антитіла, здатного селективно зв'язуватися з фосфорилованим в положенні 396 тау-білком навіть в тих випадках, коли такі молекули знаходяться у присутності тау-білка, який був фосфорилований в положенні 404 тау- білка. Пов'язаний аспект цього винаходу відноситься до антитіла, здатного селективно зв'язуватися з фосфорилованим в положенні 396 тау-білком навіть в тих випадках, коли такі молекули знаходяться у присутності непатогенного тау-білка. Як визначено додатково, цей винахід відноситься до антитіла, селективного стосовно патологічного тау-білка, при цьому вказаний патологічний тау-білок є гіперфосфорилованим тау-білком, що виявляється у вигляді смуги, відповідної 64 кДа (у вестерн-блот-аналізі), у трансгенних мишей, що надмірно експресують ізоформу 2МАВ людського тау-білка.
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло до тау-білка, яке при застосуванні з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей /Т94510 специфічно зменшує смуги гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 і 70 кДа щонайменше на 90 95, зменшуючи при цьому смугу тау-білка розміром 55 кДа не більше ніж на 10 95. Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло до тау-білка, яке специфічно зменшує смуги гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 і 70 кДа щонайменше на 90 95, зменшуючи при цьому смугу тау-білка розміром 55 кДа не більше ніж на 10 95; або яке при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами головного мозку від людей з АЮ має здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого в роб тау-білка щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше ніж на 10 95.
Інший аспект цього винаходу направлений на спосіб лікування пацієнта з таупатією, такою як хвороба Альцгеймера, який включає виснаження клубків або ослаблення прогресу утворення вказаних клубків, при цьому вказані клубки містять гіперфосфорилований тау-білок, при цьому вказаний спосіб включає приведення гіперфосфорилованого тау-білка в контакт з антитілом за цим винаходом таким чином, що клубки виснажуються, вміст в них гіперфосфорилованого тау- білка зменшується або прогрес утворення клубків ослабляється.
Як визначено в якості альтернативи, цей винахід відноситься до способу лікування пацієнта з таупатією, такою як хвороба Альцгеймера, при цьому вказаний спосіб включає приведення клубків в контакт з антитілом, селективним стосовно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396, таким чином, що в клубках відбувається виснаження по гіперфосфорилованому тау-білку.
Один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло до гіперфосфорилованого людського тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 31; 5ЕО ІО МО: 32; 5ЕО І МО: 33; 5ЕО ІЮ МО: 34; (510) ЗЕО ІЮО МО: 35; 5ЕО ІЮ МО: 36; 5ЕО І МО: 37; 5ЕО ІО МО: 38; 5ЕО ІЮ МО: 40 ії БЕО І МО: 46;
(5) СОВ2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 4;
ЗЕО ІО МО: 41 і 5ЕО І МО: 47; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ОО МО: 5;
ЗЕО ІО МО: 42 і 5ЕО І МО: 48; (4) СОВІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО 10 МО: 6;
ЗЕО ІО МО: 43; 5ЕО ІЮ МО: 49; 5ЕО ІО МО: 52 ії 5ЕО І МО: 55; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 7; 5ЕО ІО МО: 28; 5ЕО ІО МО: 29; 5ЕО ІО МО: 30; 5ЕО ІЮ МО: 44;
ЗЕО ІО МО: 50; 5ЕО І МО: 53 і 5ЕО І МО: 56; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО 10 МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 39; 5ЕО ІЮ МО: 45; 5ЕО ІО МО: 51; 5ЕО ІО МО: 54 і
ЗЕО ІО МО: 57.
Один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло до гіперфосфорилованого людського тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) легкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІО МО: 12; 5БО І МО: 16;
ЗЕО ІО МО: 17; 5ЕБЕО ІО МО: 18; 5ЕО І МО: 19; 5ЕО ІО МО: 20; 5ЕО ІЮО МО: 21; 5БЕО ІЮ МО: 22 і
ЗЕО ІО МО: 23; і (б) важкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІО МО: 11; 5ЕО ІО МО: 13;
ЗЕО ІО МО: 14; 5ЕО ІЮ МО: 15; 5ЕО ІО МО: 24; 5БЕО І МО: 25; 5ЕО ІО МО: 26 ї БЕО ІЮ МО: 27.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло до гіперфосфорилованого людського тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на моноклональне антитіло до гіперфосфорилованого людського тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, що
Зо містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4;і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на моноклональне антитіло до гіперфосфорилованого людського тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати в лікуванні таупатій, таких як хвороба Альцгеймера (АБО), хвороба аргірофільних зерен (АСВ), прогресуючий над'ядерний параліч (РР), кортикобазальна дегенерація (СВО), ТВІ (травматичне пошкодження головного мозку легкої, гострої або хронічної форм) і хронічна травматична енцефалопатія (СТЕ).
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом додатково призначені для застосування в лікуванні психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з
АС, і апатії, обумовленої АО, або апатії у пацієнтів з АЮ.
СТИСЛИЙ ОПИС ІЛЮСТРАТИВНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фігура 1. Рідиннофазний аналіз інгібування захоплення антигенів РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ із застосуванням гуманізованого С10-2 і варіантів (С10-2 М325 і С10- бо 2 М325 АТ01Т). Як описано в прикладі ЗА, досліджували залежне від концентрації інгібування б захоплення антигенів РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ РЗ96б-специфічними антитілами пС10-2 (квадратики), НС10-2 М325 (чорні кружки) і пС10-2 М332 АТ01т (білі кружки). Фракцію РЗ з матеріалу від суб'єктів з АО інкубували 60 хвилин при кімнатній температурі (к. т.) із зростаючими концентраціями антитіл (0-14000 нМ) перед інкубацією з 200 нг/мл мишачого антитіла С10-2, іммобілізованого на 96-лункових планшетах. Захоплені антигени РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ виявляли за допомогою міченого 5ЦІ БО-ТАа антитіла до загального тау-білка (М50).
Розраховані значення ІС5О антитіл НС10-2 М325 (чорні кружки) і НС10-2М4332 АТО1Т (білі кружки) складали 44 НМ і 14 нМ відповідно. Це є помітним поліпшенням в порівнянні з йС10-2, як можна побачити при порівнянні кривих на фігурі 1. Відповідно, в одному аспекті цього винаходу антитіла інгібують РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ в рідиннофазному аналізі інгібування, описаному в даному описі, таким чином, що сигнал зменшується на 50 95 при концентрації антитіла, що становить 100 нМ або менше, виходячи з рідиннофазного аналізу інгібування захоплення антигенів РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ.
Фігура 2. Аналіз інгібування пептиду, що ілюструє позірну афінність пС10-2 і споріднених варіантів. Як описано в прикладі ЗВ, залежне від концентрації інгібування зв'язування антитіла в розчині рідкої фази з пептидом Ріай 386-408 (ре396) досліджували з антитілами НС10-2 (квадратики), йС10-2 М325 (чорні кружки) і йС10-2 М32 АТ01Т (білі кружки). Антитіла попередньо інкубували при 1 нг/мл протягом 60 хв. при к. т. із зростаючими концентраціями (0- 10000 нм) Ріай 386-408 (р5396) перед інкубацією в лунках, покритих 100 нг/мл Ріай 386-408 (ре396/ре404). Зв'язане з лунками антитіло виявляли за допомогою міченого З ЦО РО-ТАС антитіла до ІД людини (М50).
Як можна побачити з фігури 2, антитіло НС-10.2 (1050-24 нМ), антитіло НС10.2 М325 (ІС50-50 нМ) і антитіло НС10.2 МЗ325, АТ01Т (1050-34 нМ) характеризуються значеннями ІС50, що складають менше 100 нМ і навіть менше 60 нМ, виходячи з досліджень позірної афінності із застосуванням розчину рідкої фази з Ріай (Р396) 386-408.
Фігура З (панелі А-7 і АА-АСІ). Імуногістохімічне виявлення патологічного тау-білка в зразках головного мозку, отриманих посмертно від донорів з А0О, і в головному мозку від мишей г/Т44510.
Як описано в прикладі 4, в префронтальній корі від З різних донорів з АЮ пС10-2, пС10-2 М325 і
Зо пС10-2 М325 АТ01Т мітили нейрофібрилярні клубки, нитки нейропілю і дистрофічні нейрити.
Найбільш високі інтенсивності забарвлювання виявляли при найбільш високих концентраціях антитіла. У контрольних зрізах головного мозку не спостерігалася імунореактивність. Усі З антитіла мітили фосфорилований тау-білок в головному мозку від "44510 із запущеною формою патології.
Забарвлювання посилювалося в напрямі від йС10-2 до йС10-2 М325 і до пС10- 2 М325 АТ01Т. Найбільш високі інтенсивності забарвлювання виявляли у разі псС10- 2 М325 А101Т, потім пС10-2 МЗ325 і потім НС10-2. Імуногістохімічне виявлення патологічного тау-білка в зразках головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера спостерігали при концентраціях не більше 100 нг/мл АЯС10-2 М325 АТО1ТінС10-2 М325.
Фігура 4 (панелі А-Е). Забарвлювання структур тау-білка у мишей гТ94510, оброблених пС10-2. НС10.2 вводили ім. (На панелях А, С, Е і Е представлені "Т44510; на панелях Ві 0 представлені ІТА). Миші отримували одноразову ін'єкцію антитіл НС10-2 при концентрації 80 мг/кг в об'ємі 150 мкл. Зрізи головного мозку отримували через З дні згідно зі способом, описаним в прикладі 5. пС10-2 специфічно мітило цільові структури іп мімо в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку "794510, але не із контрольних зразків головного мозку ІТА. Зображення з накладенням сигналів АІехаБіног488 і Ноеснвї показані на зрізах гіпокампу.
Фігура 5 (панелі А-Е). Забарвлювання структур тау-білка у мишей гТ94510, оброблених пС10-2 М325. (На панелях А, С і Е представлені гГ94510; на панелях В, О і Е представлені ІТА).
Миші отримували одноразову ін'єкцію антитіл НС10-2 М325 при концентрації 80 мг/кг в об'ємі 150 мкл. Зрізи головного мозку отримували через З дні згідно зі способом, описаним в прикладі 5. пС10-2 М325 специфічно мітило цільові структури іп мімо в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку гТ94510, але не із контрольних зразків головного мозку ІТА. Зображення з накладенням сигналів АІехагРішог488 і Ноеснві показані на зрізах гіпокампу.
Фігура 6 (панелі А-Е). Забарвлювання структур тау-білка у мишей г/Та44510 після ім. ін'єкції пС10-2 М325 АТ01Т. (На панелях А, С і Е представлені "Т94510; на панелях В, 0 і Е представлені ІТА). Миші отримували одноразову ін'єкцію антитіл пС10-2 М325 А101Т при концентрації 80 мг/кг в об'ємі 150 мкл. Зрізи головного мозку отримували через 3 дні згідно зі способом, описаним в прикладі 5. НС10-2 М325 А101Т специфічно мітило цільові структури іп бо мімо в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку /Т94510, але не із контрольних зразків головного мозку ТА. Зображення з накладенням сигналів АІехаРіног488 ії Ноеснві показані на зрізах гіпокампу.
Порівняння фігур 4-6 указує на те, що пПС10.2, пС10-2 М325 і нС10-2 М325 АТО1Т проникають через гематоенцефалічний бар'єр при внутрішньовенній ін'єкції. Фігури додатково указують, що пС10-2 М325 і пС10-2 М325 АТ01Т мітили структури тау-білка (імунореактивні стосовно клубків тау-білка) в гіпокампі і корі головного мозку з покращеними результатами в порівнянні з пС10-2.
Фігура 7 (панелі А-0). Молекули тау-білка, розпізнавані рв396-специфічними антитілами в головному мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера (АБ). Як описано в прикладі 6, в зрізах головного мозку від суб'єктів з АЮ клубки тау-білка були або спільно міченими антитілами до Е1 і роб, або позитивними тільки для антитіл до ре396 (стрілки). Зрізи аналізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Ряд клубків тау-білка мітили тільки антитіла НС10-2 або антитіла пС10-2 М325 АТ01Т (стрілки). Враховуючи, що непіддатливі виявленню клубки не забарвлюються антитілами до М-кінцевого фрагмента тау-білка, молекули тау-білка, мічені антитілами йС10-2 або йС10-2 М325 А101Т окремо, ймовірно, представляють позаклітинні непіддатливі виявленню клубки.
Фігури 8А-8С. Виявлення патологічного тау-білюка за допомогою вестерн-блотингу. Як описано в прикладі б, розділі "ЇВиявлення патологічного тау-білка за допомогою вестерн- блотингу", патологічний тау-білок виявляли за допомогою вестерн-блотингу з використанням пС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 АТ01Т. Об'єднані зразки переднього мозку від трьох мишей г/194510 і такі ж від нетрансгенних (відмінних від Т9) контрольних тварин одного приплоду, що убиваються у віці 32 тижнів, і об'єднані зразки кори головного мозку від чотирьох донорів з АЮ і такі ж від чотирьох здорових контрольних (НС) донорів відповідно фракціонували на розчинні (51) фракції, фракції розчинного в ТВ5 осаду (51р) і нерозчинні в саркозилі (РЗ) фракції і аналізували за допомогою вестерн-блотингу стосовно фосфорилованого епітопу роз396 тау-білка з використанням 1 мкг/мл НС10.2 (А), пС10-2 М325 (В), пС10-2 М325 АТО1Т (С). У разі гТд4510 нормальний людський тау-білок 4ВОМ відображався при 55 кДа, тоді як гіперфосфориловані молекули тау-білка відображалися при 64 кДа і 70 кДа. У разі АО гіперфосфориловані молекули тау-білка відображалися у вигляді чотирьох смуг, відповідних 54, 64, 69 і 74 кДа, при різній кількості типової для АЮ плями.
Кожне з НС10-2, пС10-2 М325 і пС10-2 М325 А101Т було селективним стосовно тау-білків мишей г/Т94510 в порівнянні з нетрансгенними мишами і стосовно тау-білків донорів з АЮ в порівнянні із здоровими контрольними донорами. Крім того, в розчинних (51) фракціях, фракціях розчинного в ТВ5 осаду (51р) і нерозчинних в саркозилі (РЗ) фракціях кожне з пС10-2, пС10-2 М325ійС10-2 М325 А101Т було селективним стосовно патогенного тау-білка розміром 64 кДа від мишей гТ944510 в порівнянні з нормальним тау-білком розміром 55 кДа від мишей г"Та4510.
Фігура 9. Імунопреципітація тау-білка із зразків головного мозку від суб'єктів з АЮ. Як описано в прикладі 6, розділі "Імунопреципітація патологічного тау-білка", імунопреципітацію тау-білка з використанням 10 мкг пС10.2, пС10-2 М325, пС10-2М325 А101Т, з використанням контрольного (91 людини (підс1) із 500 мкг попередньо очищених лізатів гомогенатів кори головного мозку, об'єднаних від чотирьох донорів з АО і здорових контрольних (НС) донорів, аналізували за допомогою вестерн-блотингу з використанням поліклонального кролячого антитіла до тау-білка ре396 (тау-білок ре396). У разі АО гіперфосфориловані молекули тау- білка відображалися у вигляді чотирьох смуг, відповідних 54, 64, 69 і 74 кДа, при різній кількості типової для АЮ плями.
Фігура 10 А-С. Кількісна оцінка агрегації тау-білка за допомогою аналізу Сівбіо.
Затравлювальний матеріал дикого типу (МУ) (М/М) не продемонстрував затравлювальної дії, і фоновий сигнал віднімали з усіх затравлених зразків. Затравлені гомогенати від Т44510 характеризувалися ефективною затравлювальною дією, і на затравлювальний ефект не впливала обробка за допомогою В12, проте на нього в різному ступені впливала обробка в дослідженнях затравлювальної дії, що проводяться з використанням антитіл до тау-білка за цим винаходом (пС10-2 М325 АТО1Т» йС10-2 М325 » ПС10-2) при концентрації 20 мкг/мл. На графічних зображеннях представлені результати чотирьох незалежних груп експериментів, і вони виконані у вигляді діаграми відносної агрегації тау-білка (кратності сигналу щодо фонового рівня, нормалізованої до загального білка), і відносний вміст нерозчинного тау-білка р396 кількісно оцінювали за допомогою денситометрії вестерн-блотів нерозчинної в Т/йоп-Х фракції (нормалізована кратність сигналу по відношенню до фонового рівня). Всі зразки нормалізували по відношенню до антитіла ізотипічного контролю В12. На фігурі 10 В-С представлена кількісна бо оцінка агрегації тау-білка за допомогою аналізу Сізріо. Клітини НЕК293, трансфектовані рерМА для введення затравки, не продемонстрували сигнал, що підтверджувало відсутність виявлення вхідного затравлювального матеріалу. Затравлювальний матеріал УМ (дикого типу) (М/МУ) не продемонстрував затравлювальної дії, проте, на відміну від цього, гомогенати від /Т44510 (СС) характеризувалися ефективною затравлювальною дією в порівнянні з позбавленими затравки.
На цей затравлювальний ефект не впливала обробка за допомогою НЕЇ, але він частково усувався шляхом обробки антитілами до тау-білка (С10-2501.25пПАСІЗ6-286-АБІ). На графічних зображеннях представлені три незалежні набори зразків, і вони виконані у вигляді діаграми відносної агрегації тау-білка (кратності сигналу щодо фонового рівня, нормалізованої по відношенню до загального білка). У прикладі 6, розділі "Клітинний аналіз і аналіз агрегації", протокол буде описаний.
Фігура 11. Кількісна оцінка сигналу Таб у вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з АО із застосуванням різних кількостей антитіл НС10-2 і 2.10.3. Як описано в прикладі 7, обидва антитіла видаляли невелику частку загального тау-білка з екстрактів головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера.
Фігура 12. Кількісна оцінка сигналу тау-білка Р-5422 у вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ із застосуванням різних кількостей антитіл пС10-2 (ромби) і 2.10.3 (трикутники). На фігурі показані результати з прикладу 7. Тау-білокю фосфорилований по серину-422, може ефективно видалятися з екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ в результаті імуновиснаження із застосуванням пС10-2 або 2.10.3. Обидва антитіла приводили до видалення більше 90 95 тау-білка Р-5422, хоча для досягнення такого ж ефекту була потрібна більша кількість антитіла 2.10.3.
Фігура 13. Кількісна оцінка сигналу тау-білка рБЗОб у вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ із застосуванням різних кількостей антитіл НС10-2 і 2.10.3. На фігурі показані результати з прикладу 7. Імуновиснаження за допомогою НС10-2 приводило до видалення 88 95 тау-білка, фосфорилованого по серину- 396, тоді як 2.10.3 приводило до видалення лише 55 95 тау-білка ре396 з екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ.
Фігура 14. Кількісна оцінка сигналу тау-білка Р-5199/202 у вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ із застосуванням різних
Зо кількостей антитіл НС10-2 і 2.10.3. На фігурі показані результати з прикладу 7. Імуновиснаження за допомогою пС10-2 приводило до очищення 69 95 тау-білка, фосфорилованого по серину- 199/202. Антитіло 2.10.3 не приводило до такого ж дозозалежного зменшення.
Фігура 15. Картини вестерн-блотингу екстрактів головного мозку від суб'єктів з хворобою
Альцгеймера до і після імуновиснаження. На фігурі показані результати з прикладу 7. Присутній фрагмент тау-білка, фосфорилованого по серину-396, розміром 25 кДа. Імуновиснаження за допомогою пС10-2 приводило до зменшення смуги тау-білка розміром 25 кДа. 2 інші фосфо- специфічні антитіла 2.10.3 і АТ8 не приводили до видалення цієї молекули розміром 25 кДа.
Фігура 16. Кількісна оцінка сигналу тау-білка рБ39б у вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ із застосуванням різних кількостей варіантів НС10-2 М325, МЗ32О, М325 АТО1Т, М320 АТО1Т, М320 О55Е і М325 О55Е.
Як можна зробити висновок з прикладу 8, здатність антитіл за цим винаходом до видалення тау-білка, фосфорилованого по серину-396, з гомогенатів головного мозку від суб'єктів з АО, була істотною. При вмісті менше 0,1 мкг антитіла (точка виміру при 75 нг) варіанти приводили до зменшення сигналу рБ396 щонайменше на 2895 (за винятком МЗ32О, О55Е, який характеризувався 16 95), тоді як С 10.2 приводило до зменшення сигналу ро396 на менш ніж б об.
Фігура 17 (панелі А-0). Затравка клубків тау-білка в гіпокампі, викликана ін'єкцією екстрактів головного мозку від суб'єктів з АЮ. Як викладено в прикладі ва, при дозі 15 мг/кг обробка за допомогою тС10-2 значущо зменшувала патологію клубків в підданому затравлювальній дії гіпокампі на 57 95 (Р«0,05). Спостерігалася виразна тенденція, що вказувала на те, що пС10-2 також зменшувало патологію. Для порівняння 2.10.3 не характеризувалося ефектом при тій же дозі.
Фігура 18. Залишки Р-5ег396 і Туг394 знаходяться в центрі антигензв'язувальної ділянки
Показана структура Пе(392)-МаІ(393)- Ту((394)-І ух(395)-рбег(396)-Рго(397)-Ма|(398).. ..-У основній взаємодії з антитілом за цим винаходом бере участь гідрофобна кишеня, роегЗ396 і
У394 тау-білка. Існують розгалужена мережа водневих зв'язків, що утворюється між бічним ланцюгом з У(394) і остовом з фосфонату з рбег396, і взаємодії зарядів/полярні взаємодії між ними. СОВІ1 НС антитіл за цим винаходом містить паліндромний мотив з 8 залишків ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА 60 АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА
АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА (Т-РНе-ТНг-Азр-Аго- Пиг-Пе-Ніх). Заряджені залишки взаємодіють за допомогою розгалуженої мережі зв'язків, утвореної водневими зв'язками, взаємодій зарядів, і взаємодій зарядів/полярних взаємодій між антитілом і тау-білком.
Фігура 19. Ефективність антитіл в парадигмі лікування
Як викладено в прикладі Б, клітини НЕК293, що експресують пТаиш-РЗОТЇ, піддавали затравлювальній дії гомогенатів від Т44510, попередньо інкубованих з вказаними антитілами, трипсинізували і піддавали повторній затравлювальній дії через 24 години (антитіла повторно додавали) і збирали через 48 годин після піддавання затравлювальній дії. Загальні клітинні гомогенати досліджували стосовно агрегованого тау-білка за допомогою аналізу агрегації тау- білків від Сібріо. Даними є об'єднані дані від 4 незалежних біологічних повторів ж/- 5.Е.М., нормалізовані по відношенню до СС-В12(194510).
Клітини, що експресують РЗОТІ-Ніац, піддавали затравлювальній дії 40 мкг гомогенату головного мозку від Т94510 (загальний білок), попередньо інкубованого протягом ночі при 4 "С з антитілами (20 мкг/мл «133 НМ) в б-лункових планшетах. Затравка за допомогою СС-В12 приводила до значної затравлювальної відповіді. АС10.2 надавало приблизно 40 95 вплив на агрегацію. Всі інші антитіла демонстрували щонайменше зіставний з пПС10.2 ефект. Зокрема, варіанти йС10.2 М325 і М325 АТ01Т демонстрували більш виражені ефекти у вигляді зменшеної агрегації тау-білка на 45 95 і 62 95. Варіант М325 А101Т демонстрував значущо більш виражений ефект стосовно агрегації в порівнянні з йС10.2. На фігурі показано, що гуманізоване С 10.2 є ефективним при залученні індукованої тау-білком затравлювальної дії, проте додавання М325 і, зокрема, подвійної мутації М325 і АТ101Т підвищує нейтралізуючу активність підб.
Фігура 20. Дослідження стосовно дезамідування варіантів в стресових умовах
Як викладено в прикладі 8с, дезамідування залишків Авп в положенні 32 або 34 МІ -ланцюга контролювали шляхом аналізу триптичного пептиду І С:Т2 (МТМТСОАБОЮТ5БІХІ ММУУгРООКРОК;
ЗЕО ІО МО: 58) за допомогою І С-М5. Х являє собою Авп, Сіп або 5ег у відповідних варіантах, вказаних на фігурі 20. М5 аналіз дозволяє виконати розрахунок відносного вмісту дезамідованих пептидів по відношенню до недезамідованих. У разі МТ, варіантів АТО1Т і О55Е спостерігається істотне дезамідування в пептиді І С:Т2. Також очевидно, що зміна Авп32 або на
Ко) Сіп, або на 5ег повністю запобігає дезамідуванню пептиду по іншим залишкам Азп34. Також не виявляли ніякого дезамідування варіантів (Іп3З2. Аналогічні результати спостерігали у разі варіантів Абп3За4.
Фігура 21. Зменшення затравлювальної дії і агрегації тау-білка в кортикальних нейронах за допомогою антитіл до тау-білка
Затравлювальну дію і агрегацію тау-білка в культурах кортикальних нейронів з ембріонів мишей гТ94510 індукували за допомогою 0,2 нг патологічного тау-білка з фракцій РЗ або 51р від 40-тижневих мишей гТ94510 і вимірювали за допомогою аналізу агрегації тау-білка Сівріо. На 7- й день культивування (0ІМ) нейрони обробляли сумішшю РЗ або 51р і 10 мкг антитіла або фосфатно-сольового буферного розчину (РВ5). Повну зміну середовища здійснювали на ІМ 1 з видаленням залишкових затравок РЗ ії 51р і антитіл. Затравку тау-білка забезпечували протягом додаткових 4 днів, і нейрони піддавали лізису на 0ІМ15 з вимірюванням затравлювальної дії і агрегації тау-білка. РВ5 і контрольне антитіло (ДС людини (контр. аб Ідс) не впливали на затравлювальну дію і агрегацію тау-білка. Затравлювальна дія і агрегація тау- білка частково усувалися шляхом обробки антитілами до тау-білка (пС10.2 АТ0О1Т М325 » пС10.2 М3255 пС10.2). Вимірювали наступне зменшення затравлювальної дії і агрегації тау- білка: 23 95 - у разі НС10.2, 41-53 95 - у разі НС10.2 М325 і 48-60 95 - у разі НС10.2 АТО01Т М325.
На стовпчикових діаграмах представлені дані з двох незалежних експериментів стосовно агрегації тау-білка, нормалізовані по відношенню до нейронального білка, у вигляді середніх значень ж 50. Використовували однофакторний АМОМА і критерій Ньюмена-Кейлса для
БО множинних порівнянь (РВбБ/контр, ар ІдсСю ов о порівнянні з йС10.2, нС10.2 М325, иС10.2 АТО1Т М325, и "р«0,001; йС10.2 в порівнянні з пС10.2 М325, пС10.2 АТО01Т М325,
ЯНр-0,001).
Фігура 22. Дозозалежне забарвлювання структур тау-білка у мишей /Та44510 після і.м. ін'єкції пС10-2 М325. пС10-2 М325 специфічно мітило цільові структури іп мімо в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку гТ94510. Показані зображення передньої поясної кори головного мозку.
Найбільш сильні сигнали спостерігали при дозі 20 і 80 мг/кг, слабкі сигнали - при дозі 8 мг/кг, відсутність видимого сигналу - при дозі 0,8 мг/кг.
Фігура 23. Викликана затравлювальною дією патологія тау-білка в гіпокампі
Число клітин, що характеризуються забарвлюванням клубків за Сзайуах, в підданому затравлювальній дії гіпокампі, зменшувалося шляхом обробки за допомогою пС10-2 (50 9), иС10-2 М325 (48 95) ії пС10-2 М325 АТ01Т (47 95). Кількісну оцінку виконували в кожних 6-х зрізах, що охоплюють дорсальний гіпокамп, всього використовували 8 зрізів на тварину. Число клітин відображає суму позитивних клітин у всіх підділянках гіпокампу, ідентифікованих в 8 зрізах. Для аналізу даних використовували однофакторний апома і критерій Данетта для множинних порівнянь.
ПОСЛІДОВНОСТІ, ВКЛЮЧЕНІ ШЛЯХОМ ПОСИЛАННЯ
ЗЕО ІО МО: 1 людський тау-білок (2М4В)
ЗЕО ІО МО: 2 залишки 386-408 тау-білка (ре396, ре404)
ЗЕО ІЮ МО: З СОВІ легкого ланцюга С10-2
ЗЕО І МО: 4 СОВ2 легкого ланцюга С10-2
ЗЕО І МО: 5 СОВЗ легкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 6 СОВІТ важкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 7 СОВ2 важкого ланцюга С10-2
ЗЕО І МО: 8 СОВЗ важкого ланцюга С10-2
ЗЕО І МО: 9 легкий ланцюг мишачого С10-2
ЗЕО ІО МО: 10 важкий ланцюг мишачого С10-2
ЗЕО І МО: 11 важкий ланцюг гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 12 легкий ланцюг гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 13 варіант О55Е важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 14 варіант 0550) важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 15 варіант 0555 важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 16 варіант МЗ325 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 17 варіант МЗ32О легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 18 варіант М345 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 19 варіант МЗ340О) легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІО МО: 20 варіант МЗ325, М345 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІО МО: 21 варіант М32О, М345 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
Коо) ЗЕО ІО МО: 22 варіант МЗ32О, М340О) легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 23 варіант М325, М340) легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 24 варіант А101Т важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 25 варіант О55Е, АТ101Т важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 26 варіант 0550), АТ01Т важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 27 варіант 0555, АТ101Т важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 28 варіант ОБ55Е СОНВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІО МО: 29 варіант 0550 СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІЮ МО: ЗО варіант 0555 СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІО МО: 31 варіант М325 СОН легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 32 варіант М32О СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІО МО: 33 варіант М345 СОН легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 34 варіант М34О СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 35 варіант М325, М345 СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 36 варіант М32О, М345 СОН легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 37 варіант М32О, М34О СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 38 варіант М325, М34О СОН легкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 39 варіант АТО1Т СОВЗ важкого ланцюга гуманізованого С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 40 СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМАТ
ЗЕО ІЮ МО: 41 СОВ2 легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМАТ
ЗЕО І МО: 42 СОВЗ легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМАТ
ЗЕО ІЮ МО: 43 СОВІ1 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІЮ МО: 44 СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІЮ МО: 45 СОВЗ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО І0О МО: 46 варіант М325 СОВІ легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІО МО: 47 варіант М325 СОВ2 легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІЮО МО: 48 варіант М325 СОВЗ легкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІЮО МО: 49 варіант АТ01Т СОВІ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІО МО: 50 варіант АІ 017 СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕБЕО ІО МО: 51 варіант АТ01Т СОВЗ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією ІМСТ
ЗЕО ІЮ МО: 52 СОВІ1 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїіа
ЗЕО І МО: 53 СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїіа
ЗЕО ІЮ МО: 54 СОВЗ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїіа
ЗЕБЕО ІЮО МО: 55 варіант АТ01Т СОВІ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїйа
ЗЕО ІЮО МО: 56 варіант АТ01Т СОВ2 важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїйа
ЗЕО І МО: 57 варіант АТО1Т СОВЗ важкого ланцюга гуманізованого С10-2 згідно з нумерацією за Споїіа.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Використовуваний в даному описі винаходу термін "тау" є синонімом "тау-білка" і відноситься до будь-якої з ізоформ тау-білка (ідентифікованих, наприклад, в ОпіРгої як Р1063З6, 1-9). Нумерація амінокислот тау-білка, використовувана в даному описі винаходу, наведена стосовно ізоформи 2 (5ЕО ІЮО МО: 1), показаної нижче, при цьому метіонін (М) є амінокислотним залишком 1.
ЗЕОО МО: 1:
МАБРЕКОБЕБУ МЕОНАСТУСІ. зррЕКроссут МнОопОевевто Моск
РТІБЕООСНЕЕРО БЕТВОАКОТЕ ТАББВУТАРІУ ПЕСАРОКОЛА АОРНТЕІ РКО
ТТАБЕАСІСО ТРЕБІБОБАвО НУТОАНМУВК ЗКІСШТОВООК КАКОЛІНКТК
ІАТРЕСААРР СОЮКОСАМАТЕ ІРБАКТЕРАРК ТРРІВОБРеК сосрЕдотеве
ОБРОТРОБНВ БТРЕЬВТРРТ ВЕРЕКУВУУВ ТЕРКЯРЕЯАК ЄВІОТАВИрМ
РОСЖМНУКаКІ с5ТЕМОЖНОР ОСИКУОТІМЕ КкІПЬаеМУСВК СОВКОМІ КНУ
РШСОБУЗКУХУ КРУНЕАКУТЕ КООЗООМІНН КрРОСООУВУКЮ ЗЕКТООКЕКОВУ ааКІсСВЬОМІ ТНУБСОСОМКА ТБЕТНКМСТЕНАЕ МАКАКТІНОЛ БІЗУУКВрУуУВ зетакРЕНнівМ УБаТаВБІЮМУ ПаРОБАТТАВ БУВАБСАКОС
Цей винахід відноситься до антитіл і їх епітопзв'язувальних фрагментів, які здатні специфічно зв'язуватися з тау-білком, і зокрема, з людським тау-білком, і в одному варіанті здійснення проявляють здатність до специфічного зв'язування з фосфорилованим залишком 5396 (ре396) людського тау-білка. Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом додатково характеризуються тим, що вони не здатні або практично не здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим сериновим залишком 404 (рбБ404) в людському тау-білку, наприклад, в умовах обмеженої кількості антитіл або ненасичувальних умовах. Додатково, фосфорилування в рб404 не перешкоджає специфічному зв'язуванню з епітопами, що містять роз396. Використовувані в даному описі позначення "ре" і "РІЗ" означають фосфосериновий амінокислотний залишок і подальші номери визначають положення залишку по відношенню до послідовності під 5ЕО ІО МО: 1. Як використовується в даному описі, антитіло "практично" не здатне зв'язуватися з епітопом, якщо стосовно іншого епітопу таке зв'язування складає менше 20 96, менше 10 95, менше 5 956, менше 2 9о і переважніше менше 1 95 від зв'язування, спостережуваного для такого іншого епітопу.
Термін "антитіло" (АБ) в контексті цього винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну або, згідно з деякими варіантами здійснення цього винаходу, до фрагмента молекули імуноглобуліну, які мають здатність до специфічного зв'язування з епітопом молекули
Сантигену"). Антитіла, що зустрічаються в природі, в типовому випадку є тетрамерами, які зазвичай складаються щонайменше з двох важких ланцюгів (НС) і щонайменше двох легких ланцюгів (НІ). Кожен важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (скорочено званого в даному описі МН) ії константного домену важкого ланцюга, що зазвичай складається з трьох доменів (СНІ, СН2 і СНЗ). Важкі ланцюги людини можуть відноситися до будь-якого ізотипу, включаючи Ідсї (підтипи ІДС, Іде, ІдсЗ3 і 4054). Кожен легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (скорочено званого в даному описі МІ) і константного домену легкого ланцюга (СІ). Легкі ланцюги людини включають каппа-ланцюги і лямбда-ланцюги. Варіабельний домен важкого і легкого ланцюгів в типовому випадку відповідає за розпізнавання антигену, а константний домен важкого і легкого ланцюгів може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, в тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (С14д) класичного шляху активації системи комплементу. МН- і МІ -домени можуть додатково підрозділятися на гіперваріабельні домени, звані "ділянками, що визначають комплементарність" (СОР), які чергуються з доменами з консервативнішою послідовністю та які називаються "каркасними ділянками" (ЕН). Кожен УН їі МІ складається з трьох СОВ-доменів і чотирьох ЕВ-доменів, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку:
ЕВ1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕА3-СО83-ЕВ4. Варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Особливо відповідними є антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, які були "виділені" таким чином, щоб вони існували у фізичному середовищі, що відрізняється від середовища, в якому вони можуть зустрічатися в природі, або які були модифіковані так, щоб вони відрізнялися за амінокислотною послідовністю від антитіла, що зустрічається в природі, або їх епітопзв'язувальних фрагментів.
Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або цукрові бічні ланцюги, і зазвичай мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і лінійні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не з останніми, завжди втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може містити амінокислотні залишки, що безпосередньо беруть участь у зв'язуванні, і інші амінокислотні залишки, які безпосередньо не беруть участь у зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, що ефективно блокуються пептидом, що специфічно зв'язується з епітопом (іншими словами, амінокислотний залишок знаходиться в межах ділянки розпізнавання для пептиду, що специфічно зв'язується з епітопом).
Використовуваний в даному описі термін "епітопзв'язувальний фрагмент антитіла" означає фрагмент, частину, ділянку або домен антитіла (незалежно від того, як вони отримані (наприклад, шляхом розщеплювання, рекомбінантним шляхом, синтетичним шляхом і т. п.)), які здатні специфічно зв'язуватися з епітопом. Епітопзв'язувальний фрагмент може містити 1, 2, 3, 4, 5 або усі 6 СОВ-доменів такого антитіла і, не дивлячись на те, що здатний специфічно зв'язуватися з таким епітопом, може проявляти специфічність, афінність або селективність стосовно того епітопу, який відрізняється від епітопу для такого антитіла. Переважно, проте, щоб епітопзв'язувальний фрагмент містив усі б СОВ-доменів такого антитіла.
Зо Епітопзв'язувальний фрагмент антитіла може являти собою або містити частину одного поліпептидного ланцюга (наприклад, в з5сЕм) або може являти собою або містити частину двох або більше поліпептидних ланцюгів, кожна з яких має аміно-кінець і карбоксильний кінець (наприклад, в діатілі, Рар-фрагменті, Раьг-фрагменті і т. п.). Фрагменти антитіл, які проявляють здатність до зв'язування з епітопом, можна отримати, наприклад, шляхом розщеплювання інтактних антитіл протеазами. Переважніше, щоб, не дивлячись на те, що два домени Еу- фрагмента, МІ ї МН, в природних умовах кодуються окремими генами, полінуклеотиди, які кодують такі послідовності генів (наприклад, їх кодуючу кКДНК), можна було за допомогою рекомбінантних способів з'єднати гнучким лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому МІ- і МН-ділянки асоційовані одна з одною з утворенням одновалентних епітопзв'язувальних молекул (відомих як одноланцюгові Ем (5сЕм); див., наприклад, Віга єї аї!., (1988) Зсієпсе 242:423-426; і Нивюоп еї а!. (1988) Ргос. Маї). Асад. 5сі. (0О.5.А.) 85:5879-5883). Як альтернатива, шляхом використання гнучкого лінкера, який є дуже коротким (наприклад, має довжину менш ніж приблизно 9 залишків) для того, щоб забезпечити можливість асоціації МІ- ії МН-доменів одного поліпептидного ланцюга один з одним, можна утворити біспецифічне антитіло, діатіло або аналогічну молекулу (у якій два такі поліпептидні ланцюги асоціюють один з одним з утворенням двовалентної епітопзв'язувальної молекули) (див. наприклад, РМАБ БА 90(14), 6444-8 (1993) стосовно опису діатіл). Приклади епітопзв'язувальних фрагментів, що охоплюються цим винаходом, включають (ї) Рар'- або Рар- фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з МІ-, МН-, СіІ- ії СНіІ-доменів, або одновалентне антитіло, описане в УМ/О 2007059782; (ії) Е(ар)2-фрагменти - двовалентні фрагменти, що містять два Рар-фрагменти, з'єднані дисульфідним містком в шарнірному домені; (ії) Ба-фрагмент, що по суті складається з МН- і СНІ1-доменів; (ім) Ем-фрагмент, що по суті складається з МІ - і МН-доменів, (м) ЧАбБ-фрагмент (УМага еї аї, Маїште 341, 544-546 (1989)), який по суті складається з МН-домену і також називається доменним антитілом (Ної! еї аї;
Тгепаз Віоїесппої. 2003 Мом;2(П): 484-90); (мі) антитіла верблюжих або нанотіла (Немеїв 6ї аї;
Ехреп Оріп Віо! Тег 2005 Цдап;5 (І): 1 11-24) і (мії) виділену ділянку, що визначає комплементарність (гіперваріабельну ділянку) (СОВА). Додатково, не дивлячись на те, що два домени Еу-фрагмента, МІ і МН, кодуються окремими генами, їх за допомогою рекомбінантних способів можна з'єднати синтетичним лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у 60 вигляді одного білкового ланцюга, в якому МІ- і МН-домени знаходяться в парі, з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга єї аЇ, Зсівєпсе 242,423-426 (1988), і Нивіюп еї аі., РМА5 БА 85, 5879-5883 (1988)). Ці ї інші фрагменти антитіл, застосовні в контексті цього винаходу, додатково обговорюються в даному описі. Також слід розуміти, що термін "антитіло", якщо не вказане інше, також включає антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, що зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (епітопзв'язувальні фрагменти), отримувані за допомогою будь-якої відомої методики, такої як ферментативне розщеплювання, синтез пептидів і рекомбінантні методики. Отримане антитіло може мати будь-який ізотип. Як використовується в даному описі, "ізотип" відноситься до класу імуноглобуліну (наприклад, Ід, де, дз або ІдДС24), що кодується генами константних доменів важких ланцюгів. Такі фрагменти антитіл отримують за допомогою традиційних методик, відомих фахівцям в даній галузі; при цьому відповідні фрагменти, здатні зв'язуватися з бажаним епітопом, можна без зусиль піддати скринінгу стосовно корисності таким же чином, як і інтактне антитіло. У одному варіанті здійснення Ес-ділянка антитіл за цим винаходом містить мутацію, яка модулює ефекторні функції.
Термін "біспецифічне антитіло" відноситься до антитіла, що містить два незалежні епітопзв'язувальні фрагменти, кожен з яких націлюється на незалежні мішені. Ці мішені можуть бути епітопами, присутніми в різних білках, або різними епітопами, присутніми в одній і тій же мішені. Молекули біспецифічних антитіл можна отримувати за допомогою компенсаторних змін амінокислот в константних доменах НС початкових молекул моноспецифічних двовалентних антитіл. Отримане в результаті гетеродимерне антитіло містить один Раб, внесок в утворення якого вносять два різні початкові моноспецифічні антитіла. Зміни амінокислот в Ес-домені приводять до підвищення стабільності гетеродимерного антитіла з біспецифічністю, стабільною за часом. (Нідомжау еї аї, Ргоївіп Епдіпеегіпуд 9, 617-621 (1996), СсипазеКагап еї аї, УВС 285, 19637-1 (2010), Мооге єї аі, МАБз 3:6 546-557 (2011), 5ігор вї аї, УМВ 420, 204-219 (2012), Меїх єї аІ.,, Ргоївіп Епадіпеегіпуд 25:10 571-580 (2012), Іабгі|їп еїаій, РМАБ 110:113, 5145-5150 (2013),
Зргеїег Моп Кгецйдепвієїп еїам, МАБ5 5:5 646-654 (2013)). Біспецифічні антитіла також можуть включати молекули, що отримуються за допомогою злиття 5сЕм. Два моноспецифічні 5сЕм потім незалежно з'єднують з Ес-доменами, здатними утворювати стабільні гетеродимери, з
Зо отриманням однієї біспецифічної молекули (Мабгу еї аї.,, РЕОБ5 23:33 115-127 (2010).
Біспецифічні молекули мають здатності до подвійного зв'язування.
Терміни "С10-2", "людське С10-2", "нС10-2", "НС1Т0-2", "нС10.2", "Гуманізоване С10-2" і "гуманізоване С10-2", як використовується в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і визначаються як антитіло С10-2. Даний термін призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що має: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що має: (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 7; і (3 СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 8, або що складаються з них.
Антитіло С10-2 являє собою гуманізоване антитіло, яке може бути визначене як таке, що містить важкий ланцюг під 5ЕО ІЮ МО: 11, легкий ланцюг під 5ЕО ІЮО МО: 12 або обидва. Один варіант здійснення цього винаходу направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять важкий ланцюг під ЗЕО ІО МО: 11 і легкий ланцюг під 5ЕО ІЮ МО: 12.
Термін "тпС10-2", використовуваний в даному описі винаходу і на фігурах, призначений
БО означати мишаче антитіло С10-2 і визначається під 5ЕО ІО МО: 9 і 10. Мишаче антитіло С 10.2 використовується як контрольне антитіло і не є частиною цього винаходу.
Терміни "нС10-2 М325"7 і "С10-2М325"7, використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 32 за типом заміни М на 5, ії визначаються як антитіло М325. Терміни "пС10-2 МЗ320" ії "С10-2М320О", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 32 за типом заміни М на С), і визначаються як антитіло
М3290.
Терміни "нС10-2 М3457 і "С10-2 М345", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 34 за типом заміни М на 5, ії визначаються як антитіло М345. Терміни "пС10-2 М340" ії "С10-2М340", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 34 за типом заміни М на С), і визначаються як антитіло
М340).
Терміни "нС10-2 М325 М3457 і "С10-2 М325 М345"7, використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутації амінокислотних залишків 32 і 34 за типом заміни М на 5, і визначаються як антитіло МЗ325, М345. Терміни "НС10- 2 М320 М3457 і "Сб10-2 М320 М345", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутації амінокислотних залишків 32 і 34 за типом заміни М на О і за типом заміни М на 5 відповідно, і визначаються як антитіло МЗ32О, М345.
Терміни "нС10-2М320 М340" і "С10-2 М320 М340", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутації амінокислотних залишків 32 і 34 за типом заміни М на С), і визначаються як антитіло М32О, М340). Терміни "пС10-2 М325 М340" і"С10-2 М325 М340", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутації амінокислотних залишків 32 і 34 за типом заміни М на 5 і за типом заміни М на О відповідно, і визначаються як антитіло М3З25, М340.
Терміни "НС10-2 О55Е" і "С10-2 О55Е", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 55 за типом заміни О на Е, і визначаються як антитіло О55Е. Терміни "нС10-2 0550", "С10-20550", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є
Зо варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 55 за типом заміни О на С), і визначаються як антитіло 0550. Терміни "нС10-20555"7, "Сб10-20555", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 55 за типом заміни О на 5, і визначаються як антитіло 0555.
Терміни "нС10-2 АТО1Т" і "С10-2 А101Т", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 101 за типом заміни А на Т, і визначаються як антитіло А101Т.
Терміни "йС10-2 М325 АТО01Т", "С10-2 М325 АТО01Т", "вС10-2 АТО1Т М3257 і "С10- 2 АТ01Т М325", використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 101 за типом заміни А на Т, ї де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 32 за типом заміни М на 5, і визначаються як антитіло МЗ25, АТО1Т.
Терміни "йС10-2 М320О АТО01Т", "С10-2 М320О0 АТО1Т" нС10-2 АТО1Т МЗ2О" ії "С10- 2 АТ01Т М320, використовувані в даному описі винаходу і на фігурах, маються на увазі як синоніми і є варіантами антитіла С10-2, де важкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 101 за типом заміни А на Т, ї де легкий ланцюг був підданий мутації таким чином, щоб принаймні містити мутацію амінокислотного залишку 32 за типом заміни М на С), і визначаються як антитіло МЗ2О, АТО1Т.
Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл", використовувані в даному описі винаходу, відносяться до препарату з молекул антитіл єдиного молекулярного складу. Традиційна композиція она основі моноклональних антитіл характеризується єдиною специфічністю зв'язування і афінністю до конкретного епітопу. У певних варіантах здійснення моноклональне антитіло може складатися із понад одного Еар- домену з підвищенням таким чином специфічності більш ніж до однієї мішені. Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" не призначені обмежуватися будь-яким конкретним способом отримання (наприклад, рекомбінантним, бо трансгенним, гібридомним і т. п.).
Антитіла за цим винаходом і їх епітопзв'язувальні фрагменти переважно є "гуманізованими", зокрема, якщо вони використовуються для терапевтичних цілей. Термін "гуманізований" відноситься до молекули, що зазвичай отримується за допомогою рекомбінантних методик, яка має епітопзв'язувальну ділянку, отриману з імуноглобуліну від виду, відмінного від людини, і решту структури імуноглобуліну, в основі якої лежить структура і/або послідовність людського імуноглобуліну. Епітопзв'язувальна ділянка може містити або повні варіабельні домени антитіла, відмінного від людського, злиті з людськими константними доменами, або тільки ділянки, що визначають комплементарність (СОВ), або їх частини, таких варіабельних доменів, прищеплені до відповідних людських каркасних ділянок людських варіабельних доменів.
Залишки каркасних ділянок таких гуманізованих молекул можуть бути дикого типу (наприклад, повністю людськими), або вони можуть бути модифіковані так, щоб містити одну або декілька амінокислотних замін, що не виявляються в людському антитілі, послідовність якого служила як основа для гуманізації. Гуманізація зменшує або усуває вірогідність того, що константний домен молекули діятиме як імуноген у індивідуумів-людей, проте можливість вироблення імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен зберігається (ГоВидію, А.Р. еї аї. (1989) "Моизе/Нитап Спітетгіс Мопосіопа! Апіїроду Іп Мап: Кіпеїїс5 Апа Іттипе Незропзе", Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. (0.5.А.) 86:4220-4224). Інший підхід фокусується не тільки на отриманні константних доменів людського походження, але також і на модифікації варіабельних доменів таким чином, щоб реконструювати їх якомога ближче до людської форми. Відомо, що варіабельні домени як важкого, так і легкого ланцюгів містять три ділянки, що визначають комплементарність (СОР), які розрізняються за відповіддю на антигени, що розглядаються, і визначають здатність до зв'язування, фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕВ), які є відносно консервативними у даного виду і які імовірно забезпечують остов для СОН. У тих випадках, коли антитіла, відмінні від людських, отримують у відношенні конкретного антигену, варіабельні домени можна "реконструювати" або "гуманізувати" шляхом трансплантації СОВ, що походять від антитіла, відмінного від людського, на ЕВ, що присутні в людському антитілі, яке підлягає модифікації.
Про застосування даного підходу до різних антитіл повідомлялося в зай, К. еї а!. (1993) Сапсег
Ве5 53:851-856. Віесптапп, Г. еї аї. (1988) "Не5Ппаріпа Нитап Апііродіє5 Тог Тнегару", Маїшйге 332:323-327; Мепоеуеп, М. еї аї. (1988) "Ве5паріпд Нитап Апііродієв: Стайіпд Ап АпіШувзогуте
Зо Асіїмпу", Зсіепсе 239:1534-1536; КешШерогоцди, С А. єї аї. (199197 Нитапігайоп ОЇ А Моизе
Мопосіопа! Апібоду Ву СОВ-Стайіпу: Те Ітропапсе ОЇ Егатемжок Везідие5 Оп Іоор
Сопіоптаїййоп", Ргоївіп Епаіпеєегіпу 4:773-3783; Маєда, Н. еїа!. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ Везпнареа
Нитап Апіїродієз Мп НІМ-Мешкнаїїгіпу Асіїмпу", Нитап Апіїродієз Нубгідота 2:124-134; Согптап,
З. 0. еїа!. (1991) "НезНнаріпаА Тнегареціїс СА Апіїбоду", Ргос. Маї). Асад. сі. (0О.5.А.) 88:4181- 4185; Тетрезі, Р.В. еїа!ї. (1991) "НезПпаріпд А Мопосіопа! Апіїроду То Іппірії Нитап Незрігайгу зЗупсуйа! Мігив ІпТесійоп іп мімо", Віо/Гесппоіоду 9:266-271; Со, М. 5. еїа). (199197 Нитапігей
Апііродієз Рог Апіїміга! Тнегару", Ргос. Маї!. Асай. 5сі. (0О.5.А.) 88:2869-2873; Сапег", Р. еїа!. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апії-рів5йег2 Апіїрбоду Бог Нитап Сапсег Тегару", Ргос. Май). Асад. зсі. (0.5.А.) 89:4285-4289; і Со, М.5. еї аї. (1992) "Спітейс Апа Нитапігейд Апіїродіеєз М/Н Зресіїйсну
Бог Те СОЗ33 Апіїдеп", У. Іттипої. 148:1149-1154. У деяких варіантах здійснення в гуманізованих антитілах зберігаються всі послідовності СОВА (наприклад, в гуманізованому мишачому антитілі, яке містить усі шість СОВА від мишачих антитіл). У інших варіантах здійснення гуманізовані антитіла мають одну або декілька СОВ (одну, дві, три, чотири, п'ять, шість), змінених в порівнянні з початковим антитілом, які також називають однією або декількома СОВА, "отриманими з" однієї або декількох СОВ початкового антитіла. Можливість гуманізації антитіла добре відома (див., наприклад, патенти США МоМо 5225539; 5530101; 5585089; 5859205; 6407213; 6881557).
Термін "антитіло "ХХ" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент (наприклад, антитіло "С10-2"), що містять: (а) легкий ланцюг і важкий ланцюг, варіабельний домен важкого ланцюга або СОВ1-3 варіабельного домену важкого ланцюга, визначені за їх відповідним 5ЕО ІЮО МО, або (р) варіабельний домен легкого ланцюга і важкий ланцюг, варіабельний домен важкого ланцюга або СОВ1-3 варіабельного домену важкого ланцюга, визначені за їх відповідним 5ЕО ІО МО, або (с) СОВ 1-3 варіабельного домену легкого ланцюга, визначені за їх відповідним 5ЕО ІЮ МО, і важкий ланцюг, варіабельний домен важкого ланцюга або СОВ1-3 варіабельного домену важкого ланцюга, визначені за їх відповідним 5ЕО
ІО МО, або такими, що складаються з них. У певних варіантах здійснення антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент визначені їхнім повним варіабельним доменом важкого ланцюга, визначеним за його 5ЕО ІО МО, і їх варіабельним доменом легкого ланцюга, визначеним за його
ЗЕО І МО.
Якщо в даному описі не вказане інше, нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константному домені антитіла відповідає системі нумерації ЄЮ, яка також називається ЕО- індексом, яка описана в КаБбаї єї аі, Зедиепсевз ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, Бій Еа. Рибіїс
Неацй 5егуісе, Маїйопаї Іпзійшез ої Неайн, Веїйезаа, МО, 1991.
У деяких антитілах тільки частина СОН, а саме підмножина залишків СОВ, потрібних для зв'язування, що називається 508, необхідна для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі. Залишки СОВ, що не контактують з відповідним епітопом і не містяться в ОВ, можна ідентифікувати на підставі попередніх досліджень. Наприклад, залишки Туг, 5ег, Сіп, Гув, РНе,
Сіп, відповідні залишкам 60-65 НС під 5ЕО ІЮ МО: 11, часто не є необхідними для виділення з ділянок СОВ за Кабаї (вони також зустрічаються в СОН2 НС (ЗЕО ІО МО: 7), що знаходяться за межами гіперваріабельних петель за Споїпіа (див. Кабаї єї аї. (1992) бедиепсев ої Ргоївїп5 ої
Іттипоіодіса! Іпієгеві, Маїйопаї Іпзійшев ої Неайй, публікація Мо 91-3242; Споїпіа, С еї а!. (1987) "Сапопіса! Зіписіцгез Бог Те Нурегуагтіабіє Редіоп5 ОЇ Іттиподіориїйп5", У. Мої. Віо!ї. 196:901- 917), за допомогою молекулярного моделювання і/або емпіричним шляхом або згідно з описаним в Соплаїез, М.А. еї аї. (2004) "ОВ Стацйіпуд Ої А Мигіпе Апіїбоду О5іпд Мийіріе Нитап
Септіїйе Тетріаїєз То Міпітіге 5 Іттиподепісйу", Мої. ІттипоїЇ. 41:863-872. У таких гуманізованих антитілах в положеннях, в яких відсутні один або декілька залишків донорного
СОР або в яких пропущений весь донорний СОР, амінокислота, що займає певне положення, може бути амінокислотою, що займає відповідне положення (згідно з нумерацією за Кабраї) в акцепторній послідовності антитіла. Кількість таких замін акцепторних амінокислот на донорні в
СОН, які потрібно включити, відображає баланс альтернативних думок. Такі заміни є потенційно переважними для зниження кількості мишачих амінокислот в гуманізованому антитілі і зниження внаслідок цього потенційної імуногенності. Проте, заміни також можуть обумовлювати зміни афінності, і переважно уникають значного зменшення значень афінності. Положення для заміни в межах СОВ і амінокислоти, необхідні для заміни, також можна вибрати емпіричним шляхом.
Антитіла також характеризують згідно з системою нумерації ІМСТ, яка чітко визначена в рівні техніки. Довжина (за числом амінокислот, тобто за числом зайнят их положень) є важливим і початковим поняттям ІМаИТ-ОМТОГОам (пир:/Лимлу.іїтої.ог9). За значеннями довжини СОВ-ІМОИТ характеризують Ій і М-ДІЛЯНКИ ТЕ генів зародкової лінії і М-"ДОМЕНИ
Зо реаранжированих генів, КкДНК і білки.
Наприклад, антитіла можна характеризувати згідно з схемою нумерації за СНошіа пЕрулимли.ріоіпт.огу. ик/аб5/. Схема нумерації за Споїпіа є ідентичною схемі за Кабаї, проте відбуваються вставки в СОВ-І1 і СОВ-НІ в структурно визначених положеннях. Схема нумерації за Споїйтіа заснована на положенні структурних ділянок-петель. Це означає, що топологічно еквівалентні залишки в цих петлях отримують однакову мітку (на відміну від схеми за Кабаї).
Той факт, що зміна однієї амінокислоти в залишку СОВ може приводити до втрати функціонального зв'язування (Ниадікой, 5. еїс... (1982) "Біпдіє Атіпо Асій Б!ирвійшіоп Айегіпд
Апіідеп-Віпаіпуд Зресіїйсну", Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (ОБА) 79(6): 1979-1983), забезпечує можливість систематичної ідентифікації альтернативних функціональних послідовностей СОВ. У одному переважному способі отримання таких варіантів СОВА полінуклеотид, що кодує СОВ, піддають мутагенезу (наприклад, за допомогою випадкового мутагенезу або за допомогою сайт- спрямованого способу (наприклад, ампліфікації, опосередкованої полімеразною ланцюговою реакцією, з праймерами, що кодують мутантний локус)) з отриманням СОВА, що має замінений амінокислотний залишок. Шляхом порівняння за відповідним залишком ідентичності початкової (функціональної) послідовності СОВА з ідентичністю варіанта послідовності СОВ із заміною (нефункціональної) для цієї заміни можна визначити вагу заміни згідно з ВІ О5ИМБб2.Її|. У системі ВГОБОМ представлена матриця амінокислотних замін, що створюється шляхом аналізу бази даних послідовностей відносно достовірних вирівнювань (Едау, 5.8. (2004) "МУНеге біа Те в'ОБОМб2 Аїїдптепі 5соге Маїйгїх Соте Егот?", Маїшге Віоїесн. 22(8):1035-1036; Непікоїй, у.а. (1992) "Атіпо асіа зирвійшіоп таїйгісе5 їгтот ргоївіп БіосК5", Ргос. Маї!. Асад. сі. (ОБА) 89:10915- 10919; Капіп, 5. еїаіІ. (1990) "Меїнод5е Рог Авзезвзіпу Те еіаїївіїса! бідпітісапсе ОЇ Моїіесшіаг
Зедиєпсе ЕРеаштев Ву Овіпуд Сепега! бсогіпд Зспетев" Ргос. Маї!. Асад. сі. (О5А) 87:2264-2268;
Аївепиї, 5.Р. (1991) "Атіпо Асіа 5иБ5шйшіоп Маїгісе5 Егот Ап Іптоптаїйоп ТНеогеїїс Регзресіїме",
У. Мої. Віої. 219, 555-565. В даний час найбільш досконалою базою даних ВІ ОБИМ є база даних в'озИОМб2 (ВГОЗИМба.ЇЇ)). У таблиці 1 представлені значення ваги замін згідно з В ОБОМб2. Її) (чим більша вага, тим консервативнішою є заміна і, таким чином, тим ймовірніше, що заміна не впливатиме на функцію). Якщо епітопзв'язувальний фрагмент, що містить отриману в результаті СОВ, не може зв'язуватися з тау-білком, наприклад, то вважають, що вага заміни 60 згідно з В ОБИМБб2.Її| свідчить про її недостатню консервативність, і вибирають і проводять нову заміну-кандидата, що має більшу вагу заміни. Таким чином, наприклад, якщо початковим залишком був глутамат (Е), а нефункціональним замінюючим залишком був гістидин (Н), то вага заміни згідно з ВІ О5ИМб2.їїЇ дорівнювала 0, і консервативніші зміни (як, наприклад, на аспартат, аспарагін, глутамін або лізин) є переважними.
Таблиця 1
ТА ВнІмМІо|с Іо |ЕЇСІН|І! с у уукІмМм Іє|РЇ5| ТМ
АЇзч 1 2г|2г|о|7л7|л7|10| 2 ліг члініо| з ее |о віл о|2|з|ніо|| 2103 22 131 2|| | 3 2 | з міг 061-330 |о0|0|н/|з з 0 2/1 3з3| 2і|н/|о | 4 | -2 | з оІ2 2-16! 3|0|е|л| 13 4 1 31311011 4 з | з со 3131-3159 4|3| 31 1 3 1 2|3|ч|1| 21 2 | лі о|лініого|з3|65|е| 2103 2 ян о з3|ч10|| 2 1 | 2
ЕЇлЛ О101ч2| 4|2|5| 2103 З ні 2 310 3 2 | 2 сао г2г/о0о1|-71|-31|2|-21|6|2| 4 4 2 31 3| 210 | 2 2 | з | з нІгіо їні з1|01|0| 21-83 3 1 211211 2 2 | ч2 | З 11713133 31|3|4| 3-4 2 з нм 0| 31 2/1 3 7
Іл 1213471 21|3|4| 324 212103 2г| 1 2 7 | ні кіло ліз нінігі| т 2513-13 2 | г млі 2 з|1101|2 3 2гініча|л 50 2|л|17 7 | 1
ЕЕГ 21-31-31-31|21/-31|3|3|1|0 103 01-61 4| 2| 2 я | 3 | т
РІ 2121-1312 2|3 3 21 4|7|ч|ч| 4 3 | 2 5Інілініо|л7|о0|0|0|ч|2 210 1214 | 2 то лоти 22 літе аг г
МІо|з313| || 2|2|-3| || ні гін | 2 2/0 | з | 7 | м
Цей винахід, таким чином, передбачає застосування випадкового мутагенезу для ідентифікації покращених СОВ. У контексті цього винаходу консервативні заміни можуть бути визначені як заміни в межах класів амінокислот, відображених в одній або декількох з таблиць 2, З або 4.
Таблиця 2
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця З
Альтернативні класи амінокислотних залишків для консервативних замін ннжиншижиннн нин шини 8м1 111 2 4в1Г1111к
БМ
611 мХММм
Таблиця 4
Альтернативні фізичні і функціональні класифікації амінокислотних залишків
Групи консервативніших замін включають валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін і аспарагін-глутамін.
Додаткові групи амінокислот також можуть бути складені з використанням принципів, описаних, наприклад, в Стєіїдйіоп (1984) Ргоїєїпв: Біписішге ап Моїіесшціаг Ргорепіввз (24 Ева. 1993), МУ. Н. Егеетап апа Сотрапу.
Як альтернативу можна застосовувати технологію фагового дисплея для підвищення (або зниження) афінності СОВ. У цій технології, званій дозріванням афінності, використовується мутагенез або "прогулянка по СОВ" і повторний відбір із застосуванням антигену-мішені або його антигенного епітопзв'язувального фрагмента для ідентифікації антитіл, що мають СОН, які зв'язуються з вищою (або нижчою) афінністю з антигеном в порівнянні з первинним або початковим антитілом (див., наприклад, Сіавзег еї аї!. (1992) 9). Іттипоіоду 149:3903). Мутагенез цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів, приводить до отримання напіввипадкового набору амінокислотних мутацій. Можна конструювати бібліотекию, що складаються з пулу варіантів клонів, кожен з яких відрізняється однією зміною амінокислоти в одній СОВ, який також містить варіанти, що представляють кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку СОВ.
Мутантні форми з підвищеною (або зниженою) афінністю зв'язування з антигеном можна піддати скринінгу шляхом приведення іммобілізованих мутантних форм в контакт з міченим антигеном. Можна застосовувати будь-який спосіб скринінгу, відомий з рівня техніки, для ідентифікації мутантних антитіл з підвищеною або зниженою афінністю до антигену (наприклад,
ЕПІЗА) (див. Ми єї аі). 1998, Ргос. Май. Асад. сі. (0.5.А.) 95:6037; Мейоп еї а!., 1995, У.
Іттипоіоду 155:1994). Можливо також застосовувати прогулянку по СОВА, в ході якої легкий ланцюг піддається випадковому мутагенезу (див. 5спіег єї а!., 1996, у). Мої. Віо. 263:551).
Способи виконання такого дозрівання афінності описані, наприклад, в Кгаиве, у.б. єї ап (2011) "Ап Іпвзепіоп Миїайоп Тнаї Оівіоп5 Апіїроду Віпаїпод не Агспіесійге Епнапсев ЕРипсійп ОЇ
А Нитап Апііїроду", МВіо. 2(1) рії: е00345-10. дої: 10.1128/тпВіо.00345-10; Киап, С.Т. єї аї. (2010) "Аніпіку-МаїигедАпії-Сіусоргоївіп ММВ ВАесотрбіпапі Іттипоїохіп5 Тагдеїпуд Маїїдпапі Спіїотав
Апа Меїапотав", Іпії. У. Сапсег 10.1002/|с25645; НаскКеї, В.). еї аї. (2010) "Зарійу Апа сов Сотрозійоп Віазе5 Епгісп Віпдег Рипсііопаїйу І апазсарев", у. Мої. Віої. 401(1):84-96; Мопідотегу,
О.С. еїаї. (2009) "Аніпіу Маїшгайоп Апа СпНагасіегігайоп ОЇ А Нитап Мопосіопа! Апіїроду Адаїпві
НІМ-1 ар41", МАбБз 1(5):462-474; Стивіспіпа, Е. еї аї. (2009) "Айіпйу Маїишгайоп Ву Тагодеїва
Оімегвіїїсайоп ОЇ Те СОВ-НЕ2 Іоор ОЇ А Мопосіопа! Раб Оеєгімед Рот А Зупіпеїїс Маїме Нитап
Апіїбоду Гіргагу Апа Оігесієй Адаїп5і Те Іпіеттаї! Тгітегтіс Сойеа-Соїї ОгїСр41 Мієїдв А 5еї ОтРарзт
ММ Ітргомей НІМ-1 Мешгаїї2гайоп Роїепсу Апа Вгеадій", Мігоіоду 393(1): 112-119; Ріпіау, М... еїаі. (2009) " АНіпйу Маїцйгайоп ОЇ А Нитапігед Наї Апіроду Рог АМТІ-ВАСЕ Тнегару:
СотргеНепвзіме Миїадепевзіз Немваїв А Нідн Геме! ОїМшиаїйопаї! Ріавіїспу Воїй Іпвіде Апа Оцівіде
Тпе Сотріетепіатпу-Оеїептіпіпоа Ведіопв", ). Мої. Віої. 388(3):541-558; Вовігот, 9. еїаї. (2009) "Іптргоміпа Апіїроду Віпаіпа Айіпйу Апа Зресіїйсну Рог ТНегарешіс ЮемеІортепі", Меїнодз» Мо).
Віої. 525:353-376; 5івідіІ, 5. еїаІ. (2008) "п Міго Айіпйу Маїшгайоп ОЇ Нитап СМ-С5Е Апіїродієв
Ву Тагдеїєа СОВ-Оімегвійсайоп", Мої. Іттипої!. 46(1):135-144; і Вагаегав, В. єї аї. (2008) "Аніпйу
Маїсгаїйоп ОГї Апіібодієв Аввзівієй Ву Іп 5іїїсо Моаеїїпд", Ргос. Маї!. Асад. сі. (ОА) 105(26):9029- 9034.
Таким чином, послідовність варіантів СОВ охоплюваних антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів може відрізнятися від послідовності СОВА початкового антитіла, варіантів С10-2 і
С10.2 завдяки замінам; наприклад, заміненим 4 амінокислотним залишкам, З амінокислотним залишкам, 2 амінокислотним залишкам або 1 амінокислотному залишку. Згідно з варіантом здійснення цього винаходу додатково передбачається, що амінокислоти в СОВ-ділянках можна замінювати за допомогою консервативних замін, визначених в З таблицях вище. Наприклад, кислий залишок Азр можна замінити на Сіи без значного впливу на характеристики зв'язування антитіла.
Як використовується в даному описі, говорять, що антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент "специфічно" зв'язуються з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо вони реагують або асоціюються з цим епітопом частіше, швидше, з більшою тривалістю і/або з більшою афінністю або авідністю в порівнянні з альтернативними епітопами. Також при прочитанні цього визначення слід розуміти, що, наприклад, антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з першою мішенню, можуть специфічно або переважно зв'язуватися з другою мішенню або можуть не робити цього.
Використовуваний в даному описі термін "зв'язування", що застосовується до зв'язування антитіла із попередньо визначеним антигеном, в типовому випадку відноситься до зв'язування з афінністю, відповідною КО, що становить приблизно 107 М або менше, як, наприклад, приблизно 108 М або менше, як, наприклад, приблизно 107 М або менше, при визначенні за допомогою, наприклад, технології поверхневого плазмонного резонансу (ЗРА) на приладі
ВІАсогеФ 3000 із застосуванням антигену як ліганду і антитіла як аналізованої речовини, ії до зв'язування із попередньо визначеним антигеном з афінністю, відповідною КО, щонайменше вдесятеро нижчою, як, наприклад, щонайменше в 100 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 1000 разів нижчою, як, наприклад, щонайменше в 10000 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 100000 разів нижчою, ніж для його афінності зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, В5БА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену, або близькоспорідненим антигеном. Величина, на яку афінність є нижчою, залежить від КО антитіла, так що якщо КО антитіла є дуже низькою (тобто антитіло є високоспецифічним), то величина, на яку афінність до антигену є нижчою, ніж афінність до неспецифічного антигену, може бути щонайменше 10000-кратною.
Термін "Ка" (с-1 або 1/с), використовуваний в даному описі, відноситься до константи швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену. Вказане значення також називають значенням Кої!ї.
Термін "ка" (М-1 х с-1 або 1/Мс), використовуваний в даному описі, відноситься до константи швидкості асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену.
Термін "КО" (М), використовуваний в даному описі, відноситься до рівноважної константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення Ка на ка.
Термін "КА" (М-1 або 1/М), використовуваний в даному описі, відноситься до рівноважної константи асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення ка на Ка.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента, які проявляють одну або декілька наступних властивостей: (ї) практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (її) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404 (ре404); (мі) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей /Т94510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білка щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з екстрактами головного мозку, отриманими посмертно від людей з АЮ.
Додатковий варіант здійснення цього винаходу відноситься до способу отримання 60 високоспецифічних високоафінних антитіл, де вказаний спосіб включає стадії:
(А) проведення ін'єкції імуногена ссавцеві з тим, щоб імунізувати вказаного ссавця; (В) повторення вказаної імунізації вказаного ссавця два або більше разів; (С) проведення скринінгу зразка сироватки від вказаного повторно імунізованого ссавця щодо наявності необхідних високоспецифічних високоафінних антитіл, але в значно меншому ступені здатних зв'язуватися з іншим білком; і (р) добування вказаних високоспецифічних високоафінних антитіл.
Таким чином, цей винахід відноситься до високоспецифічного високоафінного антитіла до патогенного гіперфосфорилованого тау-білка, що містить гіперфосфорилований залишок 5396.
Такі антитіла можуть бути отримані за допомогою адаптації вищезгаданого способу отримання високоспецифічних високоафінних антитіл шляхом: (А) проведення ін'єкції імуногена ссавцеві при цьому вказаний імуноген містить дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30 послідовних амінокислотних залишків, що містять
ТОНОАЕІМУКРВЇРМУМУБООЮТОРВАНІ. (5ЕО ІО МО: 2), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2МАВ, з тим, щоб імунізувати вказаного ссавця; (В) повторення вказаної імунізації вказаного ссавця два або більше разів; (С) проведення скринінгу зразка сироватки крові від вказаного багато разів імунізованого ссавця щодо наявності високоспецифічних високоафінних антитіл, здатних зв'язуватися з патогенним гіперфосфорилованим тау-білком, що містить фосфорилований залишок 5396, але в значно меншому ступені здатних зв'язуватися з непатогенним тау-білком; і (р) добування вказаних високоспецифічних високоафінних антитіл.
Як використовується в даному описі, "практично відсутня здатність" до зв'язування з молекулою тау-білка означає більш ніж 20 95 різницю, більш ніж 40 95 різницю, більш ніж 60 95 різницю, більш ніж 80 95 різницю, більш ніж 100 95 різницю, більш ніж 150 95 різницю, більш ніж 2-кратну різницю, більш ніж 4-кратну різницю, більш ніж 5-кратну різницю або більш ніж 10- кратну різницю у функціональних характеристиках в порівнянні з детектовним зв'язуванням, опосередкованим еталонним антитілом.
Терміни "селективний" і "муноселективний", коли мова йде про здатності до зв'язування, які має антитіло до тау-білка у відношенні двох епітопів, призначені позначати те, що для
Зо спостережуваного зв'язування в насичувальних умовах виявляється щонайменше 80 95 різниця, щонайменше 95 95 різниця і най переважніше 100 95 різниця (тобто відсутність детектовного зв'язування з одним епітопом). Терміни "селективний" і "муноселективний", коли мова йде про антитіло до тау-білка, додатково призначені позначати те, що антитіло зв'язується з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера і здатне розрізняти патологічний і непатологічний людський тау-білок.
Терміни фракція "що екстрагується в ТВ5" (51), фракція "що екстрагується у високосольовому розчині/саркозилі" (53) і "нерозчинна в саркозилі" фракція (РЗ) означають фракції, що отримуються за допомогою біохімічного фракціонування тау-білка, описаного в даному описі.
Термін "нормальний тау-білок" відноситься до нормального тау-білка головного мозку, що містить 2-3 моля фосфату на моль білка.
Термін "гіперфосфорилований тау-білок" відноситься до поліфосфорилованих молекул тау- білка, відповідних індукованому поліаніонними молекулами зсуву рухливості у вестерн- блотингу, або до молекул тау-білка, що мають більше п'яти, шести або семи фосфорилованих серинових, треонінових або тирозинових сайтів.
Термін "тау-білок, що має фосфорилований залишок 396" відноситься до гіперфосфорилованого тау-білка, в якому залишок 396 є фосфорилованим.
Термін "трансгенна тварина, відмінна від людини" відноситься до тварини, відмінної від людини, що має геном, що містить один або декілька людських трансгенів або трансхромосом, що кодують важкий і/або легкий ланцюг (інтегрованих або не інтегрованих в природну геномну
ДНК тварини), яка здатна експресувати повністю людські антитіла. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген, що кодує людський легкий ланцюг, і або трансген, що кодує людський важкий ланцюг, або трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, так що у миші виробляється людське антитіло до тау-білка при імунізації антигенним тау-білком і/або клітинами, що експресують тау-білок. Трансген, що кодує людський важкий ланцюг, може бути інтегрований в хромосомну ДНК миші, як у випадку з трансгенними мишами, наприклад, мишами НиМАБ, такими як миші НСо7 або НСо12, або трансген, що кодує людський важкий ланцюг, може зберігатися позахромосомно, як у випадку з трансхромосомними мишами КМ, описаними в М/002/43478. Такі трансгенні і трансхромосомні миші (в сукупності називаються в 60 даному описі "трансеенними мишами") здатні виробляти декілька ізотипів людських моноклональних антитіл до даного антигену (таких як Ід, ІА, ЗМ, ЧО і/або І9ЗЕ), що піддаються У-О-У-рекомбінації і перемиканню ізотипу.
Трансгенну тварину, відмінну від людини, також можна використовувати для отримання антитіл до специфічного антигену шляхом введення генів, що кодують таке специфічне антитіло, наприклад, шляхом формування функціонального зв'язку генів з геном, що експресується в молоці тварини.
Термін "лікування" або "здійснення лікування", використовуваний в даному описі, означає полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення прогресу або тяжкості захворювання або порушення або полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення одного або декількох симптомів або побічних ефектів такого захворювання або порушення. Для цілей цього винаходу "лікування" або "здійснення лікування" додатково означає підхід для отримання сприятливих або бажаних клінічних результатів, де "сприятливі або бажані клінічні результати" включають, без обмеження, часткові або повні, що виявляються або не виявляються, зменшення інтенсивності прояву симптому, зниження ступеня тяжкості порушення або захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) стану захворювання або порушення, затримку або уповільнення прогресу стану захворювання або порушення, полегшення або пом'якшення стану захворювання або порушення і ремісію захворювання або порушення. "Ефективна кількість", вживана стосовно антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, відноситься до кількості, яка при введенні в необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу є достатньою для досягнення наміченого біологічного ефекту або бажаного терапевтичного результату, в тому числі, без обмеження, клінічних результатів. Фраза "герапевтично ефективна кількість", вживана стосовно антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, призначена позначати кількість антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, яка є достатньою для полегшення, пом'якшення, стабілізації, усунення, уповільнення, ослаблення або затримки прогресу стану порушення або захворювання або симптому порушення або захворювання. У варіанті здійснення спосіб за цим винаходом передбачає введення антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента в комбінаціях з іншими сполуками. У таких випадках "ефективною кількістю" є кількість комбінації, достатня для того, щоб викликати намічений біологічний ефект.
Зо Терапевтично ефективна кількість антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом може варіюватися залежно від таких чинників, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума, а також від здатності антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента викликати бажану відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективною також є така кількість, при якій будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла переважуються терапевтично сприятливими ефектами.
Як вказано вище, цей винахід, зокрема, відноситься до моноклональних антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів і до абсолютно нового способу отримання таких молекул (ії, отже, таких їх епітопзв'язувальних фрагментів). Ця можливість виділяти моноклональні антитіла за допомогою нового способу представлена в даному описі винаходу на прикладі його застосування для виділення моноклональних антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з фосфорилованим сериновим залишком 396 (Р-5396, ре396, Р'5396) людського тау-білка (ЗЕО
ІО МО: 1). Ці антитіла додатково характеризуються своєю здатністю розрізняти фосфориловані залишки серину-396 і серину-404 (Р-5404, рб404), так що вони не зв'язуються з тау-білком з фосфорилованим серином-404, за винятком випадків, коли тау-білок також фосфорилований по залишку 396.
Антитіла за цим винаходом або їх епітопзв'язувальний фрагмент були отримані і виділені шляхом застосування нового способу, який сприяє відбору р8в396-специфічних антитіл.
Додатково, за допомогою застосування цієї дуже строгої процедури відбору клонів антитіл були отримані антитіла, які є не тільки високоспецифічними до 5396, але також і високоселективними стосовно фосфорилованого епітопу ре396. Ці антитіла унікальним чином розпізнають тау-білки з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера. Процедура скринінгу забезпечує ідентифікацію антитіл, що володіють функціональною і терапевтичною корисністю.
Індукували вироблення антитіл до дифосфорилованого пептиду
ТОНаАЕІМУК/ріІЗРУУЗаИаОТрІЗРАНІ (5ЕО ІО МО: 2), що охоплює залишки 386-408 тау-білка 2М4НА. Мишей імунізували цим фосфорилованим пептидом. Після отримання достатніх титрів антитіл мишей вбивали і отримували гібридоми. Гібридоми піддавали скринінгу за допомогою дот-блот-аналізу і М5О-ЕГ ІА з іммобілізованим патологічним і непатологічним людським тау- білком. Здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків в ході дот- блот-аналізу і вестерн-блот-аналізу застосовували для відбору гібридом. Відбирали бо шістнадцять клонів, з яких брали чотири гібридомні клони, які виробляли антитіла, що характеризуються надзвичайно високими здатностями до зв'язування з патологічним матеріалом людського тау-білка.
Специфічне зв'язування з патологічним і непатологічним тау-білком також визначали шляхом виділення тау-білка з ураженого захворюванням і не ураженого захворюванням головних мізків людей з АЮ і іммобілізації цього матеріалу на планшетах для М5О-ЕГІЗА (приклад 4).
Додатковий аспект цього винаходу відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, утворення яких відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить щонайменше 18, як, наприклад, щонайменше 20, послідовних амінокислотних залишків в межах ТОНСАЕІМУКРОЇРУМБООЮТРУРВАНІ. (5ЕО ІЮ МО: 2), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4В. У цьому аспекті цього винаходу утворення моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента в типовому випадку відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30, послідовних амінокислотних залишків, що містять ТОНнНОАБІМУКРОРМУМБООТРІВРАНІ (5ЕО 10 МО: 2), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 248.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, що володіють специфічністю стосовно фосфорилованого тау-білка (рТай) від пацієнтів, уражених АЮ, в порівнянні із здоровими контрольними суб'єктами у відповідній віковій групі, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються відмінністю в специфічності стосовно фосфорилованого тау-білка (рТац) від пацієнтів, уражених АЮ, в порівнянні з тау-білком від здорових контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі, що представляє собою більш ніж 50- кратне, як, наприклад, більш ніж 100-кратне підвищення специфічності стосовно матеріалу, ураженого АБ, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на
ЕПЗА аналізі для виявлення фосфорилованого тау-білка (рТац) в гомогенатах головного мозку від суб'єктів з АО і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1
ЕПЗА або М50О для фосфорилованих і мультимерних молекул, як описано в даному описі.
Пов'язаний аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його
Зо епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, що володіють специфічністю стосовно тау- білка з матеріалу, ураженого АЮ, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються відмінністю в специфічності стосовно матеріалу, ураженого АО, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі, що представляє собою більш ніж 50-кратне, як, наприклад, більш ніж 100-кратне підвищення специфічності стосовно матеріалу, ураженого АЮ, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на ЕГІЗА або М50 аналізі для виявлення фосфорилованого тау-білка (рТац) в гомогенатах головного мозку від суб'єктів з АЮ і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1 ЕїІ5А для фосфорилованих і мультимерних молекул.
Спосіб виконання схеми 1 ЕГІБА або М5О включає стадії А) забезпечення захоплення патологічних антигенних людських тау-білків із зразків головного мозку від суб'єктів з АЮ на планшетах, покритих С10-2; В) інкубації антигенних тау-білків із зростаючими концентраціями ре396-специфічних антитіл і С) виявлення залишкового вільного антигенного тау-білка, захопленого іммобілізованим С 10.2, за допомогою мічених 50 РО-ТАС антитіл до людського (загального) тау-білка від М5О.
Конкретніше, стадія А включає покриття планшетів М5О (у типовому випадку протягом ночі при 4 "С) антитілом С10-2, в типовому випадку при 0,5 мкг/мл (захоплюючим антитілом) в буфері для покриття, блокування (у типовому випадку протягом 1 години при кімнатній температурі) і промивання, в типовому випадку З рази. Стадія В включає змішування зразків лізату РЗ (у типовому випадку розбавленого при 1:1000-2-4 мкг/мл загального білка) і/або 51 (р) (у типовому випадку розбавленого при 1:300-20-40 нг/мл загального білка) з матеріалу від суб'єктів з АЮ (об'єднаних від З пацієнтів) з антитілом, специфічним до пептидного епітопу роз396, в концентраціях, що ступінчасто змінюються, і інкубацію (у типовому випадку протягом 1 години при кімнатній температурі). Реакційні суміші потім інкубують протягом 2 годин в планшетах, підготовлених на стадії А. Стадія С включає виявлення тау-білка, захопленого С10- 2, за допомогою міченого ЦІ ГО-ТАС антитіла до людського тау-білка (у типовому випадку при 1:50) від М5О згідно з інструкціями виробника. Планшети аналізують на БЕСТОНФ 5600 від
М50. РЗ з матеріалу від суб'єктів з АО і 51 (р) з матеріалу від суб'єктів з АО тестують згідно з аналогічною схемою.
Додатковий варіант здійснення направлений на антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим сериновим залишком 396 людського тау-білка (5ЕО ІЮО МО: 1), які були отримані або вироблені в клітинній лінії, такій як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, клітинна лінія комахи, дріжджів або бактерії.
Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (5ЕО ІО МО: 1), отримують в клітинній лінії
СНО, клітинній лінії НЕК, клітинній лінії ВНК-21, клітинній лінії миші (такій як клітинна лінія мієломи), клітинній лінії фібросаркоми, клітинній лінії РЕВ.Сб, клітинній лінії НКВ-11, клітинній лінії САР і клітинній лінії людини НиН-7.
Характеристики специфічної афінності і властивостей зв'язування варіантів С10-2 і С10.2 отримували із застосуванням пептидів 386-410 тау-білка (284М), фосфорилованих або не фосфорилованих в положенні 396 або 404. Шляхом застосування специфічного протоколу імунізації і скринінгу, стисло викладеного в цій заявці, отримують високоспецифічні стосовно фосфосерину-396 (ре396) антитіла.
Щоб продемонструвати, що антитіла є специфічними стосовно патологічного тау-білка, також отримували характеристики антитіл С10-2 за допомогою імуногістохімічного аналізу.
Антитіла проявляють високоспецифічне зв'язування з нейрофібрилярними клубками в зразках головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера (клубки тау-білка) і в зрізах від трансгенних по тау-білюу мишей Т94510, що експресують людський (РЗОТІ) мутантний тау- білок. Зв'язування з тканиною з контрольних зразків головного мозку людей і із зразків головного мозку нетрансгенних мишей не спостерігається, що демонструє те, що антитіла специфічно зв'язуються з людським тау-білком і, зокрема, з тау-білюоом, що асоціюється з альцгеймерівською патологією.
Антитіло С10-2
Один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4;
Ко) (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно визначений, використовуючи визначення згідно з ІМОТ, один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 40; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 41; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 42; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 43; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 44; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 45.
Альтернативно визначений, використовуючи визначення згідно з Споїйа, один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять:
БО (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 52; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 53; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 54.
Показана унікальна здатність антитіл за цим винаходом до розпізнавання тау-білка, що асоціюється з характерною для захворювання патологією. Порівнювали зв'язування патологічного і непатологічного тау-білка. Порівняння проводять стосовно п'яти опублікованих антитіл до тау-білка: ПАСІ-286, ІРМО02, Н.8.5, 2.10.3 ії 4Е4. Антитіло 2.10.3 є комерційно бо доступним рекомбінантним моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з тау-
білком, фосфорилованим по серину-422 (рБ422). Н.Ов.5 є комерційно доступним моноклональним антитілом, яке розпізнає М-кінцеву ділянку тільки людського тау-білка (епітоп, відповідний амінокислотним залишкам 25-30). Антитіло відноситься до ізотипу дае.
Терапевтичне антитіло до тау-білка МІ-105-4Е4 є комерційно доступним антитілом. У таблиці показано, що виділені антитіла проявляють виключно високий ступінь специфічності і селективності стосовно людського патологічного тау-білка. Ця селективність перевершує селективність будь-якого з порівнюваних антитіл, показаних в таблиці 5.
Таблиця 5
При насиченні антитіло С10-2 проявляє більш ніж 100-кратну селективність стосовно тау- білка РУ, виділеного із зразків головного мозку людей з АЮ.
Для демонстрації того, що відібрані антитіла володіють функціональною і терапевтичною корисністю, антитіла тестували в аналізах агрегації тау-білка іп міїго і в клітині (приклад 8). Цими аналізами є функціональні аналізи, в яких демонструється, що антитіла здатні перешкоджати процесу патологічної агрегації тау-білка. Клітини НЕК293 транзієнтно трансфектують людським тау-білюом РЗОТІ-РІ АС (4ВОМ). Потім клітини піддають дії екстрактів, що містять тау-білки, із зразків головного мозку людей з АЮ або із зразків головного мозку трансгенних Т94510. Ця дія патологічного тау-білка сприяє поглинанню тау-білка клітинами і його внутріклітинній агрегації.
Як імуновиснаження препаратів тау-білка за допомогою антитіла С10-2, так і безпосередня обробка клітин цими антитілами здатні забезпечувати істотне зменшення утворення агрегатів тау-білка.
Терапевтичну корисність антитіла С10-2 також оцінювали у мишей, що експресують людський тау-білок/Р51. Ця мишача модель є більш відповідною тваринною моделлю захворювання Аб, в якій патологія АО утворюється лише в пізньому віці (у віці 12-18 місяців).
Проте, у мишей виявляється гіперфосфорилування тау-білка перед появою патології щільних клубків. Мишам ін'єктували дозу 15 мг/кг двічі на тиждень протягом тривалого періоду 13 тижнів.
У мишей, оброблених антитілом, виявляється істотне зменшення рівня фосфорилованого тау- білка, що указує на те, що при тривалій обробці за допомогою С10-2 зменшуватиметься патологія, викликана клубками і, таким чином, подальша нейродегенерація іп мімо.
Зо Антитіла за цим винаходом специфічно видаляють гіперфосфорилований тау-білок з екстрактів головного мозку мишей /Т94510 за допомогою способів імуновиснаження. Крім того, антитіла за цим винаходом не видаляють нормальний тау-білок з гомогенатів, тоді як комерційно доступне антитіло Таи5 видаляє. На відміну від комерційних антитіл, що зв'язуються з тау-білками, в яких має місце фосфорилування по залишку 404 або як по залишку 404, так і по залишку 396, антитіла за цим винаходом специфічно видаляють на 95 9о гіперфосфорилований тау-білок, який фосфорилований по серину-396. Експерименти (приклад 12) демонструють, що не дивлячись на те, що антитіло за цим винаходом видаляє лише дуже невелику частку загального тау-білка в гомогенаті головного мозку (895), ці антитіла, проте, специфічно видаляють гіперфосфорилований тау-білок (на 90 95). Відповідно, один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з патогенним гіперфосфорилованим тау-білком. Додатково, в експериментах, в яких гіперфосфорилований тау-білок видаляли за допомогою антитіла за цим винаходом, активність затравлювальної дії усувається. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка. Було висунуто припущення, що при зменшенні затравлювальної дії зменшується розвиток утворення клубків і прогрес таупатій, зокрема хвороби Альцгеймера.
Відповідно, додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом для застосування в зменшенні прогресу АО або інтенсивності симптомів АЮ.
Антитіло О55Е
Один аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла О55Е. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5. (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло ОБ55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло ОБ55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло 0550
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла 0550). Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3;
Ко) (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0550), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮО МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 14.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0550), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
БО Антитіло 0555
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла 0555. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло Ю555, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 15.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0555, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Дослідження із застосуванням антитіла 0555, антитіла 0550), антитіла О55Е указують на те, що мутація цього залишку приводить до утворення антитіла з незмінними властивостями зв'язування в порівнянні з вказаними антитілами до і після обробки при низькому значенні рн протягом тривалого періоду часу при кімнатній температурі, що указує на те, що ізомеризація відсутня при низькому значенні рН або що будь-який ізомеризований білок має незмінні властивості зв'язування в порівнянні з попередньою обробкою.
Антитіло М325
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М325. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6;
Ко) (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М325, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ325, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативним визначенням антитіла МЗ25, використовуючи визначення згідно з ІМСТ, є моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 46;
БО (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 47; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 48; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 43; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 44; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 45.
Додатковим альтернативним визначенням антитіла МЗ325, використовуючи визначення згідно з Споїйа, є моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 5; 60 (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 52;
(є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 53; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 54.
Як можна побачити з фігури 1, ІС50 антитіла М325 (чорні кружки) є зменшеною в порівнянні з антитілом С10-2: розраховано, що ІС50О М325 складає 44 нМ. Це помітне поліпшення в порівнянні з С10-2 не було очікуваним. Як підтверджується фігурою 1, один аспект цього винаходу направлений на антитіло, яке інгібує РЗ з матеріалу від суб'єктів з А в рідиннофазному аналізі інгібування, описаному в даному описі, таким чином, що сигнал зменшується на 50 95 при концентрації антитіла, що становить 100 нМ або менше. У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом характеризується ІС50, що складає від 0,1 нМ до 100 нМ, як, наприклад, концентрацією 50 нМ або менше, як, наприклад, від 0,1 нМ до 50 нМ, виходячи з рідиннофазного аналізу інгібування захоплення антигенів РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ.
Дані, отримані при застосуванні антитіла МЗ25, указують, що мутація в положенні 32 легкого ланцюга антитіла С10-2 або СОН! ІС антитіла С10-2 за типом заміни на серин приводить до підвищеної позірної афінності (ІС5О) в аналізах інгібування пептиду. Крім того, мутація в положенні 32 за типом заміни на серин або глутамін (антитіло МЗ25 і антитіло МЗ2О)) усуває дезамідування як в положенні 32, так і 34, як показано на фігурі 20. Специфічна активність, визначена в рамках досліджень затравлювальної дії і агрегації іп міїго, зберігається як у варіанті
МЗ25, так і МЗ2О.
Можливість потенційного дезамідування ідентифікували в С10-2 в положенні, яке може привести до неоднорідності партій білків. С10-2 характеризувалися неоднорідним зв'язуванням з антигенами РЗ з матеріалу від суб'єктів з АО, при цьому незначна частка з високою позірною афінністю (2-5 нМ), а переважна, що зв'язується з низькою позірною афінністю (200-1000 нМ) (фігура 1). Неоднорідне зв'язування може відображати різні субпопуляції дезамідованих і недезамідованих С10-2. Варіант отримували за допомогою заміни (М325), яка запобігала дезамідуванню. Показано покращене зв'язування за активністю, про що свідчила в цілому знижена ІС50 (вища позірна афінність) в порівнянні з С10-2. Вводили додаткову заміну АТО1Т, що приводить до однорідного зв'язування за типом, що характеризується високою позірною афінністю. Покращена активність зв'язування як у МЗ25, так і у М325-А101Т свідчить про те, що
Зо за допомогою вищеописаних мутацій отримують стабільніші і більш однорідні антитіла.
Антитіло МЗ32О
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М320О. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М320О, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 17; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ32О, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32;
БО (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Як вказано, дані, отримані при застосуванні антитіла МЗ325, указують, що мутація в положенні 32 легкого ланцюга антитіла С10-2 або СОВІ І С антитіла С10-2 за типом заміни на серин приводить до підвищеної позірної афінності (ІС50), при цьому мутація за типом заміни на глутамін (антитіло МЗ32О) приводить до незмінної активності зв'язування. Проте мутація в 60 положенні 32 за типом заміни на серин або глутамін (антитіло МЗ325 і антитіло М32О) усуває дезамідування як в положенні 32, так і 34, як показано на фігурі 20. Відповідно, як антитіло
М325, так і антитіло МЗ32О володіють перевагами. Специфічна активність, визначена в рамках досліджень затравлювальної дії і агрегації іп міо, зберігається як у варіанті М325, так і М320О.
Антитіло М345
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М345. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 33; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 18; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М340
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М340). Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ340, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 19; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ340О), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М3З25, М345
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М3З25, М345.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 35; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; 60 (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5;
(4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 20; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 35; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М320, М345
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М32О), М345.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 36; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу,
Ко) направленого на антитіло МЗ32О, М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 21; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, 35 направленого на антитіло МЗ32О, М345, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 36; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; 40 і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М320, М340 45 Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла МЗ32О, М340).
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 37; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4;
БО (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, 55 направленого на антитіло М3З2О), М340), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 22; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З2О), М340), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 37; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло МЗ25, М340
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М325, М340.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 38; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ325, М340), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 23; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ325, М340), відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 38;
Ко) (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло АТО1Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла А101Т. Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 12; і
БО (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і 60 (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Дані, отримані при застосуванні антитіла АТО1Т, указують на те, що мутація важкого ланцюга антитіла С10-2 або СВАЗ важкого ланцюга антитіла С10-2 приводить до двократного підвищення зв'язування пептиду і 10-20-кратного підвищення зв'язування з матеріалом РЗ.
Додатково, варіанти, що містять мутацію А101Т, характеризуються підвищеною специфічною активністю в аналізах затравлювальної дії іп міїко.
Антитіло МЗ25, АТО1Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М3З25, А101Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 24.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з
Ко) (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7.
Використовуючи визначення згідно з ІМОТ, антитіло МЗ325, А101ї являє собою моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 46; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 47; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 48; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 49; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 50; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 51.
Використовуючи визначення згідно з СНПоїа, антитіло МЗ325, А101ї являє собою моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 55; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 56; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 57.
Як можна побачити з фігури 1, ІС50 антитіла М325, А1011 (білі кружки) є істотно зменшеною в порівнянні з антитілом С10-2: розраховано, що ІС50 М325, А101Т складає 14 нМ. Це помітне поліпшення в порівнянні з С10-2 не було очікуваним. Виходячи з фігури 1, один аспект цього винаходу направлений на антитіло, яке інгібує РЗ з матеріалу від суб'єктів з АО в рідиннофазному аналізі інгібування, описаному в даному описі, таким чином, що сигнал зменшується на 50 95 при концентрації, що становить 100 нМ антитіла або менше, як, наприклад, від 10 нМ до 100 нМ антитіла, як, наприклад, при концентрації, що становить 50 нм або менше, як, наприклад, від 10 нМ до 50 нМ антитіла. Як показано на фігурі 20, антитіло
МЗ325, А101 є дуже стійким стосовно дезамідування. Як показано на фігурі 19, антитіло МЗ325,
А101тТ характеризувалося більш вираженим зменшенням агрегації.
Антитіло М320, А101Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла МЗ20О, АТ01Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ32О), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 17; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ32О), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7.
Антитіло МЗ325. О55Е
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М3З25, О55Е.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять:
Ко) (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, О55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М3З25, О55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з
БО (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М320, О55Е
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М32О, О55Е.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; 60 (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і
(У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М32О, О55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 17; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М32О, О55Е, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 28; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
Антитіло М3З45, АТО1Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М345, АТО01Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; (5) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ345, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його
Зо епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 18; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло МЗ345, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7.
Антитіло М340, А101Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла М340), АТО1Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4;
БО (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М340), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 19; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло М340), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під зБЕО ІЮ МО: 34; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7.
Антитіло ОБ55Е, А101Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла О55Е, А101Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло О55Е, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 25.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло О55Е, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з:
Ко) (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Антитіло 0550, А101Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла 0550), АТО1Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0550), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 26.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0550), А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; 60 (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 29; і
(У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Антитіло 0555, АТО1Т
Інший аспект цього винаходу відноситься до варіанта антитіла С10-2, антитіла 0555, А101Т.
Цей аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0555, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 27.
Альтернативно певний додатковий варіант здійснення аспекту цього винаходу, направленого на антитіло 0555, А101Т, відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39.
Передбачаються комбінації варіантів важких ланцюгів і варіантів легких ланцюгів, як, наприклад, передбачаються безліч варіантів в межах легкого ланцюга і/або безліч варіантів в межах важкого ланцюга, комбінація одного варіанта в межах легкого ланцюга з одним або
Зо безліччю варіантів в межах важкого ланцюга, комбінації безлічі варіантів в межах легкого ланцюга з безліччю варіантів в межах важкого ланцюга. Антитіло за цим винаходом переважно містить: легкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 12 (легкий ланцюг С10-2);
ЗЕО ІЮ МО: 16 (варіант МЗ325 легкого ланцюга); БЕО ІО МО: 17 (варіант МЗ32О легкого ланцюга); БЕО ПО МО: 18 (варіант М345 легкого ланцюга); 5ЕО ІЮО МО: 19 (варіант М340О легкого ланцюга);
ЗЕО ІЮ МО: 20 (варіант М325, М345 легкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 21 (варіант М32О, М345 легкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 22 (варіант М32О, М340О) легкого ланцюга) і 5ЕО ІО МО: 23 (варіант МЗ25, М340 легкого ланцюга); і важкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 11 (важкий ланцюг С10-2);
БЕО ІО МО: 13 (варіант ЮО55Е важкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 14 (варіант Ю55О важкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 15 (варіант 0555 важкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 24 (варіант АТОТ1Т важкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 25 (варіант О55Е, АТ01Т важкого ланцюга); 5ЗЕО І МО: 26 (варіант 0550, АТ01Т важкого ланцюга) і 5ЕО ІЮ МО: 27 (варіант 0555, АТ101Т важкого ланцюга).
У одному варіанті здійснення легсий ланцюг являє собою 5ЕО І МО: 12, важкий ланцюг вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 13 (варіант О55Е важкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 14 (варіант 0550 важкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 15 (варіант 0555 важкого ланцюга); 5ЕО ІЮ
МО: 24 (варіант АТО1Т важкого ланцюга); 5ЕО ІО МО: 25 (варіант Ю55Е, АТ01Т важкого ланцюга); ЗЕО ІО МО: 26 (варіант 0550, А101Т важкого ланцюга) і 5ЕО ІО МО: 27 (варіант р555, А101Т важкого ланцюга). У альтернативному варіанті здійснення у випадку, якщо важкий ланцюг являє собою 5ЕО ІО МО: 11, то легкий ланцюг вибраний з групи, що складається з 5ЕО
ІО МО: 16 (варіант М325 легкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 17 (варіант М32О легкого ланцюга); 5ЕО
ІО МО: 18 (варіант М345 легкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 19 (варіант М340) легкого ланцюга); 5ЕО
ІО МО: 20 (варіант М325, М345 легкого ланцюга); 5ЕО ІЮ МО: 21 (варіант М32О, М345 легкого ланцюга); БЕО ІО МО: 22 (варіант МЗ32О, М340 легкого ланцюга) і 5ЕО ІЮ МО 23 (варіант М325,
М340О легкого ланцюга).
Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 31; 5ЕО ІО МО: 32; 5ЕО І МО: 33; 5ЕО ІЮ МО: 34; 60 ЗЕОІЮО МО: 35; 5ЕО ІЮ МО: 36; 5ЕО І МО: 37 ї БЕО І МО: 38;
Зб
(б) СОВ2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ФЕО ІЮ МО: 7; 5ЕО 10 МО: 28; 5ЕО ІЮО МО: 2911 5ЕОІЮО МО: 30; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 8 і 5ЕО ІЮ МО:39.
Варіанти здійснення комбінацій варіантів, що представляють інтерес, включають такі, де антитіла вибрані з групи, що складається з антитіла МЗ325, А101Т; антитіла МЗ32О, А1017т; антитіла М3З25, О55Е і антитіла М32О, О55Е, переважним є антитіло М3З25, А101Т. Як можна побачити з прикладів, антитіло М3З25 і антитіло МЗ325, А101Т є переважними варіантами здійснення.
В сукупності приклади показують, що антитіла за цим винаходом, зокрема С10-2, ефективно зв'язуються з планшетами М5О, покритими антигенами РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ. Для порівняння, комерційні антитіла, такі як РНЕ-13, володіють низькою активністю зв'язування. Крім того, РНЕ-13 демонструвало значно вищий ступінь неспецифічного зв'язування в порівнянні з антитілами за цим винаходом. Рідиннофазне інгібування С10-2 захоплення антигену Ріай в планшеті, покритому С10-2, є ефективним (050-10-20 нМ), тоді як у випадку з РНЕ-13 воно є неефективним (ІС50-500-1000 нм).
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і (4) важкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з ФЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО
ІО МО: 14, 5ЕО І МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮ МО: 26 і БЕО ІЮО МО: 27.
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (а) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (б) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; (с) СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 8; і
Ко) (3) легкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 16, 5ЕО І МО: 17, 5ЕО
ІО МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮО МО: 22 і 5ЕО І МО: 23.
Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом в типовому випадку інгібує РЗ з матеріалу від суб'єктів з АО в рідиннофазному аналізі інгібування таким чином, що сигнал зменшується на 50 95 при концентрації, що становить 100 нМ антитіла або менше, як, наприклад, від 10 нМ до 100 нМ антитіла, як, наприклад, від 50 нМ або менше, як, наприклад, від 1О0нМ до 50 нМ антитіла. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом в типовому випадку здатні видаляти щонайменше 15 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-396, з гомогенатів головного мозку від суб'єктів з АЮ при вмісті антитіла, що становить приблизно 75 нг, що визначають за сигналом тау-білка ре396 у вестерн-блотингу після досліджень з імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент переважно являє собою людське або гуманізоване антитіло.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, згадані вище, згідно з одним варіантом здійснення можуть додатково містити варіант таких СОН, СОВ2 або СОВЗ легкого і/або важкого ланцюга (не більше ніж з 4 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з З відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з 2 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з 1 відмінністю в амінокислотах).
Як можна побачити з фігури 18, СОВІ НС, СОВ82 НС, СОВЗ НС і СОВЗ І С щонайменше в одному варіанті здійснення важливі для зв'язування з ділянкою 392-398 тау-білка. У одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальний фрагмент містять: У одному аспекті цього винаходу цей винахід направлений на антитіло або його епітопзв'язувальні фрагменти, що утворюють гідрофобну кишеню, утворювану ІЗ'НЗ,
ІГЗ:Е8", НІ:НІЗ, Н2:М1, Н2:УЗ з 394 пептиду тау-білка. У варіанті здійснення цей винахід направлений на антитіло, яке конкурує з антитілом, додатково описаним в даному описі, за утворення мережі водневих зв'язків між сольватованим /РІ'З396 і І 3:Т4, НІ:В10, НІ1:Т11, НЗ:ВІ1,
НЗ:Т3; С) 13:Е8 являє собою С-кінцевий залишок каркасної ділянки, фланкуючий СОН ІЗ (див. фігуру 11).
Як можна бачити з кристалічної структури, визначеної за допомогою рентгенографічного бо аналізу, антитіло за цим винаходом зв'язується на двох рівнях селективності. Перший рівень селективності являє собою селективність стосовно гіперфосфорилованого патологічного тау- білка, а другий рівень селективності являє собою селективність стосовно фосфорилованого серинового залишку, де фосфат вказаного фосфорилованого серину зв'язаний водневим зв'язком з бічним ланцюгом тирозинового залишку, віддаленого на один залишок від вказаного фосфорилованого серину. Відповідно, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, селективні стосовно амінокислотного мотиву гіперфосфорилованого тау-білка, при цьому мотив складається з фосфорилованого серинового залишку і тирозинового залишку, розташованих через один залишок. У типовому випадку амінокислотний мотив має послідовність:
У - Х-в(фосфорилований)- Р - де М являє собою тирозин, Х являє собою амінокислоту, що зустрічається в природі, Р являє собою опролін, і З(фосфорилований) являє собою серин з фосфорилованою гідроксильною групою бічного ланцюга.
Так само, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІА із амінокислотних залишків, де ЯК є бічним ланцюгом амінокислоти, що зустрічається в природі.
ЕФ й ЕВ !
М рани я я а й -к шт
Зх Й ТБ. Ж с Гу
У й ха о и А
Н
13
Без обмеження будь-якою конкретною теорією вважають, що антитіло за цим винаходом є селективним стосовно амінокислотного мотиву ІА, де вказаний мотив має конформацію, яку приймає патологічний тау-білок. Відповідно, амінокислотний мотив ІА в типовому випадку є послідовністю, селективно розпізнаваною антитілом за цим винаходом. Відповідно, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІА з амінокислотних залишків, де АВ є бічним ланцюгом амінокислоти, що зустрічається в природі.
У типовому варіанті здійснення даного аспекту цього винаходу цей винахід направлений на
Зо антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІВ з амінокислотних залишків, такого як, без обмеження, ІС або І, де Е є бічним ланцюгом амінокислоти, що зустрічається в природі.
що Е В Ах Її 7. я. ее ан в реж у дк тре и бод и Ши Ше ши їж і Н ! | І
Б 5 т о Ше -
К ех - в
Ше з се в меч че
М ів
ММ. г й гу Й
Й Ной Н «НЯ не: шо М. АК, Ж кре Ш-к бе б ж вт я б я . з : й
М не й о Ш ай "зх, то н м і Кей м ос ок М оте ох а у г
Не
С
А
З й вона н АК і з «НМ. У ще я. яку З й ве екон до в Дн в и она: чи АХ кий а шк їх М ! в ди М, ї чи ух "а
Е і да с Вера око т
ЩО щи кх тя й бе я о
М в
У одному аспекті цього винаходу СОВ'І-ділянка НС антитіла за цим винаходом, Азр-Аго- ГНг-
Пе-Нів (ЗЕО ІО МО: 7) взаємодіє з мотивами ІА-ІО гіперфосфорилованого тау-білка.
Як можна побачити з фігури 18, в даному аспекті цього винаходу наявність двох послідовних заряджених залишків, а саме аспарагінової кислоти і аргініну в СОВІ НС грає роль в поєднанні за допомогою водневого зв'язку з мотивом в цільовому епітопі тау-білка, де антитіло є селективним стосовно амінокислотного мотиву гіперфосфорилованого тау-білка, при цьому мотив складається з фосфорилованого серинового залишку і тирозинового залишку, розташованих через один залишок. Відповідно, один аспект цього винаходу направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний Фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком,
переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІА-ІЮ з амінокислотних залишків, де антитіло містить СОН -ділянку НС, яка містить два послідовні заряджені амінокислотні залишки, такі як аспарагінова кислота і аргінін. У додатковому альтернативному варіанті даного аспекту цього винаходу антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом зв'язуються з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно епітопу, що містить серин-396 і тирозин-394, де між групою РОЯ4 і одним з вказаних серину-396 і тирозину-394 утворюється ковалентний зв'язок, і між групою РО4 і іншим з серину-396 і тирозину-394 утворюється водневий зв'язок, де антитіло містить СОВІ1-ділянку НС, що містить два послідовні заряджені залишки, такі як аспарагінова кислота і аргінін. Заряджені амінокислотні залишки СОВІ -ділянки
НС можуть бути вибрані з групи, що складається з аргініну, лізину, аспарагінової кислоти і глутамінової кислоти, де щонайменше один з вказаних залишків є аспарагіновою кислотою або аргініном, де переважно одним зарядженим залишком є аргінін, а інший є аспарагіновою кислотою.
У додатковому варіанті здійснення даного аспекту цього винаходу один або обидва з двох послідовних заряджених амінокислотних залишків фланковані полярним амінокислотним залишком, переважно вибраним з треоніну і тирозину. Крім того, один або обидва з одного або обох з двох послідовних заряджених амінокислотних залишків фланковані мотивом з З амінокислотних залишків, який являє собою полярний залишок-гідрофобний залишок-полярний залишок.
У одному варіанті здійснення СОВІ1 НС містить мотив з 5 залишків ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА
АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА, де щонайменше один з вказаних залишків є аспарагіновою кислотою або аргініном, де переважно один заряджений залишок являє собою аргінін, а інший являє собою аспарагінову кислоту. Переважно мотив з 5 залишків являє собою мотив ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА -ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА - Авр-Аг9у. Переважніше мотив з 5 залишків СОВІ НС характеризується послідовністю ГТп/-РПе- Тиі-Азр-Ага.
Цікаво відзначити, що СОВІ НС антитіла за цим винаходом містить мотив ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА
АМІНОКИСЛОТА з обох сторін двох послідовних заряджених амінокислотних залишків, залучених в утворення водневого зв'язку з фосфатною групою, залученою в електростатичну взаємодію між 5396 і У394. Відповідно, в переважному варіанті здійснення СОНІ НС за цим винаходом містить паліндромний мотив з 8 залишків ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА -
ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА -
ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА -
ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА. Переважно мотив з 8 залишків СОНІТ НС передбачає мотив ТНг-
Рпе-Тии-Азр-Аг9УУІОІМРНА АМІНОКИСЛОТА -ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА. Переважніше мотив з 8 залишків СОТ НС передбачає мотив ТНг-РНе-ТнНг-
Авр-Агд- Гиг-Пе-Нів.
У одному варіанті здійснення антитіло розпізнає епітоп в межах залишків 392-398 гіперфосфорилованого тау-білка, що містить серин-396 і тирозин-394, де серин-396 є фосфорилованим і де антитіло містить СОН -ділянку НС, що містить два послідовні заряджені амінокислотні залишки. У переважному варіанті здійснення антитіло розпізнає епітоп в межах залишків 392-398 гіперфосфорилованого тау-білка, що містить серин-396 і тирозин-394, де серин-396 є фосфорилованим і де антитіло містить СОВІ-ділянку НС, що містить мотив з 5 залишків ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА. У переважному варіанті здійснення антитіло розпізнає епітоп в межах залишків 392-398 гіперфосфорилованого тау-білка, що містить серин-396 і тирозин-394, де серин-396 є фосфорилованим і де антитіло містить СОВ'1-ділянку НС, що містить мотив ПОЛЯРНА
АМІНОКИСЛОТА -ГІДРОФОБНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА
АМІНОКИСЛОТА - ЗАРЯДЖЕНА АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА - ГІДРОФОБНА
АМІНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНА АМІНОКИСЛОТА.
У додатковому переважному варіанті здійснення антитіло містить СОВІ1-ділянку НС, визначену в даному описі винаходу, і СОНЗ-ділянку НС, що містить мотив з б залишків, що містить щонайменше два заряджені залишки.
Цей винахід також передбачає спосіб зменшення утворення клубків тау-білка у пацієнта, який включає введення пацієнтові, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом або його епітопзв'язувальних фрагментів.
Один аспект цього винаходу направлений на спосіб лікування таупатії із застосуванням антитіла за цим винаходом або його епітопзв'язувальних фрагментів. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РБР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВ! (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У типовішому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з А, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка.
Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Відповідно, додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальні фрагменти для застосування в лікуванні таупатії. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у
Зо пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою
Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби
Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У типовішому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АЮ, або психозу у пацієнтів з АБО, апатії, обумовленої АЮ, або апатії у пацієнтів з АЮ, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РБР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВ! (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка. Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АЮ, апатії, обумовленої А0, або апатії у пацієнтів з АО і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Один аспект цього винаходу направлений на терапію, що передбачає введення Її) антитіла до тау-білка і ії) сполуки, вибраної з групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно Ар-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; у) додаткового інгібітору агрегації тау-білка; є) інгібітору ацетилхолінестерази;
І) протиепілептичного засобу; 9) протизапального лікарського засобу і
Р) 5ЗВІ.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на композицію, яка містить Її) антитіло до тау-білка і її) сполуку, вибрану з групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно Ар-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; у) додаткового інгібітору агрегації тау-білка; е) інгібітору ацетилхолінестерази;
І) протиепілептичного засобу; 9) протизапального лікарського засобу і п) 55ВІ.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на набір, який містить Її) композицію, яка містить антитіло до тау-білка і ії) композицію, яка містить сполуку, вибрану з групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно АВД-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; е) додаткового інгібітору агрегації тау-білка;
ТУ) інгібітору ацетилхолінестерази; 9) протиепілептичного засобу;
Р) протизапального лікарського засобу і ї) антидепресанту. а) Антитіло до тау-білка, комбіноване з інгібітором ВАСЕ 1 У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з інгібітором ВАСЕ 1. Інгібітор
ВАСЕЇ може бути низькомолекулярним інгібітором ВАСЕ І, таким як І 2886721, МК-8931,
АЙ03293 або Е2609.
У додатковому варіанті здійснення інгібітор ВАСЕ 1 представлений формулою
Мн» н ї ХУ й Е
Ше М хмизу дет
В З їй й де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково
Ко) заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св алкілу, С2-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі-Св фторалкілу або Сі-Св алкокси; і ВІ являє собою один або декілька з водню, галогену, С1і-Сз фторалкілу або С:і-Сз алкілу; і В2 являє собою водень або фтор.
Ілюстративні сполуки формули І включають св
НОМ. яю М де й (35, 65)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6б-метилпіперидин-2-тіон,
Кк
Ху
Ж іш я х я (о ш- й (ЗА, 6Н)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилшперидин-2-тіон,
пу нь. щи їй і, ї й Н си доє (35, 65)-6-(5-аміно-2,3-дифторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилпіперидин-2-тіон, «ее «3 Е
М сн др чо Ех
НЕК й ко ке
КЗ и (ЗА, 65)-6-(5-аміно-2,3-дифторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилпіперидин-2-тіон,
З пе ше и а з (65)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3,6-біс(фторметил)піперидин-2-тіон.
Додатково, відповідний інгібітор ВАСЕ 1 може бути представлений формулою ЇЇ
Мих
І МУ в
АК М і й і ї - Е т до
Формуа Й, де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, 1,2,4-триазолілу, тіофенілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, 1,3,4- тіадіазолілу, ізотіазолілу, 1,3,4-оксадіазолілу, 1,2,4-оксадіазолілу, фуразанілу і 1,2,4- тіадіазолілу, і де Аг необов'язково заміщений одним або декількома з галогену, СМ, С1-Св алкілу, Со-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі--Св фторалкілу або С1-Св алкокси; В' являє собою Сі1-Сз алкіл або Сі-Сз фторалкіл; В? являє собою водень, галоген, С1і-Сз фторалкіл або С:-Сз алкіл; і
ВЗ являє собою С.і-Сз алкіл.
Ілюстративні сполуки, що є інгібітором ВАСЕ 1, формули ІІ включають сполуки, вибрані з групи, що складається 3: 0 М-(3-(28, /55)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5- тетрагідропіридин-2-іл)-А-фторфеніл)-5-фторпіколінаміду; М-(3-(28, 55)-6-аміно-3,3,5-трифтор- 2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду; /- М- (3-28, 55)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- метоксипіколінаміду; М-(3-(2А, 55)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5- тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-ціано-3-метилпіколінаміду і М-(3-(28, 5А)-6-аміно-3,3,5- трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-(дифторметил)піразин-2- карбоксаміду.
Інші інгібітори ВАСЕ можуть бути вибрані з формули, наведеної нижче:
МН дО КЕ ї МК
Ар дж Вау 3 А щи ще
В.
Щ де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св алкілу, С2-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі-Св фторалкілу або Сі-Свє алкокси; і
В' являє собою один або декілька з водню, галогену, С1і-Сз фторалкілу або С1-Сз алкілу;
В2 являє собою водень або фтор, або фармацевтично прийнятних солей вказаного.
Наприклад, сполуки, такі як:
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіколінамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(метокси-аз)піколінамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-ціано-З-метилпіколінамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-хлорпіколінамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіразин-2-карбоксамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-2-метилоксазол-4-карбоксамід;
М-(3- (25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-4-бром-1 -метил-1Н-імідазол-2-карбоксамід;
М-(3- (25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-4-метилтіазол-2-карбоксамід;
М-(3- (25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-2-(дифторметил)оксазол-4-карбоксамід;
М-(3- (25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-1 -(дифторметил)-1Н-піразол-3 -карбоксамід;
Зо М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(дифторметил)піразин-2-карбоксамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-4-хлорбензамід;
М-(3-(25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-фторпіколінамід;
М-(3-(25, 58)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіколінамід;
М-ІЗ3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-фторпіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-метоксипіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 5)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-фторпіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 58)-6-аміно-5-фтор-5-(фтормєтил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-метоксипіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 5)-6-аміно-5-фтор-5-(фторметил)-2-метил-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4,5- дифторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід;
М-І3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4А-фторфенілі| -5 - фторпіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4-фторфеніл|-5- метоксипіридин-2-карбоксамід;
М-ІЗ3-К25, 55)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4-фторфеніл|-5- метоксипіразин-2-карбоксамід;
М-І3-К25, 58)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4-фторфеніл|-5- фторпіридин-2-карбоксамід;
М-І3-К25, 58)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4-фторфеніл|-5- метоксипіридин-2-карбоксамід і
М-І3-К25, 58)-6-аміно-5-фтор-2,5-біс(фторметил)-3,4-дигідропіридин-2-іл|-4-фторфеніл|-5- метоксипіразин-2-карбоксамід; або фармацевтично прийнятна сіль вказаних сполук.
Інші інгібітори В АСЕ можуть бути представлені формулою, наведеною нижче:
АК, Мн. жи 7 ее ї й й е
ВЖЕ
Формули Ї, де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, оксазолілу, тіазолілу і ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома з галогену, СМ, Сі-Св алкілу, Со-Свє алкенілу, С2о-Св алкінілу, С1-
Св фторалкілу або Сі-Свє алкокси; і
В ї В? незалежно являють собою водень, галоген, С1-Сз фторалкіл або С:1-Сз алкіл; або відповідною їй фармацевтично прийнятною сіллю.
Наприклад, сполуки, такі як: (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- хлорпіколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- фторпіколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- метоксипіразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-ї - (дифторметил)-1Н-піразол-3 -карбоксамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-2-
Зо (дифторметил)оксазол-4-карбоксамід, (5)-М-(3 -(б-аміно-3,3 -дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5 -тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б5-ціанопіколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-2- метилоксазол-4-карбоксамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- метоксипіримідин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- (дифторметил)піразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-2-метилоксазол-4-карбоксамід, (5)-М-(3 -(6-аміно-3,3 -дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5 - дифторфеніл)-5-метоксипіразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-фторпіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-хлорпіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-ціанопіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-метоксипіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-(метокси-(ІЗ)піколінамід,
(5)-М-(3-(6-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-ціано-3-метилпіколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- (метокси-азЗ)піколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- бромпіколінамід, (5)-М-(3-(6б-аміно-3,3-дифтор-2-(фторметил)-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- бромпіколінамід; або фармацевтично прийнятна сіль вказаних сполук.
Інші сполуки ВАСЕ можуть бути представлені формулою, наведеною нижче: щ З п Я ми а ши с Кк. й Мои ко Я Кк в Е - Е Е
Формула 1 де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св алкілу, С2-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі-Св фторалкілу або Сі-Свє алкокси; і
В' являє собою водень, галоген, Сі-Сз фторалкіл або С:-Сз алкіл; або відповідною їй фармацевтично прийнятною сіллю.
Сполуками можуть бути: (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-хлорпіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-фторпіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-метоксипіразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)- 2-метилоксазол-4-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-метоксипіколінамід, (5)-М-(3 -(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3 -дифтор-2,3,4,5 -тетрагідропіридин-2-іл)-4-
Зо фторфеніл)-5-(дифторметил)піразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б5-ціанопіколінамід, (5)-М-(3-(б-амшо-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрапдрошридин-2-іл)-4-фторфеніл)- 4-метилтіазол-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-метоксипіримідин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-метокси-3-метилпіразин-2-карбоксамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-ціано-З-метилпіколінамід, (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-бромпіколінамід, (5)-М-(3-(б-амшо-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрапдрошридин-2-іл)-4-фторфеніл)- 5-(метокси-(ІЗ)піколінамід і (5)-М-(3-(6-аміно-2-(дифторметил)-3,3-дифтор-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-(метокси-с!З)піразин-2-карбоксамід, або фармацевтично прийнятними солями вказаних сполук.
Інші інгібітори ВАСЕ можуть бути представлені формулою, наведеною нижче:
МН де, « ХХ, ХК Е
Ки МВ а еоя ще ша г МУК Е
ШУ де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1і-Св алкілу, С2-Св алкенілуС2-Св алкінілу, С1-Св фторалкілу або Сі-Св алкокси; і
В' являє собою одне або декілька з водню, галогену, С1і-Сз фторалкілу або С1-Сз алкілу; або відповідною їй фармацевтично прийнятною сіллю.
Сполука може являти собою: м-(3-(28, З5, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-фторпіколінамід, м-(3-(28, З5, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіразин-2-карбоксамід, м-(3-(28, З5, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрапдропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіколінамід, м-(3-(28, 35, 5)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-фторпіколінамід, м-(3-(28, 35, 5)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіразин-2-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-2-метилоксазол-4-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-метоксипіколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5 -(метокси-сіЗ3) піколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-хлорпіколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-1 -метил-1Н-імідазол-2-карбоксамід, м-(3-(28, 35, 5А)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрапдропіридин-2-1л)-4-
Зо фторфеніл)-5-(трифторметил)піразин-2-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-4-метилтіазол-2-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 5)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-2-(дифторметил)оксазол-4-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-1 -(дифторметил)-1Н-піразол-3-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(дифторметил)піразин-2-карбоксамід, -(3-(28, 35, 5Н8)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-4-хлорбензамід, м-(3-(28, 35, 58)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-ціанопіколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 5А)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-(метокси-аз)піколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(метокси-аз)піколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(метокси-а3)піразин-2-карбоксамід,
М-(3-(2 8, 35, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-ціано-З-метилпіколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4,5- дифторфеніл)-5-(метокси-аз)піколінамід, м-(3-(28, ЗВ, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-(метокси-аз)піколінамід,
М-(3-(2 8, 35, 55)-6-аміно-3,5-дифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4- фторфеніл)-5-бромпіколінамід, або фармацевтично прийнятні солі вказаних сполук. р) Антитіло до тау-білка, комбіноване з антитілом до МЗРОаЇ О-А-БЕТА
У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з антитілом до МЗРИаЇ О-А-БЕТА. с) Антитіло до тау-білка, комбіноване із сполукою, застосовною в активній або пасивній імунотерапії стосовно АВ-пептиду
У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати із сполукою, застосовною в активній або пасивній імунотерапії стосовно АВ-пептиду. а) Антитіло до тау-білка, комбіноване з антагоністом ММОА-рецептора
У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з антагоністами ММОА-рецептора. Антагоніст ММОА-рецептора може бути вибраний з групи, що складається з мемантину, наменди, намзарику (мемантин/донепезил) і їх генеричних форм. Антагоніст ММОА-рецептора може бути вибраний з антипсихотичного засобу. Пресинаптичні нейрони перешкоджають надмірному вивільненню глутамату за допомогою механізмів негативного зворотного зв'язку, проте такі механізми порушуються в умовах клітинного стресу, таких як при АЮ. Надлишок глутамату в синаптичній щілині викликає постійне відкриття кальцієвих каналів, приводячи до підвищених рівнів внутріклітинного кальцію в нейронах, що викликає важке пошкодження і/або загибель нейронів. Шляхом антагонізації ММОА-рецептора в умовах надмірного притоку кальцію антипсихотичний засіб зменшує надмірне надходження кальцію в нейрони, що зменшує клітинну загибель і покращує нормальну передачу сигналу в нейронах і, тим самим, когнітивну функцію. е) Антитіло до тау-білка, комбіноване з додатковим інгібітором агрегації тау-білка У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з інгібітором агрегації тау-білка.
І) Антитіло до тау-білка, комбіноване з інгібітором ацетилхолінестерази У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-більюа можна комбінувати з інгібітором ацетилхолінестерази (АСНЕЇ). АСНЕЇ часто застосовують як засоби першої лінії терапії
Зо когнітивних симптомів при АЮ від легкої до помірної форми. АСНЕЇ також широко застосовують для лікування АО від помірної до важкої форми, зокрема донепезил, який схвалений для цієї субпопуляції. АСНЕЇ зменшують холінергічний дефіцит, спостережуваний у пацієнтів з А0О, і покращують здатність пацієнта здійснювати повсякденну діяльність. У одному варіанті здійснення цей винахід передбачає терапію, яка передбачає антитіло до тау-білка, визначене в даному описі винаходу, і інгібітор ацетилхолінестерази.
У одному варіанті здійснення АСНПЕЇ вибраний з групи, що складається з донепезилу, галантаміну і ривастигміну. АСНЕЇ може являти собою пігулку для перорального застосування, желе, сироп або іншу форму розчину для перорального застосування. АСНЕЇ також може бути пластиром для трансдермального введення. 9) Антитіло до тау-білка, комбіноване з протиепілептичним засобом У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білью»а можна комбінувати з протиепілептичним засобом.
Р) Антитіло до тау-білка, комбіноване з протизапальним засобом У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з протизапальним засобом. ї) Антитіло до тау-білка, комбіноване з антидепресантом
У терапії, композиції або наборі за цим винаходом антитіло до тау-білка можна комбінувати з антидепресантом.
Депресія є поширеним раннім супутнім симптомом деменції при АЮ. Трициклічні антидепресанти у свій час були переважними засобами лікування депресивних симптомів при
Ар, проте 55БВІ в значній мірі замінили ці засоби. У одному варіанті здійснення есциталопрам є антидепресантом, оскільки його часто призначають для лікування АЮ у зв'язку 3 його сприятливим профілем побічних ефектів і мінімальними взаємодіями з лікарськими засобами. У додатковому варіанті здійснення циталопрам або сертралін є антидепресантами, як їх часто також застосовують. У додатковому варіанті здійснення вортіоксетин є антидепресантом, оскільки він пов'язаний з поліпшенням когнітивної функції і доказом візуалізації нейронної ефективності у пацієнтів, страждаючих від МОЮ. Антидепресант може бути вибраний з групи, що складається з есциталопраму, сертраліну, циталопраму, пароксетину, флуоксетину, венлафаксину, тразодону, міртазапіну, вортіоксетину і їх генеричних форм.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом або його бо епітопзв'язувальні фрагменти в композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм,
розріджувачем, допоміжним засобом і/або стабілізатором. Антитіла за цим винаходом або їх епітопзв'язувальні фрагменти можна застосовувати в терапії для лікування таупатії. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АС, апатії, обумовленої АБ, або апатії у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), лобно- скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми |і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У типовішому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АОС, апатії, обумовленої
АР, або апатії у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями
Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка. Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО0, апатії, обумовленої А, або апатії у пацієнтів з АО і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Лікування, що передбачається цим винаходом, може бути тривалим, і пацієнт може отримувати лікування щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
Антитіла за цим винаходом можуть, наприклад, бути моноклональними антитілами, що отримуються за допомогою гібридомного способу, вперше описаного в Копіеєг вї аї., Машге 256,
Зо 495 (1975), або можуть бути моноклональними антитілами, що отримуються за допомогою рекомбінантних ДНК або інших способів, або переважніше можуть бути отримані за допомогою нового розкритого способу. Моноклональні антитіла також можна виділяти з одержаних за методом фагового дисплея бібліотек антитіл за допомогою методик, описаних, наприклад, в
СіасКвоп еї аЇ, Майте 352, 624-628 (1991) і Матїк5 еї аїЇ, У. МОЇ. ВіоІ. 222, 581-597 (1991).
Моноклональні антитіла можна отримувати з будь-якого відповідного джерела. Таким чином, наприклад, моноклональні антитіла можна отримувати з гібридом, отриманих з В-лімфоцитів селезінки миші, отриманих від мишей, імунізованих антигеном, що представляє інтерес, наприклад, у вигляді клітин, що експресують антиген на поверхні, або нуклеїнової кислоти, що кодує антиген, що представляє інтерес. Моноклональні антитіла також можна отримувати з гібридом, що походять від клітин, що експресують антитіла, від імунізованих людей або ссавців, відмінних від людини, таких як щури, кролі, собаки, вівці, кози, примати і т. п.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є людським антитілом. Людські моноклональні антитіла, направлені проти тау-білка, можна отримувати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Такі трансгенні і трансхромосомні миші включають мишей, які називаються в даному описі відповідно мишами НиМАБ (від слів "людське моноклональне антитіло") і мишами
КМ, і в сукупності називаються в даному описі ""трансгенними мишами".
Миша НимАБ містить мінілокус гена людського імуноглобуліну, який кодує нереаранжировані послідовності варіабельних і константних доменів важких ланцюгів (ні у) і варіабельних і константних доменів легких ланцюгів (к) людського імуноглобуліну, разом з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси, що кодують у- і к-ланцюги (І опрего, М. еї аії, Маїште 368, 856-859 (1994)). Відповідно, у мишей виявляється зменшена експресія мишачого ІДМ або ІдК, ї у відповідь на імунізацію введені трансгени, що кодують людський важкий і легкий ланцюг, піддаються перемиканню класу і соматичній мутації з утворенням високоафінних людських моноклональних антитіл Ідс к-ізотипу (І опрега, М. єї аї. (1994), вище, огляд наведений в І опрега, М., НапароокК ої Ехрегітепіа! Рпаптасоіоду 113, 49-101 (1994),
Гопрего, М. апа Низлаг, О., Іпїет. Неу. Іттипої. Мої. 13 65-93 (1995) і Нагаїіпо, Р. апа Гопрего,
М... Апп. М. М. Асай. 5сі 764 536-546 (1995)). Отримання мишей НиМАБб детально описано в
Тауюг, Г. еї аї., Мисієїс Асід5 Незеєатгсп 20, 6287-6295 (1992), Спеп, «у. еї аї, Іпіегпайіопаї! (510) Іттипоїоду 5, 647-656 (1993), Гоайоп еї аї,»У. Іттипої. 152, 2912-2920 (1994), Таупог, Ї. еї аї,
Іптегпаййопа! Іттипоіоду 6, 579-591 (1994), Рівпуміа, 0. еї аї, Маїшге ВіотесппоЇоду 14, 845-851 (1996). Див. також 05 5545806, 05 5569825, 05 5625126, 005 5633425, 05 5789650, 05 5877397, 55661016, 005 5814318, 05 5874299, 05 5770429, 05 5545807, МО 98/24884, МО 94/25585,
МО 93/1227, МО 92/22645, МО 92/03918 ії МО 01/09187.
Миші НСо?7, Нсої12, Нсо17 і НСо20 мають УКО-порушення в своїх ендогенних генах легких ланцюгів (каппа) (як описано в Спеп єї аі, ЕМВО .. 12, 811-820 (1993)), СМО-порушення в своїх ендогенних генах важких ланцюгів (як описано в прикладі 1 УУО 01/14424) і трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг (як описано в Рібзпм/лій еїа!ї, Маїиге Віоїесппоіоду 14, 845- 851 (1996)). Крім того, миші НСо7 мають трансген НСо7, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в 05 5770429), миші НСо12 мають трансген НСо12, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 МО 01/14424), миші НСо17 мають трансген НСо17, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 МО 01/09187), а миші НСо20 мають трансген НСог0, що кодує людський важкий ланцюг. Отримані в результаті миші експресують трансгени, що кодують важкі ланцюги і легкі каппа-ланцюги людських імуноглобулінів, в генетичному оточенні, гомозиготному стосовно руйнування ендогенних локусів, що кодують мишачі важкі ланцюги і легкі каппа-ланцюги.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в СПеп єї аі., ЕМВО 3. 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в прикладі 1 МО 01/09187. Дана лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, як описано в Рібзпмліа еї аї!., Майте Віоїесппоіоду 14, 845-851 (1996). Дана лінія мишей також несе трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, що складається з
СЕ-фрагмента хромосоми 14 (5020), як описано в МО 02/43478. Мишей Нсо12-Ваїр/с, Нсо17-
ВаїБ/с ії НСо20-Ваір/с можна отримувати шляхом схрещування НСо12, НСої1ї7 і НСог20 з
КСо5кІ(Ваїб) згідно з описаним в УУО 09/097006.
Миші "94510 є відомою моделлю таупатії, що забезпечує тимчасовий і просторовий контроль над експресією трансгену, що кодує мутантний тау-білок. У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в Спеп еї аї., ЕМВО .4. 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був
Зо підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в прикладі 1 М/О 01/09187. Дана лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, як описано в Різпм/йа єї а!., Мате ВіоїесппоЇІоду 14, 845-851 (1996). Дана лінія мишей також несе трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, що складається з НСЕ-фрагмента хромосоми 14 (5020), що відповідає за зв'язування з епітопом, як описано в МО 02/43478.
Спленоцити від цих трансгенних мишей можна використовувати для утворення гібридом, що секретують людські моноклональні антитіла, згідно з добре відомими методиками. Людські моноклональні або поліклональні антитіла за цим винаходом, або антитіла за цим винаходом, що походять від інших видів, також можна отримувати трансгенним шляхом за допомогою отримання іншого ссавця, відмінного від людини, або рослини, що є трансгенними стосовно послідовностей важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, що представляють інтерес, і отримання з них антитіла у добувній формі. Що стосується отримання антитіл у ссавців трансгенним шляхом, антитіла можна отримувати в молоці кіз, корів або інших ссавців і добувати з нього. Див., наприклад, О5 5827690; 05 5756687; 05 5750172 ії 05 5741957.
Антитіло за цим винаходом може відноситися до будь-якого ізотипу. При виборі ізотипу в типовому випадку виходитимуть з бажаних ефекторних функцій, таких як індукція АЮСО.
Ізотипами, що наводяться як приклад, є Ідс1, Ідс2, ІдДОаЗ ії 9204. Можна використовувати константні домени будь-якого з людських легких ланцюгів каппа- або лямбда-типу. За бажанням, клас антитіла до тау-білка за цим винаходом можна перемкнути за допомогою відомих способів. Наприклад, антитіло за цим винаходом, яке спочатку було ІДМ, можна піддати перемиканню класу на антитіло Ідс за цим винаходом. Додатково, методики перемикання класу можна застосовувати для перетворення одного підкласу Ідсї на іншій, наприклад, з сі на
Ідс02. Таким чином, ефекторну функцію антитіл за цим винаходом можна змінити шляхом перемикання ізотипу, наприклад, на антитіло да, Ідс2, Ідса3, Ідс4, дО, ІДдДА, ІЗ4Е або ІМ для різних терапевтичних шляхів застосування. У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є антитілом да, наприклад, Ідс1 к-ізотипу. Вважають, що антитіло відноситься до конкретного ізотипу, якщо його амінокислотна послідовність найбільшою мірою гомологічна цьому ізотипу в порівнянні з іншими ізотипами.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є повнорозмірним антитілом, переважно антитілом Ідсї, зокрема, антитілом ІдС1 к-ізотипу. У іншому варіанті здійснення 5О0 антитіло за цим винаходом є епітопзв'язувальним фрагментом антитіла або одноланцюговим антитілом.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти можна, наприклад, отримувати шляхом розділення на епітопзв'язувальні фрагменти за допомогою традиційних методик, а епітопзв'язувальні фрагменти піддавати скринінгу стосовно корисності таким же чином, як описано в даному описі для повних антитіл. Наприклад, епітопзв'язувальні Е(ар')»-фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла пепсином. Отриманий в результаті епітопзв'язувальний Р(ар')»-фрагмент можна обробити для відновлення дисульфідних містків з отриманням епітопзв'язувальних Рар'-фрагментів. Епітопзв'язувальні Рар-фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла ІдСї папаїном; епітопзв'язувальні Рар'-фрагменти можна отримувати шляхом розщеплювання антитіла ІдСь пепсином. Епітопзв'язувальний Р(аб')- фрагмент також можна отримати за допомогою зв'язування Рар', описаних нижче, за допомогою тіоетерного зв'язку або дисульфідного зв'язку. Епітопзв'язувальний Рар'-фрагмент являє собою епітопзв'язувальний фрагмент антитіла, отриманий шляхом розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірному домені Е(аб)2. Епітопзв'язувальний Рар'-фрагмент можна отримати шляхом обробки епітопзв'язувального Е(ар'я2-фрагмента відновником, таким як дитіотреїтол.
Епітопзв'язувальний фрагмент антитіла також можна отримати шляхом експресії нуклеїнових кислот, що кодують такі епітопзв'язувальні фрагменти, в рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емап5 еїаї., У. Іттипої. Меїй. 184, 1233-38 (1995)). Наприклад, химерний ген, що кодує частину епітопзв'язувального Е(ар')2-фрагмента, може містити послідовності ДНК, що кодують СНІ-домен і шарнірний домен Н-ланцюга, за якими розташований стоп-кодон для зупинки трансляції, для отримання такої усіченої молекули епітопзв'язувального фрагмента антитіла.
У одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка являє собою одновалентне антитіло, переважно одновалентне антитіло, описане в МО 2007059782 (включена шляхом посилання в даний опис у її повному обсязі), що має делецію в шарнірній ділянці. Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло являє собою одновалентне антитіло, де вказане антитіло до тау- білка сконструйоване за допомогою способу, що включає: ї) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому
Зо вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує МІ -ділянку вибраного антиген- специфічного антитіла до тау-білка, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну Сі - ділянку ІД, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Мі -ділянку вибраного антиген- специфічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку Ід, функціонально зв'язані разом, і де у випадку з підтипом ІдДОС1 нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку, була модифікована так, щоб Сі -ділянка не містила будь-яких амінокислот, здатних утворювати дисульфідні зв'язки або ковалентні зв'язки з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність Сі -ділянки, у присутності поліклонального людського
Ід або при введенні тварині або людині; ії) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антиген-специфічного антитіла, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну СН-ділянку людського Ід, де нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку, була модифікована так, щоб ділянка, відповідна шарнірній ділянці і, як того вимагає підтип Ід, іншим ділянкам СН-ділянки, таким як СНЗ -ділянка, не містила будь-яких амінокислотних залишків, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків або ковалентних або стабільних нековалентних зв'язків між важкими ланцюгами з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність СН-ділянки людського Ід, у присутності поліклонального людського ІдСі або при введенні тварині, людині, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антиген-специфічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку вказаного Ід, функціонально зв'язані разом; ії) забезпечення клітинної системи експресії для отримання вказаного одновалентного антитіла; ім) отримання вказаного одновалентного антитіла шляхом сумісної експресії конструктів нуклеїнових кислот з (Її) і (ії) в клітинах клітинної системи експресії з (іїї).
Так само, в одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка за цим винаходом являє собою одновалентне антитіло, яке містить: () варіабельний домен антитіла за цим винаходом, описаний в даному описі, або епітопзв'язувальну частину вказаного домену, і (ії) СнН-домен імуноглобуліну або його домен, що містить СН2- і СНЗ-домени, де СН-домен або його домен був модифікований таким чином, щоб домен, відповідний шарнірному домену і, якщо імуноглобулін не відноситься до підтипу ІД24, іншим доменам СН-домену, таким як СНЗ- 60 домен, не містив будь-яких амінокислотних залишків, здатних утворювати дисульфідні зв'язки з ідентичним СН-доменом або інші ковалентні або стабільні нековалентні зв'язки між важкими ланцюгами з ідентичним СН-доменом у присутності поліклонального ЇДС людини.
У додатковому варіанті здійснення важкий ланцюг одновалентного антитіла за цим винаходом був модифікований таким чином, щоб вся шарнірна ділянка була піддана делеції.
У іншому додатковому варіанті здійснення послідовність одновалентного антитіла була модифікована таким чином, щоб вона не містила будь-яких акцепторних сайтів М-зв'язаного глікозилування.
Цей винахід також включає "біспецифічні антитіла", де ділянка зв'язування антитіла з тау- білком (наприклад, ділянка зв'язування з тау-білююом моноклонального антитіла до тау-білка) є частиною двовалентного або полівалентного біспецифічного остову, який націлюється більш ніж на один епітоп (наприклад, другий епітоп може включати епітоп рецептора, що бере участь в активному транспорті, так що біспецифічне антитіло проявлятиме покращений трансцитоз через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр). Таким чином, в іншому додатковому варіанті здійснення одновалентний Раб антитіла до тау-білка може бути з'єднаний з додатковим ЕРар або всем, які націлюються на інший білок, з отриманням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло може мати подвійну функцію, наприклад, терапевтичну функцію, що надається доменом антитіла, що зв'язується з тау-білком, і транспортну функцію, завдяки якій воно може зв'язуватися з молекулою рецептора для посилення перенесення через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом також включають одно ланцюгові антитіла. Одноланцюгові антитіла являють собою пептиди, в яких Еу-домени важкого і легкого ланцюгів з'єднані один з одним. У одному варіанті здійснення цей винахід передбачає одноланцюговий Ем (5сЕм), де важкий і легсий ланцюги в Ем антитіла до тау-білка за цим винаходом з'єднані за допомогою гнучкого пептидного лінкера (у типовому випадку завдовжки приблизно 10, 12, 15 або більше амінокислотних залишків) в один пептидний ланцюг. Способи отримання таких антитіл описані, наприклад, в 05 4946778, РійсКІйип в Те РНпаптасоіоду ої
Мопосіопаї! Апіібодієв, мої. 113, Возеприга апа Мооге еадв. Зргіпдег-Мепад, Мем МоїКк, рр. 269-315 (1994), Віга єї аї., Зсієпсе 242, 423-426 (1988), Нивіоп єї аі., РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988) і
МссСанепу єї аї, Майте 348, 552-554 (1990). Одноланцюгове антитіло може бути одновалентним, якщо використовується тільки один МН і МІ, двовалентним, якщо використовуються два МН і Мі, або полівалентним, якщо використовується більше двох МН і Мі.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, описані в даному описі, можна модифікувати шляхом включення, можна модифікувати шляхом включення будь-якої придатної кількості модифікованих амінокислот і/або зв'язків з такими кон'югованими замісниками. Придатність в даному контексті зазвичай визначається здатністю принаймні в значній мірі зберігати селективність стосовно тау-білка і/або специфічність стосовно тау-білка, притаманну недериватизованому початковому антитілу до тау-білка. Включення однієї або декількох модифікованих амінокислот може бути переважним, наприклад, для збільшення періоду напівжиття поліпептиду в сироватці крові, зменшення антигенності поліпептиду або збільшення стабільності поліпептиду при зберіганні Амінокислоту(и) модифікують, наприклад, котрансляційно або посттрансляційно в ході отримання рекомбінантним шляхом (наприклад, шляхом М-зв'язаного глікозилування в мотивах М-Х-5/1 в ході експресії в клітинах ссавців) або модифікують за допомогою синтетичних засобів. Необмежувальні приклади модифікованої амінокислоти включають глікозиловану амінокислоту, сульфатовану амінокислоту, преніловану (наприклад, фарнезиловану, геранілгераніловану) амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, ациловану амінокислоту, ПЕГіловану амінокислоту, біотиніловану амінокислоту, карбоксиловану амінокислоту, фосфориловану амінокислоту і т. п. У літературі представлено безліч джерел, які можуть бути керівництвом для фахівця з модифікації амінокислот.
Протоколи, що наводяться як приклад, знаходяться в УмаїКкег (1998) Ргоївіп Ргоїосоіїє Оп СО-
БО Вот, Нитапа Ргевз5, Тома, МУ. Модифіковану амінокислоту можна вибрати, наприклад, з глікозилованої амінокислоти, ПЕГілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон'югованої з ліпідним фрагментом, або амінокислоти, кон'югованої з органічним дериватизуючим засобом.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом також можна модифікувати хімічним шляхом за допомогою ковалентного кон'югування з полімером, наприклад, для збільшення періоду напівжиття в кровотоку. Полімери, що наводяться як приклад, і способи приєднання їх до пептидів проілюстровані, наприклад, в 05 4766106; 05 4179337; 05 4495285 і 5 4609546. Додаткові ілюстративні полімери включають поліоксіетиловані поліоли і поліетиленгліколь (РЕ) (наприклад, РЕС;и; з молекулярною масою від приблизно 1000 до приблизно 40000, наприклад, від приблизно 2000 до приблизно 20000, наприклад, приблизно 3000-12000 г/моль).
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна додатково застосовувати в способі діагностики або як діагностичний візуалізуючий ліганд.
У одному варіанті здійснення передбачені антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом, що містять одну або декілька мічених радіоактивними ізотопами амінокислот.
Мічене радіоактивним ізотопом антитіло до тау-білка можна застосовувати як в діагностичних, так і в терапевтичних цілях (ще однією можливою ознакою є кон'югування з міченими радіоактивним ізотопом молекулами). Необмежувальні приклади таких міток включають, без обмеження, вісмут (23Ві), вуглець (С, 19С, 1723, хром (Ст), кобальт (Со, 60Со), мідь (Си), диспрозій (55Пбу), ербій (99Ег), фтор (Р), гадоліній (159050, 159032), галій (88(3а, 6/"Са), германій (68(з42е), золото (198Ац), гольмій (96Но), водень (УЗН), індій (Тип, 72, 719, 751и), йод (1211123, 12511911), іїридій (79217), залізо (Ре), криптон (8'"Ку), лантан (| а), лютецій (177 у), марганець (Мп), молібден (Мо), азот (ЗМ, "»М), кисень (720), паладій (ЗРО), фосфор (2Р), калій (2К), празеодим (""2Рі), прометій (9Рт), реній (196Ве, "88Ве), родій (ВП), рубідій (В, 82АБ), рутеній (822Ви, 27Ви), самарій (53517), скандій (775с7), селен (756), натрій (Ма), стронцій (8551, 895, 9251), сірку (255), технецій (Тс), талій (2171), олово (З5п, 71751), ксенон (З3Хе), ітербій (99Ур, 175Ур, 177Ур), ітрій (9У), цинк (9521) ії цирконій (77). Цирконій (77) представляє особливий інтерес.
Способи отримання амінокислот, мічених радіоактивними ізотопами, і відповідних похідних пептидів відомі з рівня техніки (див., наприклад, дипднапз еї аЇ., у Сапсег Спетоїпегару апа
Віотегару 655-686 (2-е видання, під редакцією СНаїпег апа ГІ оподо, Гірріпсоїї Намеп (1996)) і 5 4681581; 05 4735210; 005 5101827; 05 5102990 (05 ВЕЗ5500), 005 5648471 ії 05 5697902.
Наприклад, радіоактивний ізотоп можна кон'югувати за допомогою способу з використанням хлораміну Т (Ііпаєдгеп, 5. єї аї. (1998) "Снпіогатіпе-Т Іп Нідн-5ресіїіс-Асіїмну Вадіоіодіпайоп ОЇ
Апіїродієз Овіпд М-Биссіпітіду!-3-(ТиітеїНу!івіаппуї!) Вепгоаїе Ав Ап Іпіептеадіаїе", Мисі. Меа. Віо!. 25(7):659-665; Кипи, М. еї аї. (1993) "Зпе-5ресіїс Сопіндайоп Ої А Вадіоіодіпаїєд Рпепеїйпуіатіпе
Оегімайме То А Мопосіопа! Апібоду Незиїйїв5 Іп Іпстеазейд РНадіоасіїмпу І осаїї2айоп Іп Титог", у).
Мей. Спет. 36(9):1255-1261; Веа, ОЛМУ. єї аї. (1990) "Зйе-зресіїїсаПу гадіоіодіпаїейд апіїбоду ог
Тагдеїіпу Шштогв", Сапсег Нев. 50(3 Зиррі):8575-8615).
Зо Цей винахід також передбачає антитіла до тау-білка і їх епітопзв'язувальні фрагменти, мічені за допомогою детектовної флуоресцентної мітки (такої як хелат рідкоземельного елементу (наприклад, хелат європію)), мітки флуоресцеїнового типу (наприклад, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, 5-карбоксифлуоресцеїн, б-карбоксифлуоресцеїн, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн), мітки родамінового типу (наприклад, АГЕХА РГООКФ 568 (Іпийгодеп), ТАМКАФ або данзилхлорид), МІМОТАСІ 680 ХІІ РГОШОБКОСНЕКОМЕ "М (Регкіп ЕЇІптег), фікоеритрину; умбеліферону, лісаміну; ціаніну; фікоеритрину, техаського червоного, ВОВБІРУ
ЕІ -5ЕФ (Іпмігодеп) або його аналога, всі з яких підходять для оптичного виявлення. Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна виконувати шляхом приєднання діагностичної молекули за цим винаходом до придатних до виявлення речовин, включаючи, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або до комплексів з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин.
Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна виконувати шляхом приєднання діагностичної молекули за цим винаходом до детектовних речовин, що включають, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або до комплексів з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин. Також можна використовувати парамагнітні мітки, і їх переважно виявляють за допомогою позитронно- емісійної томографії (РЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (5РЕСТ). Такі парамагнітні мітки включають, без обмеження, сполуки, що містять парамагнітні іони алюмінію (АТ), барію (Ва), кальцію (Са), церію (Се), диспрозію (Бу), ербію (Ег), європію (Еи), гадолінію (Са), гольмію (Но), іридію (Іг), літію (Ії), магнію (Ма), марганцю (Мп), молібдену (М), неодиму (Ма), осмію (05), кисню (0), паладію (Ра), платини (РО), родію (ВИ), рутенію (Ви), самарію (т), натрію (Ма), стронцію (5), тербію (ТЬ), тулію (Тт), олова (5п), титану (Ті), вольфраму (М) і цирконію (21), і, зокрема, Со»2, Сі"2, Ст, би, Рез2, Без, бат, Мпе3, Мі, Ті, М і У, позитрон- випромінювальні ізотопи металів при використанні різних видів позитронно-емісійної томографії і нерадіоактивні парамагнітні іони металів.
Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка або його фрагмент, що зв'язується з тау-білюоюм, за цим винаходом можуть бути міченими флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїзотопною міткою або ферментною міткою. Мічене антитіло або його фрагмент можна застосовувати для виявлення наявності або вимірювання кількості вказаного тау-білка в головному мозку суб'єкта. Цей спосіб може включати виявлення або вимірювання кількості антитіла до тау-білка або фрагмента, що зв'язується з тау-білком, зв'язаного з вказаним тау-білком, шляхом візуалізації іп мімо і може включати візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до тау-білка або фрагмента, що зв'язується з тау-білком, зв'язаного з таким тау-білком.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до вектора експресії, що кодує один або декілька поліпептидних ланцюгів антитіла за цим винаходом або його фрагмента, що зв'язується з тау-білком. Такі вектори експресії можна застосовувати для отримання антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом рекомбінантним шляхом.
Вектор експресії в контексті цього винаходу може являти собою будь-який відповідний ДНК- або РНК-вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні і синтетичні вектори на основі нуклеїнових кислот (послідовність нуклеїнової кислоти, що містить відповідний набір елементів контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 5У40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловірус, дріжджові плазміди, вектори, отримані в результаті об'єднання плазмід і фагової ДНК, і вектори на основі вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). У одному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до тау-білка, міститься у векторі на основі "голої" ДНК або РНК, включаючи, наприклад, лінійний експресійний елемент (описаний, наприклад, в 5уке5 апа доппвзіоп, Маї Віоїесй 12, 355-59 (1997)), векторі на основі щільно укладеної нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в 5 6077835 і/або МО 00/70087), плазмідному векторі, такому як рВА322, рОС 19/18 або рус 118/119, векторі мінімального розміру "тідде" на основі нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в
Зспакомв»кі єї а!., Мої Тнег 3, 793-800 (2001)) або представлена у вигляді векторного конструкта нуклеїнової кислоти, що осаджується, такого як конструкт, що осаджується СаРох (як описано, наприклад, в У/О 00/46147, Вепмепізіу апа Везпеї, РМАБ ОБА 83, 9551-55 (1986), МУідіег єї аї,
Сеї! 14, 725 (1978), і Согаго апа Реагзоп, бБотаїййс Сеї! Сепеїйсв 2, 603 (1981)). Такі вектори на основі нуклеїнових кислот і їх застосування добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, 05 5589466 і 05 5973972).
У одному варіанті здійснення вектор є придатним для експресії антитіл до тау-білка або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом в бактеріальній клітині. Приклади таких векторів включають вектори експресії, такі як Вінезстірі (Зігаїадепе), вектори ріМ (Мап НеекКе 4
Зеспизвіег, у. Віої. Снет. 264, 5503-5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп, Мадісон, Вісконсін) і т. п.
Вектор експресії може також, або альтернативно, бути вектором, відповідним для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, відповідний для експресії в дріжджовій системі. Відповідні вектори включають, наприклад, вектори, що містять конститутивні або індуковані промотори, такі як промотори генів фактора альфа, алкогольоксидази і РОН (огляд яких наведений в: ЕР. А!йвиреї! єї аї., єд. Ситепі Ргоїосої5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, Сстеепе Рибіїзпіпуд апа УмМіеу Іпіегосівєпсе Мем/ Могк (1987), Стапі єї аї, Меїйодв іп Епгутої 153, 516-544 (1987), Манапоміси, 0. єї аІ. Меїподз Мої. Віої!. 824, 329-358 (2012), Сеїїк,
Е. еї аї. Віотесппої. Адм. 30(5), 1108-1118 (2012), Ії, Р. еї аї. Аррі. Віоспет. ВіоїтесНпої. 142(2), 105-124 (2007), Воеєг, Е. єї аІ. Аррі. Містобвіо!. Віоїтесппої. 77(3), 513-523 (2007), мап дег Маай, О.М.
Меїтоаз Мої. Віо!. 178, 359-366 (2002), і Ноїпїдег, Р. Меїтоаз Мої. Віо!. 178, 349-357 (2002)).
У векторі експресії за цим винаходом нуклеїнові кислоти, що кодують антитіло до тау-білка, можуть містити будь-який відповідний промотор, енхансер і інші елементи, сприяючі експресії, або бути пов'язаними з ними. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, ІЕ промотор/енхансер СММ людини, а також промотори ВБ5М, 5М40, 51 3-3, ММІМ і
Ї ТА НІМ), ефективні полі-(А)-послідовності термінації, точку початку реплікації для продукту плазміди в Е. соїї, ген стійкості до антибіотиків як селективний маркер і/або відповідний сайт клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти також можуть містити індукований промотор, а не конститутивний промотор, такий як ІЕ СММ (фахівець в даній галузі техніки зрозуміє, що такі терміни фактично описують ступінь експресії гена в певних умовах).
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, такої як трансфектома, яка виробляє антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, визначені в даному описі, або біспецифічну молекулу за цим винаходом, визначену в даному описі. Приклади клітин-хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК. Наприклад, в одному варіанті бо здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить нуклеїнову кислоту, стабільно інтегровану в клітинний геном, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до тау-білка за цим винаходом або його епітопзв'язувального фрагмента. У іншому варіанті здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить неінтегровану нуклеїнову кислоту, таку як плазмі да, косміда, фагміда або лінійний експресійний елемент, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до способу отримання антитіла до тау-білка за цим винаходом, при цьому вказаний спосіб включає стадії: а) культивування гібридоми або клітини-хазяїна за цим винаходом, як описано в даному описі вище, і БЮ) очищення антитіла за цим винаходом від культурального середовища.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до препарату в тому сенсі, в якому цей термін використовується в даному описі, який містить антитіло до тау-білка, визначене в даному описі, і який практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися 3 тау-білююом, або істотним чином не змінюють функціональні характеристики препарату, спрямовані проти тау-білка. Таким чином, такий препарат не охоплює сироватку крові, що утворюється в природних умовах, або очищений похідний продукт такої сироватки крові, який містить суміш антитіла до тау-білка і іншого антитіла, яке не змінює функціональні характеристики антитіла до тау-білка в препараті, де такі функціональні характеристики являють собою: () практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (її) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (мі) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або
Зо (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні згідно з описаним в даному описі з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей га 4510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білка щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні згідно з описаним в даному описі з посмертними екстрактами з головного мозку людей з АЮ.
Цей винахід, зокрема, відноситься до препаратів такого антитіла до тау-білка, що має структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності (у будь-яких своїх СОВ, варіабельних доменах, залишках каркасної ділянки і/або константних доменах) в порівнянні із структурою антитіла до тау-білка, що зустрічається в природі, де вказана структурна зміна обумовлює прояв антитілом до тау-білка значно змінених функціональних характеристик (тобто більш ніж з 20 95 різницею, більш ніж з 40 95 різницею, більш ніж з 60 95 різницею, більш ніж з 80 95 різницею, більш ніж з 100 95 різницею, більш ніж з 150 95 різницею, більш ніж з 2-кратною різницею, більш ніж з 4-кратною різницею, більш ніж з 5-кратною різницею або більш ніж з 10- кратною різницею у функціональних характеристиках) в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом до тау-білка, що зустрічається в природі; де вказані функціональні характеристики являють собою: (ї) практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (її) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (мі) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром бо 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні згідно з описаним в даному описі з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей /Т94510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білка щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при
Б застосуванні згідно з описаним в даному описі з посмертними екстрактами головного мозку людей з АЮ.
Термін "практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах" відноситься до повної відсутності таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в таких препаратах або до включення таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в такі препарати в концентрації, в якій вони істотним чином не впливають на властивості зв'язування з тау-білком даних препаратів. Говорять, що антитіло є "виділеним", якщо воно не має еквівалента, що утворюється в природних умовах, або було відокремлене або очищене від компонентів, які в природних умовах супроводжують його.
Термін "антитіла, що утворюються в природних умовах", використовуваний стосовно таких препаратів, відноситься до антитіл (включаючи аутоантитіла, що утворюються в природних умовах), утворення яких відбувається в організмі живих людей або інших тварин як природний наслідок функціонування їх імунних систем.
Таким чином, препарати за цим винаходом не виключають, а насправді явним чином охоплюють препарати, які містять антитіло до тау-білка і спеціально додане додаткове антитіло, здатне зв'язуватися з епітопом, який не міститься в тау-білку. Такі препарати, зокрема, включають їх варіанти здійснення, в яких препарат проявляє підвищену ефективність в лікуванні хвороби Альцгеймера (АЮ), хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР) ії кортикобазальної дегенерації (СВО). Крім того, цей винахід направлений на препарати, які містять антитіла антитіла до тау-білка або їх епітопзв'язувальні фрагменти, призначені для застосування в лікуванні психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АЮ, або психозу у пацієнтів з АБО, апатії, обумовленої АЮ, або апатії у пацієнтів з АО і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві. Крім того, препарати за цим винаходом містять антитіла антитіла до тау-білка або їх епітопзв'язувальні фрагменти, які можна застосовувати в лікуванні інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації,
Зо пов'язаної з хворобою Паркінсона.
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить: (ї) антитіло до тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, обидва з яких визначені в даному описі, або препарат в тому сенсі, в якому цей термін визначений в даному описі, який містить таке антитіло до тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент; і (ї) фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції можна складати з фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, а також з будь-якими іншими відомими наповнювачами і допоміжними засобами згідно з традиційними методиками, такими як розкриті в Ветіпдіоп: Те 5сієпсе апа
Ргасіїсе ої Рпагтасу, 22па Едіп, Сеппаго, Ед., Маск Рибіїзпіпа Со., Еавіоп, РА, 2013.
Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі, а також будь-які інші відомі допоміжні засоби і наповнювачі мають бути придатними для вибраної сполуки цього винаходу і вибраного способу введення. Придатність носіїв і інших компонентів фармацевтичних композицій визначають на підставі відсутності значного негативного впливу на бажані біологічні властивості вибраної сполуки або фармацевтичної композиції цього винаходу (наприклад, на підставі меншого, ніж істотний вплив (на підставі 10 95 або меншого відносного пригнічення, 5 95 або меншого відносного пригнічення і т. д.)) стосовно зв'язування з епітопом.
Фармацевтична композиція цього винаходу також може містити розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, такий як Тмеєп-20 або ТГмееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або вільні протеїногенні амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори і/або інші матеріали, відповідні для включення у фармацевтичну композицію. Розріджувач вибирають таким чином, щоб він не впливав на біологічну активність комбінації. Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, фізіологічний фосфатно- сольовий буферний розчин, розчини Рінгера, розчин декстрози і розчин Хенка. Крім того, фармацевтична композиція або склад також можуть містити інші носії або нетоксичні нетерапевтичні неімуногенні стабілізатори і т. п. Композиції також можуть містити великі макромолекули, що поволі метаболізуються, такі як білки, полісахариди, такі як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і сополімери (наприклад, функціоналізована латексом сефароза, агароза, целюлоза і т. п.), полімери амінокислот, сополімери амінокислот і бо агрегати ліпідів (наприклад, масляні краплі або ліпосоми).
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях цього винаходу можна змінювати для того, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції і способу введення. Вибраний рівень дози залежатиме від ряду фармакокінетичних чинників, зокрема активності конкретних використовуваних композицій цього винаходу або їх аміду, шляху введення, часу введення, швидкості виведення конкретної використовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, вживаних в комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і анамнезу пацієнта, що піддається лікуванню, а також аналогічних чинників, добре відомих в галузі медицини.
Фармацевтичну композицію можна вводити будь-яким відповідним шляхом і способом, зокрема парентеральним, місцевим, пероральним або інтраназальним способом, для профілактичного і/або терапевтичного лікування. Згідно з одним варіантом здійснення фармацевтичну композицію цього винаходу вводять парентерально. Використовувані в даному описі винаходу фрази "парентеральне введення" і "що вводиться парентерально" означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включають епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, внутрічерепну, інтраторакальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію і інфузію.
Додаткові відповідні шляхи введення сполуки за цим винаходом іп мімо і іп міго добре відомі з рівня техніки і можуть бути вибрані звичайними фахівцями в даній галузі техніки.
У одному варіанті здійснення цю фармацевтичну композицію вводять за допомогою внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції або інфузії.
Фармацевтично прийнятні носії включають будь-які можливі відповідні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, засоби, що надають ізотонічність, антиоксиданти і засоби, що уповільнюють абсорбцію, і т. п., які є фізіологічно сумісними із сполуками цього винаходу.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях цього винаходу, включають воду, сольовий розчин, фосфатно- сольовий буферний розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.), а також їх придатні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, кукурудзяна олія, арахісова олія, бавовняна олія і кунжутна олія, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат, і/або різні буфери. В галузі фармацевтики добре відомі інші носії.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального отримання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій.
Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли будь-яке традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу.
Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів для покриття, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції цього винаходу також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т. п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутилований гідроксіанізол (ВНА), бутилований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т. п.; і (3) металохелатори, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т. п.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити засоби, що забезпечують ізотонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин, або хлорид натрію, в композиціях.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити одну або декілька допоміжних речовин, відповідних для вибраного шляху введення, такі як консерванти, зволожувальні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини, консерванти або буфери, які можуть збільшити термін зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Сполуки 60 цього винаходу можна отримувати з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді складу з контрольованим вивільненням, в тому числі у вигляді імплантатів, трансдермальних пластирів і мікроїнкапсульованих систем доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, полімери, які руйнуються біологічно, біосумісні полімери, такі як сополімер етилену і вінілацетату, поліангідриди, полігліколеву кислоту, колаген, поліортоестери і полімолочну кислоту, окремо або разом з воском, або інші матеріали, добре відомі з рівня техніки. Способи отримання таких складів в цілому відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, бивіаіїпей апа
Сопігоїїєйд Веїєазе Огид Овїїмегу бБузіє тв, у. В. Вобіпзоп, єд., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем/ МогК, 1978.
У одному варіанті здійснення сполуки за цим винаходом можна складати для забезпечення належного розподілу іп мімо. Фармацевтично прийнятні носії для парентерального введення включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли які-небудь традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях за цим винаходом. Додаткові активні сполуки також можна включати до складу композицій.
Фармацевтичні композиції для ін'єкцій як правило мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Композиція може бути складена у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, відповідної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути водним або неводним розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і відповідні їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. В багатьох випадках буде переважним включення засобів, що забезпечують ізотонічність, наприклад цукрів, багатоатомних спиртів, таких як гліцерин, маніт, сорбіт, або хлориду натрію в композицію. Тривалого всмоктування ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включення в композицію засобу, що уповільнює всмоктування антитіла, наприклад моностеаратних солей і
Зо желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, наприклад, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією.
Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, наприклад, з перелічених вище. У разі стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів отримання порошків є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті яких отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь- який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією. Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти з перелічених вище. У разі стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів приготування є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті яких отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Схеми дозування у вищезгаданих способах лікування і шляхах застосування, описаних в даному описі винаходу, коректують для отримання оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом деякого часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як визначається потребами терапевтичної ситуації. Композиції для парентерального введення можна складати у вигляді одиничної лікарської форми для простоти введення і рівномірності дозування. Одинична лікарська форма, використовувана в даному описі винаходу, відноситься до фізично дискретних одиниць, зручних в якості одиничних доз для суб'єктів, що підлягають лікуванню; при цьому кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до одиничних лікарських бо форм цього винаходу продиктовані (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним ефектом, якого необхідно досягти, і (Б) обмеженнями, притаманними галузі складання такої активної сполуки для лікування чутливості у індивідуумів, і безпосередньо залежать від них.
Ефективні дози і режими дозування антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом залежать від захворювання або стану, що підлягають лікуванню, і можуть бути визначені фахівцями в даній галузі техніки. У будь-який заданий день, коли дають дозу, доза може знаходитися в діапазоні від приблизно 0,0001 до приблизно 100 мг/кг і частіше від приблизно 0,01 до приблизно 5 мг/кг ваги тіла реципієнта. Наприклад, дози можуть складати 1 мг/кг ваги тіла або 10 мг/кг ваги тіла або знаходитися в діапазоні 1-10 мг/кг ваги тіла. Таким чином, ілюстративні дози включають від приблизно 0,1 до приблизно 10 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 5 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, наприклад, приблизно 0,15 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 5 мг/кг/ваги тіла або приблизно 10 мг/кг/ваги тіла.
Лікар із стандартною кваліфікацією в даній галузі легсо може визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар може почати з доз антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, використовуваних у фармацевтичній композиції нижчих рівнів, ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту. В цілому, відповідною добовою дозою композиції цього винаходу буде така кількість сполуки, яка є найнижчою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Така ефективна доза зазвичай залежатиме від описаних вище чинників. Введення може бути, наприклад, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньочеревним або підшкірним. За бажанням, ефективну добову дозу фармацевтичної композиції можна вводити у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше частин дози, що вводяться окремо з відповідними інтервалами протягом доби, необов'язково у вигляді одиничних лікарських форм. Хоча сполуки цього винаходу можна вводити окремо, переважно вводити сполуки у вигляді фармацевтичної композиції, описаної вище.
Зо Мічені антитіла або їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати в діагностичних цілях для виявлення, діагностики або моніторингу захворювань або порушень.
Цей винахід передбачає виявлення або діагностику нейродегенеративного або когнітивного захворювання або порушення, зокрема, без обмеження, хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РБОР) і кортикобазальної дегенерації (СВО), що включають: (а) проведення аналізу наявності піроглутамілованих Ар- фрагментів у клітинах або зразках тканин суб'єкта за допомогою одного або декількох антитіл, що специфічно зв'язуються з тау-білком; і (б) проведення порівняння рівня антигену з контрольним рівнем, наприклад, з рівнями в зразках нормальних тканин, при якому підвищення аналізованого рівня антигену в порівнянні з контрольним рівнем антигену свідчить про захворювання або порушення або свідчить про тяжкість захворювання або порушення.
Антитіла або їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати для аналізу тау-білка або фрагментів тау-білка в біологічному зразку за допомогою імуногістохімічних способів, добре відомих з рівня техніки. Інші способи з використанням антитіл, застосовні для виявлення білка, включають імунологічні аналізи, такі як імуноферментний аналіз (ЕПІБА) і радіоїмунологічний аналіз (ВІА), а також аналізи з використанням платформи Мезо ЗсаЇІє Різсомегу (М50О). У таких наборах і способах можна застосовувати відповідні мітки для антитіл, і мітки, відомі з рівня техніки, включають ферментні мітки, такі як лужна фосфатаза і глюкозооксидаза; радіоізотопні мітки, такі як йод (1251191), вуглець (77С), сірка (255), тритій (ЗН), індій (п) і технецій ("Тс); а також люмінесцентні мітки, такі як люмінол і люцифераза; і флуоресцентні мітки, такі як флуоресцеїн і родамін.
Наявність мічених антитіл до тау-білка або їх фрагментів, що зв'язуються з тау-білком, можна виявляти іп мімо в діагностичних цілях. У одному варіанті здійснення діагностика включає: а) введення суб'єктові ефективної кількості такої міченої молекули; Б) очікування протягом деякого проміжку часу після введення для забезпечення концентрації міченої молекули в місцях відкладення АВ (за наявності таких) і для забезпечення очищення від незв'язаної міченої молекули до фонового рівня; с) визначення фонового рівня і 4) виявлення міченої молекули у суб'єкта таким чином, що виявлення міченої молекули на рівні, що перевищує фоновий, свідчить про те, що суб'єкт має захворювання або порушення, або свідчить про тяжкість захворювання або порушення. Відповідно до такого варіанта здійснення 60 молекулу мітять візуалізуючим компонентом, відповідним для виявлення, за допомогою конкретної системи візуалізації, відомої фахівцям в даній галузі. Фонові рівні можна визначити за допомогою різних способів, відомих з рівня техніки, зокрема шляхом порівняння кількості виявленого міченого антитіла із стандартним значенням, попередньо визначеним для конкретної системи візуалізації. Способи і системи, які можна застосовувати в способах діагностики за цим винаходом, включають, без обмеження, комп'ютерну томографію (СТ), сканування всього тіла, таке як позитронно-емісійна томографія (РЕТ), магнітно-резонансна візуалізація (МР) і ультразвукове дослідження.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в терапії.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в лікуванні, діагностиці або візуалізації таупатій.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в лікуванні хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР) і кортикобазальної дегенерації (СВО).
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування у виробництві лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації таупатій.
Лікарський препарат переважно призначений для лікування хвороби Альцгеймера (АВ), хвороби аргірофільних зерен (АСО), прогресуючого над'ядерного паралічу (Р5Р) і кортикобазальної дегенерації (СВО), найпереважніше хвороби Альцгеймера (АБ). Лікарський препарат також переважно призначений для лікування психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АЮ, або психозу у пацієнтів з АО, апатії, обумовленої АЮ, або апатії у пацієнтів з АО, і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає спосіб лікування, діагностики або візуалізації хвороби Альцгеймера або інших таупатій у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб включає введення лікарського препарату на основі моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, як визначено в даному описі, вказаному суб'єктові в
Зо ефективній кількості.
У переважному варіанті здійснення лікування є тривалим і переважно продовжується щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає набір, який містить антитіло або його фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в терапії.
ПЕРЕЛІК ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ
1. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІО МО: 1) таким чином, що антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент практично не зв'язується з 5ЕО ІЮ
МО: 1, фосфорилованою по залишку 404, у випадку, якщо залишок 396 не є фосфорилованим. 2. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1, які інгібують РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ в рідиннофазному аналізі інгібування таким чином, що моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються ІС50, що становить 100 нМ або менше, як, наприклад, від 0,1 нМ до 100 нМ, як, наприклад, концентрацією, що становить 50 нМ або менше, як, наприклад, від 0,1 нМ до 50
НМ. 3. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1 або 2, при цьому вони здатні видаляти щонайменше 15 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-396, з гомогенатів головного мозку від суб'єктів з хворобою
Альцгеймера при вмісті антитіла, що становить приблизно 75 нг, що визначають згідно з сигналом тау-білка ре396 у вестерн-блотингу після досліджень з імуновиснаження екстрактів головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера. 4. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО І МО: 3, 5ЕО І МО: 31; 5ЕО ІС МО: 32; 5ЕО ІЮО МО: 33; 5ЕО ІО МО: 34;
ЗЕО ІЮО МО: 35; 5ЕО ІЮ МО: 36; 5ЕО І МО: 37; 5ЕО ІО МО: 38; 5ЕО ІЮ МО: 40 ії БЕО І МО: 46; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; 5ЕО І
МО: 41 ї БЕО ІЮ МО: 47; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під зБЕО І МО: 5; 5ЕО ІЮ (510) МО: 42 і 5ЕО ІЮ МО: 48; бо
(4) СОВІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 6; 5ЕО
ІО МО: 43; БЕО ІЮ МО: 49; 5ЕО ІО МО: 52 і 5ЕО ІЮО МО: 55; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 7; 5ЕО ІО МО: 28; 5ЕО ІО МО: 29; 5ЕО ІО МО: 30; 5ЕО ІЮ МО: 44;
ЗЕО ІО МО: 50; 5ЕО ІЮ МО: 53 і 5ЕО І МО: 56; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 39; 5ЕО ІЮ МО: 45; 5ЕО ІО МО: 51; 5ЕО ІО МО: 54 і
ЗЕО ІО МО: 57. 5. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) легкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 12; 5ЕО ІО МО: 16; 5ЕО
ІО МО: 17; 5ЕО ІЮО МО: 18; 5ЕО ІЮО МО: 19; 5ЕО ІЮ МО: 20; 5ЕО І МО: 21; 5ЕО ІЮО МО: 22 і 5ЕО
ІО МО: 23; і (р) важкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з ФЕО ІЮО МО: 11; 5ЕО ІЮ МО: 13; 5ЕО
ІО МО: 14; 5ЕО ІЮ МО: 15; 5ЕО ІО МО: 24; 5ЕО ІЮ МО: 25; 5ЕО І МО: 26 і 5ЕО І МО: 27. 6. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, де (а) легкий ланцюг являє собою 5ЕО ІО МО: 12; і (р) важкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з ФЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО
ІО МО: 15, БЕО ІО МО: 24, 5ЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО І МО: 26 ї БЕ ІЮ МО: 27. 7. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, де (а) легкий ланцюг, вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 16; 5ЕО ІО МО: 17; 5ЕО
ІО МО: 18; 5ЕО І МО: 19; 5ЕО ІЮ МО: 20; 5ЕО ІЮ МО: 21; 5ЕО ІЮ МО: 22 і 5ЕО ІЮО МО: 23; і (р) важкий ланцюг являє собою 5ЕО ІО МО: 11. 8. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5;
Ко) (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 9. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13. 10. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО 1Ю МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 11. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4;
БО (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 12. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 14. 13. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять щонайменше одне 3: 60 (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3;
(б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 14. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 15. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 15. 16. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 17. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять:
Ко) (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 18. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 19. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 20. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом
БО здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 21. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 17; і 60 (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11.
22. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 23. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 24. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 18; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 25. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і
Ко) (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 26. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 27. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 19; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 11. 28. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6;
БО (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 29. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 35; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8.
30. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 20; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 31. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 35; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 32. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 36; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 33. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 21; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 34. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 36; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і
Ко) (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 35. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 37; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 8. 36. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 22; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 37. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під зБЕО ІЮ МО: 37;
БО (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 38. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 38; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; 60 (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5;
(4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 39. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 23; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО 1О МО: 11. 40. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 38; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 41. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 42. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24. 43. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять щонайменше одне з: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 44. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 45. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24. 46. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7.
47. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і () СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 39. 48. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 17; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24. 49. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7. 50. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і
Ко) (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 51. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 16; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13. 52. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 31; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 28; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 53. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5;
БО (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 54. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 17; (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 13. 55. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 32; і 60 (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 28;
і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 8. 56. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 57. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 18; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24. 58. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 33; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; і (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7. 59. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом
Ко) здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 34; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮО МО: 7; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 60. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 19; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 24. 61. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ1 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 34; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39; і що додатково містять щонайменше одне з (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять щонайменше одне з (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6;
БО (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 7. 62. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 63. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом 60 здійснення 1 або 5, що містять:
(а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 25. 64. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 28; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 65. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 66. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 26. 67. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять
Ко) (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 29; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 68. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під 5ЕО 1Ю МО: 30; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 69. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 5, що містять: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 12; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 27. 70. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, що містять: (а) СОВІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 3; (б) СОВ2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 4; і (с) СОВЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 5; і що додатково містять (4) СОВІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: 6; (є) СОВ2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІО МО: З0; і (У СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність під ФЕО ІЮ МО: 39. 71. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-5, що характеризуються селективністю стосовно амінокислотного мотиву гіперфосфорилованого тау-білка, при цьому мотив містить фосфорилований сериновий залишок і тирозиновий залишок, розташовані через один залишок. 72. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 71, де амінокислотний мотив має послідовність: 60 --Хх-(фосфоріїілованни) - Р -,
де У являє собою тирозин, Х являє собою амінокислоту, що зустрічається в природі, Р являє собою пролін, і З(фосфорилований) являє собою серин з фосфорилованою гідроксильною групою бічного ланцюга. 73. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що містять Ес-ділянку. 74. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що додатково містять компонент для збільшення періоду напіввиведення іп мімо даного засобу. 75. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що характеризуються специфічним зв'язуванням з людським тау-білюом, що містить фосфорилований залишок 396, згідно з наступними критеріями тестування: ї) антитіло практично не зв'язується з нефосфорилованим тау-білком; ії) антитіло практично не зв'язується з тау-білюом, фосфорилованим в 404, якщо він при цьому не фосфорилований в 396; Ні) антитіло зв'язується з тау-білюом, фосфорилованим в 396; і ім) антитіло зв'язується з тау-білком, якщо як 396, так і 404 є фосфорилованими. 76. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, утворення яких відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить щонайменше 18 послідовних амінокислотних залишків, як, наприклад, щонайменше 20 послідовних амінокислотних залишків, в межах ТОНнНОАБІМУКРОРМУМБОЮТІВРАНІ (5ЕО 10 МО: 2), що охоплює залишки 386-408 тау-білка 248. 77. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 76, утворення яких відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30, послідовних амінокислотних залишків, що включають ТОНСОАЕІМУКР'ЗРУУМБОЮТОРВАНІ (5ЕО І МО: 2), що охоплює залишки 386- 410 тау-білка 2М4В. 78. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, що володіють специфічністю стосовно фосфорилованого тау-білка (рТацй) від пацієнтів, уражених АЮ, в порівнянні із здоровими контрольними суб'єктами у
Зо відповідній віковій групі, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються відмінністю в специфічності стосовно фосфорилованого тау-білка (рТац) від пацієнтів, уражених Аб, в порівнянні з тау-білком від здорових контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі, що являє собою більш ніж 50-кратне, як, наприклад, більш ніж 100- кратне, підвищення специфічності стосовно матеріалу, ураженого Аб, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на БЕЇІ5БА аналізі для виявлення фосфорилованого тау-білка (рТай) в гомогенатах головного мозку від суб'єктів з АЮ і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1 ЕЕ І5А для фосфорилованих і мультимерних молекул. 79. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 78, що володіють специфічністю стосовно тау-білка з матеріалу, ураженого АЮ, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються відмінністю в специфічності стосовно матеріалу, ураженого АБ, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі, що являє собою більш ніж 50-кратне, як, наприклад, більш ніж 100-кратне, підвищення специфічності стосовно матеріалу, ураженого
Ар, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на ЕГІЗА аналізі для виявлення фосфорилованого тау-білка (рТай) в гомогенатах головного мозку від суб'єктів з АО і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1 ЕГІЗА для фосфорилованих і мультимерних молекул. 80. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, утворення яких відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид: ТОНОАЕІМУКРІЗРУУБОаОЮТеРОРВАНІ. (5ЕО ІО МО: 2), що охоплює залишки 386-410 тау- білка 2М4АВ, або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка. 81. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, які були отримані або вироблені в лінії клітин, такій як лінія клітин людини, лінія клітин ссавця, відмінного від людини, лінія клітин комахи, дріжджів або бактерії, або за допомогою рекомбінантної технології. 82. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 81, отримані в лінії клітин СНО, лінії клітин НЕК, лінії клітин ВНК-21, лінії мишачих клітин (такій як лінія клітин мієломи), лінії клітин фібросаркоми, лінії клітин РЕН.Сб, лінії клітин НКВ-11, лінії клітин САР і лінії людських клітин Нин-7.
83. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, де вказане моноклональне антитіло експресується гібридомою, яка була виділена шляхом скринінгу гібридом з використанням людського патологічного і непатологічного тау-білюка для виділення клонів, які як ії) є специфічними стосовно фосфорилованих епітопів 5396, так і ії) специфічно розпізнають гіперфосфорилований тау-білок з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера, де вказані антитіла або їх епітопзв'язувальні фрагменти здатні розрізняти патологічний і непатологічний людський тау-білок.
84. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, де антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент додатково містять детектовний компонент.
85. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 84, де детектовний фрагмент, є флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїізотопною міткою або ферментною міткою.
86. Препарат, що містить антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь- яким з варіантів здійснення 1-70, де вказаний препарат практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися з тау-білком, або істотним чином не змінюють функціональні характеристики антитіла до тау-білка в препараті, де вказані функціональні характеристики вибрані з групи, що складається 3:
(ї) практично відсутньої здатності до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком;
(і) практично відсутньої здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396;
(ії) здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396;
(ім) здатності до зв'язування тау-білка, фосфорилованого як в 5396, так і в 5404;
(м) здатності до селективного розрізнення фосфорилованих залишків 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404 або так що вони переважно зв'язуються з 5396;
(мі) здатності до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера;
(мії) здатності до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або
(мії) здатності до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні згідно з описаним в прикладах з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей г/Г44510.
87. Препарат, що містить антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-70, де вказане антитіло або його вказаний епітопзв'язувальний фрагмент мають структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності в порівнянні із структурою антитіла, що зустрічається в природі, до тау-білка, де вказана структурна зміна обумовлює прояв вказаним антитілом або вказаним фрагментом змінених функціональних характеристик в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом, що зустрічається в природі, до тау-білка, де вказані функціональні характеристики вибрані з групи, що складається з:
(ї) практично відсутньої здатності до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком;
(і) практично відсутньої здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396;
(ії) здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396;
(ім) здатності до зв'язування з тау-білюком, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404;
(у) здатності до селективного розрізнення фосфорилованих залишків 53 96 і 5404 тау-білка,
так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404 або так що вони переважно зв'язуються з 5396;
(мі) здатності до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера;
(мії) здатності до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або
(мії) здатності до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні згідно з описаним в даному описі з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей г/Г44510.
88. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87 і фармацевтично прийнятний носій. 89. Нуклеїнова кислота, що кодує моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70 або що кодує ланцюг, що є їх складовою. 90. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87, або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88 для застосування в терапії. 91. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87, або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88 для застосування в лікуванні, діагностиці або візуалізації таупатії. 92. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87, або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88 для застосування в лікуванні таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО, апатії, обумовленої Аб, або апатії у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (Р5Р), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою
Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби
Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу.
Зо 93. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70 для застосування в лікуванні хвороби Альцгеймера. 94. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87, або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88 для застосування у виготовленні лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації таупатій. 95. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, або препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87, або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88 для застосування як лікарського препарату для лікування захворювання, вибраного з групи, що складається з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АЮ, або психозу у пацієнтів з АБО, апатії, обумовленої АЮ, або апатії у пацієнтів з АЮ, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РБР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВ! (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. 96. Спосіб лікування, діагностики або візуалізації хвороби Альцгеймера або інших таупатій у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб передбачає введення вказаному суб'єктові терапевтично ефективної кількості моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, препарату згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86- 87 або фармацевтичної композиції згідно з варіантом здійснення 88. 97. Спосіб згідно з варіантом здійснення 96, де лікування є тривалим. 98. Спосіб згідно з варіантом здійснення 97, де тривале лікування проводять протягом щонайменше 2 тижнів, як, наприклад, протягом щонайменше 1 місяця, протягом щонайменше 6 бо місяців або протягом щонайменше 1 року.
99. Спосіб згідно з будь-яким з варіантів здійснення 96-98, де суб'єктом є людина. 100. Набір, що містить антитіло або його фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-70, препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 86-87 або фармацевтичну композицію згідно з варіантом здійснення 88, для застосування в терапії. 101. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1-70, або препарат або фармацевтична композиція, що містять вказані антитіло або фрагмент, для застосування у виявленні наявності або вимірюванні кількості вказаного тау- білка в головному мозку суб'єкта. 102. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, препарат або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 88, де вказані виявлення або вимірювання передбачають візуалізацію іп мімо вказаного антитіла до тау-білка, зв'язаного з вказаним тау-білком. 103. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, препарат або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 99-100, де вказані виявлення або вимірювання передбачають візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до тау-білка або його вказаного фрагмента, зв'язаних з вказаним тау-білком. 104. Спосіб видалення щонайменше 90 95 гіперфосфорилованого тау-білка з клубка, при цьому вказаний клубок містить гіперфосфорилований тау-білок, при цьому вказаний спосіб передбачає приведення гіперфосфорилованого тау-білка в контакт з моноклональним антитілом або його епітогов'язувальним фрагментом, які є селективними стосовно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396, і які визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-70. 105. Спосіб затримки прогресу хвороби Альцгеймера у пацієнта, при цьому вказаний спосіб передбачає зменшення або ослаблення накопичення патологічного тау-білка у вказаного пацієнта шляхом введення моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, при цьому вказане моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396, і визначені в будь- якому з варіантів здійснення 1-70. 106. Фармацевтична композиція, яка містить: ї) антитіло до тау-білка згідно з варіантами здійснення 1-70 і, зокрема, варіантами здійснення 17, 18, 44 або 45, і ії) сполуку, вибрану з
Зо групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно Аб-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; е) додаткового інгібітору агрегації тау-білка; е) інгібітору ацетилхолінестерази;
І) протиепілептичного засобу; 9) протизапального лікарського засобу і
Р" ЗОВНІ; і ії) одну або декілька фармацевтично прийнятних допоміжних речовин. 107. Спосіб лікування хвороби Альцгеймера, зменшення прогресу АЮ або зменшення прояву симптомів АЮ, що передбачає терапію, що передбачає введення і) антитіла до тау-білка згідно з варіантами здійснення 1-70 і, зокрема, варіантами здійснення 17, 18, 44 або 45, і ії) сполуки, вибраної з групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно А(З-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; е) додаткового інгібітору агрегації тау-білка; є) інгібітору ацетилхолінестерази;
І) протиепілептичного засобу; 9) протизапального лікарського засобу і
Р) 5ЗВІ. 108. Набір, який містить: ї) композицію, яка містить антитіло до тау-білка згідно з варіантами здійснення 1-70 і, зокрема, варіантами здійснення 17, 18, 44 або 45, і ії) композицію, яка містить сполуку, вибрану з групи, що складається з а) інгібітору ВАСЕ; р) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно тау-білка; с) сполуки, застосовної в активній або пасивній імунотерапії стосовно АР-пептиду; а) антагоністів ММОА-рецептора; 60 є) додаткового інгібітору агрегації тау-білка;
ТУ) інгібітору ацетилхолінестерази; 9) протиепілептичного засобу;
І) протизапального лікарського засобу і ї) антидепресанту. 109. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаним інгібітором ВАСЕЇТ є низькомолекулярний інгібітор ВАСЕ І, вибраний з групи, що складається з
І у2886721, МК-8931, А20О3293 або Е2609. 110. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний інгібітор ВАСЕ1 представлений формулою І:
Чу м М ше КЕ
М й ке
Кк
В де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з галогену, СМ, С1-Св алкілу, С2-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі-Свє фторалкілу або Сі-Св алкокси; і ВІ являє собою одне або декілька з водню, галогену, С1і-Сз фторалкілу або С:1-Сз алкілу; і В2 являє собою водень або фтор. 111. Композиція, спосіб або набір за пунктом 110, де сполука формули І вибрана з групи, що складається з
ЕЕ
(35, 65)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6б-метилпіперидин-2-тюну, 5 Е ; зр
Шев ем й як (ЗА, 65)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилпіперидин-2-тіону, ї Е «КОХ я нЖ щи г зЕ (35, 65)-6-(5-аміно-2,3-дифторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилпіперидин-2-тіону, по
Е
(ЗА, 65)-6-(5-аміно-2,3-дифторфеніл)-3-фтор-3-(фторметил)-6-метилпіперидин-2-тіону,
ее
НЕ
М шк ЗЕ - Го (65)-6-(5-аміно-2-фторфеніл)-3-фтор-3,6-біс(фторметил)піперидин-2-тіону. 112. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний інгібітор ВАСЕ1 представлений формулою ІІ:
МН;
Е «Є -
Шк щі я лист о а ще
Формула Й де Аг вибраний з групи, що складається з фенілу, піридилу, піримідилу, піразинілу, імідазолілу, піразолілу, 1,2,4-триазолілу, тіофенілу, тіазолілу, оксазолілу, ізоксазолілу, 1,3,4- тіадіазолілу, ізотіазолілу, 1,3,4-оксадіазолілу, 1,2,4-оксадіазолілу, фуразанілу і 1,2,4- тіадіазолілу, і при цьому Аг необов'язково заміщений одним або декількома з галогену, СМ, Сі-
Св алкілу, Се-Свє алкенілу, С2-Св алкінілу, Сі-Свє фторалкілу або Сі-Свє алкокси; В' являє собою
Сі-Сз алкіл або Сі-Сз фторалкіл; В? являє собою водень, галоген, Сі-Сз фторалкіл або С1-Сз алкіл; і ВЗ являє собою Сі-Сз алкіл. 113. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний інгібітор ВАСЕ1 вибраний з групи, що складається з: М-(3-(28, 55)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5- диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-фторпіколінаміду;М-(3-(2А, 55)-6- аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5- метоксипіразин-2-карбоксаміду; м-(3-(28, 55)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5- тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-метоксипіколінаміду; М-(3-(2А, 55)-6-аміно-3,3,5- трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-5-ціано-3-метилпіколінаміду і
М-(3-(28А, 5А8)-6-аміно-3,3,5-трифтор-2,5-диметил-2,3,4,5-тетрагідропіридин-2-іл)-4-фторфеніл)-
Б-(дифторметил)піразин-2-карбоксаміду. 114. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний антагоніст ММОА-рецептора вибраний з групи, що складається з мемантину, наменди, намзарику (мемантин/донепезил) і їх генеричних форм. 115. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний інгібітор ацетилхолінестерази вибраний з групи, що складається з донепезилу, галантаміну і ривастигміну. 116. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108, де вказаний антидепресант вибраний з групи, що складається з есциталопраму, сертраліну, циталопраму,
Зо пароксетину, флуоксетину, венлафаксину, тразодону, міртазапіну, вортіоксетину і їх генеричних форм. 117. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108 для застосування в лікуванні таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АБО, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форм), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАВТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою
Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби
Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу.
118. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108 для застосування у виготовленні лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації таупатій. 119. Композиція за пунктом 106, спосіб за пунктом 107, набір за пунктом 108 для лікування хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), кортикобазальної дегенерації (СВО), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Імунізація мишей тау-пептидами, фосфорилованими в 396/404
Мишей С56/ВІ 6 і ЕМВ імунізували з використанням 10 мкг фосфорилованого тау-пептиду 386-408 (ре396/р404) (5ЕО І МО: 2), кон'югованого з РЗО, в складі з ад'ювантом ТітегМах.
Миші були самками і самцями з ліній С56/ВІ 6 і ЕМВ. Мишей у віці 2-3 місяців імунізували фосфорилованим тау-білком 386-408, кон'югованим з пептидним епітопом РЗО.
Імуногенний фосфорилований пептид тау-білка 386-408 (ре396/р404), кон'югований з РЗО, змішували з ТйегМах (400 мкг/мл пептиду в суміші 1:1 об.0б.) згідно з протоколом постачальника ТігегМах, і мишам підшкірно ін'єктували 20 мкг антигенного пептиду (100 мкл).
Контрольним мишам ін'єктували тільки ад'ювант. Всіх мишей, імунізованих пептидом, піддавали повторній імунізації за допомогою 0,5 мкг пептиду/ТПйегМах (10 мкг/мл пептиду, змішаного, як описано вище, і ін'єктованого) з місячними інтервалами. Під кінець мишей піддавали повторній імунізації за допомогою фосфорилованого тау-білка 386-408 (ре396/ро404), кон'югованого з
РЗО, без ТіегМах за З дні до збору спленоцитів з подальшим злиттям спленоцитів з клітинами
ЗР-2. Отримані первинні гібридоми відбирали для циклів повторного клонування після того, як вони проявляли позитивне зв'язування з фосфорилованим тау-білком 386-408 (ре396/роа404), що виявляли за допомогою ЕЇІЗА, і проявляли активність переважного зв'язування з антигенами 51 і РЗ з лізатів головного мозку суб'єктів з АЮ ії Т04510 (як описано нижче в прикладі 28). Таке зв'язування порівнювали 3 активністю зв'язування таких антитіл, спостережуваною в лізатах головного мозку від контрольних суб'єктів, за допомогою дот-блот- аналізів і планшетів для ЕГ ІА або М50О, покритих лізатом головного мозку.
Приклад 2А. Отримання гібридом
Зо Мишей піддавали повторній імунізації за допомогою фосфорилованого тау-білка 386-408 (р396/р5404), кон'югованого з РЗО, без Тіе(Мах за 3 дні до збору селезінок від мишей- респондерів з подальшим злиттям спленоцитів з клітинами 5Р-2. Гібридоми відбирали для циклів повторного клонування після виявлення за допомогою ЕЇГІ5А позитивного зв'язування з фосфорилованим тау-білююом 386-408 (ре396/р5404) і прояву активності переважного зв'язування з антигенами 51 і РЗ із лізатів головного мозку від суб'єктів з АЮ і Т4510 в порівнянні з лізатом головного мозку від контрольних суб'єктів за допомогою дот-блот-аналізів і планшетів для ЕГІ5ЗА або М50, покритих лізатом головного мозку.
Приклад 28. Вестерн-блот-аналіз і дот-блот-аналіз специфічних антитіл Біохімічне фракціонування тау-білка
Тканини головного мозку людей або мишей гТ94510, що надмірно експресують людський тау-білок з мутацією РЗОТІ, гомогенізували в 10 об'ємах Тгіз-сольового буферного розчину, що містить інгібітори протеаз і фосфатаз, як вказано далі: 50 мМ Ттгів/НСІ (рН 7,4); 274 мМ Масі; 5
ММ КСІ; 1 95 суміш інгібіторів протеаз (Воспеє); 1 95 коктейль інгібіторів фосфатаз І і ІІ (Бідта) і 1
ММ фенілметилсульфонілфторид (РМ5Е; бідта). Гомогенати центрифугували при 27000 х 9 протягом 20 хв. при 4 "С з отриманням фракцій надосадової рідини (51) і осаду. Зразки осаду повторно гомогенізували в 5 об'ємах буфера з високою концентрацією солі/сахарози (0,8 М
Масі, 10 95 сахароза, 10 мМ Ттів/НСЇ, |рнН 7,4), 1 мМ ЕСТА, 1 мм РМ5БЕ) і центрифугували, як описано вище. Зразки надосадової рідини збирали і інкубували з саркозилом (кінцева концентрація 1 95; бідта) протягом години при 37 "С з подальшим центрифугуванням при 150000 х 9 протягом однієї години при 4 "С з отриманням зразків осаду, нерозчинних в саркозилі, що називаються фракцією РЗ в даному описі. Осад РЗ ресуспендували в буфері ТЕ (10 мМ Ттіз/НСІ рН 8,0Ї, 1 мМ ЕОТА) до об'єму, рівного половині початкового об'єму, використовуваного для гомогенатів головного мозку.
Вестерн-блот- і дот-блот-аналіз и
Фракціоновані екстракти тканин 51 і РЗ розчиняли в 505-буфері для зразків, що містить 0,1
М ОТТ. Піддані тепловій обробці зразки (95 "С протягом 10 хв.) розділяли за допомогою гель- електрофорезу в 4-12 95 Вібз-Тгіз-гелях для 50О5-РАСЕ (Іпийгодеп) і переносили на мембрани з
РМОБЕ (ВіоВаєй І арогаютієз, Геркулес, Каліфорнія). Зразки для дот-блотингу наносили плямами безпосередньо на нітроцелюлозні мембрани (АтегзНпат, Пітсбург, Пенсільванія) у відомих бо концентраціях для всіх зразків. Мембрани як для вестерн-блотингу, так і для дот-блотингу блокували в 5 965 знежиреному сухому молоці в ТВ5-Гиуєеп (0,5 95) з рН 7,4 з подальшим інкубуванням з 1 мкг/мл С10-2 протягом ночі при 4 "С. Мембрани промивали і інкубували з антитілом до мишачого ІдСї, кон'югованим з пероксидазою (1:5000; даскбвоп ІттипоВРезеагси,
Вест Гроув, Пенсільванія). Зв'язані антитіла виявляли за допомогою системи посиленої хемілюмінесценції (набір ЕСІЇ РІО; РеїКіпЕІтег). Кількісну оцінку і візуальний аналіз імунореактивності в рамках вестерн-блотингу і дот-блотингу виконували за допомогою підключеної до комп'ютера аналітичної системи біовізуалізації І А5-4000 (Еціййт, Токіо, Японія) і програмного забезпечення Мийї Сацде м3.1 (Рціййт). Білкове навантаження коректували за об'ємом початкових фракцій, і його можна перетворити на початкову вогку масу тканини.
Приклад 3. Рідиннофазний аналіз інгібування захоплення антигенів РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ
Приклад ЗА. Мета. Виконати кількісну оцінку інгібування зв'язування антигенів тау-білка роОЗ9б з матеріалу головного мозку РЗ від суб'єктів з АЮ з мишачим С10.2 за допомогою людського С10-2 і підданих мутації варіантів. Планшети М5О, покриті мишачим С10-2 перед інкубуванням з РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ або РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ, попередньо інкубували з варіантами С 10.2, що представляють інтерес. Ступінь інгібування представляли у вигляді значень ІС50, що відображають позірну афінність зв'язування антитіла в рідкій фазі з антигенами. Значення ІС5О отримували за допомогою апроксимації до моделі односайтового або двосайтового зв'язування із застосуванням програмного забезпечення Старій
Рай Ріїхт. Антитіло негативного контролю (мишаче С10-1), реактивне стосовно Р (404) тау- білка, додавали для порівняння (дані не показані).
Спосіб. Планшети М5О покривали захоплюючим антитілом (750 нг/мл мишачого С10-2 в карбонатному буфері, рН 8,5) протягом ночі при кімнатній температурі з подальшим блокуванням (30 хв. в РВ5, З 95 ВБА, 0,1 95 МР40) і 5-кратним промиванням (РВ5, 0,1 95 В5А, 0,1 95 МРА4А0). Антитіла в концентрації (0-1000 нМ), що ступінчасто змінюється, інкубували протягом 60 хв. з матеріалом РЗ від суб'єктів з АО при кімнатній температурі і потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі в планшетах М50О, покритих мишачим С10-2, як описано вище. Планшети промивали 5 разів (РВ5, 0,1 95 ВБА, 0-01 95 МРА0) і антитіло до загального тау-білка (М5О, мічене ЦІЇ ГО-ТАС, 1:50) додавали для виявлення захопленого тау-
Ко) білка, яке відображало не піддані інгібуванню вільні антигени тау-білка.
Результати. Дані показували дозозалежне інгібування захоплення тау-білка за допомогою людського С10-2 і варіантів (фігура 1). Варіанти С10-2М325 і С10-2 М325:А101Т демонстрували більш виражене інгібування (ІС50-44 і 14 нМ відповідно, що відповідає моделі односайтового зв'язування), тоді як С10-2 характеризувалося неоднорідним інгібуванням, що відображалося найкращою відповідністю моделі двосайтового зв'язування (250 14 нм/630 нм). Низькоафінне зв'язування (050-630) було переважаючим, оскільки високоафінне зв'язування антитіла (ІСб50-14 нМ) складало менше 25 95 від загального зв'язування. Результати показані на фігурі 1.
Приклад ЗВ. Мета. Виконати кількісну оцінку інгібування зв'язування пептидів 386-408 тау- білка р5396 за допомогою людського С10-2 і підданих мутації варіантів в рідиннофазному аналізі інгібування. Ступінь інгібування представляли у вигляді значень ІС50О, що відображають позірну афінність зв'язування антитіла. Значення ІС5О отримували за допомогою апроксимації до моделі односайтового або двосайтового зв'язування із застосуванням програмного забезпечення Старий Рай Ріїзт. Антитіло негативного контролю (мишаче С10-1), реактивне стосовно Р (404) тау-білка, додавали для порівняння (дані не показані).
Спосіб. Планшети М5О покривали пептидом 386-408 тау-білка р5396 в карбонатному буфері, рН 9,5, протягом ночі при кімнатній температурі з подальшим блокуванням (30 хвилин в
РВ5, З 95 В5А, 0,1 95 МР40) і 5-кратним промиванням (РВ5, 0,1 95 ВА, 0,1 95 МР40). Тау-білки 386-408 рЗ396 в концентрації (0-1000 нМ), що ступінчасто змінюється, інкубували протягом 60 хв. 3 1 нг/мл антитіла при кімнатній температурі і потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі в планшетах М50, покритих тау-білком 386-408 р5396, як описано вище.
Планшети промивали 5 разів (РВ5, 0,1 95 В5А, 0,1 95 МР) і антитіло до загального тау-білка (М50, мічене БЦ! РО-ТАС, 1:50) додавали для виявлення зв'язаного антитіла, яке відображало не піддане інгібуванню вільне антитіло. Результати показані на фігурі 2.
Приклад 4. Імуногістохімічна профілізація антитіл
Тканини
Миша. Тканини головного мозку мишей збирали від 8-місячних мишей гТ94510. Ці трансгенні миші експресують людський мутантний тау-білок (РЗОТІЇ ОМАР) під контролем елементу відповіді ТеОй в СатК2-позитивних нейронах і характеризуються вираженим гіперфосфорилуванням тау-білка і утворенням клубків, починаючи з віку б місяців і далі. бо Нетрансгенні тварини одного приплоду виступали як контролі. Зразки головного мозку мишей фіксували шляхом занурення в 4 96 параформальдегід і вмуровували в парафін. Людина.
Фіксовані у формаліні і вмуровані в парафін зразки лобної долі кори головного мозку людини придбали у Тіззиє боіІшіопе5 (Глазго, Великобританія). Тканини від З донорів з діагностованою кінцевою стадією хвороби Альцгеймера (А; У-МІ стадія за Вгаак) порівнювали з тканиною від не ураженого деменцією контрольного донора у відповідній віковій групі.
Імуногістохімічне дослідження
Зрізи завтовшки чотири мкм з тканин миші і людини нарізували на мікротомі, депарафінували і піддавали демаскуванню антигену шляхом мікрохвильової обробки зрізів в 10
ММ цитратному буфері, рН 6, протягом 10 хвилин. Ендогенну пероксидазу блокували за допомогою 1 95 пероксиду водню, а потім 5 95 нормальної свинячої сироватки крові в РВБ, 1 95
ВЗА, 0,3 96 ТиИйоп Х-100 (РВ5-ВТ). Зрізи інкубували протягом ночі при 4 "С з антитілами НС10-2, иС10-2 М325 і йС10-2 М325 АТ01Т, розбавленими в РВ5-ВТ в діапазоні концентрацій, вказаних на фігурі 1. Зрізи промивали в РВ5, 0,25 95 В5А, 0,1 95 Топ Х-100 перед інкубуванням з біотинілованим вторинним свинячим антитілом до людських імуноглобулінів (Ме В1140; бідта-
Аїагісн) при 1:200 протягом 1 години. Після додаткового промивання застосовували набір для утворення комплексу стрептавідин-біотин (Месіог Іарогаюгієз, Бурлінгейм, Каліфорнія) і нарешті імунореактивність візуалізували за допомогою 0,05 95 діамінобензидину. Зрізи піддавали контрастному забарвлюванню гематоксиліном з виявленням локалізації ядер.
Результати
В З зразках головного мозку від суб'єктів з АЮ пС10-2, пС10-2 М325 і пС10-2 М325 АТО1Т мітили структури, відповідні патологічному тау-білку (тобто клубки, нитки нейропілю, дистрофічні нейрити). Ступінь імунореактивності був залежним від концентрації. Наприклад, видимого мічення гліальних клітин або судин не було виявлено. У зрізах з контрольного зразка головного мозку імунореактивність не була виявлена. Аналогічним чином, усі З антитіла приводили до появи передбачуваного патерну стосовно фосфорилованого тау-білка як в гіпокампі, так і в корі головного мозку із зразків головного мозку /Т94510. У зрізах головного мозку від нетрансгенних мишей імунореактивність не була виявлена.
Приклад 5. Забарвлювання структур, що містять тау-білок, у мишей /Т94510 після і.м. ін'єкції
Спосіб
Зо Десятимісячні миші "Т9д4510. Ці трансгенні миші експресують людський мутантний тау-білок (РЗОТІ ОМ4А) під контролем елементу відповіді ТеЇОйЙ в СатК2-позитивних нейронах і характеризуються вираженим гіперфосфорилуванням тау-білка і утворенням клубків, починаючи з віку б місяців і далі. Крім того, у мишей /194510 віком 10 місяців присутня нейродегенерація в ділянках з вираженою патологією. Трансгенні по одному гену тварини ЇТА одного приплоду виступали як контролі. Миші отримували одноразову ін'єкцію в хвостову вену антитіл НС10-2, НС10-2 М325 або пС10-2 М325 А101Т при концентрації 80 мг/кг. Кожній миші проводили ін'єкцію в об'ємі 150 мкл. Через три дні після ін'єкції мишей перфузували протягом 2 хв. за допомогою РВ5 з подальшою перфузією протягом 10 хв. за допомогою 4 95 параформальдегіду. Зразки головного мозку піддавали кріозахисту в 30 95 сахарозі і нарізували на вільно плаваючі кріозрізи завтовшки 40 мікрон. Зрізи інкубували з 5 95 нормальною свинячою сироваткою крові в РВБ/1 95 ВБА/0,З 95 Тийоп Х-100 протягом 20 хв., промивали в РВ5 і нарешті інкубували з кон'югованим з АІехаРійог488 вторинним антитілом до ІдСї людини при 1:200 (Мо 709-545-149; дасквоп ІттипоВевзеаїгсі І арогайгіевз, Вест Гров, США). Для забарвлювання ядер застосовували Ноеспзі. Зрізи промивали в РВ5, поміщали на предметне скло і досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Результати
Ім. ін'єкція НС10-2, пС10-2 М325 і НС10-2 М325 АТ01Т приводила до зв'язування іп мімо з цільовими структурами в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку тварин "94510 відповідного віку (фігури 4-7). Число спостережуваних позитивних структур варіювалося між окремими тваринами /194510. У контрольних мишей ІТА специфічні флуоресцентні сигнали після ін'єкції будь-якого з трьох антитіл не були виявлені (фігури 4-7). Ін'єкція контрольного ЇдСсї людини, що виступала як негативний контроль, не приводила до появи сигналів у мишей гТа4510 (дані не показані). Позитивні сигнали в зразках головного мозку гТ94510 було нелегко виявити як сигнали від внутріклітинного забарвленого матеріалу, і вони могли бути сигналами від позаклітинного матеріалу тау-білка, що вивільнився під час процесу нейродегенерації. В сукупності ці дані дозволяють припустити, що антитіла НС10-2, нС10-2 М325 і нС10- 2 М325 АТ01Т здатні проникати в паренхіму головного мозку і специфічно забарвлювати мішені у мишей /Т94510 іп мімо.
Приклад 6. Визначення характеристики імунореактивності тау-білка в зразках головного 60 мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера
Тканини
Вмуровані в парафін зразки лобної долі кори головного мозку людини придбали у Тібз5иє
ЗоЇшіопе (Глазго, Великобританія). Включали тканини від донорів з діагностованою кінцевою стадією хвороби Альцгеймера (АБ; У-МІ стадія за Вгаак).
Імуногістохімічне дослідження
Зрізи завтовшки чотири мкм з тканин людини нарізували на мікротомі, депарафінували і піддавали демаскуванню антигену шляхом мікрохвильової обробки зрізів в 10 мМ цитратному буфері, рН 6, протягом 10 хвилин. Зрізи інкубували з 5 95 нормальною свинячою сироваткою крові в РВ5, 1 95 В5А, 0,3 95 Топ Х-100 (РВ5-ВТ) з подальшим інкубуванням протягом ночі при 4 "С з антитілами НС10-2 або НС10-2 М325 А101Т, розбавленими в РВ5З-ВТ. Зрізи промивали в
РВ5, 0,25 95 ВБА, 0,1 90 Тийоп Х-100. Імунореактивність візуалізували за допомогою кон'югованого з АІехаБійог488 вторинного антитіла до ДС. людини (1:200; Мо 709-545-149,
Уасквоп ІттипоВезеагсі І арогайогієв, Вест Гров, США). У разі подвійної імунофлуоресценції зрізи спільно інкубували з АТ8 (1:500; Мо ММ1020, ТнеттоРїізНег, Вальтман, США) або антитілом до загального людського тау-білка ЕТ, виготовленим за індивідуальним замовленням кролячим антитілом, що індукується проти М-кінцевого фрагмента тау-білка 19-33 (Стоме еїаїЇ, 1991).
Імунореактивності АТ8 і Еї1 візуалізували відповідно за допомогою кон'югованого з
АІехагРіног/568 антитіла до мишачого антитіла (1:400; Мо АТ10037, ТнепторРівНеї) і кон'югованого з
АІехаБінйог568 антитіла до кролячого антитіла (1:400; Мо А10042, ТНнетгтоБРівпег). Зрізи аналізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Результати
У зрізах з АО, підданих подвійному забарвлюванню стосовно М-кінцевого фрагмента загального тау-білка і тау-білка ре396, популяцію нейронів, що містять клубки, мітили як Е1, так і антитіла НС10-2 або пС10-2 М325 АТ01Т (фігура 7). Ряд клубків тау-білка мітили тільки антитіла НС10-2 або антитіла НС10-2 М325 А101Т (фігура 7, стрілки). Раніше було показано, що позаклітинний тау-білок (непіддатливі виявленню клубки) не забарвлюється антитілами до
М-кінцевого фрагмента тау-білка (наприклад, Вопаагеїй єї аї, 1990; Вгаак еї аї, 1994; Ріогев5-
Воа'гіднез єї аї, 2015). Таким чином, молекули тау-білка, мічені антитілами НС10-2 або пС10- 2 М325 АТО01Т окремо, ймовірно, репрезентують позаклітинні непіддатливі виявленню клубки.
Зо Вестерн-блот-аналізи і імунопреципітація
Процедура експерименту і опис експерименту
Використовували трансгенних мишей гТ94510: кКДНК людського тау-білка з мутацією РЗОТІ. (42ОМ ТаиРЗО1І) поміщали після конструкції тетрациклінового оперона-респондера (ТАНЕ). Для активації трансгена респондер повинен спільно експресуватися з конструкцією активатора, що складається з тетрациклінової системи умовної експресії гена (ТА). Систему активатора ІА поміщали після промотора САМКІЇс, обмежуючи таким чином експресію ТВЕ головним чином в структурах переднього мозку. Респондер трансгена тау-білка експресували в лінії мишей ЕМВ/М (Тасопіс), а систему активатора ІТА підтримували в лінії мишей 12956 (Тасопіс). їх потомство Е1 несло трансгени респондера і активатора (794510) разом з нетрансгенними (відмінними від Та) і трансгенними по одному гену мишами одного приплоду. Для експериментів використовували тільки мишей Е1. Всіх мишей схрещували в Тасопіс, Данія, і генотипували за допомогою аналізу
ДНК з хвоста із застосуванням пар праймерів 5-ЗАТТААСАаСасСАТТАСАССТО-3 і 5- ,ССАТАТИАТСААТТСААдсСасспАТААДИ-3" для трансгена активатора ІА і 5- тТаААССАСаАтТааСсТаАсСОС-3 ії 5-ТатСАТСаСТТСсСАаТОоСОСоО-3 для трансгена респондера мутантного тау-білка. Мишей тримали групами, і вони отримували воду і їжу (Брогаарден, Данія) в необмеженому доступі, а також речовини з добавками. Цикл світло/темрява складав 12 годин; кімнатна температура складала 21:52 "С, і відносна вологість складала 55 95 ж 5 95. Експерименти виконували згідно з законодавством Данії щодо експериментальних тварин (ліцензія Мо 2014-15-0201-00339).
Мишей убивали шляхом зсуву шийних хребців в цілях збереження метаболічного оточення головного мозку і попередження появи артефактів, які могли змінити біохімічні профілі тау-білка.
Зразки головного мозку мишей розрізали сагітально уздовж серединної лінії з отриманням двох півкуль. Кору головного мозку і гіпокамп правої півкулі від кожної тварини піддавали швидкому заморожуванню на сухому льоду і зберігали при -80 "С до застосування. Заморожені зразки кори людського головного мозку від пацієнтів з хворобою Альцгеймера (АБ) і здорових контрольних (НС) донорів відповідного віку придбали в Тізвиє 5оіЇшіоп (Глазго, Великобританія).
Зразки людського головного мозку характеризувалися аналогічним часом посмертної обробки, що складав « 6 годин, і на них проводили визначення характеристик стосовно патології амілоїду і тау-білка, і вибрані зразки від суб'єктів з АО класифікували як відповідні стадіям М-МІ за Вгаак.
Для імунопреципітації тау-білка з лізатів головного мозку застосовували набір для імунопреципітації за допомогою поперечного зв'язування (Тпепто Рібпег Ріегсе 26147) згідно з інструкціями виробника. Стисло, антитіло зв'язували з білком А/й спільно з агарозою з подальшим поперечним зв'язуванням зв'язаного антитіла з 055 (дисукцинімідилсубератом).
Гомогенат головного мозку готували в буфері Ттгів (25 мМ Ттгіз/НеСї, рН 7,6, 150 мМ Масі, 1 мм
ЕОТА, 1 мм ЕСТА і повна суміш інгібіторів протеаз і фосфатаз) і попередньо очищали протягом ночі при 4 "С з контрольною агарозною смолою. Попередньо очищений лізат інкубували із смолою з поперечно зв'язаним антитілом протягом ночі при 4 "С з подальшим елююванням антигену за допомогою 50 мкл буфера для елюювання (рн 2,8) і відразу ж центрифугували в пробірках для збору зразків, що містять 5 мкл 1 М Тіз, рН 9,5. Імунопреципітований тау-білок розчиняли в 505-буфері для зразків, що містить дитіотреїтол (ОТТ, 100 мМ), піддавали тепловій обробці (95 "С протягом 10 хв.) і піддавали вестерн-блотингу, описаному нижче.
Концентрації людського тау-білка вимірювали в гомогенатах головного мозку і попередньо очищених лізатах за допомогою ЕГІ5А для загального людського тау-білка згідно з інструкціями виробника (Іпутодеп).
Тканини гомогенізували в 10 об'ємах Тгіз-сольового буферного розчину (ТВ5), що містить інгібітори протеаз і фосфатаз, як вказано далі: 50 мМ ТТтгів/НСЇІ (рН 7,4); 274 мМ Масі; 5 мМ КС; 1 до суміш інгібіторів протеаз (Воспе); 1 95 коктейль інгібіторів фосфатаз | і І (бБідта) і 1 мМ фенілметилсульфонілфторид (РМУ5Е). Гомогенати центрифугували при 27000 х у протягом 20 хв. при 4 "С з отриманням фракцій надосадової рідини (51) і осаду. Зразки осаду повторно гомогенізували в 5 об'ємах буфера з високою концентрацією солей/сахарози (0,8 М Масі, 10 95 сахароза, 10 мМ ТТтгівз/НСЇІ, |рН 7,4), 1 мМ ЕСТА, 1 мМ РМ5БЕ) і центрифугували згідно з описаним вище. Зразки надосадової рідини збирали і інкубували з саркозилом (кінцева концентрація 1 90;
Зідта) протягом однієї години при 37 "С з подальшим центрифугуванням при 150000 х а протягом однієї години при 4 "С з отриманням фракцій, що екстрагуються в сольовому розчині і саркозилі (53) і нерозчинних в саркозилі (РЗ). Осад РЗ ресуспендували в буфері ТЕ (10 мМ
Тгів/НСЇІ |рН 8,01, 1 мМ ЕОТА) до об'єму, рівного половині початкового об'єму, використовуваного для гомогенатів головного мозку. Для збагачення фракцій (51 молекулами гіперфосфорилованого тау-білка частину фракції 51 відокремлювали шляхом додаткового
Зо центрифугування при 150000 х уд протягом 20 хв. з отриманням фракцій надосадової рідини (5і5) і осаду (Бір). Осад бір повторно суспендували в буфері ТВ5 до об'єму, рівного одній п'ятій використовуваного початкового об'єму 51. Фракціоновані екстракти тканин 5, бір і РЗ розчиняли в 505-буфері для зразків, що містить ОТТ (100 мМ). Піддані тепловій обробці зразки (95 7С протягом 10 хв.) розділяли за допомогою гель-електрофорезу в 4-12 95 Вів- Гіз-гелях для
ЗО5-РАСЕ (Іпийгодеп) і переносили на мембрани з РМОЕ (ВіоВай Іарогайюгієез, Геркулес,
Каліфорнія). Після блокування блокувальним розчином, що містить 5 95 знежирене молоко і 0,1
Фо ТИйоп-ХІОО в ТВ5, мембрани інкубували з 1 мкг/мл йпС10.2, пС10-2 М325, пС10- 2 М325 АТ01Т або кролячим антитілом до тау-білка ре396 (Іпийгодеп). Мембрани промивали і інкубували з кон'югованими з пероксидазою антитілами до дб; людини або антитілами до кролячих антитіл (1:5000; дасквоп ІттипоВезеагси, Вест Гров, Пенсільванія). Зв'язані антитіла виявляли за допомогою системи посиленої хемілюмінесценції (набір ЕС РІ 05; Режіп ЕІтег).
Кількісну оцінку і візуальний аналіз імунореактивності в рамках вестерн-блотингу виконували за допомогою підключеної до комп'ютера біовізуалізаційної аналітичної системи І АБ-4000 (Рційіт,
Токіо, Японія) і програмного забезпечення Миїйїї Сацде м3.1 (Ец|ййт). Для виявлення тау-білка завантажували приблизно 2 мкг 51 від миші, 20 мкг 51 із зразків людського головного мозку і рівні об'єми різних фракцій (51, 51р і РЗ) з виконанням 505 РАСЕ.
Виявлення патологічного тау-білка за допомогою вестерн-блотингу
Об'єднані гомогенати переднього мозку від трьох 32-тижневих мишей /Т94510 і такі ж від нетрансгенних (відмінних від Та) контрольних тварин одного приплоду і об'єднані зразки кори головного мозку від чотирьох донорів з АЮ і такі ж від чотирьох здорових контрольних (НС) донорів розділяли на розчинну (51) фракцію, фракцію розчинного в ТВ5 осаду (бір) і нерозчинну в саркозилі (РЗ3) фракцію. НС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М3З254А101Т використовували при концентрації 1 мкг/мл у вестерн-блотингу і виявляли патологічний тау- білок в зразках від мишей гГ94510 і суб'єктів з АЮ. Автори цього винаходу спостерігали виявлення тау-білка розміром 55 і 64 кДа в 51 і тау-білка розміром 64 і 70 кДа у фракціях РЗ і
Зір від 32-тижневих мишей /Т94510. Крім того, спостерігали три смуги усіченого тау-білка розміром « 50 кДа у фракції РЗ3. Сигнал не був виявлений в бір і РЗ від відмінних від Т9 контрольних тварин одного приплоду, що не експресують людський трансгенний тау-білок. У фракції 51 від відмінних від Тд мишей виявляли слабкий сигнал, відповідний молекулі розміром 60 близько 50 кДа, яка, найймовірніше, представляла ендогенний мишачий тау-білок,
фосфорилований по залишку 5396 (фігури 8ВА-8С). Підводячи підсумок, можна відзначити, що пС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 А101Т забезпечували виявлення тау-білка ре396, а також як нормальних фосфорилованих молекул тау-білка розміром 55 кДа, так і гіперфосфорилованих молекул тау-білка розміром 64 кДа в зразках від мишей г/Т44510. Найбільш сильний сигнал спостерігали у разі НС10-2 М325 АТ1О01Т.
У фракціях 51, бір і РЗ від донорів з АЮ йпС10.2, йС10-2 М325, пС10-2 М325 АТО1Т забезпечували виявлення типової для АЮ плями тау-білка і чотирисмуговий патерн патологічного тау-білка (тау-білок розміром 54, 64, 69 і 74 кДа). Як і очікувалося, нерозчинні в саркозилі молекули гіперфосфорилованого тау-білка, виділені з фракції РЗ, були найбільш вираженими, за ними слідували розчинні молекули гіперфосфорилованого тау-білка, збагачені у фракції бір. У фракціях РЗ від здорового контролю (НС) сигнал не був виявлений. У фракціях
ЗІ і бір від НС виявляли слабкий сигнал, відповідний молекулі розміром близько 55 кДа, яка, ймовірно, представляла нормальний тау-білок, фосфорилований по залишку 5396 (фігури 8А- 8С). Підводячи підсумок, можна відзначити, що пС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 АТО1Т забезпечували виявлення типової плями тау-білка, характерної для АЮ, і чотирисмуговий патерн патологічного тау-білка, що представляють гіперфосфорилований тау-білок. Найбільш сильний сигнал спостерігали у разі НС10-2 М325 АТО1Т.
Імунопреципітація патологічного тау-білка
Для визначення здатності НС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 А101Т до зв'язування з тау- білком в неденатуруючих умовах встановлювали протокол імунопреципітації (ІР) тау-білка, в якому антитіла до тау-білка ковалентно зв'язуються шляхом утворення поперечного зв'язку з білком А/З смоли і тим самим забезпечують відсутність контамінації антитілами при ІР. У разі аналізу тау-білка за допомогою 505-РАСЕ присутність важких ланцюгів антитіла, вживаного для ІР, може порушувати сигнали, оскільки виявляють обидва білки з розміром близько 50 кДа.
Досліджували ефективність йС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 А101Т стосовно зниження вмісту патологічного тау-білка з людського головного мозку. Як антиген використовували 500 мкг попередньо очищеного лізату з гомогенатів головного мозку, об'єднаних від чотирьох донорів з АО, і таких же від НС донорів, що містять відповідно 0,1 мкг і 0,15 мкг людського тау- білка (визначеного за допомогою ЕГІ5А для людського тау-білка). НС10.2, пС10-2 М325, пС10-
Зо 2 М325 АТО01Т (10 мкг) забезпечували зниження вмісту молекул тау-білка розміром 54, 64, 69 і 74 кДа (чотири смуги патологічного тау-білка) і пляму, характерну для АЮ, із попередньо очищених гомогенатів від суб'єктів з АО (співвідношення антиген/АьЬ 1:100), що візуалізували за допомогою поліклонального кролячого антитіла до тау-білка ре396 (фігура 9). Порівнюючи інтенсивність смуг тау-білка із зразків головного мозку від суб'єктів з АО, яка знижувалася за допомогою пС10.2, пС10-2 М325, пС10-2 М325 АТО01Т, з інтенсивністю у разі контрольного антитіла до їдС людини і головного мозку НС, можна підвести підсумок, що пС10.2, пС10- 2 М325, пС10-2 М325 АТО1Т забезпечували імунопреципітацію тау-білка, гіперфосфорилованого по ділянці ре396, виключно в зразках головного мозку від суб'єктів з АЮ і були ефективними при співвідношенні антиген/антитіло 1:100.
Клітинний аналіз і аналіз агрегації
Клітини НЕК293 піддавали транзієнтній трансфекції людським тау-білком-РЗОП-РІГ Асі в 6- лункових планшетах через 24 години після посіву, після чого через 24 години їх інкубували з гомогенатом головного мозку протягом 24 годин з подальшим розділенням і пересіванням клітин і збором через додаткові 24 години. Клітини лізували і піддавали ультразвуковій обробці в РВ5, доповненому буфером, що містить 1 95 Топ Х, Рпоз-віор і інгібітори фосфатаз і протеаз сОтрієїе (Роснє), і піддавали ультрацентрифугуванню при 100000 х 4 протягом 30 хвилин.
Осад ресуспендували в 505, піддавали ультразвуковій обробці і ультрацентрифугуванню протягом 30 хвилин при 100000 х д. Зразки надосадової рідини аналізували за допомогою вестерн-блотингу. Клітини, що експресують людський тау-білок РЗОТЇ, продемонстрували наявність нерозчинного (фракція ОБ, виявлення за допомогою ЕТ1/Н АС) гіперфосфорилованого (виявлення за роОЗ396) тау-білка при затравлюванні за допомогою загальних гомогенатів головного мозку від трансгенних по тау-білку мишей гТ94510.
Клітини, оброблені гомогенатом контрольного головного мозку мишей ІТА, продемонстрували відсутність агрегованого гіперфосфорилованого людського тау-білка.
Додатково, загальні клітинні лізати клітин НЕК293 аналізували за допомогою аналізу агрегації тау-білка від Сізріо. В основі цього аналізу лежить флуоресценція з розрізненням за часом із застосуванням одного і того ж антитіла як донорного (кон'югованого з ТЬЗ), так і акцепторного (кон'югованого з 42) антитіла в ЕВЕТ. Зразок об'ємом 10 мкл змішували з сумішшю антитіл об'ємом 10 мкл і інкубували протягом 20 годин. Планшет прочитували на планшет-рідері бо РПпегавзіаг для оцінки флуоресценції з розрізненням за часом (виміряної/інтегрованої після включення збуджуючого світла сигналу ЕНЕТ). У аналізі вимірюють рівень агрегованого тау- білка як в людському секційному матеріалі, так і у мишей /Т94510 і в клітинах НЕК із затравкою з високою специфічністю і чутливістю. Результати показані на фігурі 10.
Приклад 7. Імуновиснаження по тау-білку
Екстракти головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера отримували із заморожених зразків префронтальної кори головного мозку, узятих посмертно, в 10х об'ємі стерильного холодного РВ5. Тканину гомогенізували із застосуванням ножового гомогенізатора з подальшою ультразвуковою обробкою в режимі вихідної потужності 2 з імпульсами 5 х 0,9 секунд (ультразвуковий дезінтегратор Вгапзоп). Потім гомогенат центрифугували при 3000 9 протягом 5 хвилин при 4 "С. Зразки надосадової рідини розділяли на аліквоти, піддавали миттєвому заморожуванню і зберігали при - 80 "С до застосування. 25 мкг антитіла (гуманізовані варіанти С10-2 ї 2.10.3, мишаче АТВ, піп 1020 від ТПнегто
Зсіепійіс) іммобілізували на магнітних гранулах ЮОупареаде в 125 мкл суспензії (набір для імунопреципітації Супареадз» з білком Сх Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання покриті гранули змішували з різними кількостями непокритих промитих гранул. Починали з 100 до гранул, покритих АБ, що відповідало 5 мкг антитіла, із зниженням до 100 95 непокритих гранул. Загальна кількість гранул була однаковою у всіх зразках. Гранули змішували з 20 мкл екстракту з матеріалу від суб'єктів з АбО і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хв.
Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти розділяли на аліквоти, піддавали миттєвому заморожуванню і зберігали при -80 "С до застосування.
Аналіз виснаження за допомогою вестерн-блотингу
Зразки кип'ятили в їх завантажувальному 505-буфері і 100 мМ ОТТ. Об'єм, відповідний З мкл екстрактів, завантажували в 4-12 95 Вів-Гіз--ель МиИРАСЕ (ІМеТеси, Момех). Після електрофорезу білки блотували на мембрану Іттобіоп-РЇ з РМОР (0,45 мкм, ІРР 10100,
МіПіроге). Мембрану блокували за допомогою блокуючого буфера 5ЕА (Мо продукту 37527,
ТНегто). Рівні тау-білка і Р-їаш оцінювали в зразках за допомогою Тац5 (Таб є комерційно доступним антитілом до тау-білка, епітоп якого, як описано, знаходиться серед амінокислот 210- 241 тау-білка. Воно являє собою мишаче моноклональне до тау-білка. Абєат аьв80579, 1:2000), мишачого С10-2 (1 мкг/мл), Р-5199/202 (447682, Іпмйгодеп, 1:1000), Р-5422 (ар79415, Арват,
Зо 1:750), людського ІРМ (1 мкг/мл). баран і актин застосовували як контролі навантаження (ар9484, Ареат, 1:2000, А5бБ441, Ббідта, 1:20000). Застосовували вторинні антитіла Ідс, кон'юговані з флуорофором (козине антитіло до людських імуноглобулінів, кон'юговане з ІВНОує 800СМУ, козине антитіло до кролячих імуноглобулінів, кон'юговане з ІНОує 800СМУ/, козине антитіло до мишачих імуноглобулінів, кон'юговане з ІВОує 680, 1 І-СОВ Віозсієпсев), і сигнал оцінювали кількісно за допомогою Одуззеу Сі х і програмного забезпечення Ітаде 5іцйаіо (ГІ-
СОВ Віозсієпсез). Проводили кількісну оцінку окремих смуг, а також сигналу в цілих доріжках, і на її підставі будували сигмоїдальні криві залежності доза-відповідь і за наявності можливості оцінювали максимальний ефект і значення ЕС50О.
Результати
Як антитіла 2.10.3, так і антитіла С10-2 видаляли невелику частину тау-білка з препарату головного мозку від суб'єкта з хворобою Альцгеймера. Це указує на селективність стосовно субпопуляції тау-білка в загальному вмісті тау-білка. 2.10.3, сконструйоване таким чином, щоб володіти специфічністю до тау-білка рб422, видаляло не більше 24 95 від загальної кількості тау-білка, тоді як С10-2 видаляло не більше 15 95 загального тау-білка (див. фігуру 11). Це можна інтерпретувати так, що субпопуляція рО396 є меншою за субпопуляцію тау-білка, при цьому всі інші чинники є рівноцінними. Як альтернатива, дані можна інтерпретувати так, що антитіла С10-2 є більш селективними стосовно роЗ396, ніж антитіло 2.10.3 є селективним стосовно ро422.
Як 2.10.3, так і С10-2 видаляли більше 90 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-422, хоча кількість антитіла, необхідна для видалення 50 95 тау-білка рб422, розрізнялася, при цьому для досягнення одного і того ж ефекту було потрібно 0,42 мкг антитіла у випадку з 2.10.3 і 0,27 мкг у випадку з С10-2 (див. фігуру 12). У одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло є специфічним до епітопу в межах 386-404, де сериновий залишок 396 людського тау- білка є фосфорилованим і де 80 95 тау-білька рбБ422 видаляється (у дослідженнях з імуновиснаження з використанням вестерн-блот-аналізу) при застосуванні менш ніж 1 мкг антитіла.
С10-2 ефективно видаляло тау-білокю, фосфорилований по серину-396 (максимальний ефект: 88 95, і половина цього ефекту досягалася при застосуванні 0,30 мкг антитіла). 2.10.3 видаляло меншу частину тау-білка, фосфорилованого по серину-396 (максимальний ефект: 60 бо Фо, і половина цього ефекту досягалася при застосуванні 0,63 мкг антитіла) (див. фігуру 13). Це указує на те, що весь тау-білок, фосфорилований по серину-422, також є фосфорилованим по серину-396, але існує частина гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину- 396, в якій відсутній фосфорилований серии в положенні 422. У одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло є специфічним до епітопу в межах 386-404, де залишок 396 людського
Б тау-білюка є фосфорилованим і де 80 95 тау-більа рб5396 видаляється (у дослідженнях з імуновиснаження з використанням вестерн-блот-аналізу) при застосуванні менш ніж 1 мкг антитіла.
Значна частина тау-білка, що видаляється С10-2, також була фосфорилованою по серину- 199/202, оскільки 69 95 тау-білка, що характеризується таким фосфорилуванням, підпадало під вплив імуновиснаження (50 956 ефект при застосуванні 0,34 мкг антитіла). Імуновиснаження за допомогою 2.10.3 не давало сигмоїдальної кривої залежності доза-відповідь для тау-білка ро 199/202, хоча при підвищенні кількості антитіла спостерігалося зниження інтенсивності сигналу (максимальне зменшення 52 95 при застосуванні максимальної кількості антитіла (5 мкг) (див. фігуру 14). У одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло є специфічним до епітопу в межах 386-404, де сериновий залишок 396 людського тау-білка є фосфорилованим і де 80 95 тау-білка Р-5199/202 видаляється (у дослідженнях з імуновиснаження з використанням вестерн-блот-аналізу) при застосуванні менш ніж 1 мкг антитіла.
Ці результати вказують на те, що антитіло С10-2, що націлюється на фосфорилований серин-396, зв'язується з крупнішим пулом гіперфосфорилованих тау-білків, ніж антитіло 2.10.3, що націлюється на фосфорилований серии в положенні 422.
При дослідженні окремих смуг на картині вестерн-блотингу після імуновиснаження смугу, відповідну 25 кДа, ідентифікували як молекулу, фосфориловану по серину-396. Цей фрагмент піддавався імуновиснаженню за допомогою С10-2, проте 2.10.3 і АТ8 не приводили до виснаження цього фрагмента (див. фігуру 15). Таким чином, С10-2 характеризується унікальною властивістю видаляти цю усічену форму тау-білка з екстрактів головного мозку від суб'єктів з хворобою Альцгеймера.
Приклад 8. Порівняння варіантів С10-2
Всі варіанти С10-2 характеризувалися однаковою ефективністю в аналізі імуновиснаження (див. фігуру 16). Ці результати демонструють, що введені мутації не змінювали функціональне
Зо зв'язування з тау-білюом, специфічним для головного мозку суб'єктів з хворобою Альцгеймера. ва. Обробка антитілами у мишей гТ94510 із затравкою
Використовували трансгенних мишей, що експресують людський мутантний тау-білок (РЗОТІ ОМАВ) під контролем елементу відповіді Те-Ой в СатК2-позитивних нейронах (гГТ94510).
У цій моделі патологія тау-білка зазвичай починає розвиватися у віці З місяців, але при згодовуванні матерям доксицикліну під час вагітності і протягом перших З тижнів життя дитинчати патологія розвивається на пізнішій стадії (починаючи з віку 6 місяців). Мишей, попередньо оброблених доксицикліном, обробляли протягом тривалого періоду за допомогою тС10-2, пС10-2, 2.10.3 або контрольного антитіла в дозі 15 мг/кг/тиждень, починаючи з віку 2 місяців. У віці 2,5 місяця екстракт головного мозку від суб'єкта з хворобою Альцгеймера вводили шляхом інфузії в гіпокамп. 20 мишей отримували анестезію, будучи зафіксованими в стереотаксичній рамці, шляхом вдихання ізофлурану. Череп оголяли, і його положення вирівнювали, поки брегма і лямбда не розташувалися на одному рівні. У черепі просвердлювали отвір на 2 мм латерально (справа) і на 2,4 мм назад від брегми. Шприц зі скошеним наконечником на 10 мкл (5С2Е) застосовували для ін'єкції затравлювального матеріалу на 1,4 мм вентрально поверхні головного мозку за вищезгаданими координатами. 2 мкл екстрактів, описаних в прикладах 7, вводили шляхом повільної інфузії в необхідне місце (1 мкл/хвилину) і шприц залишали на 5 хвилин перед його видаленням. Рану закривали швами і мишей зігрівали, поки вони прокидалися. Мишей доглядали протягом З місяців, а потім убивали і піддавали перфузійній фіксації за допомогою 4 95. Мишей обробляли антитілом до убивання, через З місяці після піддавання затравлювальній дії.
Імуногістохімічне дослідження
Зафіксовані зразки головного мозку нарізували на коронарні зрізи товщиною 35 мкм при
М5А 30 і кожний 6-ий зріз забарвлювали на наявність клубків тау-білка (забарвлювання сріблом за Саїййуаб5). Позитивно забарвлені нейрони (сома) підраховували в іпсилатеральній і контралатеральній сторонах гіпокампу всіх зразків головного мозку. Були включені всі підділянки гіпокампу. Підрахунок проводили у восьми зрізах на головний мозок. Результати відображають сумарну кількість позитивних нейронів з 8 зрізів.
Статистичний аналіз. Варіанса значущо розрізняється при порівнянні груп. У зв'язку з цим застосовували непараметричний критерій Краскела-Волліса і критерій для множинних бо порівнянь Данна.
Результати. Екстракти викликали затравлювальну дію з формуванням патології клубків в іпсилатеральному гіпокампі. Обробка за допомогою тС10-2 значущо знижувала патологію клубків в підданому затравлювальній дії гіпокампі на 57 95 (Р«0,05). Спостерігалася виразна тенденція, яка вказувала на те, що НС10-2 зменшувало патологію. 2.10.3 не характеризувалося таким ефектом (див. фігуру 17).
Приклад 80. Протизатравлювальні ефекти варіантів С10.2
Мета дослідження
Було висловлено припущення, що трансцелюлярне розповсюдження агрегатів тау-білка сприяє розвитку патології і топологічному рознесенню хвороби Альцгеймера в ЦНС. Були розроблені моделі затравлювальної дії іп міо, в яких клітинний людський тау-білок, що експресується в клітинах НЕК293, піддають затравлювальній дії патологічних агрегатів тау- білка, використовуваних позаклітинно. Метою цього дослідження була оцінка і порівняння терапевтичного ефекту моноклонального людського антитіла С 10.2 і варіантів в умовах затравлювання в парадигмі лікування. Термін "затравлювання" мається на увазі як такий, що означає введення такої кількості гіперфосфорилованого тау-білка (затравки), яка ініціює гіперфосфорилування/неправильне згортання тау-білка, що експресується в клітинах.
Передумови, що визначають актуальність дослідження
Відкладення позаклітинних бляшок АВ і наявність парних спіральних філаментів тау-білка усередині нейронів є характерними ознаками хвороби Альцгеймера. Внутрішньонейрональні включення тау-білка (головним чином складаються з нерозчинних в детергентах гіперфосфорилованих амілоїдних форм тау-білка і відкладаються у пацієнтів з АЮ за просторово-часовим патерном, що вказує на рознесення агрегатів в ЦНС. Експериментально було показано, що агрегати тау-білка розповсюджуються від клітин до клітин як іп мімо, так і іп міїго за пріоноподібним механізмом. Така присутність позаклітинного рознесення, що впливає на розповсюдження захворювання, відкриває можливості для імунотерапії антитілами, проникаючими в ЦНС.
Було показано, що застосування агрегатів/затравок тау-білка приводить до агрегації тау- білка в клітинах іп міїго (Егові єї аї, 2009, Сцо апа І ее 2011, Мапатапага еї аї, 2013). Автори цього винаходу розробили модель затравлювальної дії іп мій, в якій неочищені гомогенати
Зо головного мозку від мишей Та44510 (що містять агрегований людський тау-білок) застосовували для внесення затравки людського тау-білка 0М4В з мутацією РЗОТЇ, що транзієнтно експресується в клітинах НЕК293. Важливо відзначити, що залишкові агрегати тау-білка (затравки) не можуть бути виявлені в контрольних клітинах із затравкою реОМА, тому всі прочитувані показники виявляють перетворення клітинного тау-білка і не виявляють якого- небудь сигналу від екзогенного затравлювального матеріалу. У даному аналізі визначали протизатравлювальні ефекти різних варіантів пС10.2.
Варіанти
Антитіло С10-2 (НС 10.2)
Антитіло МЗ25 (пС10.2 МЗ25)
Антитіло МЗ2О (пС10.2 М320)
Антитіло М325, О55Е (пС10.2 М325 О55Е)
Антитіло МЗ32О, О55Е (пС10.2 МЗ32О О55Е)
Антитіло М325, АТ01Т (пС10.2 М325 А101Т)
Еталонний об'єкт (еталонні об'єкти)
Контрольний НіІдСаІ1 (В 12)
Тест-система/тварини
Клітини НЕК293, транзієнтно трансфектовані пТГаиш-РЗОТІ (ОМАН).
Схема експерименту
Затравлювальний матеріал. Гомогенати від 12-місячних мишей 194510 (і контролів) гомогенізували у вигляді 10 95 гомогенатів в ТВ5 без інгібіторів за допомогою гомогенізації з гранулами і піддавали ультразвуковій обробці. Гомогенати центрифугували при 21000 х 49 протягом 15 хв. і для затравки використовували розчинну фракцію.
Аналіз затравлювальної дії в НЕК293. У даному аналізі в б-лунковий планшет висівали 600000 клітин НЕК293 на лунку в день 0. В день 1 клітини трансфектували за допомогою 4 мкг плазмідної ДНК із застосуванням 10 мкл ліпофектаміну 2000 згідно з протоколом виробника.
Середовище замінювали через 4 години. В день 2 клітини піддавали затравлювальній дії неочищеного гомогенату головного мозку від 12-місячних мишей Та4510 або іТа. Гомогенати, що містять 40 мкг загального білка (приблизно 65 нг загального людського тау-білка у разі гомогенатів від Т94510), вносили до середовища кожної лунки. Для експериментів з обробкою бо антитілами гомогенати попередньо інкубували з антитілами або без них протягом ночі при 4 "С.
Через 6 годин після піддавання затравлювальній дії середовище замінювали на середовище з низьким вмістом сироватки для зниження клітинної проліферації і повторно застосовували антитіла.
В день З (через 24 години після піддавання затравлювальній дії) клітини трипсинізували протягом З хвилин для руйнування позаклітинних затравок і повторно висівали по 800000 клітин на лунку в б-лункові планшети для експериментів з фракціонування, по 20000 клітин в 96- лункові планшети для аналізу агрегації тау-білка за Сібріо і по 10000 клітин в 96-лункові планшети для оцінки захоплення антитіл за допомогою високопродуктивної візуалізації.
Антитіла повторно вносили в кожну лунку.
Фракціонування клітин. Через 48 годин після піддавання затравлювальній дії клітини для фракціонування збирали шляхом відскрібання в холодний РВ5, осаджували і лізували в ТВ5 з 1
Фо Тийоп-Х з інгібіторами фосфатаз і протеаз і піддавали ультразвуковій обробці. Після ультрацентрифугування (100000 х 4 протягом 30 хв. при 4 "С) осад ресуспендували в 1 95 505, піддавали ультразвуковій обробці і повторно проводили ультрацентрифугування. Розчинні в
Тийоп-Х ії 505 фракції аналізували за допомогою вестерн-блотингу стосовно загального тау- білка (ЕТ) і тау-білка, фосфорилованого по 5396 (01.2). Сигнал 01.2 кількісно оцінювали за допомогою імунофлуоресценції на пристрої для візуалізації Одуззеу.
Аналіз агрегації тау-белка за Сіб5ріо. Через 48 годин після піддавання затравлювальній дії клітини для аналізу агрегації за Сізріо промивали в крижаному РВ5 і піддавали сублімаційній сушці. Клітини лізували в 1 95 Т/йоп-Х з інгібіторами фосфатаз/протеаз і бензоназою (РНКаза і
ДНКаза) і інкубували на орбітальному шейкері при 650 об./хв. протягом 40 хв. при 4 с.
Загальний клітинний лізат аналізували стосовно агрегатів тау-білка за допомогою аналізу агрегації тау-білка за Сівріо; у основі даного аналізу лежить застосування одного і того ж антитіла, зв'язаного з донором і акцептором, для вимірювань ЕВЕТ за допомогою гомогенної флуоресценції з розділенням за часом (НТАРЕФ, Сібріо) Мономірний тау-білок може зв'язуватися тільки з акцепторним або з донорним антитілом, оскільки вони є такими, що конкурують стосовно одного і того ж зв'язуючого епітопу - ЕВЕТ відсутній. На відміну від цього, олігомерний тау-білок може зв'язуватися як з донором, так і з акцептором - сигнал ЕВЕТ.
Загальний білок визначали у всіх зразках за допомогою ВСА і співвідношення сигнал-шум для зразка нормалізували по відношенню до білка і дані представляли у вигляді діаграми відносної агрегації тау-білка з використанням 8 технічних повторів.
Захоплення антитіла. Через 48 годин після піддавання затравлювальній дії планшети для захоплення антитіла фіксували в 4 95 параформальдегіді і 4 95 сахарозі і забарвлювали за допомогою вторинного антитіла до людських імуноглобулінів. Захоплення антитіла підтверджували із застосуванням СеПотісв.
Аналіз даних/статистичні дані
Дані представлені у вигляді об'єднаних даних від чотирьох незалежних біологічних повторів, що виконуються і аналізуються протягом двох різних тижнів ж/- 5.Е.М. Дані аналізували за допомогою однофакторного АМОМА з використанням критерію для множинних порівнянь Тьюкі "р«0,05, РО, РО, 001.
Результати "С10.2 характеризувалося знижуючим впливом стосовно затравлювальної дії і утворення нерозчинного гіперфосфорилованого тау-білка приблизно на 40 95 в порівнянні з контролем.
Решта всіх антитіл характеризувалася аналогічним ефектом або кращим ефектом в порівнянні з "С10.2. Зокрема, варіанти НС10.2 М325 і М325 А101Т демонстрували більш виражені ефекти у вигляді зменшеної агрегації тау-білка на 45 95 і 62 95. Варіант МЗ25А101Т демонстрував значущо більш виражений ефект стосовно агрегації в порівнянні з НС10.2.
Приклад 8С. Дослідження стабільності ПС10.2 і варіантів за цим винаходом
Мета дослідження
Дане дослідження виконували для оцінки основних характеристик стабільності антитіл за цим винаходом, зосереджуючись на стресових умовах для виявлення будь-яких потенційних відмінностей у варіантах.
Схема дослідження
Всі зразки спочатку готували в однакових початкових умовах (буфер, концентрація і рівень агрегації). Це дозволяє усунути відмінності в початкових властивостях, які потенційно можуть впливати на подальший прояв поведінки зразка. Контроль зберігали при -80 "С і аналізували паралельно з підданими стресу зразками (40 "С). Зразки видаляли з умов 40 "С в різні моменти часу і в кінці аналізували одночасно за допомогою 5ЕС-ОРІ С, пептидного картування за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (І СМ5) і диференціальної скануючої 60 флуориметрії (О5БЕ).
Варіанти
Антитіло С10-2 (НС 10.2)
Антитіло МЗ25 (пС10.2 МЗ25)
Антитіло МЗ2О (пС10.2 М320)
Антитіло М325, О55Е (пС10.2 М325 О55Е)
Антитіло М32О, О55Е (пС10.2 М32О О55Е)
Антитіло М325, АТ01 (нС10.2 М325 А101Т)
Антитіло АТ101Т (пС10.2 А1О01Т)
Антитіло Ю55Е (пС10.2 О55Е)
Антитіло М32О, АТО01Т (нС10.2 М32О АТ101т)
Еталонний об'єкт
Зразки антитіл, що зберігаються при -80 "С протягом дослідження, використовували як еталон.
Ввідна інформація
Аспекти стабільності моноклонального антитіла є важливими як для аспектів виготовлення, кінцевого зберігання, так і для складання лікарської речовини. У даному дослідженні автори цього винаходу піддавали антитіла стресу за допомогою циклів заморожування- розморожування, впливу високої температури і низького рН з метою виявлення того, чи присутні явні проблеми в будь-якому з кандидатів.
Матеріали і способи
Для досліджень з дезамідування зразки поміщали у флакони при об'ємі зразків, що становить 1 мл, і інкубували при 40"С. У попередньо визначені моменти часу зразок переносили в умови -80 "С і зберігали до проведення аналізу.
Дослідження з дезамідування
Дезамідування залишків Абп досліджували на пептидному рівні з метою отримання докладної інформації стосовно фактичних даних залишків. Таким чином, тАб розщеплювали за допомогою свинячого трипсину після відновлення і алкілування (йодоцтова кислота) із застосуванням стандартних протоколів. Пептиди розділяли на колонці СЗНТ130 С18 1,7 мкм і вводили в пристрій для МБ ХЕМО ОТОЕ (У/аїег5), що функціонує в режимі М5е. У всіх серіях
Зо використовували однакові параметри. Пептидні карти, отримані з урахуванням всіх моментів часу, аналізували в Віорпаптаї! упх і кількісно оцінювали при наступних обмеженнях: включали тільки пептиди, ідентифіковані як позитивні стосовно дезамідування, не включали фрагменти, отримані фрагментацією в джерелі іонів. Відсоток дезамідування кожного ідентифікованого пептиду контролювали протягом деякого часу.
Стислий огляд способу 5ЕС
Агрегацію визначали за допомогою 5ЕС-хроматографії на колонці АСОШІТМ ОРІ СФ ВЕН2гОО
ЗЕС 1,7 мкм, 4,6 х 150 мм в Асдийу ОРІ С з детектором ТОМ (У/аїег5). Зразки в об'ємі 20 мкл, доведені до 100 мкг/мл (розбавлені в рухомому буфері: РВ5 Сібсо-Іпийтодеп Мо 14190-094--0,1
М Масі), вносили до колонки при 0,4 мл/хв. і розділяли протягом б хвилин за допомогою ізократичного елюювання.
Дані аналізували за допомогою Мав5і упх і АОС використовували для кількісної оцінки рівнів агрегації.
Експеримент з низьким значенням рн
НС10.2 вносили до колонки з білком С і елюювали при рН 2,8 з використанням стандартних умов. Зразок витримували при рнН 2,8, і аліквоти видаляли через 0,15, 30, 60,120 і 180 хв., і нейтралізували перед знесолюванням в РВ5. Зразки аналізували стосовно афінності зв'язування, агрегації і дезамідування.
Визначення характеристик ПС10.2 в стресових умовах. Дезамідування в умовах 40 "С і 28 днів
Дезамідування Абп спостерігали в декількох незначних і трьох основних ділянках, що охоплюються пептидами І С:Т2, НС:Т36 і НС:Т25. В них рівень дезамідування збільшувався за часом, при цьому складав відповідно 75 95, 38 905 і 28 90 в кінцевій точці. На відміну від пептиду
НС:Т36 і Т25, на підставі аналізу іп 5іїсо (послідовність мотиву), передбачалося, що залишки
Авп (10 М32 і М34) в пептиді І С:Т2 не схильні до дезамідування, проте несподіваним чином у фактичному експерименті вони явно відрізнялися від інших залишків Авп в НС10.2. Збільшений рівень дезамідування цього пептиду корелює із зниженою активністю зв'язування з дифосфорилованим пептидом і дозволяє припустити механістичний зв'язок між дезамідуванням і ІС50. Дане спостереження також дозволяє припустити, що зміна залишків Авп 32 і/або З34ві С
НС10.2 могло зменшувати рівень дезамідування в цих ділянках.
При аналізі варіантів виразно видно, що проста модифікація Азп32 за типом заміни або на зЗег, або на Сііп повністю запобігає реакції дезамідування в Азп34 (фігура 20). Крім того, автори цього винаходу не виявляли ніякого дезамідування Сіп32 у варіантах з цією мутацією.
Дезамідування при низькому значенні рН
У даному дослідженні автори цього винаходу аналізували пС10.2 аналогічним чином, як описано вище для дослідження стабільності при 40 "С. Тільки в цьому випадку використовували суміш трипсину і І уз-С (продукт Рготеда) для оптимізації розщеплювання лізинових залишків.
Додаткових ділянок або ступеня дезамідування не спостерігали, і знов-таки найбільш помітними пептидами були 1 0-12, НО-Т25 і НО-Т36. Крім того, в зразках, підданих обробці при низькому значенні рН, не спостерігали зміни ІС50.
Аналіз 5ЕС
Рівень агрегації складав нижче З 95 у всіх препаратах, і зміни ступеню агрегації протягом 28 днів при 40 "С не спостерігали.
Приклад 9
Виділення затравок тау-білка у мишей гГ94510
Миші гТ9д4510 є трансгенними по двох генах, при цьому сумісно експресують тау-білок 4АВОМ з мутацією РЗОТІЇ в людському гені МАРТ, розташованому нижче тетрациклінового оперона- респондера (ТРЕ) і конструкції активатора, що складається з тетрациклінової системи умовної експресії гена (ТА). Мутація РЗОТІ є домінантною мутацією, що приводить до лобно-скроневої деменції з паркінсонізмом, пов'язаного з хромосомою 17 (ЕТОР-17). У мишей /Тд4510 експресія
РЗОТІ. нТай індукує патологію тау-білка, зокрема утворення ранніх клубків і нейрофібрилярних клубків (МЕТ), втрату нейронів і поведінкові аномалії, залежним від віку чином. МЕТ являють собою агрегати тау-білка усередині нейронів, що складаються з парних спіральних філаментів (РНЕ), закручених стрічок або прямих філаментів, при цьому вони є нерозчинними в детергентах і містять в основному гіперфосфорилований тау-білок. Гіперфосфорилування означає, що тау-білок є фосфорилованим в більшій кількості ділянок, ніж тау-білок з головного мозку здорової дорослої людини, і що по заданій ділянці фосфорилюється вищий, ніж в нормі, відсоток молекул тау-білка (28 фосфо моль/моль тау-білка). Анатомічне розповсюдження МЕТ являє собою посмертну гістопатологічну характерну ознаку, яка корелює із зниженням
Зо когнітивних здібностей при хворобі Альцгеймера (А) і з втратою пам'яті при нормальному старінні і помірному когнітивному розладі. Патерн розповсюдження МЕТ в головному мозку пацієнтів з АО є високоієрархічним і був роздільний на шість стадій. Поступове виникнення змін
МЕТ в головному мозку також підтверджували біохімічним шляхом і класифікували на десять стадій відповідно до ураженої ділянки. Визначення характеристик різних молекул тау-білка із зразків головного мозку від суб'єктів з АЮ біохімічним шляхом спочатку грунтувалося на протоколі фракціонування із застосуванням 1 95 саркозилу для виділення нерозчинного тау- білка. На підставі цього способу нерозчинні в саркозилі гіперфосфориловані молекули тау- білка, виділені у фракцію нерозчинного в саркозилі осаду (РЗ), визначали як РНЕ тау-білка і розглядали як біохімічний еквівалент МЕТ. Розчинні в буфері гіперфосфориловані молекули тау-білка, виділені в розчинну фракцію (51), визначали як нефібрилярні олігомерні молекули тау-білка і розглядали як біохімічний еквівалент ранніх клубків тау-білка. У мишей гТа4510 нормальний мономірний фосфорилований і нефосфорилований людський трансгенний тау- білок 4АВОМ присутній в розчинній фракції (51) і візуалізується у вигляді молекул тау-білка розміром 55 кДа на 505-РАСЕ. Гіперфосфорилований тау-білок 48ОМ з мутацією РЗОТІ. відображався у вигляді тау-білка із зміщеною рухливістю розміром 64 кДа і 70 кДа в розчинній (51) фракції і виключно у фракції розчинного в Тгіз-сольовому буферному розчині (ТВ5) осаду (бір) і фракції нерозчинного в саркозилі осаду (РЗ). Нерозчинні в саркозилі молекули тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа, виділені в РЗ, являють собою фібрили тау-білка (РНЕ тау-білка) і біохімічний еквівалент МЕТ. Розчинні в буфері молекули тау-білка розміром 64 кДа і 7О кДав 51 Її збагачені у фракції розчинного в ТВ5 осаду (бір) являють собою олігомерний тау-білок і біохімічний еквівалент ранніх клубків тау-білка. Молекули тау-білка розміром 70 кДа є специфічними для мутанта РЗОТІ. і також виявляються в зразках головного мозку від пацієнтів з
ЕТОР-17. Тканину головного мозку від 40-тижневих мишей гТ94510 гомогенізували в 10 об'ємах
ТВ5, що містить 50 мМ Ттів/НСЇІ (рН 7,4), 274 мМ Масі і 5 мм КС1. Гомогенати центрифугували при 27000 х у протягом 20 хв. при 4 "С з отриманням фракцій надосадової рідини (51) і осаду (РІ). Фракцію 51, що екстрагується в ТВ5, розділяли шляхом центрифугування при 150000 х 49 протягом однієї години при 4 "С на фракції надосадової рідини (5і5) і осаду (бір). Осад 5ір повторно суспендували в 10 мМ Ттіз/НСІ |рН 8,01 до об'єму, рівного одній п'ятій початкового об'єму 51. Осад Р1 повторно гомогенізували в 5 об'ємах буфера з високою концентрацією бо солей/сахарози (0,8 М Масі, 10 95 сахарози, 10 мМ Ттгів/НСІ рН 7,41) і центрифугували при 27000 х а протягом 20 хв. при 4 "С. Зразки надосадової рідини збирали і інкубували з саркозилом (кінцева концентрація 1 95; бідта) протягом однієї години при 37"С з подальшим центрифугуванням при 150000 х 4 протягом однієї години при 4 "С з отриманням зразків нерозчинного в саркозилі осаду, що називається в даному описі винаходу фракцією РЗ3. Осад
РЗ ресуспендували в 10 мМ Ттгіз/НСІ |рнН 8,0) до об'єму, рівного половині початкового об'єму, використовуваного для гомогенатів головного мозку. Патологічний тау-білок з головного мозку миші г"Т44510, що характеризується на 50О5-РАСЕ як гіперфосфорилований тау-білок розміром 64 і 70 кДа, присутній виключно у фракціях бір і РЗ у вигляді розчинного в ТВ5 олігомерного тау-білка і нерозчинного в саркозилі фібрилярного тау-білка відповідно. Фракції 5і5 містили нормальний нефосфорилований і фосфорилований тау-білок, який відображається на 505-
РАСЕ у вигляді тау-білка розміром 55 кДа. Патологічний тау-білок, розчинний олігомерний і нерозчинний фібрилярний, виділений у фракціях бір і РЗ відповідно, використовували як затравки гіперфосфорилованого тау-білка для рекрутинга ендогенного мономірного людського тау-білка з утворенням включень агрегованого тау-білка і для індукції затравлювальної дії стосовно тау-білка в культурах первинних кортикальних нейронів, виділених у мишей гТ94510.
Аналіз затравлювальної дії в культурі первинних нейронів, виділених у мишей гТе4510
Мишачі кортикальні нейрони (СТХ) виділяли з Е14-16-денних ембріонів мишей гТ94510.
Трансгенних по одному гену, активатору ІТА, мишей спарювали в певний час з трансгенними по одному гену, респондеру мутантного тау-білка, мишами. Вагітних самок убивали через 14-16 днів після зачаття і ембріони генотипували за допомогою ДНК головного мозку із застосуванням пар праймерів 5- сСАТТААСАаСасСАТТАСАасСта-з" і 5- ,ССАТАТИАТСААТТСААдсСасспАТААДИ-3! для трансгена активатора ІА і 5- тТаААССАСаАтТааСТаАсСОо-3 і 5--ТатсАТСаСТТоСАаТОСОССО-3 для трансгена респондера мутантного тау-білка, при цьому виділені зразки ебріональної кори головного мозку зберігали в середовищі Нірегпаїє Е без хлориду кальцію (ВгаїпВіїв ГІ С) при 4 "С. Зразки кори головного мозку з ембріонів мишей гТ44510 відбирали і дисоційовані нейрони висівали на покриті 100 мкг/мл полі-І -лізином чашки при щільності 0,13 х 105 клітин/сме (420000 клітин/мл, 100 мкл/лунка, 96-лунковий планшет) і культивували в кондиційованому глією нейробазальному середовищі, доповненому 2 95 розчином добавки В-27 з антиоксидантами, 0,5 мМ І -глутаміну,
Зо 100 Од/мл пеніциліну, 0,1 мг/мл стрептоміцину (всі розчини від Сірсо-ВВІ Іпуйтодеп).
Кондиційоване глією нейробазальне середовище отримували за допомогою конфлюентних і непроліферуючих культур первинних мишачих астроцитів після 24 годин інкубування.
Підживлення нейронів здійснювали через 4 дні іп міо (ОМ) шляхом заміни половини середовища свіжим кондиційованим глією нейробазальним середовищем і подальше підживлення здійснювали на кожен сьомий день. На 0ІМ4 після підживлення культуру нейронів обробляли за допомогою 1 мкМ цитозин-арабінозиду для припинення проліферації клітин.
Частина гліальних клітин в культурах складала менше 10 95, як визначали за допомогою антитіла до гліального фібрилярного кислого білка (СЕАР) на 0ІМ15. СТХ від мишей /Т494510 експресували ендогенний мишачий тау-білок і трансгенний людський тау-білок 4ВОМ. СТХ від мишей гТ494510 містили тільки нормальний людський мономірний нефосфорилований і фосфорилований тау-білок, що відображається на 505-РАСЕ у вигляді смуг тау-білка розміром 55 кДа; при цьому в нативних СТХ від мишей /1944510 молекули гіперфосфорилованого тау- білка відсутні (64 і 70 кДа). На 0ІМ7 затравлювальну дію стосовно тау-білка індукували шляхом інкубування СТХ із затравками патологічного тау-білка у вигляді або розчинного олігомерного, або нерозчинного фібрилярного гіперфосфорилованого тау-білка, виділеного у фракціях 5ір і
РЗ відповідно. Повну зміну середовища проводили на ОІМ11 для запобігання безперервному поглинанню затравок патологічного тау-білка, і затравлювальну дію стосовно тау-білка в СТХ вимірювали на БІМ15. Затравлювальна дія стосовно тау-білка характеризувалася рекрутингом мономірного розчинного людського тау-білка з утворенням включень агрегованого і гіперфосфорилованого тау-білка, що відображаються на 505-РАСЕ у вигляді смуг тау-білка із зміщеною рухливістю при вищій молекулярній вазі, що становить 64, 70 і 140 кДа. Обидві затравки гіперфосфорилованого тау-білка, розчинного оолігомерного або нерозчинного фібрилярного з фракцій бір і РЗ відповідно, в рівній мірі індукували затравлювальну дію стосовно тау-білка в СТХ. Для вивчення впливу антитіл до тау-білка на затравлювальну дію стосовно тау-білка СТХ обробляли сумішшю з 0,1 мкл фракції РЗ або 0,2 мкл фракції бір (що містять 0,2 нг загального людського тау-білка), виділеними у 40-тижневих мишей гТа4510, ї 10 мкг антитіла (пС10.2, пС10.2 М325, нС10.2 АТ01Т М325, контрольний ІдСь людини) або фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ). Суміш затравки тау-білка і антитіла попередньо інкубували протягом 2 годин при 4 "С перед додаванням до СТХ. На бІМ11 бо виконували повну заміну середовища на свіже кондиційоване сглією нейробазальне середовище. На 0ІМ15 нейрони лізували в крижаному буфері з Тийоп для лізису (1 95 Топ Х- 100 в 50 мМ Тіз, 150 мМ Масі (рн 7,6) з 1 95 сумішшю інгібіторів протеаз (Коспе), 1 95 коктейлем інгібіторів протеаз І і ІІ (бБідта) і 0,2 95 бензонази (бідта)) при струшуванні при 200 об./хв. протягом 45 хвилин при 4 "С, і лізати використовували в аналізі агрегації іп міо за Сівбріо, і вміст білка визначали з використанням аналізу з біцинхоніновою кислотою (ВСА) згідно з інструкціями виробника. У основі аналізу агрегації тау-білків від Сібріо лежить флуоресценція з розрізненням за часом із застосуванням одного і того ж антитіла в якості як донорного (кон'югованого з ТОЗ3-), так і акцепторного (кон'югованого з 42) антитіла в резонансному перенесенні енергії флуоресценції (ЕВЕТ), і його виконували згідно з інструкціями виробника.
Стисло, зразок об'ємом 9 мкл змішували з сумішшю антитіл об'ємом 9 мкл і інкубували протягом 20 годин. Планшет прочитували на планшет-рідері РПегабзіаг для оцінки флуоресценції з розрізненням за часом (виміряної/інтегрованої після включення збуджуючого світла сигналу
ЕВЕТ). У даному аналізі вимірювали агрегацію тау-білка, як олігомерів, так і фібрил тау-білка, в матеріалі головного мозку від мишей /Т944510 і в лізатах нейронів від підданих затравлювальній дії стосовно тау-білюла СТХ, виділених з ембріонів "794510, з високою специфічністю і чутливістю. Результати можна побачити на фігурі 21. Інкубування затравок з РЗ або 5ір з людським контрольним антитілом Ідсї приводило до аналогічного сигналу агрегації тау-білка від підданих затравлювальній дії СТХ як і інкубування затравок з РЗ або бір з РВ5. Сигнали від
РВ5 і людського контрольного антитіла Ід усереднювали і приймали за 100 95 агрегації тау- білка. Антитіла до тау-білка ПС 10.2, пС10.2М4325 і пС10.2А1017-М325 значущо зменшували сигнали агрегації тау-білка, обумовлені індукованою як РЗ, так і бір затравлювальною дією стосовно тау-білка, на 0ІМ15. Результати 2 окремих експериментів узагальнювали. Антитіло
С10.2 зменшувало індуковану РЗ і бір затравлювальну дію стосовно тау-білка на 23 95.
Варіанти НС10.2М325 і НС10.2А1017-М325 зменшували індуковану РЗ і бір затравлювальну дію стосовно тау-білка на 41-53 95 і 48-60 95 відповідно. Варіанти НС10.2М325 і пС10.2А101Т-М325 перевершували ПС10.2 стосовно зниження затравлювальної дії стосовно тау-білка в СТХ від гТа4510, індукованої затравками гіперфосфорилованого тау-білка з бір або РЗ, що складаються з олігомерного або фібрилярного тау-білка відповідно.
Приклад 10
Зо Дозозалежне забарвлювання структур тау-білка у мишей гТ94510 після ім. ін'єкції НС10- 2 М325 АТО1Т
Спосіб
Дванадцятимісячні миші "94510. Ці трансгенні миші експресують людський мутантний тау- білок (РЗОТІ ОМАР) під контролем елементу відповіді Теї-ОйЙ в СатК2-позитивних нейронах і характеризуються вираженим гіперфосфорилуванням тау-білка і утворенням клубків, починаючи з віку б місяців і далі. Крім того, у мишей /194510 віком 12 місяців присутня нейродегенерація в ділянках з вираженою патологією. Миші отримували одноразову і.м. ін'єкцію в хвостову вену антитіл ИС10-2 М325 в дозах 80 мг/кг, 20 мг/кг, 8 мг/кг ії 0,8 мг/кг. Кожній миші робили ін'єкцію в об'ємі 100 мікролітрів. Через три дні після ін'єкції мишей перфузували протягом 2 хвилин за допомогою РВ5 з подальшою перфузією протягом 10 хвилин за допомогою 4 95 параформальдегіду. Зразки головного мозку піддавали кріозахисту в 30 95 сахарозі і нарізували на вільно плаваючі кріозрізи товщиною 40 мікрон. Зрізи інкубували з 5 95 нормальною свинячою сироваткою крові в РВ5/1 95 ВБА/О,З 95 Тийоп Х-100 протягом 20 хвилин, промивали в РВ5 і нарешті інкубували з кон'югованим з АІехаРіног488 вторинним антитілом до
Іа людини при 1:200 (Ме 709-545-149; дасквоп ІттипоВезвеагси І арогаюгієв, Вест Гров, США).
Зрізи промивали в РВ5, поміщали на предметне скло і досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Результати
Їм. ін'єкція пС10-2 М325 приводила до зв'язування іп мімо з цільовими структурами головним чином в гіпокампі і корі головного мозку із зразків головного мозку тварин /Т494510 відповідного віку (фігура 1). Число спостережуваних позитивних структур варіювалося між окремими тваринами /Т94510. Позитивні сигнали в зразках головного мозку гТ44510 було нелегко виявити як внутріклітинний забарвлений матеріал, і вони могли бути позаклітинним матеріалом тау-білка, що вивільняється під час процесу нейродегенерації. За допомогою напівкількісної оцінки найбільш високі сигнали (інтенсивність флуоресценції і число позитивних структур) виявляли у всіх мишей, яким вводили дозу 20 і 80 мг/кг (таблиця 6). Мічені структури спостерігалися при 8 мг/кг у З з 4 мишей, проте на явно нижчому рівні, ніж при 20 їі 80 мг/кг.
Внутрішньовенна ін'єкція в дозі 0,8 мг/кг не приводила до появи сигналів, що перевищують фоновий рівень, при використовуваному способі візуалізації. В сукупності ці дані дозволяють припустити, що антитіла НС10-2 М325 здатні дозозалежним чином проникати в паренхіму головного мозку і специфічно забарвлювати мішені у мишей гТ94510 іп мімо. Фігура 22.
Таблиця 6 п- 2 М325 флуоресценції відношенню до 80 мг/кг) 01741111 вмиг | 777 жу 17771111 11174111 овмиг | зум 17771110
Флуоресцентно-мічені структури тау-білка, виявлені в зрізах головного мозку після і.м. ін'єкції пС10-2 М325. Напівкількісна оцінка: ---- сильний; ї-- помірний; ж слабкий; 0 не виявлений.
Приклад 11. Затравлювальна дія стосовно тау-білка з формуванням патології тау-білка
Приготування затравки
Заморожені зразки кортикальної тканини від донорів з АЮ отримували від Тіз5це боішіоп5 (Глазго, Великобританія). Тканину головного мозку зважували і гомогенізували із застосуванням ножового гомогенізатора в стерильному холодному РВ5 (10 кратний об'єм зразка головного мозку). Гомогенат потім піддавали ультразвуковій обробці на ультразвуковому дезінтеграторі
Вгапзоп зі встановленим режимом вихідної потужності 2 з імпульсами 5 х 0,9 с Гомогенат центрифугували при 3000 уд протягом 5 хвилин при 4 "С і надосадову рідину розділяли на аліквоти, піддавали миттєвому заморожуванню на сухому льоді і зберігали при -80 С до застосування.
Тварини, використовувані в дослідженні
Використовували трансгенних мишей, що експресують людський мутантний тау-білок (РЗОТІ ОМАН) під контролем трансактиваторного елемента, контрольованого тетрацикліном, в
Саткі!І-позитивних нейронах (пд4510). У цій моделі патологія зазвичай починає розвиватися у віці 3-4 місяців. При згодовуванні матерям доксицикліну під час вагітності і протягом перших З тижнів життя дитинчати патологія розвивається на пізнішій стадії (з віку б місяців). Вік використовуваних в даних дослідженнях мишей, попередньо оброблених доксицикліном, під час піддаванню затравлювальній дії складав 2,5 місяця.
Обробка антитілами
Антитіла готували в концентрації 1,5 мг/мл в стерильному РВ5 і розділяли на аліквоти з достатньою кількістю антитіла для одного моменту часу введення дози. Аліквоти зберігали при 4 "С до застосування. Починаючи з віку 2 місяців до убивання у віці 5,5 місяця, миші отримували тижневу ІР дозу антитіла (15 мг/кг, рівну 10 мл/кг). Використовувані антитіла: контрольне
Зо людське В12-Іща1, пС10-2, пС10-2 М3251іС010-2 М325 АТО01Т.
Стереотаксична ін'єкція
Безпосередньо після отримання 3-ї дози антитіла миші отримували анестезію, будучи зафіксованими в стереотаксичній рамці, шляхом вдихання ізофлурану. Череп оголяли, і його положення вирівнювали, поки брегма і лямбда не розташувалися на одному рівні. У черепі просвердлювали отвір на 2 мм латерально (справа) і на 2,4 мм назад від брегми. Шприц зі скошеним наконечником 26 калібру на 10 мкл (5С02Е) застосовували для ін'єкції затравлювального матеріалу на 1,4 мм вентрально поверхні головного мозку.
Два мкл матеріалу вводили шляхом повільної інфузії в необхідне місце (0,5 мкл/хв.) і після цього шприц залишали ще на 5 хв. перед вийманням. Рану закривали і налагоджували шви, і мишей зігрівали під час виходу з анестезії. Потім мишей тримали протягом З місяців до виконання перфузійної фіксації за допомогою 4 95 параформальдегіду.
Гістологія
Зафіксовані зразки головного мозку обробляли в Меишйгозсіепсе Авзосіаіїе5з (Ноксвілл,
Теннессі) із застосуванням технології МийіВгаїпФ. Не більше 25 зразків головного мозку мишей спільно заливали в один блок і нарізали в замороженому вигляді на зрізи по 35 мкм у фронтальній площині через весь головний мозок. Кожний 6-й зріз забарвлювали за допомогою забарвлювання сріблом за СаїПуах для виявлення нейрофібрилярних клубків. Зрізи поміщали на предметне скло, накривали покривним склом і проводили підрахунок нейронів (сому), позитивних щодо забарвлювання сріблом за СаїІуав, в усіх зразках головного мозку в гіпокампі з боку ін'єкції. Включали всі підділянки гіпокампу. Підрахунок проводили у восьми зрізах на головний мозок. Результати відображають сумарну кількість позитивних нейронів з 8 зрізів.
Результат
Усі з НС10-2, пС10-2 М3251і пС10-2 М325 А101Т значущо зменшували затравлювальну дію клубків тау-білка в підданому ін'єкції гіпокампі (однофакторний апома і критерій для множинних порівнянь Тьюкі). НИС10-2: 50 95, НС10-2 М325: 47 95 і С10-2 М325 АТО1Т: 60 95 в порівнянні з мишами, обробленими контролем.
Фігура 23.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ХХ. Лунибек А/С (8. Мівабеск 8/8) «120» АНТИТІЛА, СПЕЦИФІЧНІ ДО ГІПЕРФОСФОРИЛОВАНОГО ТАУ-БІЛКА «іЗО0» 1048-ч0-РСТ кібох 57 «170» Расевсто Ууекаїоп 3.5 «їй» 1 «»іїї» 441 «ті22» вик «213» Штучна «ех «23 Людський тзусбілок «апож 1
Ме діа біз рхо Аку бій Сі ре бі Уаї Меб сів Авр Мія Аїа біх ї 5 То 15
Тих Тух біу пев біу АвроАку Шує Дяр Сів біжу біу Тук ТВ Мей Нів хо 25 зо біз Авр о біп 13 с1у Аве їТВк Авр АХа Сі цей Ппув З10 Бех Ро цей сів тТвЕ РКО Так біз Авр о сіу Вех бі бі Рро б1іу бек бій ТЕ Зех 5 бо дир діа ЦПув Яек ТБ рхо Твк Аза 010 Дер Уві Таж Аїа Бгто йем Уаї
Б 70 75 во
Авр 010 С1у Аіа Рко с1уУу Пув бій Аза й1а діа бід го Ні Тік бій ва 90 з5
І1е Рко біб біу Так Тк Азїв бів біз ліз сіу Т18 сіу Авр Тк о руе 100 7а5 116;
Вех ТІнб біб Авр біз Атїа Аза біу Нів Уаї Таж бів А1а Ако Ме Уві 115 120 125 бек їдра ВЗоє Гуз Ар сі Тв біу Бех Авр Ар оПув був Аза їде біу 130 хЗ5 140
Аїа бар б1у Був Тих ув Ї16 АТа Тих РКО Аху С15У Аза Аза Рко Рко 145 150 155 180 піх ій Буз ді бів Аза Аз Аза Тпх Ах тТіе РрРго Аїа Ппув Тих рко ї65 170 їла рхо діа Рго був Тк о рхо рРго бек бек 01іу біб: Рко рРко Буз бер ШУ їіво 185 79а азр йха бек Сіу Тух бех Зек Ркго С1у Зекг БЕЗ йіу ТЬк Ркго біу век 19558 209 205
Аку Веб Ак Тру рко бек Пе) РКО ТЬк Рко Рко ТЕ Аку біз РКО був 219 218 220 їув Уа Аїа уві Уві Ако Тк о Рро Рко Пуз йет Рхо Беж Зек Аїа Буг 225 236 235 240
Веб дк пе 0165 Тбк АтТа Ро Уві Рис Меб Рхго Авр ої Пуз Авп чаї 2545 250 255 уз Бек Гуз Ї1їєе б1іу Яек ТНх сій Аво Бец їуз Нів сів Бко б1у с-1у
Бо 265 79
Сіу пув Уаї сіп ї18 її Ав Іув Гув цев Авр Пец бок Авпоуві бій 275 250 285
Зек пуз Суз С1іу Зек Був Авр Ава Ії йув Нів Уві Рко бі» їу щіу 290 295 зо
Бех чаї бів їі Уві Тук цу Рко Уаї йзр їй бек уз Уві Тк обег 395 зі0 315 320 пУув Сув біу бек їси Сіу Ав Ії Нів нів був рко біу Біу 91у бів 325 зо за чаї бі Уаї був бек біс цул Твп АвроББе Муз АБр Ага Ууаі біп бек 345 а5О їуз їі й1у бах ей Авр о Авп їїв ТВ Ніз Уві РО біу 0іу сіу Аза 355 Кс) 355 ув був їїо піз ТВх Нів Бу Тео Тр Ре Ася біз Ав Аза пу від 370 375 зво їув Твж Дар нів піу Азії бій їте Уаії Тук МПув Бек Рко Уві Чаї ех за5 зва 95 400
Сіу дер Тлх Яег о Рго Аку Нів цем бех Ап уві Веє Бах Тс обуу важ 405 410 415 їіз Авр Меб Уаї Аер Бек рке бів Пец Аїа ТЕ їм Аїа Авр. Ста Маї
420 425 230
Бех Ліз Вох пез Аза Ппув Сів 1у Без 435 440 кеї0м «211» 23 «гівх БІЛОК «2132 Штучна ка?о5 «йИ23» залишки 386-408 тау-білкюка (раЗОб, 0404) «00 2
Твк Авр о Нія 5З1Уу Аїа іш І1їв Уві Тухє Туз Бех Кто Уаї Уві бек біу ї 5 10 ї5
Авр тв Бек рго Ата Нів Бей «кій З «ії 11 «212» БІЛОК «213х Штучна «айх «З» СРЕХ леского ланцюга С10-9 «ап» З сіп діва бЗех Сів Азрв ТВх Вес Т1є Авй Тем Ай 1 5 10 «ії» 4 «2112 7 «гі» ВіЛОК «213» Штучна ки» «223» СОВа легкого лавцюєта С10-2 «до» 4 біу Аїз баг йяд пев 033 Тне і 5 «10» Б «51ї1ж 9 «2125 БІЛОК «213» Швучна «20» «2232. СПИЗ легкого ланцюга СІ0-2 «цОож 5 ївач бій Нів Та Тук ївеи Рко Рпе ТвЕг 1 Е «10» 56 «її» Б «12» БІЛОК «213» Штучва «вах «ви3» СОМ1і важкоро ланцюга Сіб0-2 «400» 5 двр бжо Тахо тІзіє Ніз і 5 «ох 7 «211» 15 «іа» ВІЛОК «213» Штучва ква» ке23з СОКО зажкоро йзниюєа С10-2 «400 7
Рко б1у Авр Сіу бек Тк Іує ТуУуж беж С1І0 їз Ре Сів 1 В 10 1У жегій» 8 «ії» 5 «212 БІЛОК. «213» Штучва «ого» «2235 СОВЗ важкого лавцюква СІ0-2 «аж св
Ака Бі Віз Має Авр Тут ії 5 «210» 5 «її» 14 «ій» БІДОК «813» Легкий ланцюг мишачога сій» «00» 9
АврЛоуайх біп Має Ії бїп бек Бго Ябк о бек рей бек діа Вех ей ФУ 1 Б їо 15 двр ї19 Уві ТВ: Меб Твг Суз сіл А1а бех Сів б1іу Тек бек їТе Азп зо їв деп Ттрорре Сіп бів був ко біу Шув Аза Рхо Пув їей Те) її тТук 1у Аза Бек Авп оцеш 015 Авр біу Уві Рко бек Бк рРне бах сіу
Бо 55 бо дах Аку Тук Піу ТЬх Ар Ре Так ей Тьх Ї1е Важ Жек Бшц сти двр 70 7 во січ АвроМеб діа Так о Тукє Ба бує ївп бів Ніз ТВЖ Ту Бей Рхо Ре 85 аб 95 їх Бйе 0іу Як біу Твкобуз рез біз Її Гуз Аху Аза Авр Дів дів 100 105 110
Рто Так Уаї Бек Ії Ріпа Рго Рко Беж беж бів сіп цей Тв бек С0Щ1уУ 115 1950 125 біу Аїа Зех Чаї Уві Сув Ббйе БПес Ав о Аво Бе Тук Рко Був Авр Її 130 їЗВ 140
Азп уаї Пуя Тхр Пув Ііє Аяр с1у Бек бій Акад біп Ав оїу Мадї Бей 145 150 155 160 вай бек о Ткр Тйх Авр сСіп йзр Бех Муз Аве Бах ТВж Тук Зах Мас бек 1655 ілі і75 цех Твж о йея Так оїви ТЕ Ппуєя Авробіз Туг бі Акч о Нівз Ап оЗех Тух 180 ів85 190
Тит Сув бій дів Тк Віз Буз Тк оВех Тах бек рхо Іїе Узі Пув Бек 195 200 щВ
Рве Ава Акоу Авп біль Сув «?і0з 10 «гії» 435 «219» БІЛОК «9135 Важкий ланцюг мишачастюе сі10-2 «д00х 30 тк ат біп їжи Сіп біп Бех Авр о А18 біб тез уяї буя Рко іу Аа 1 5 10 15
Зек Узі Був Ї1є бек Сув їув Аїв Ваг о біу Тує тах Ра ТЬс Ар Ах зо
ТвЕ їі Ніз Ткр Узі Був біз Акча РКО «1 біп о біу Бей бій Ткр І1з з5 40 МУ
Сі Тух її Тук Вко біу Авр 01у бек тТНх Гуз Тутїг Авп о біа Ав бе
Бо 55 БО уз бьу Туз зів Твх Таб Тж азів Ав Гуз Бек Бек бек ТИХ Аїв Тут 65 70 75. во
Мекобів ей Авп обех цен» Те Вех біб Авробек Аза Уаї Тук РБе Суз 85 зо 95
Аїа Ага Ак біу Аіа Меб Авзр Тук Тктр б1у Сів біу Тк Бетг таї тиж 190 105 118 чаї бах Бах Дів Гув ТвВЕ Тв Бхо Бко бек Уаі Тухк Рхо Без Аїа Рко 115 120 125 сіу нег Аза Аї8 біп Тйх Ап оба Ме Уві ТвЕ Те Сіу Сув Пецп Уві 130 135 140
Тув біу Тук Ре Ржо бій Рко Чаї Твж уві тТйє ТкроАвп Яех ту век 145 150 155 150
Ти бах бек біу узі Ні ТБк Ре бхо А13з Уві тю біп бех Авр оцей 165 170 175
Тух ТВх Гей бек дек бех Уві Ті: Уві Рко Бек бек ТБт Тур ко Вех і8б ї85 І50 -1ї Тнк Уві Тс Сув Авпоуві Аза Нівз Рхо Ала беж бак Трах Був Чаї 195 2560 295
Авр о цув Мув Ії Чаї Рхо Ага Авр оСуз 01у Сув Пув Рхо Сув ІТе Суб 710 215 225
Твх уаї рго бін уві бек Яех уві рРпе її Рйе Рко Рка Був рго Гуз т25 230 235 240 дар уаї Гей Тк її Твк ойей Тк Рко Пув Уаї Тк Сув Маії Уві МУаї 245 во 255 дяр їіє беїх йув Авр Авр рко бій Уві сій ББе бек Ттр Рів Угі Авр 250 265 278 дир уві сів Маї Нія ТБЕ Аїа біп Твг о бій Рхо Аке біз сів біт РБе 278 280 285
Авп бек Твк Рів Ак бек Уві Бех бБіц їей Ржо Ії МебЄ Нів бів Авр 290 295 збо
Тхр Тен Ав оСіу Пув сім Ре Пуз Суз Аху уаїі Ана беж А1а Аза Бве за5 310 зії 325
Рго Аіа Рко Ї1ів біо Був ТБжх Їіе Бех Був Тк Був Сіу Ат ро пуб зав зай зе
Аїв Вга БЗів Уа1ї Тук Тих Ті Ехо Рха Рко був бі бій Ме дів ув 340 345 зва
Авр Пцув Маї Век Бем ТБх Суз Ме Хі Тйж Авв о бБе Бе Рко пів Авр 55. 350 з65
Ті Тпж Уаії бій Ткр осів Тер Азп біу Сів Рко Аіз бій АввотТук був 370 378 380
Авр;оївх сів Бко їїе Мей Авб Так Авросіу Бек Тук вне Уаї Ттух веж зв 390 зав 400
Ів Івй два о уаї біпоГуз Яех Авп Ттр бій Аза сСіу АвпоТвке Ре Ту 05 410 415
Сув ек Уві Ппей Нів Січ СіУу Пейп Нав Авп о Нів Нів Тпх біб Був Бех 425 4360
Без Веп: Нів Бах Ржхо шіу Пув 435 ка» 1 камі» 445 «гі? БІЛОК «2135 Штучна каг0»
«223» Важкий занцюг гуманівованого С10-2 «дО0хж 11 бів Маї біб їсп Чаї Сів бег Сіу Аїа бій аї Чаї ув рто піу дії ії З їй 15
Бех Уві Муз Іїє Зег Суз Туз А1а бек Сіу Тук ТБк Ре Тьх Азр Ако 20 25 30
Ти Ізїе Нів Тер Уві АхЯ біп Азїва Бхо біу сій 0б1Уу Пе біз Тер Ії6 з5 49 45 с-1іУу Тух 16 Тук РЕБо сБу Авр б1іу Вег Тах Та Тук беж бів був рна 5О 55 60 біп Сіу Аку Аза Твг Пед Твт Аза Азр тк бех Аіа бех Таж Аза Тук 779 75 во
Мек Сі рез бег Бех цес Ага бех біз АвротТвх Аів о Маї Тух Тух Сук. вк за а5
Аіїв Ак йо сіу Аїа Меж Дер Тух Тер Сіу сій б1у Тк бек уаї ТЕ 100 105 110
Маї бек бек Аїз дек Так Цув Б1уУ Рго бек Уві Рре Рхо без Аїа Рко 115 20 25 дех бах тра бек ТНЕ бах С1у С1у Твх Ата Ата Пез Б1у Сув пев Уаї 139 135 140
Ів Авр о Тух РВЄ Рко ОТ Рко Уві ТВг: Чаї Векг Ткр Аяп бах біу Аїв 145 155 155 160.
їез ТЕ Бех СІіу Маі Нів Тих Ре Рго Аїа Маі Пец біз бек ех бі 165 170 і75 ївецп Тук йак пес Век Вех Уві Уві Твк уві ро Бех беж бек їей Ф1У ї5о 185 190
ТнЕ бів Тк о Тухк їїє Сув Авп уяві АвпоНія Був Ро бек АвпотТйк пув ха5 200 2а5
Чаї Авр Муз Аху Уві сій рхо Муз бак був дар був Тих Ні Тк Сув 210 215 220
Рка Рко Сув о Рхо Азїа рРко бій Бем о їхміа ШЬУу біу Рго Зех Уві РБе гей 235 235 240
Ріє Бго Рко буз Рго Був Ар Тах Цей) Ме Ї1е Бех Аху Тк Рко 03 745 250 5 чаї Тв Суз узі Уаї Узі Авроуаї бек Ні сій Ар обо біб Чаї Шув 26 265 270
Ве Авоп о ТсроТукх чаї Азр сіу уві біз Уві Нів АЛяв Аза Був Хрг Гуз 275 зво 285 го вхо біз бі: бів Туг Ав Бех Твг о Тух Аку Уаї Уві Бек Уві Шей 29 255 390
Тих Уаії ївшци Нів бів Двробжр о Тєзі Авпобіу Гуз біо Тут Був Суа ув за5 10 ЗІ5 Зо
Чаї бег ляй цуз дів Бей рко дів Ро І1е Січ Був ТНХ І1е Бек Туз
Зав азо з іа їхв бі біп Рко Ак бій оРко біп Уві Тук ТЬх Пам реко ркго Збе 340 зав З5о
Аха біо бІз Мес Тс Гуз Аза о біп Уві беж йез ТВх Сув тез Уві Був.
Зв5 зво зб сіу Бе Тук рко Бек Авр Іїе Аїа уаії Сій Чтр Сі Бех дзп бі бівйб 370 375 зве
Рко сі; Ав Ап оТУК Був ТВкК оЇБк оВко Рго Уаї Бей; Авр обек Авр о сіу зя5 399 3955 400 бек Ре Ре цей Тух Вех пув цез ТВвх Маї Авр ув Зехк Аж Тктр и бів за5 48 45 сіп біу Авп Уві Ріє бег Сув бек Уві Ме: Нія бій Аї8 еп Нівз Авл 420 425 40
Нів Тук Тк Сію Гуз Бех Бей бетг Гей бех Рко Стіу Буз 435 440 445 «10 12 «11» 214 «8125 вІЛОК «2135 Штучна «вед «273У Легкий ланцюг гуманівзованого С10-2 «00» 12 двр Уві бія Меї Тих біп беж Рко Век бек їхні Зех АЇв беж уві сіш ії в 10 ї5
Аїв Сув сій Уаї Тож Нів сію Сіу пев» бех шеж рто Уві Тьвк о буз бек 395 200 205
Бе Авп йка сіу білі Сук 210 «105 13 «112 844 «212» БІЛОК кеїЗх Штучна «20» «Ра3». Варіантст 05ЗБЮ важкого ланцюєюа гуманізованого СТ0-2 «ОО» 13 бів Узі баз бем чаї бів бек Ту вла Бій Уві Уаі Був Еко бі Аза 1 5 160 15
Бек Уаї пуб Іїе Зех Суз Був А1а беж Б:іу Тух ТВвк Ре Тих Авр Ах 20 25 зо
Тих їів Нів Ткр о УМаї Ажа бів Аза Рко Сіу бів біу їжа біз Ткр о Т1е за 495 5 сіу Тук Іі Тук Вго біу біз Сіу бек Твк Гув Тух бек бів їде Рве. 50 5Б о біп сіу Ату діа тТвх йей ТВх Аза Авр отв Бог АТа бек Тих Аза Тук 8 70 75 во
Меї сіб ва бак бек Без Аху бЗех із Авр Так дія чаї Тук Туж Сув за з
Аїа йка Ака Сіу Аїа Ме Авр Тук Тхр піу сій с1у ТБ Зек уді Тв 105 1035 кьа чаї Зех Чек Аїа бек Тих Мбув біу рко Зег Уві вБа рго їі Аїа Вго 115 129 125
Бек Бежт цу Зек Тржобек Оіу Сіу тах Аза Аїа пе: сіу Сув рай Ма1 1ї1з0 їз3За 140
Був Азр Тук Ре Рко бїй Рго Уаї Тк Уаії Бек Ткр Авп Яек Сіу Аїав 145 150 хв 160 цечз ТВх бек Оїу Увж Нів Трх Рре Бхо Аза Уві без бів бек Бах 1у 155 170 175 їз Тук Беж Без вк Бек чаї Уаї ТЬг Маї Рко бек Зех Бек цей СТУ ї80 185 199 тих піп Твж о Тук тів Суз Авво уві Ав оНів Був Рко бек Авп Так Гув ї195 2аб 295
Уаї йзр Пуз Ас ві біл Ро Був Бех Сув бер пув ТВх Нів Твх був 219 ів 220
Рко Рко Сув Вго Аіїва Рео бій опей пев» біу СТу Ркго беж Уаї РБе ем 225 23 735 240
Бра рко рко буз Бко був АвротТає Пез Меб її бегоАха ТВж ко сі 245 250 25 чаї тих Сув Уві уві Уві Авр Уаї Зех Нів Сіш Авр РКО біз ах бух 260 965 270
Бне Ав Тхр Тук Уаї Анр Сіу Уві біс Уаї Нія Авп о Атїа був Тих був 278 280 295
Рко Аха біб біз сід тТук Аво вк Тв Ту Ага Маї Уві бек ар ей 250 295 з0о
Тру Чаї пем Пів бІ1в Авр Тур Бей Авп о біу Гув бі Тук Пув був Був зок кА зі15 320
Чаї бек Авп був Ата пер орто АтТа рРко їі біб Був Тах ї3іє бек із зав 330 зз5 ліз ув діу біп Бхо Акад Бі рРге бів Уаї Тує Тпж йем Рко Ркб Бех зай 345 зво
Аква сів біс Мебє ТБЕ Був дев бів Май беж Пец Так о Суз тен Уаз Був зво зв
Зі РБе Тук Рго бек Азр о Тіє Аіїї уаії сій Тер бій бек двп Сіу бій зт ЗУБ зво
Бко біз Авпойзп о Тух ув ТЬжх о Твх Рко Руо Уаї Тем Авр бех Авр с15 385 390 395 400
Веж Бе Бе йеч Тук Бех Пує йей Тайх Уві Авр Цуз Зек Аку Ткр бів 505 415 415 сій Сіу давай хуаї ББе Бех Сув Бех Уаї Меї Нів Сі АТа Гей Ніз Ав го 425 439
Нів Тух Тлх бій пув Ввх Тв Бегоцез бек Рга с1у
435 440 «еїй» 14 «211» 444 жеї2з» БІЛОК «2132» Штучна. «чав» «ге3» Варізнте БЯ5О важкого ланцюга гуманізованого С10-2 «00» 14 сів Уаї біп Шев чаї бів Бех С1У Аїзв біз Уві вії йує Бко Бу Аїа ї 5 о і15 баг Уаї цу ї1їє бех був Цув Аїа Бек біу Тук ТЬе РБе ТрЕ Ввр о Акоа о 25 30
Твх І1е Нів Тхр Уві Ака бій Афа Бо біу бів біу Беюв бій Тхв 18 су Тук їі Тук рРко піу біп біу Бек ТБж Був Тужх Вех Іл пух ве 60 св біу Аху Віз Тйк Гес Твк дів Авр Тв: бек Аїз Бек тТьх Аза Тук 65 70 75 о
Мет біз їБвоа бах бек їйвза» Ажу Зак о зі); Ар о Тк Ала чаї Тух Тук Сув 85 во 95 дів Ага Ага біу Аіз Ме АвроТух Тер 01у бів Сіу тТвх Бах Уві ТВЕ 100 105 10 туаї ву Вег Аїв Зех ТЬХ БПуз С1у Рго Зехкх Уаії Бе Рго бемжм лів рхо 115 120 125
Баг Бех був бек ТВжх Бек сіу Біу Тр Аїа Аза пох су Суз пей Уві 139 ї35 148 уз АвроТує Бпе Рко сій Рекс Маї ТБк Уві бек Тхр бал Бех біу діа 145 і80 155 66
Теч ТЬх бек біу Маї Ні Твс Без Рхо Аза Узі йей бій беж Бех 01У 165 170 175
Іво Тук бак ІТєв Ват Зак уа1ї Маї Ме Уві рРко ЯЗехс Бек бак цечй ЩУу ї80 155 190
Тнжх бів Тпк о Тух їіе Сув Авп оУаі АвпоНів Був Рко Бех Авб ТВжЖ Му 195 250 205
Чаї Авр Цує Вк Уві Сіц рто Був бек Су Авр Гув ТНЕ Нія Тк Сув ій 715 250
Бтго рго був рРко АтТа Рхо бій Бем Без біу біу Ро бек Маї Ре цей 225 230 235 240
Вве рго Рко ув Рко Пуя Авр о Тпх їво Мебї Пе бек АкаЯ жк Еко ОО 248 25 235
Чаї Твх Суя чаї Узі Уві Авр Уві Ват Нія сіб Авр о Рхо біз Уві Пув 260 265 27
Ріє дяйп Ттр оту уаї Авр щіу Уві сь Уві Нів Авипозіа Муз Ток оух 87 280 285 гкго Ах сій сіє біп ТУук Ави бек ТЕ Тує вка Ча1 Уаї бек Уаі Те
290 295 зво
Твг Уаії цеш Нів бБіп АвБ Тв Бей Аяп о біу пу піч Тук та Сув Був зо зо ЗіБ з2а
Маї Бек Авп обув Аїа Пцез Рго Аза РЕсо ІТ бій ув Три о ї1е бек Був 325 330 за5 діа був С1у бів Рко Ак сі) рго бів Уаї Тук Тв їн Рхз» рко Вехг 340 зав зо
Аха бів Змі Меб Твх Ппуз Аза біп Уаї бек реа Твху Суз Тез Уві Був з55 зво 365
Біу Бе Ту РрРко бек Авр Іі Аза Уві сі Тжр о біз бак Ав обі сій 370 375 зво ро біз дай Ави Ту Пузв ТВ ТвВЕ рео Рко Уаз Бей Авробех Авросіу зв 390 355 400
Баг Ре Ре Цей тух Вах Був Без Тк Уаї Авр Ів бах Аку Ткр Сід 405 410 415 біп біу АвбоУві пе бек Сув Бек Маї Меє Нів біз Аза їй Нів Аво 420 425 азо
Ніз Тух Те бів руб Вех тей бек їейш Бак Рко У 335 ай «210» 15 «її» 445 «Р12х БІЛОК «213» Штучна
«ае3» Варіант БЕ важкого ланцюга гумамнізованого С10-3 «абОз 18
Сіп Уаї біп пейп Уві бір Бек б1у Аіз змі ба) Маї ув РКО біу іа ії З ів і5 бек Уаї Пув І1іє бех Сув мув А1а бек біу Тух Тих ре ТВк двр Ах
Зо
Твх Їіїє Нів Тхр 83 Ака бів Аза Бго біу біп Сіу бем біч Ткр ї12 сіу Тух ї1їє Тук Рхо б3іу Бек а1у бек Тс ПЦув Тук Зех Сію Гуз Ре 5О 55 во сіп с1іу Ага Аза ТвЕ пе Тк Аза Авр о ТАх Беж Аза Бех Тах Ата ТУух 65 70 75 Е539) має біп тен обех Бех Пец Ахч Звт біз АвроТБг АМХ1іа Уві Тук Тук Сув 85 що ак віз вх вка біу діа Меб Авр Тух Ттр БІ1у бій біу ТЬжх Век уаії ТЕ 100 105 110 чаї вад бек Аїй бех Тс Пуз б1іу Рко Бек Ууді Бре Бго Бей Афа ро 115 129 125
Яеш бак Му Бех ТБЕ бек Сіу б1іу ть Аїа Віза ем біу Сув ей Уаї
І30 135 140 туз Ахр отут РБе Ркб сій Бко Маї Те Уаї Век Ткр Ав бек іУу Аїа
145 150 155 160
Те Так о Зеж б1іу Маї Нів Твх Вне Рхо Аїз Уві Бею біп бек ве Сі ї185 170 іт дез Тух бек Меч Бек бек Чаї Уаї Тне Уві Рго Зех Чаї Яех пец біу 180 185 50
ТЕ біб Твх Тух Х1їз Сув Ава Уві Ава Нів Був Ро бек Аз оТНЕ їуг 195 295 225
Маї Авр Іа АкЧ Уаіїі біб рРЕо Муз бек був АвроПпув ТБх Нів Тв був 210 215 220
Фко рхо Сума рхо А1іа Рко біз ем їз іу 51іу Бко Яек Маї Ре Цеви 225 230 35 240
Ре Ро Рко Був Рко їув АзротТвпс рей Меб Ії беж Аг Твг Рка бій 245 250 255 чаї ТВ був Уві Узі Уа Авроуа1ї1 бек о Ніз біз Азр БРко бій Уаї дув 260 255 270
Бо Ай Ткр Тут Уві Ашр сіу Уві ОЦ Уаі Нія Авп Віа був ТВк Був 275 380 285 рхо Ава бій біз 010 Тук два бек Тпх Тук Аг Уві Уаї Зек Маї Ццез 290 295 зоо
Тпх уаї пез Ні Сів Авр о Тхр без Аз о Сіу ув бій Тук лув Сув Пув 305 зі 315 з2а
Уві Век Авп Пуз АТа вм Рко Аза Рго її біз їПув ТВЖ ї1ї6є Вех Був 325 зза з3з5
Аза уз Б1у бів Рко Ажху бів Рко біп Уві Тук тье тей Рко рей дек 340 з45 50
Агч біо бів Меє ТЬЕ Шув Азов бів Уві бек Пе Таг Сув оо уві Був
ЗБ. ЗО 365
О1у Ре Тух Бго бек Авр І1а Аіїа Уві сій Тр біз бек о Авв осіу бід 370 375 зва
Рко біз АвпоАвп Тук Пує ТВІ Твх Ро рРко Уаї Мем йвр Бех Авр СІ зн 395 зах 400
Бек Впе Ре пец ТУХ Зак Був Го Так Мазі Авр о цув бех Аку тТжр бів 5а5 410 415
Сів бі Ав оУуаї РБе бех Сув бак уві Меб Ні біз Бі Пен Нів Вей 420 425 аз
Нів Ту ТЬх бій Кує бек їво Бек оТец Вех Рко п1у 435 440 «гій» 16 «11 214 «ві?» ВІЛОК «213» Шеучна «шах «223» Варіант М3З28 деркого: данцюга. гуманізовзансоюо 018-2 хай» 15 дво Мві бік: МеЄ ТБ бСіп бек Ро бек Бех тей бек Аїа беж Уаії 015
1 Б їо 15
Авр Ак Уві ТрЕ Меї Таж Сув бій Аіа бек Сіп Авр о Твк бек о їзє Зег го 25 зо
Тез Ап Тер пе сіб бів Пуз Бк біуУу муз Аїа реє Мея Пез Бе Їїв з 40 48
Тух біу Діаз бет Ап ей біцш Твк біу Уаї ко беж дкЯ РБа бек (1У во БЕ 5
Зах Асу ех бі Тпх Авр РБе Тв Сех ТвВг Тіє Важ Вех Бей) бів Рко 65 70 7 на біз Авр Меб Аїа ТЬх Тук Тук Сує теп сів Нів Трж Тує цевз Рко Ре вв 90 а5
ТвЕ вве Шіу бек сіу ТВЕ Муз пем сій Ті Гу Аж Тк Уаї йіа Ата 160 105 110
Еко дек Уві Рве їі ББе Рго Рко Зак АвроСьш бів цей Був бек бід 115 129 125 тах Аїя бок Узі Уві Сув пец їх Азо вп оре Тух Рко Аку ста Аїа ї30 135 140
Був уві біб тТЕр Пув Маї Авв Асв Аза їм біп бек б1у Авзв о ВЗек біп 145 150 ї55 60 бій бет уві тт піз сій Авр обер оцув Азр о бех Тк Тук Зак о їев Бек і65 1790 175
Бех Твх цен Так оПпеп Бак Муз Аз1а Авр о Тук бі Муз Нів ув хуаї Тех ї89 і55 180
Ала Сув біз Маї ТЕ Нів бі Сіу цей бех Бак орхо Чві Твж гув вах 395 209; 205
Вів Ав» Аху сту бі Сув 210 «ій» 17 «2115 314 «Вій» БІЛОК «213» Штучна «Евожм «223» Варіант М320О легкого ланцюга гуманізованого с1і0-2 «400» 17
Дар Уаї сСіп Меб ТВ біп бех Бко бек Бех Пеп бек Аз беж Уаї С1у ї 5 15 15
Авр дк чаї ТЕ Ме Тнт о Сув бій Аїа бек біп Авр ЖтТих бак І1є СКп 28 зо їво Авюо ої тр оБбе бСіп С1ай Пув рто сіу Бу Аїа рко був їва во їЇТе
ЗА 40 45
Тут біУу Аіїз Век Авп їй біз Тих сіу ві Ррхо беж Ак Рпе Бек Сіу
БО Бо бо бек Ака бех С1і1у Тк АвроББе ТВроГей Ток Тіє ВЗек Бех Пейз біп ртго 655 70 75 во сія двр Має Аза Твк о Тук Тух Су ей біз Нів Тих Тує ей кхо ре
85 Зо 5
Тіж Епе Сі бек біу Твг Був Пец біс ї1е Був Аго Тьт Уві дів Аїа 00 105 110
Тко бек Уаії РБе Ії Ре РБго Рхо бок Авр обі біп м) Буг бек б1іу 115 125 125
ТтТвж АТїа бек Уві Уа Сув цей Шей АвпоАві Бпе Тук Бко Яка сіб дів 130 135 140 їмав уві сів Ткр пув уві Авр Аа Аза Бей Сів Зех біУу Або бек сів 145 150 155 ї5О сі беж чаї тає бія сії АвробЗеж ув Авробетж Тв Тук беж Тел бат 1655 170 175
Вах Таж пез Тк оБец бак о їув Аї1а Аве отТук біз їув Нів Був Ма Тук ів 185 то
Аів був бій Чаї Ток о Нів сіп сСіу ес Бек бек Рко Маї ТП» був бек 195 200 а тре Ав Акту Ту Сі Су 210 «іо» ї8 -1їз 814 «212» БІЛОЮ «713» Штучна «ооо» «293» Варіане М34Б легкого нанцюга гуманівованого с1і10-2 к«ао0Ох 18
Ар Уві біп Меж Тих біб Бек Рго бек бек Тс бек Аїа бех уа1ї 01у ї 5 10 15
Авр Ак Чаї Їх Мебс тТрпжх Су біп бів бек стіп Ар Тк Мех Ті Ав) 2 28 За
Пец век Тер о РБе сіб біб Гув рхо п1у пув Аза Руо уз Гей цем їІї6
Що 45
Тух іх Азія бек Авпа о бей біз ТВх С1у Уаі Ркбо Зех Аку рРНе век 51у
БО
Бех Аху Зак піу Тк Аврорре Тк йей ТНг Ті бек бах ей бій Рей 65 70 75 0 бів дяр Меб Аза Тк о Тук Тук о Сув Беч бів Нів Трк Тук їецй реко РБе в 50 95
Тих Рів біу ех біу Тит цуз пей бі ї1з СПув йкха Хе Уаї Ата Аїа 100 105 170 рго Яех уаїі Ре Її Бре РгОо рРго беж дар біз бів Пен Був Заг у 115 120 ня твк аіа чек Уві Уві Сув без Пцео Ана Авзп РБе Тук Ркго АгЧ4 Сію А1а зо 135 140
Ів уаї біз Тер Гуз Уві Дер Аз» Ата тез біп Бек біу Авп бек біб 145 150 135 160 сти Зак уаї ТЕ біз біпоАвр бек пув Авробек ТБЕ Тух бек Пе Бех
165 170 175
Бек Тих тей ТВЕж Гей бек Був Аїа Авр Тух Сів цує Нів пуб уяї тує ї80 185 190 віз був сій Чаї Так Ніз Сіп біу їй бек бев Рко Ув) Твх Пує бек ївзб 200 205
РБе Ав АкУ біуУу Бі Сув 219 «2ї0» 19 «211» 214 «біг» БІЛОК «2135» Штучва «Рг «223» Варіант М34А0 легкого ланцюга гумамізованого С10-9 «п» 18 дар Уаї біп Мебс ТВх біп бах ро бех Бах їсо Бех Аза бех Уаї СЬу 1 5 10 15
Ввр Ака Уаї Та Меб ТВк оСув біпп Аїа бек біп Авр Твх Зеж Ге Авп
Зо їжі Сів Тер ре бі сій пув рхо біу цув Аїа БРго був цем тез ї1е
Тук піу дів Вах Авп бем Сів Тах С1іу Уаї Рко Бек Аху рРБе Вех С1У во Ба бо
Ват Вт бек Єїу Трх АвроБре Так оБес Твг ї1іе Бех Бех Меч бів Рка 85 7 75 во сів Авр Мей Аза Тк о Тух Тух Сув ев» піп Нів ТнНу ТУк Пез Бго Ве 90 ва
Твжх Ре сСіу Зехкх сіу ТВ був Оец Зі І1е Був Аку їБк о Маї Аівз ів 100 105 110
Рго бБег Уві Ре Іїе Рюе Бка Рко бек Авр о зів піп Без оПцув бек піх 8 125 125
Так Аза Зак Маї Маї Су цей їні Дал Ав Ре Тух Рхо Аку біз А1ах 130 135 140
Ідзв Уаї біб Тер пуз уві АвроАва Аїа Тем бів бек Сіу Аза бек Пів 145 150 х55 150 біз бЗех Заї Тех біз біп Азр о нек Буз Азв Бак ах Ту Бек без бек 165 170 175 бог ТнНх їшзц Тіт гей бак муз Аїа Аяр Тух сій був Віа Був Уві Туш їво 185 130
А1їа Сув біп Чаї ТВк Ніз біай біу Пеа Беж Вег Ркб Уаї Тк Пув Бек 195 200 ов
Ева Авоп о Ахо біу сти Сув 210 «210» 20 «8115 214 «ій» БІЛОК. «іі» Штучна
«2235 Варіант М328, МЗАБ легкого ланцюга гуманізованого С10-2 «00» 20
Звроуаї бів Меє Тв сіп бек Рко бек бек їецп Бек А1їа Зех Узі 01У і З їй ї5 вро оАха уаї Тк Ме: ТИх Суз біп Аїв бек біп Авр тТпг бах І1їє бак 29 25 30
Пес беж Тер КБе сіб бір їув рко сьу Був Аіїа ро цу Тез феш Іїє тук 1у діа бек Азп оПей бій ТЕ обіу Уві Рео Бех Аха Рве ЯЗех віу 5О вв. 60
Вех дкЯ Вех біу Тк Авр о Бвбе ТВ цез Тбх їіє беж бек Пец Сіп Рко 65 то 75 во біз дар Ммек Аїз Так ТУує Тук Сув Бех бів Нів Твх Тук Без Ркго Ре 85 20 8
Твж ре біу бек біу Тк був без бій її Буз ха ТВк Уві Аїз Ата 100 105 ії10 тТко бат Чаї Бе її Бе Рко Ррко бек Авр Сіл біп йец був чех бїу 115 120 125 тТв;х вза Вес уаї Маї Сув Без їй Авп Анп Кре Тух Рко Ака ба АХВ що 135 ї40
Кув уві бій Тр був чаї АвроАвп ойта цей сів» бек спі Аз) о Бех сів 145 150 58 160 ста бЗех Уві ТВ Су сіп Авр о беє бує Авзр вас Тнж тТук Зах Бей Бек їв 170 ї7я
Зет ТВЕж Пец Тйг Пе) бек Був А1та Авр о Тухк бій був Нів Був уві тую 18 і85 ї930
Аха Сузв Бім Уві Тих Нія сів 01іу їебз бек бек Брго Уві Тах Був бЗех 95 290 25 те Аза Ага у біл був 210 «10» 21 «115 214 «віх ВІЛОК «13» Штучна кага» «2232 Варіант М3ЖО, МЗАб легкого ланцюга гуманівованоюко Сій-а «ро» 23
Авр Уаї біло Ме Твкобів Вех Ро Бет бах Бей ех Аїа Зек Уві ту і 5 10 ї5 двр Ака Узі Тах Меб ТвЕ Суз бів Але бек Піп Авр ТВ Бек ї16 Б18 зо
Іво Бех Ттр рве Сів бій пу Рто С1іу Був Аза Бко Був Ії Пес Т1е 45 тук Біу Аїа Бех Аво цес біз ТБх б1іу Уві Рхо бек Аха Ре Бек 61У 5О 55 50 бек Ага Бек біу Трк о АвроРів ТБт о їв» Так Тіз бек Веб без бій рхо 65 7о 75 во сій Авр Має Аїа Твж Тук Тує Сув їец біп Нія ТВжЖ Тує Пйеп рко Бра 85 з 35
ТпЕ рве с1іу бек С1У ТВх Ту Гей Сі Ї1е Пув Аку Жах Уві Аїа Аза 100 105 ї1їо
Рхо бек Уві Ре Ії Ріпа рРго Ркго бек Аво бі біп о пей Був ес б1у 115 120 125
Тв» Азяа Ват уві аі буя їм їши Двп Ази о Рпз Тук Рго АкаоСіо дів 1350 135 140
Іуз Чаї бБіп Тер Муз Уаї Ввр о Авп дів Пе) біп Бех С1у Авп бек біп 145 150 ї5Б5 160
Сі Яєех чаї Тс біч Сів Авзробеж Буз Ар бек Так Тух бек їй бег 1655 170 175
Вех Жпт Та Тьх ей бех уз Аза бар оТує біз Був Нів йуз Маїі Тух 180 85 50
Аїз Сув сій Уві Тих Нів біп біу цес Век Бек Рко чаї ТЕЖ Був Бех 1955 00 205
Ріпа Азов дк бі біз Суб 210 «2і0» 22 «Іі» іх
«ї12» БІЛОЮ кваіЗ» Штучна «20» «823» Варіант М320, М380 легркоко ланцюга гуманізованого С10- «00» 822
Авр Уві біб Ме ТБх бів Вах Рко Вех Бек ев Бек Аїз Бек уві су ї З я; і15
Авр Ага Чаї Тіх Мес Тк Суе Сів Аза Шек бів бро Таж дек Т16 Сіл 2 25 зо їеч сії Тер окжбе бів б1в Був рРхо 01у Пув Аза вхо Пув Тез ївец І1а 35. 40 45
Тук біу 2Мїа Бех Збп ої) біз То сту Уві РКО Век Ака Бе о Зек сїу о 55 БО бак Ак бек Спіу ТВЕ Авр ре Тих ес Тих Ії Бех Бех Цецп сів Ро 65 то 75 що бій др Меб Аза Тк бук оТух Сув цей біп Ні ТБх Тук їв Бкго Ре о 95 тих Бе піу бек біу ть оБбує цем бій Іїе Був АкКб тТвж Маї Аза віз 193 105 110 рЕо бек Уві вра ї1єе Рпе реко рхо бЗег Ар Січ бів Пец Тув Бест бі 115 150 1725
Тв: Віа Веб уві Ууаї Сув цей рей Ази оАзв о Рре Тух Рхо Аху 015 Ата їза їз35 140
Тув Уаї бів Тер Муз Чаї Азр Авп Аїа рей бій Бех Піу Ав Зак с15 185 50 ї55 хво сій бек уаї Тнх Сів біб Авр Бех мув дер Язи Тих Тужк ет тво Бех 165 170 175 бек Тпг Ген ТБЕ Без Яех бує Атїа АвроТух Січ» пув Нів Пув уві Тух 180 185 190
Азв Сув біб Уві Ти нів біп біу Пес Бех Вех рРкео Уві ТБх Гуз бек 195 240 205
Тра Азп АкЯ біу си був 210 «210?» з «511» 914 «212з3 БІЛОК «813» Штучна «е?0» «223» Варіант ММЗ, М34АО легкоко ланцюга гуманізованого С10-9 ч«аво» 23
Аве» Уві бів Ммаб Тв бів Зек Рто бек Зак Цей ЯЗек Атїа Бек уві 01У ї Б. 18 15
Аср Аку Узі Тк Мас Твх Суб бів Лів Яех біп Авр ТЬх бек Т1іє Вет зо
Лляні біо Тр РП біп бій Був Рко Сіу цув Аза Рго був без Тео їв а5 тТук сіу Аза Бех Ави Пей сії Трх о біу Чаї Ро Бек Аку Ре бек Сію
БО іх 50
Зех Ака бек шіу ТВХ Авр Рпе Тр: Пец ТВх Жіе Зах Беж Пец бів реЕо 65 то 78 во сІіз АзроМеб А1а Тех Тук Тук Сув без бік Нів Твж о Тух їв ро вве в за з
Трх рРбе 1Уу бек сіу Тк пув рей п3)з її ув Агу ТОх Уві віза Дів 100 105 110
Рко бек Уві Ре ІЗ Рпе БкоОо Рко ак Авар 13 бій бен осгпуз Вех суу 115 120 125 тв: Аїа Бак Чаї Маі Сув пай Бей АбБп о Авп Ре Тух РКО Ага бло віз 130 135 140
Був узі біп Ткр пуз Уві Авр лап Аза ес біб бек Сіу Авлпо оВех іп 145 150 155 ївБО бБіш бак Уві ТвЕ о Сбьй о сСіп о Аво» Бех Був АвроЗех Тах Хук Зех Бей бек 155 170 175
Зах Тк о пем ТТ гей бек Бує Дів Авои Туж бі; Ппув Нів Шуз Уві Тух 182 1655 оо
Аза Сув бій Уві Твх о Нів біп СІу Геп о бех Зех Рко Уві Тк Пув Бех 555 290 205
Ра АвпоАхЯ біу Бій Сув 210
«210» 24 «2115 444 кгї2х ВІДОК «?2і3» Шетучна «их «223» Баріант АЛОЇ1Т важкого панцюга гумавізованого сто кабйО» га сіп чаї біп їжи Уві бід бек біу Аїа бій Уві Маі Був Рхо біу Аїв 1 в 19 І5 вк чаі Шу Її бек Сув Пув Аіа бек сіу Тухє Тих рРре Тік Авро Аха 20 25 за
Тие ті Нів ТкЕр Уві Ате Сів Аза рко сіє Сів Сіу Бей сії Тер о їїє зе 40 ав сіу Ту її Тух Вко біу Авр о сіу Шбех Тк Був о Тук бас ій пув Ре 5О ве ви
Сів біу йжо Аза тТвжЖ ред Тох АТа АвротТпх Бех Аза бек Твк АтТа Тук 7а т5 о мес піз цен баг Бек о йво; аку бек Сіц Аво Твх Аза Уві Туж Тух Сув ве 5. ЗБ
А1з Аку вка біу тах Має Авр о Тук Тер бСіу біб піу Тпжх о Зех Уаї тве 100 305 110 чаї бої чек іа бек Тк Був біу Ркз Зехк чаї Ре рРко Тем Аза рко 115 120 125
Яек Як Пуз Зах ТБ век біу с1іу Тс Аїа Аза ей біу Сув Бех уві 130 1358 80.
Гуз АБр тує Ре Рхо бім Рко Уві Те Уаї Бех Тер Азп бек С1іу Аїх 145. ї5О0 155 1650 їв Тк Зак сіу Уаї Нів Твг РБє рРго Аза Маї Тей б1іп бек Век 01у їв 170 175 їви Тух Зек цей Бех бек Узі чаї тре Узі Рхго бБег оЗех бек епі б1У 180 385 190
Тех бів ТВ о ТУжЖ їїв Сує Ав Маї Аза Ні Муз Рко бек Авай Жбжх БУВ 195 200 "аб
Уві Дар їув Аку Уві бій ко був бек Суя Дар ув Тьх Нів ТБ оСув їй ті 229
РБко рго Сув бго Діаз Рго бій Пе бе біу йіу Бко Бек Уаї Рре Теч 236 235 240
Бра Уго Рко цуз хо ув дяр ТМ Цей Мес ті БаксАку ТВ Рго бій 245 250 258 уві їй бу Уаї Уві Уаї Авр Уві Зах Нів біо Авр о Рко бів Уві Буя 250 265 270 тва Ап Тхр Тух Уві Авросіу Чаї біз Уві Нів Ап дів Мув ТБкК обув 275 го 785
Рко вка Бім біз бів Тук Авп бек ТЕ Тує Ак уві Уві Бех баз без 259 ?95 00
Твх Уаії Без Нів Сіп Авзв Тжхр пез АвпобСіу Був біо Тук Був Сув цув 395 З1о ЗІ5 зо
Чаї Бек Аза Тув Аїв Геїз о Ртго Аза Рко І18в Сіш Був Тк Їїе бек ув зв зо Зз5
Аїа ув Біу Сів Рко Ака сій рго бій Уві Тук ТАЖ Бевз хе Вжхо Зах зай з45 чо
Ат біз сіз Меє Твх був Авп сій УЧаї Беж їей тв Сув їй Уві Був за зо зе бьУ Бе Тук Рто Бех Анр Ії Аїа Чаї 5зіз Тжр біб Зех Азвоб5іУ бів 370 75 зво рРхо сіб Аво о Ав Тук був ТВе ТЬБх о Бго Бо Уві Пе АДвр Бех Авр С1Уу 385 880 395 40о ех Ре Ріш Іюпі Тук беж Був Ге: Тк Уаї Авроїув Бек аку Тюр ОТП 05 510 215 бів с1у йеп Уві рве бек Сув Бек Уаіїі Мебє нія Сію А1ї8 Те Нав Авк 420 425 20
Нів Тук ТвК біп цуз Беж Ппеч бек Без Бех рко су 435 ах «2ї0» 5 «її» 444 «ті?» БІЛОК «13» Чтучна «220»
«2232 Варіант р5БЕ, Д10ЇТ важкого ланцюга гуманізованомо С10-2 «400» 25
Сіп Уаї біл цез ах бів беж Сіу Аза бій Уві Уаї Ппуя Ро бію Дій ї В 10 ії
Бек Уві Пух їі бех Сув Буз Аза Вех біу ТУК ТЕ РНе Тк Авр.Аку
Зо твВЕ І1е Нів Ткр Уві Ако бІп Аза рРкб сі сів Біу Без 615 ТкЕр її сіу Тух Ше Тух о Ркео С1у Біб: б1у век Теж цує Тух бах сій був Ррае 5О ве КО бій біу Ака Діаз ТвжЖ їва Твг Аза АвроТНК Бах Аїз бес Тпх Азїа Тук 795 Тт5 во
Меб бій їй бек беж Гей Акад баг О1їй дар о Твг А1а Уаї Тух Тук Сув 85 90 98
А1з вка Ака біу Твх Меї Азр Тук ТЕр віт бів сту Тбж о Зетг Чаї Те 300 105 110 чаї Вах Бех дід бек ТВЕ Ббуз сіу рЕО бек Уаїі ББе рРго Пец Аза Бо 115 120 125
Бех Яех уз баг Тв бек сіу біу Твх Аза Аїз тей б1у Сув дей Уаї
І30 135 140 мує АзротТук Рае орг Сіш Бхо Уві ТЬк Уві бек Ткр о Авп Бек сіу Аза 145 150 ї155 169
Бей ТО Бех біу Уаї Нів Тих не реа Ат Уваї пев бів Бех Вех сі ї85 і79 ї75 їси Тух бек поз бек баг уві Уві Так Уаії Рко Яех Бек бак їеч сію 180 85 180
Твпт бів ТБу Тух Іїз Суз Дяп ув) Азпобів ШПув Рхо Бек Авап Те Був вет ой 205
Уа! Кар ів зга уаї Сію Рко цув Жах Сув Авр Був ТБк Нія Тк Суя 250 215 220
Рко Рекс Суя Рхо Аїа рхо бій Гей їєса сіу су рко Бех Чаї ре без 285 239 235 240
Бпе рко Рсо Був РКО Був Авр о Тк о їеа Меб ї1іє беж Ажа ЇВвх Рко сій ха 250 255 чаї ТнжЖ Сув Уві Маї Маї Ар Маі бек Ніз біз Авр Рко Ста Уві Був 250 265 270 ре Авп оТтр Тух Маї Авробіу Уві піз Уві Нів Авп Аза Був ТЕ Був з75 2на 285
Вхо дка біта бій біп Тух Абп Бех Тах Тух Ажя Уві Мах бек Чаї їв 250 295 300 тв Уві їввиц Нав бів вро Тхр о бей дв сіУу Туз біз Тут Гув Сув Пув 305 іс з15 з2п таї Бех дай Був вїа пах РЕо Аіа Рхо І12 біб Пуя ТБЕ Іїє« Бек Гуз 325 330 335
Аіз ув сіу бів Рго Ага біз Бко біз уві Ту Тк Шцва Бко рео бек зай 345 зако вка біо біз Меб Тах був Авпобівб Уві Яежт їм ТЕ Сув Без Ууаі пуд 355 з6о ЗЕ бСіу Рпа Тук Рго бек Авр Її Азїа Уа)» бій Тер о бів бек Авпобіу бів 370 375 380
Бго бо Азо АвпоТух був Тож оТвг о Бка Бко Ма) їй Авр бек Авр Сіу звк 390 95 або
Бек Ре Ріє цей Тут ВЗек Гуз Ппвз Твж о таї Авр був век ака Ткро ів 405 410 415
Сів Сіу Аа Маї Ре беж Сув Бек уаї Меб Нів бі Аїяа їєв Ні Авй. 1425 430
Нів Тує ТькЕ Сі» Буз Чех цей Яех Пвма Зак Рхо Бі аз5 440 «210» 25 г1іК» в44 «ві2» БІЛОК кіз» Штучна ких «293» Варіант ОББО, Д101Т важкого ланцюга гуманівованого С10-2 «00х 26 бів Ууах піп їви уві бів бех біу Аїв сій Уаї Уві ру ржхо С1у Аза ї є! 10 15
Жек Уві уз Ії Язтг Сув пув Аїа 86 сію Тук тик Рає Так Авр. Акд
Зо
Трж Ізе Нів Ткр Уві Ах бій: Аіа Рко біу сій сіу пес бі тгроїї6 51у Тух Іїе Тук Рко біу Сіп Біу бек Так цув Тух Бек бій цув рве
БО БУ во бів бік Аха Аза Тих Тжнз Тнг Аза Дер о Тнх Зек Аїа бек о тТвВк лів ТЕ 68 7о 75 о мак біз Гей беж бек й) Ака бек 010 Аяр Тік Аіа чаї Тук Тух Суя ва За а5
Аїв Вкч Ахч біу Тв МебЄ Анр Тук Тхр бі Сів с1У Тбх Бех Уаї ТржЕ 3500 105 310
Чаї Зехк бак Віз бак Тік був бБіу Рко Бек МЗаї Рре ре Дей Аба Рко 115 125 125
Чех Чех цув бах ТЬх бек біу бСіу ТБ Аїа А1їа госп біу Су Без Уві 130 135 140
Іуз Авр Тук Бре Рго під Рго Уаї Тк Уві Бех Тер Авп век Ту Аів їі45 ї50 155 160 тає Твх ех Сіу Уа» Ніз Тк о рРрБе рРтго іа Уаї Пей Сіп Зех Зек біу 165 178 ї75 їв: Тук бах ей бек бек Маї1 Ма1 Тк Уаї Рхо бех бек Бех Бей С1У 180 та5 190
Тк бу тож Тук Ї1їе Сув дзп Уві АнпоНів уз РЕб Беж Авй ТЕ пу 195 200 205
Уаї Авр ув Вка Уві сії Рко пуб бек Сув Авр бує Трк Нів ТЕ Су 215 220
Рко Рко Суз Ржо Аїа Рко Січ пев Пе) сіу б1у рко бек Уві Бба їв 225 230 235 240
Бра Рко Рко був Рко Пу« АвротТнх Пео Меє її Беж Аку ТВх Бко бій 245 259 258 чаї тТвх о Сув Уаї Уві Уаї Ар уві бек Ніз бі» АвороРко сів Уві пув тво 265 270 тре лап о Ткр о Тух Уві Авзв б1у Маї біз Ма3 Ніьв Ак Аза Ппуз ТВж о Був 278 2806 285
Бто Ак бів бій біп Тук Аво бек Так Тух Ака Уві Уві бек Уві Бей 290 295 300 тах Маї без Нів Сію Ар о Ткроїей Аво обі пу біл Тук Був Сюме ув 305 зо 315 329 їні Зак Ави тує Аїв ей рко Аза Рхо Ії бій Муз ТВк їїе Бех Лув за5 ззо З35 віз був б1іу біп Ро Аху бій Рхео біп Уаї Ту ТВкх ЇТвз Ро Рко Зет 340 зав 1) хо бій бій Меб Тк Пуа Авпобів чаї бек без ТВ Сув Бей ак цує з58 зво За5
Сіу Рре Тух Рко бек дар ІЛе Аза Уві біз Теробійп бек Ав біу біп з7а 378 зно
Рхо ба ваза Авоп о Тук їує ТВс Так оБко Рка Уві Пец Ар бек Авр сі зав 99 395 400
Бах Ве Ра Бей тує Зек Пуз БПез тв Уві Авр о пув Чех Аху Тжр бір 405 410 415
Сі біт Ава Уа) Рне бек Сув Зек Уві Меб Нів бій Аза Бей НІВ оАвп 420 425 аз
Нів Фуж тах Сію уз беж Пед бех їз Бек реко СІ1У 435 440 «віх 27 «її» ай «2122 БІЛОК «7135 Штучна «ап» «2232 Варійквт 05БВ, ДІ0О1Т важкого лавцюга гуманізованоко стІта-в «4005 27 бів уві Сіп Пес Уві бів Вех біу діа сій Уві Маї цув Рко Ф1у діа 1 5 10 15
Бех Уаї цув її бек Сув Пув Аза Бек біу Тут тиж Ре ТЬк Авр Аку 29 25 Зо
Тк їі Нів Ткр уві Ака біп Аїа рРко бСіУ біп біу цей сіла тТкв ІТ за 40 45
Сіу тує т11е Ту Рго Сіу Бек С1іу Яех ТЬк їз Тух бек біб Був ВНе 5О 5Б ва
Сів бі1у Ака Аїа Твх Бей Твк Ада Ар ТО обек Азїа бек Тк Аза Тук 65 то 75 во
Мес сій Це Зек Век їв оАку Бех біз Авр о тТЬх Аза Уві Тук Тух Сує 85 во З5
Аіїа йкз Аху Сіу Тих Меї дар Тук ТЕр лі бій біуУу Тпт Важ Уві ТЕ 160 105 110
Уві бек Бек Аїа ех Тпх Був Сіу Рго Яєк Уві Ріє Рго Пец Аза реко 115 120 125
Бех бек Був ЯЗек ТАК бек біу Сіу Тік Аї8 Аїя реч б1іу Су Тем Уві 130 135 140 їув Авр Тук ВНе Рко бій Ркб Уаі Тк Ма1і Бек Тгр о Авй Вех СІУ Ата 145 150 155 ї5БО їз Тве Бек бі Уаі Нів тат ве Рео Аіз Уаї Мем Біп бек бек С1іУ т65 То 175 їв Тук ет їв; бек бек Уві Маї ТвЕ Уві Ро Бег Бек бех цей СПТУ. 180 185 150
Тнж сій Так Тує ІХе Сув Аза уаї Аап Нів Бує Рко Зак во Тк оГув 18555 200 205
Уві Авр Пузв Акца Уві бі Рко ув бек Сув Авр Туз тв Нія ТВж Сув ій 7515 220
Рко Рхо Су Рко Аіа Рго Сі пес ви піу сіу Рха Бек Уаї Ве тей 225 230 235 Ай
РБе Рко Рко Був рЖо їн АвроТах Гей Меб Із бех Аку Тих ко 15 зах 250 255 чаю тик Сув уві чаї Чаї Авр Уаії Зек Ніз сій Аврорко бід Чаї Був 280 265 270
РБе Аві Ткр Тух УВ1 Авр оїу Уві біс Маї Ні Ав о Аїа уз Тк оБбув 278 280 285
Бко бта бі біб 01 Туж Ав бех Та Тут Аку Уві Уаії бек Уаї пек 2-30 295 за таж Уві їц Ні Сіп Авр тТЕр гео Анпобіу Ппув Зїа Тух ув Су цу
Зо за зіб 320 тУаї беї дво пу діа ей Рко Аїз РжЖОо їі біз пув ЇВ о Ї3Зе Бех пцув 325 30 335
Віва пуя біу бій ро дкд сії Рго бБіп Уві Тук ТБЖ Тез Рхо вго Бех 340 За5 350
Вхч біз біз Меб Твх огпуз дво бСіп Уві Бек Її Твх Суя Лена тУаї дув зи зва зеБ
Сіу Рйє Туг рхо Бет Авр І14 Аїв Уві Бім Тер бій бек Авп біу біп 370 375 зво
Бо бі Авп о АзпоТук Пуя Твх Таж Рго Бро Уа3ї Їжні Авр Бех Ллар пІ1У
ЗБ зо зв 400
Чек Рре Бе Бем Тут Бест Цув Гей Тнк уві Авр о Муз Зех Акад ТюЕр бій 405 40 4ї5 стіп біу Ав Уві Ре бек Сув бек чаї Ме Нів Сіц Аїа рез Нів Ай 420 425 430
Нів тТук Трж бій Був бек Бей Вех Без Бак Рго с1У 435 440 «2105 28 «віїМ 16 «їі ВІДОК «713» Штухна «й2й0х «223» Ввріант ОБЗБЕ СВО важкого ланцюга гуманізованого С10-2 «ОО» в тук Іїе Тух ра б1іу бу; біу Бек Тих Цуз Тух Вех біп ув Ре бів 1 5 10 15 с1іу Аха «Щтійх 259 «вії» 18 «від» БШЮК к213» Штучна «вай» «223» Варівнт 05БО СОВА? важкого ланцюга гуманівованого піа-2 «ай» 29
Тук Ті Тук Рго 01у Суб б1у бак Твх Був Тух бах бій Тув ре бій 1 їх 10 ї5 сіу ку «вій» 30 «2115 18 «їж БІЛОК «2132 Штучна ко» «23» Варіант П5Б5В СОКО важкого планнюга гуманібЗованого С910-2 «400» 30 тує 116 Тух Рко біу Бех біу Бех Ту був Тує чех бів Пув о вве бід ї 2 10 15
ЗіУ АкЧ «210» 31 ії» 11 «212» БІЛОК «213ж Штучна «220» «223У Варіант М3З28 СОВІ легкого лавцюма гуманізованого СЬО-2 «по» зі біз й1а вах біп АвротТвЕ ех ті беж йеча Ава 1 В 0 «і00х 32 «1Р» 31
«2гі2х БІЛОК «213У Штучна иййх «2235 Варіант МЗ2О СОД1 легкого ланцюра гуманівованого Сі0-2 «ай» 357
Сів іа Чек Сіп Авр ТБж Вес ч11е б)ів їєв бів ії 5 10 «2102» 33 «хїї2 11 «2122 БІЛОК «213» Штучна «ах «23» Варіант М3З4а8 СБКЕ3 легкого ланцюга гуманізованого С10-2 «400» з бій Аіа Бек бій АвротТах бек тів Авп оїмях Зах 1 5 1о «105 За «2і1їМ 11 «21» БІЛОК «13» Штучна «22йх «223» Барівне М3ЗАО СОВі легкого ланцюга гсуманізованого стло-2 «ОО 34 піп дів бек бів Авр отв Зех Іїе Ази Пеп о бій ї із) 19 «210 35 «в1ї» 31 «12» БІЛОК:
«213» Штучна
«923» Варіант М325, М3ЗАВ СБВі легкого давцюга гуманізованого С10-2 «400» зБ іп Аїа Зежх бів Авроївж Бех І1є бек теза Ваг 1 5 10 «іх 36 ії» 11 «212» БІЛОК «213» Штучна «Вгйх «їз» Варіант НЗ20, МЗ4Я СОВІ1 легкого ланцюга гуманізованого Сі0-2 «4О0з 36 бій А1їа бек бів» дер ТВж Век ї16 бів Пе: Бех 1 5 10 «ві 33 «211» 1 «2122 БІЛОК «213» Швучна «ох «293» Варівнт М320О, МЗЯО СОВі пегкого ланцюга Гуманізованого С1055 «4одз (37 бів вів бек Сіп Авр Таж бек Ше сів Пен бій 3 5 10 «аібж 8 «2її»м 11 «2122: БІЛОК «2135 Штучна
«гео х 223» Варіант М328В, МЗ4АО СБВі легкого ланцюга гуманізованого С10-2 «00» з8 біп Аїа бех сів Авр Тв о Вех Ії Бек Ппей сів
Кк 5 о «210» 39 «21ї» в «212» БІЛОК «213» Жтучна «2202 «232 Варіант А103Т СОВЗ3 важкого плавцицюга гунанізованогко СЬ0-2 «00» 39 дха сСіу Тс Меї Авв Тух
Ж 5 «гій» 40 «ії» б «іс» БІЛОК «7135 Штучна «ий «ваз» їМсСт сьо. по сві «Ох 0 сів Авр Товт беж їїв Авип 1 Б «фі0з 4 «ії» 3 «712» БІЛОК «УІї35 Штучна
«й хра3х їМмет сій? пс осо «ФО» 41 сіу Аїа Бег 1 «10» 45 «8112 5 «12» БІЛОК «2ї3» Штучна «2ойх «виз ІМТ С10.2 З СОКУ «аа» аг
Ів) біп Ніз ТЕ Тук Гей Вжо пе ТЕ ї 5 «Рій» 43 «вії В «212» ВІЛОК «2ї3У» Штучна. «га «га» їтМостТ сі я Но срві «ОО» 43 піу Тук Твж Рпе Трх Авр Ак ТЕ ії 5 «810» 44 «21ї» В «212 БІЛОК «213х Штучна «вах
«ч«ваЗ»- ІМЄСТ сіб. 2 но сСОоВо каоох аз її тТуж ро Січ Авр Біу бег оте 1 в «вій» 45 «чиії» В «иа БІЛОК. чиї» Штучна «20» ««жа3» їІМСтТ СЬО. а НО сові «оо» 45
Аіа йка Аха біу Аїа Меї Авр Тук ї 5 «210» 4 «і1» Б «21925 БІЛОК «213» йтучна «220» «223» їїмсет м3З28/ м3з»Б,віОттТ т соку «ОО» 46 сій Авор ТЬЕ ВЗет тів Бек ї 5 «3103: 47 «її» З «гі2У БІДОК «гі» Штучна: «свт «253» ІМСТ МмЗов/МмЗз25,АіО1т пс Срна
«ОО» 47 іу Вів бах ї «Ві» 48 «11 9 «212» БІК «213» Штучна «220 «23» Мет Мзов/кЗ28,АІОїт во ср «ох «ав їв бій Нія ТвгоТїук ем Ркго Рає Те 1 5 «2105 495 «711ж В «212» ВІЛОК «7132 Штучиав «20» «га» їТМст дібі1т/М325,АТОЇтТ но ср «0» 49 с1у Тук Тк рБе ТБх Авро дк ТЕ ї 5 «2102 50 «її» 8 «212» БІЛОК «гї35 Штучна «220» «223 їЇМсСТ АТО1т,/чЗа5,АіОЬІ не срКа
«005 50 їі Тук Рко с01іу Азвр біу век ТВх 1 5 «кій» Бі жке1ї» 8 «12» БІЛОК «213» ШФучна «ва «923» ІМТ діб1тТ/М3З2в,віОїт Не СВІ «а» БУ
Аїз Ага Ако Сі Тк Ме Авр Тук 1 8 «їй» 52 жшеїї» 7 «і?» БІЛОЮ «13» ШемУчна «20» «223» срві нс С10.2/ 9325 вгідно з Спобів «00» 2 сіу Тук ТвкЕ Ре Твх Авр Ах ї в «їі» 53 «311» 6 «в12» БІЛОК «213» Штучна «20» «223» СО? НС С10.9/М325 згідно з Свпобіа «400м 53 тТук вхо біу Авр о біу Вехг 1 5 «ВО» БА «Ії» 6 «212 БІЛОК. «2135 Штучна жкг289» «З» срвЗ НО сі0,5/М388 згідна а Своєха. кап» Ба
Ака біу із Меб Авр о Тує
Її В «105 55 «Ії» 7 «ві» БІЛОК «2135 Штучна «220» «2235 сові нс діої17/ч325,А103Т згідно з Спобій «ап» Б
Сіу Тук тВпх Ре Тк ЯвзроАку 1 5 «210» б «1ї7. 6 «ій» БІЛОК «213» Штучна: «220» «2235 СрЕ? НС ОАТОЇТ/8328,А101Т згідно з Сповіа «00» 56
Тухк Рхо сі Авр обі бек і 5 «7105 57 «21125 6 «2125 БІЛОК «7135 Штучна «га «223» соВЗ НС А101Т/М328, вІ0ІтТ врідно з Спобія «роз 857
Вкч іу тих Меб Авр Тут
ХЕ 5

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Моноклональне антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮ МО: 1), що містить: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 11, або (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 24.
2. Моноклональне антитіло за п. 1, що містить: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11.
3. Моноклональне антитіло за п. 1, що містить: (а) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 16; і (р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 24.
4. Моноклональне антитіло за будь-яким з пп. 1-3 для застосування в лікуванні таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АСВ), психозу, зокрема психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з А, апатії, обумовленої АР, або апатії у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострої або хронічної форми), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Зо Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу.
5. Моноклональне антитіло за будь-яким з пп. 1-4 для застосування в лікуванні хвороби Альцгеймера.
я Ку Он ВО в 'сво х ; х ; в. я ІН МО сих р кв у Б с шк Ух КК МА ї й то жи У зд е чи мВ нт В Б Шо шк ве КОМА ек ЗД ВИБАТ І Ко Бе З бо
Е. ро оннннннннннетннннонстоннневннннонннно дн сн що і т о їв М антитіва
Фіг. ж ; ОО НСЗЧя ПОЗУ НАМ га З як 5 Ж Ах й У ех чі в яа не За ян НМ пептид За Янг сяк сову вчу к мя вх.
Знов ТК ЕК емо А я ге кенора А ОЗ Донова ДО в ООБЯ З о ВК ооо кУМКх. поча КК сек ЕЕ КК дея ше ха з ка КК Ва З ША а КЗ жа МОН 0 ЖК НК КАХ Ко ч х о х о ООН и ння А ОК М НК вв с КУ ОМ Б ОО ОО ОКО КЗ о 5 ОККО ПОВ ККУ ОН в ук НК В я МО МН ОО Я ВЕ В У КО М В В КК Я їз ИПИХНИ ИН ДИ НК ПИ Ж Я КОКО в Х ОО ОО ОО ОО Я по М 5 ОБО ЗО в й КОЖ, ОО Ка: ПОВ ОО ОККО Я р в и А М ПЕН КН НН ШК ОООКОЯ ОО ЕКО СО о о о ох ОА М І М ПН Ки НК пн КАК ВА Я що с ши ша НН ВН ОН ОО Я ОН: в КО к ОО ОК о М ЕК п КО ПО я я ОО Ов Зо КО СЯ ОККО Е о А М І вида НН КК КК КК 0 ЕК Пе КН В ЕВ ЕОМ КЕ ВЕ ОСИ я м МО СИНИ ях ОО Я САКЕ На Я ОО Є УВО ОХ ОКО Я ке ОО МО КОКО ЕН ОХ ОК в ОО ОО ЕС ОВ ПО НН ХО ОО Я ДК ПН КЕН ОК НН ПЕНІ ШУМИ МО ПИПННННИ КН ХО КВК ЕК Я ПЕК ТУ ОК ПН В ОО ЕН Я ДИМ СЕ х о ПММ КНИКИ НИКИ ПІКИ НИВКИ, ВО КИ ШЕ КОН КК ОеОКН В КК - м гм в по о в 3 ОО ОО Я ОО ОО КО В М я ОЕМ КК в НЕ НЕ В ОО В В ВО НК я М В В НК В я МАО КАК нн НЕ ОВ В в и Кия НОВ в ХА НН Нв НЕ нн АН ВК Х ПКЕЕ де ОО В ВОК ВОК с ОО а - КЕ ОО В ши М в ОО Я ке ТОК ОО ОО о и о в Дон АВ хе ОБ. є - Бак АД о о ОА оон КЕКВ У це МЕ і од о ОО х з - СЯ вант е ем денее пек кужок мк нев Ух км БУК МЕ МН В А окон сф о дух доод ж ми кі 7 МХ чх - таж век Е ща Ме Ка ВЕ о А В В пектин опіки пеки Ки пн нн ШКО МНН Ко З А ЗО ПН НК НИВИ Пе В ОН В С В п В КЕ Ж є ОВО ОКОМ КО я ше МАК в ОО С Ви КН НН В ну о ин « Он ня КК о МАХ ШИНИ ПИ ПІДП НК ШОЕ НН у ОО ПЕ ОВ ов З а Я Б По оо ХО ЕК Кая ПЕОМ п Пн ЕЕ КУ КОП КК З ОН НН НК ОН Ж ЕНН КК ПМПК ОК ПМЖ М Я ОК ВЕК СЕНИК ПН ДИНИ ПИШИ ня ДЕК КК ге ко В В о В ВВ ПЕН Нв НЕ ЖОДЕН ВНП в Ж ПЕК КИ КК КЕ Пи КИ, мк в в вв вв в в в о ва ОЛЕНИ Ие, ПОВ ВОоее ОКО вн ш о план вх - Ж КО Ж КОН в вн НН я - й твавів Хе ПЕКИ В ТИЧ КІ м КА ще ЕХ Ж ШИН ОК ПК Ж ДК о т ЯКОЮ гевзками вів бю ЕГО ож ПЕКИ ШКО ПК ВИШІ я Кк я ах ПА в я ж ен НН М ННЯ со віках диожк. ско жажкою пехождою с ПО вису ок в в о ОН ВО ННЯ певен МВВ ВВ КМ КН КК КК ИКХ ПМВИК КЕН о НЕ М М ММ пидиті ПоТИТТИ НИК ПК и но КИ г ОНЕУ БУХ ОО ХО ЩО е ЩІ ниви НК І но ни Я я ОО ХЕ Т Ба й й с ОО ко щу ВЕК НК ВАК ПОКНЕ ря ни М КУ пе В пишно З вн НО в о як у Я ДИИШИ т Е ЛИПИ НПК, Е В ПЕК, З НМ М МЕТ ИЕИ 0 И ОДДИПЕИО ИОИЕ ППЕВКИИКИ ОХ ОО ЗО ох НН о В КОКО 3. З о: З ОЖИНИ ПОВ среє КАК щ ще ПОМ В Я МОХ З МД ПИШЕ, т ДК Ж ев ОО о КО МИТИ тя ЕОМ ПВЕК ИН ВИ СО ПЕК С х п ОХ о БО В по ОЩЕ ПОПИТИ МИШКИ ДИМИИИИИ ПИ ШТИИ
ДОБ о В ВО ЗОВ В В В М м п п ПО Би 5 5 М М ВОНО шина ма а а нн нн п п ОВ ода в во ан я в КЕ ПИЛИП ППП ПИВ ППП ОО ТИПОМ ПО М а ІІ чт о и и В КН рн ЗВ в В Дн С і в в ОО М в С и ДЕ В
В В В ПИ КИ ИМЕНИ ООП ЦИК КО Ко НН НН КОН НН ОО М УК ин пн нини ЗНИК КН ОК нн ОК В Кк, п пп понос ПШКПТИЕИИИИПИОКИ ИНИИ ИКК КПИИИИИИИИИИИИИИИИИПИИИТИПКОККОИКИКИИШПИИИИНИОО КОВО ЗИ ЗНИК В в КН пен и М и ЗОН С Он НВ ЗНО Ов Он ння Бе І ІІ ПО В В В В В Я КО ВЕ М М КОВО ОКО КЕКВ ЕЕ У о КК и я МІ ОО Я ку в ТП шГс М ОО І ОНКО ВВЕ ОВЕС с ОККО ВОВК М В о КАМ Ж и М ПИ п СИП ИИИИИИИИИМИИх СоКК ТК КК КИ ЕИИИИИИОПИИИИИИИОО Б БІО
НН и и и В ОО В я с М М М Км М М ПК КО о М і КВ ПОКК У: ОТ нини ВИК Ко НИ вн нн вн нн ПК ПИШИ ПК ММК е Я ПИШИ ВО а НН и Кос ПЕК ВК у ОК одн прое нові ПЕ ВВ ПППЛИЙИНИИИ ПИТИ ВН ЗВО НОв вовни ооо вроди о во у т Знов ЗХ ПІНИ ЖИ КИ У ЗОВ нн Во ОН ЕЕ ППП ПИЛИ ИН МЕДКИОНКЕ Дня БЕН НН АВ БВ в вн ово он в о КОЛИ НИКИ ППП ПКЕЕ О ПИЛИП КПП КОЛИ ОПП ПИ ПИПИИПИПИПИПИКИПИПКПИИИДОПИППИПИПИПИККДККИИПЛ ДПП ОПИПИДИИИИ КОП ПИЛИП ППКП Ку ОО МОЯ ПИШПИПИПИЛ ПИЛИП ООН В ЗК я ОК оо в о о о в В о оо ов Зеров в око ХОо оо око но ооо ох, ОО о рено оо нн МОНО ОО НК и Вин ЗОН Ви ИН НО но и и ОО В ВО ВІНОК ВВХ ЗО о о В В С З ОН Б ОВОВЛЄОЛОЄСББ НО М КОВО Б Б ОХ "ПОВНО о ооо оо но МОП ооо ОВ о В о он ох КОЛИЛИПИПИ МИШКИ ООП ТТИПИКДИТИИПМ Т ОПП КИППППКВКОК "ОВ в нн ДОВНННи ОО ОН А КОХ МКК ВННННн нив во в с В в В в В В ВХ в ПКП ик я ВЕН Ко МО Нв КЛИНІВ ЕКО И ИН ОІИППИОЕИИИКИПИИКИЕПИОЕИИИ ПИ ОЕЕИИИИИИИОК ОВО о я ЗОН В ВО ро ХК по КК ЗОНИ К О ВО но о о о о оон ОО МО КЕ КК Ко ОО ЗВО ОХ НН КО НИ ОН ВН НН днк и ЕН В КВ п ЕЕ КЕ ках КН в ОМ В в В п в а ЕН А Ов в в в В в В В В В В КН ЗИ В в в и В В В В ОВ в В
.ОАфММУ ее дня в вв я ТЕКУ КОН ЗК ПОВ З нн МТМ км ЕВ УК ВХ АК НИМИ ИН ИИй о о о о ні о М о. ОККО У В нн ВЕН ОКО ЕВЕНО У К ПК
Фіг. в мата я ен хни 0 В ва ННН ме оно НЕ ВЕНЕ НМЕ па Й ВН и шк р ПН КН ЗНИНННН в в ОН З в а а а а А ОО В НО ІОН в КВ ОО НН в рМмув виосссвссв:;няячо;я3вТявикКксвСисввфввьх Кн вн ОККО ПЕКИ п ДН оо в НН ни МНН В МОН в ово ЕН ЗОНИ вв в НДО ДОН р НН в В о нн Є ПД КК НК ПЕНІ В ПИШИ ПИТИ ПИШИ КІН ОН ВІН ОО о Он МЕН в В ВКОИНН во М Он З вн Зоо Но НВ ЗК В В ЗБИВ ОХ. ОВО В В о в В В В В В В В ПО В В В о ВО ОКО о я ВЕН в В В. пок ВН нн ОН ни ЗНКННовН Н ЗО кв Кв во М КЕ ОО" ОО СК о ооо ОВО В В КВ ВВ ПОВ КВ вк В НН ДВ и ВВ нн ЗОН о ни ООН ППО ПП ВКМ КИШКИ ПИ ПИЛИП ПИЛИП ПК Ми о и оо ше о СО Нв о о В дн ВВ ВВ о в ви оц кв в о ск о ОК о ов во ув в В ЕН М В ПАК ПШПИПИЙИ ПОПИТИ и М НА ОО В в ЗНО в ЗК ПОВ В и ВО в о КК ФО нн нн ВОНО о. ДОМ ХО ФОМИ. В В о ДОК нн ХО ЩЕ МЕН ОН ВЕ ПІШКИ ДВК о зви ков ін в ов ов Косово вно ХНН ЕНВи вв кв ок Кв Кв Кв кв Кк КН рум: Бо Б Б (в ОО и ЗВ В З В В ВДННН нин ЗМК Н Н А і и І нн ОО ЗВ У Я м свв (с: я ПЕН У КК В В В В В В В В Є ЗО В В Б Б В Б В В В В В В В ОО и Твого 'в'ввовс'оТттстоооооот в В КК ЗВО КВ Ку о КК КИ КОКО Я ОК ОН НОМ ПИТНІ онук Кі ВЕК ОО м А М МВ
Фіг. 6 я ОО М ОО М ОВ п п Б Нв В п п в Б я о нс с я г ПО В ОВ В ОХ Со ЕН Я кН г СЯ до загального таучнУна СТ до загально тау-бінка я а тт
Фіг. 7 візшІнні З ять ва ю що не й ше у ше ВВ. КК Кк кю оком» Я ОО Я сей по п с ПО ОО В ОО я г г с ої сг с; ПО ОО я 1; с п п с п 23 п - Ба НН а ОО І М о СО и щи 03 я вч 0 (БФ ИНА пи п ПВ м я с. в ОО МО 5 НО ; г її -
Б. с я. її іван
Фіг. ВА шо ша в: о фін НЕ ОО й не С» ї зання СОЯ М3ае
Фіг. ЗВ відмінні них від 'ю яо що ши ше па ши ше ша ши о г ЕМ ОКО Я ПЕН КК о у с є в не є пи В дол я вес Ту ння є о ОХ КЖАКСИКК ООН З і екоми во ов АТ
Фіг. С шк ин НН шо Я, т, ч с Я. щі т меми хау вка ва
Фіг. З й . Агрегація тау«Мнка фракціонування з шк іаналіз за лев! використанням 01. ! ша пн снннннннсннннння іо па г т Е Ши : ЩЕ. ї З | жк Я Гі ! ! одккннк, хх | а 2 7 | ! ус тк ШЕ ши ші Що ше НИМ ї е сере» к3 5. ше жк Мі : 2 ше о-е й ша | | Б Щ ка шк нн пи М ПН Ми МИ ЗКННИ М ВХ ння в яки пе Зк ВИК ще т з А зу що се ща й ще КК й Киї Кк І ще «У ле сх г хе є сш З С я ї-- ще же -о ще ке
Фіг. 10А й ше и ШЕ ЩЕ г чию ших ше ще о ще чо і І вх й | | | ш г" Ж г «ее г а и - г с баг Ка й Я ЕЙ У
Фіг. ЛОВ
Є кож М коже Щокозово ніш 190 реншк ШЕИ шИШЕиш ш з и шк ше и ЩА ЩА Й З « «а ск ко в е ЕД У «ж «Фо «т ве о ях ЗеН «і
Фіг. 10С Загальний тву-біпок, ще виопаветься пня імунеовиснаження З ще очне ни В я ШЕ ня дня ї ; її щі Ше ник коп вої ж : ї її Бон щи дз» . БО - ж ке мкг зититіне ж Інуновиснаження за дпепомомно 8 Я ідуновиснанення за допомогою СІВ? Фіг і й БЖ 5 дах б я З щОок з тя ши чу ОО дах ї-. ЕЕ їь о й ; 5 Же с як ШИ у, в КИ е й ю мкг антита й ішуновиснаження за допомоегне ЗЛО З імуновиснаження за довемеменю СЕЗ
Фіг. 12 у й но ї" нні За ж ЗО і Я З З КЕ; х Що своя ом їе щі я ши, ; Ше чу пріо х Шо ЖОВ і х яко ОО оз Я в. | дрон мкг антена а імузновиснаження за допомогою 210.3 Я інуневиснаження за допеменно ВО фіг. З Фо» З Мне ть, Бо ша ї 5 т а ак ЕЕ БВ ВОЮ чна я кеВ ; як кеш з зах «й 51 404 ь аа ЗВ ; шо ак. ДИ В т ; ж Мх Щк- Е Кз Кк Фе Бач ка мкг антитіпа а імуневненаження за допомогою 2103 Я муковиснаження за допомог СЗЗ
Фіг. 14 ще г.
СТ. й - | дин ниж нн ше Не НЕ: СІ се ВМ ша ТЯ ше г ше вс ох БЕщ г с По овнох с гу ШИ с з
Фіг. 15
СО ЖЕ ж ЩЕ лу чі ч тво : ух Я тя с) мкг антитіва ж СОУ по вС1о-2, МІ з ВСУ ме СЕ зе У МБО є ВСЬО МО СЕ а ВС АЛ1ОТ КО ш в АТ Ж фіг. 16
Патологія кпубків у Патологія клубів у інсипатезальному гіпскамні хонтвалатераньному гіпокамя й С
В. 52 І шш У ШІ ік З |: КН Ще г і КЗ В і Б о Е .
Зх». о Б сь че ЕЕ 0 с що ЕЕ СЕК ММ ж в ьшщІ . . т 5 Кт фе ВО БО С нео ве Е: Е і й й шрРшиших ї і й її її ЕЕ | І -- КУ кс Беж Е0 В КО ПИ ОХ ха В ї У о. о. ЩЕ пані нн о нні Ен що "и. МЕ всю Вале3 еще ЩШ вО3 НЛОЗ тео Е І ! - й ВЕ ян В БЕ зо о й Ж в - ; - - ЖЕ : я " гу ЩІ ЕЕ ве ; : да в Е я че те ак те з н рі чо щ ще за , Куї г ост з» й С ВМО вс З вена ВШ ВЕНМ Ва на
Фіг. 17
«о Нзасьодії антитіла і антигену
З. 4 тд св ш 'х ре чо : г Гідрефовбна кишеня "в ши і ле МАХ "ре ці Теваваов во ди и и 4, І оч ; фен - К: ОХ МОХ . ї й ; | я ! -- с те М совка Мо щи сов на КК усу совні Я
Фіг. 18
Агрегація тау-білка (анавіз за СіББої Есе ЗШ чі5е Ж. З зі ВЕ : а яхж яке ще : зах Шон зви Ще Е; щі | Ж носіння й н-к З Ті | ще: КЕ ж шк І орнаммааінюьу : я ! нія : ! ще щі СЕ щ ще щ ше ЩЕ . як ШЕ щі ! | . я Ме ЩІ ши шше шк Я зі щ щ | | щ г щ щ | | Щщ я щі щ ; ЩЕ ще
4. ще ! . | . Й щ щ | ! ще А я я У « Ки гай Ж х я як де - Я Ка
Фіг. 19 Вадрійнт 0 едеммідуванняна й пептид Д.С:Т2 (28 днів ИН ИН лк ЕН А КИ Я ПОЕМ. п НН КН МИ ма 0 Мао | й І Аа АТ М. ШЕ ж І гол нин ИН
Фіг. 20
UAA201812547A 2016-07-12 2017-07-07 Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування UA124104C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201600416 2016-07-12
DKPA201700008 2017-01-04
DKPA201700005 2017-01-04
DKPA201700179 2017-03-14
PCT/EP2017/067067 WO2018011073A1 (en) 2016-07-12 2017-07-07 Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124104C2 true UA124104C2 (uk) 2021-07-21

Family

ID=60941665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201812547A UA124104C2 (uk) 2016-07-12 2017-07-07 Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування

Country Status (40)

Country Link
US (5) US10472415B2 (uk)
EP (2) EP3878864A1 (uk)
JP (2) JP7029415B2 (uk)
KR (1) KR102551971B1 (uk)
CN (2) CN116041504A (uk)
AU (2) AU2017295608B2 (uk)
BR (1) BR112018004916A2 (uk)
CA (1) CA3027561A1 (uk)
CL (1) CL2019000082A1 (uk)
CO (1) CO2018014325A2 (uk)
CY (1) CY1123995T1 (uk)
DK (1) DK3484916T3 (uk)
DO (1) DOP2018000281A (uk)
EC (1) ECSP19005417A (uk)
ES (1) ES2862427T3 (uk)
GE (1) GEP20217222B (uk)
HR (1) HRP20210522T1 (uk)
HU (1) HUE053679T2 (uk)
IL (1) IL263530B2 (uk)
JO (1) JOP20180117B1 (uk)
LT (1) LT3484916T (uk)
MA (2) MA45655B1 (uk)
MX (1) MX2019000476A (uk)
MY (1) MY197836A (uk)
NI (1) NI201900003A (uk)
NZ (1) NZ748983A (uk)
PE (1) PE20190227A1 (uk)
PH (1) PH12018502613A1 (uk)
PL (1) PL3484916T3 (uk)
PT (1) PT3484916T (uk)
RS (1) RS61646B1 (uk)
RU (1) RU2760875C1 (uk)
SG (1) SG11201811015RA (uk)
SI (1) SI3484916T1 (uk)
SV (1) SV2019005807A (uk)
TN (1) TN2018000419A1 (uk)
TW (1) TWI747922B (uk)
UA (1) UA124104C2 (uk)
WO (1) WO2018011073A1 (uk)
ZA (1) ZA201808329B (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2767532B1 (en) 2012-12-21 2016-07-13 National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology Novel compound for imaging tau protein accumulated in the brain
CN107849124B (zh) 2015-06-05 2021-09-24 基因泰克公司 抗tau抗体及使用方法
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
SG11201811015RA (en) 2016-07-12 2019-01-30 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
CN117820467A (zh) 2016-12-07 2024-04-05 基因泰克公司 抗tau抗体和使用方法
CA3044679A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
EP3565836A1 (en) * 2017-01-04 2019-11-13 H. Lundbeck A/S Antibodies specific for hyperphosphorylated tau for the treatment of ocular diseases
WO2018152359A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
KR20200058480A (ko) 2017-10-16 2020-05-27 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-타우 항체 및 그의 용도
CA3089923A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
EP3774888A4 (en) * 2018-03-05 2021-12-29 Janssen Pharmaceutica NV Anti-phf-tau antibodies and uses thereof
WO2020123492A1 (en) * 2018-12-10 2020-06-18 New York University Monoclonal antibodies targeting c-terminal region of phosphorylated tau
US20220187322A1 (en) 2019-03-28 2022-06-16 H. Lundbeck A/S Use of a ps396 assay to diagnose tauophaties
WO2021024209A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Inc. Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
KR20220100921A (ko) 2019-11-13 2022-07-18 아프리노이아 테라퓨틱스 리미티드 타우 단백질 응집체를 분해하기 위한 화합물 및 이의 용도
CA3227440A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Stand Therapeutics Co., Ltd. Peptide tag and nucleic acid encoding same

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1991001754A1 (en) 1989-08-09 1991-02-21 Rhodes Buck A Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ATE386115T1 (de) 1991-12-06 2008-03-15 Max Planck Gesellschaft Verwendung von proteinkinasen zur diagnose und behandlung der alzheimer krankheit
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DK1150918T3 (da) 1999-02-03 2004-12-20 Biosante Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåde til fremstilling af terapeutiske calciumphosphatpartikler
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
KR100942863B1 (ko) 1999-08-24 2010-02-17 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
AT500379B8 (de) * 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US20070134724A1 (en) 2005-08-04 2007-06-14 Peter Davies Phosphorylation of tau by abl
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP3255144A1 (en) 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
WO2009033743A1 (en) * 2007-09-13 2009-03-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
CN102596221B (zh) 2009-06-10 2019-06-04 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
WO2012045882A2 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Ac Immune S.A. Pharmaceutical composition
EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2019-02-28 Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх Человеческие анти-тау антитела
US9506051B2 (en) * 2011-05-20 2016-11-29 Oligomerix, Inc. Tau protease compositions and methods of use
KR101981351B1 (ko) 2011-10-07 2019-09-02 에이씨 이뮨 에스.에이. 타우를 인식하는 포스포특이적 항체
AU2013243861A1 (en) 2012-04-05 2014-10-23 Ac Immune S.A. Humanized Tau antibody
EP2870176A4 (en) 2012-07-03 2016-09-28 Univ Washington ANTIBODIES DIRECTED AGAINST TAU
US9567395B2 (en) 2012-08-16 2017-02-14 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
AU2014248515B2 (en) 2013-03-13 2019-03-07 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
US20160068818A1 (en) 2013-04-16 2016-03-10 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
CN105934445B (zh) 2014-01-23 2017-11-17 旭化成株式会社 嵌段共聚物组合物和粘着粘结剂组合物
US10132818B2 (en) 2014-07-08 2018-11-20 New York University Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
SG11201811015RA (en) 2016-07-12 2019-01-30 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
EP3565836A1 (en) 2017-01-04 2019-11-13 H. Lundbeck A/S Antibodies specific for hyperphosphorylated tau for the treatment of ocular diseases
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
TWI747922B (zh) 2021-12-01
US20180016330A1 (en) 2018-01-18
SV2019005807A (es) 2019-02-13
AU2017295608A1 (en) 2018-12-20
JP2019529336A (ja) 2019-10-17
ECSP19005417A (es) 2019-01-31
MA45655A (fr) 2019-05-22
AU2024201450A1 (en) 2024-03-28
CN109618556A (zh) 2019-04-12
NI201900003A (es) 2020-04-27
DK3484916T3 (da) 2021-04-06
IL263530B (en) 2022-10-01
IL263530A (en) 2019-01-31
MA56165A (fr) 2022-04-20
IL263530B2 (en) 2023-02-01
PL3484916T3 (pl) 2021-07-19
PH12018502613A1 (en) 2019-09-30
CN116041504A (zh) 2023-05-02
RU2760875C1 (ru) 2021-12-01
US20200109192A1 (en) 2020-04-09
EP3484916A1 (en) 2019-05-22
EP3878864A1 (en) 2021-09-15
US10472415B2 (en) 2019-11-12
CN109618556B (zh) 2022-10-21
MY197836A (en) 2023-07-20
US10487142B2 (en) 2019-11-26
MX2019000476A (es) 2019-06-10
GEP20217222B (en) 2021-02-10
JP7244600B2 (ja) 2023-03-22
HRP20210522T1 (hr) 2021-05-14
WO2018011073A1 (en) 2018-01-18
LT3484916T (lt) 2021-04-26
CA3027561A1 (en) 2018-01-18
US10647762B2 (en) 2020-05-12
EP3484916B1 (en) 2021-03-03
SG11201811015RA (en) 2019-01-30
MA45655B1 (fr) 2021-04-30
US20220177557A1 (en) 2022-06-09
NZ748983A (en) 2022-12-23
PT3484916T (pt) 2021-03-31
TW201809004A (zh) 2018-03-16
US11111290B2 (en) 2021-09-07
JOP20180117A1 (ar) 2019-01-30
ZA201808329B (en) 2020-02-26
TN2018000419A1 (en) 2020-06-15
JP7029415B2 (ja) 2022-03-03
CO2018014325A2 (es) 2019-01-18
JP2022023096A (ja) 2022-02-07
JOP20180117B1 (ar) 2022-03-14
BR112018004916A2 (pt) 2018-12-11
KR20190028436A (ko) 2019-03-18
PE20190227A1 (es) 2019-02-13
US20190284266A1 (en) 2019-09-19
HUE053679T2 (hu) 2021-07-28
CY1123995T1 (el) 2022-05-27
SI3484916T1 (sl) 2021-08-31
CL2019000082A1 (es) 2019-04-05
RS61646B1 (sr) 2021-04-29
KR102551971B1 (ko) 2023-07-07
US20190284265A1 (en) 2019-09-19
ES2862427T3 (es) 2021-10-07
AU2017295608B2 (en) 2024-01-04
DOP2018000281A (es) 2019-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124104C2 (uk) Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування
CN107847595B (zh) 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法
KR102536017B1 (ko) 고급 당화 최종 산물(age)에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하고, 전이성 암 세포를 사멸시키고, 암 전이를 예방하기 위한 방법 및 조성물
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
JP3746790B2 (ja) 抗ヒトＶＥＧＦ受容体Ｆ１ｔ―１モノクローナル抗体
RU2722832C2 (ru) Неприродные семафорины класса 3 и их медицинское применение
TW201829460A (zh) Il-11抗體
UA76936C2 (en) Human monoclonal antibody binding the antigen-4 of cytotoxic t-lymphocyte (ctla-4), nucleic acid, cell line, method of obtaining transgenic mammal, method to increase producing il-2 or ifn-? in the t-cells of a patient, method to treat and pharmaceutical composition used in treatment of cancer, inflammation or autoimmune disease, including the antibody
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
CN105916878A (zh) 抗半乳糖凝集素1的单克隆抗体及其片段
HUE031725T2 (en) High Human Human Protease Activated Receptor-2 Affinity
JP2007536265A (ja) インスリン様成長因子ｉを増強または阻害するための方法
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
CN110099924A (zh) Gremlin-1晶体结构和抑制性抗体
JP2003259887A (ja) カドヘリン物質および方法
KR20100023869A (ko) 페리오스틴의 Ｅｘｏｎ-17 부위에 의해 코드되는 펩티드에 대한 항체를 함유하는 암 치료제
UA125136C2 (uk) Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну
CN107531796A (zh) 识别AChE的T14肽的抗体
KR20190085935A (ko) 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
CZ318194A3 (en) Monoclonal antibodies against glucoprotein p
UA126295C2 (uk) Антитіло до альфа-синуклеїну
EP3594236A1 (en) Nav1.9 target polypeptide, antibody and antibody fragment combined with same, and related pharmaceutical composition
US7357929B2 (en) Placental growth factor as a target for the treatment of osteoporosis
WO2008059616A1 (fr) Anticorps reconnaissant le domaine c de la midkine