ES2894852T3

ES2894852T3 - Anticuerpos anti-NGF caninizados y métodos de los mismos

Info

Publication number: ES2894852T3
Application number: ES13729226T
Authority: ES
Inventors: Lisa Marie Bergeron; Graeme Bainbridge; Steven A Dunham; Minghua Dai
Original assignee: Zoetis Services LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2022-02-16
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: JP6629069B2; US20150147318A1; CA2875783C; US20170158756A1; JP2018172385A; AU2013271564A1; US9617334B2; EP2859018B1; US9951128B2; CN104364264B; AU2018201858A1; EP2859018A1; AU2018201858B2; CN104364264A; JP2015521461A; CA2875783A1; WO2013184871A1

Abstract

Una proteína de unión a antígeno aislada y caninizada que se une específicamente al Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) canino que comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (CAN-SSME3M-VL) y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (CAN-SSM57-VH).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-NGF caninizados y métodos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunología. Más específicamente, la presente invención se refiere a proteínas de unión a antígenos anti-NGF o anticuerpos que han sido modificados para ser no inmunogénicos en caninos, particularmente anticuerpos quiméricos y anticuerpos caninizados que se unen específicamente al NGF canino. La invención se refiere además al uso de dichas proteínas de unión a antígenos o anticuerpos en el tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con el NGF, particularmente el dolor, en caninos.

Antecedentes de la invención

El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue la primera neurotrofina en ser identificada, y su papel en el desarrollo y la supervivencia de las neuronas periféricas y centrales ha sido bien caracterizado. Se ha demostrado que el NGF es un factor crítico de supervivencia y mantenimiento en el desarrollo de las neuronas sensoriales periféricas y embrionarias y de las neuronas colinérgicas del cerebro anterior (Smeyne, et al., Nature 368:246-249 (1994) y Crowley, et al., Cell 76: 1001-101 I (1994)). El NGF regula la expresión de neuropéptidos en las neuronas sensoriales (Lindsay, et al, Nature 337:362-364 (1989)), y su actividad está mediada por dos receptores diferentes unidos a la membrana, el receptor de tirosina quinasa TrkA y el receptor de neurotrofina común p75 (a veces denominados receptores de NGF de "alta afinidad" y "baja afinidad", respectivamente), que está estructuralmente relacionado con otros miembros de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)).

Además de sus efectos en el sistema nervioso, el NGF ha sido implicado cada vez más en procesos fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha demostrado que el NGF aumenta la permeabilidad vascular (Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106: 199-201 (1984)), potencia las respuestas inmunitarias de las células T y B (Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), induce la diferenciación de los linfocitos y la proliferación de los mastocitos y provoca la liberación de señales biológicas solubles de los mastocitos (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988) Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986) Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992) Horigome, et al., J. Bioi. Chem. 268:14881-14887 (1993)).

El NGF es producido por un número de tipos de células, incluyendo los mastocitos (Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), los linfocitos B (Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996), los queratinocitos (Di Marco, et al., J. Bioi. Chem. 268: 22838-22846)), células musculares lisas (Ueyama, et al., J. Hypertens. 11: 1061-1065 (1993) ), fibroblastos (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), células epiteliales bronquiales (Kassel, et al., Clin, Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), células mesangiales renales (Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261: F792-798 (1991)) y los miotubos del músculo esquelético (Schwartz, et al., J Photochem. Photobiol. B66: 195-200 (2002)). Se han encontrado receptores de NGF en una variedad de tipos de células fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha encontrado TrkA en monocitos humanos, linfocitos T y B y mastocitos.

Se ha observado una asociación entre el aumento de los niveles de NGF y una variedad de afecciones inflamatorias en pacientes humanos, así como en varios modelos animales. Entre ellos se encuentra el lupus eritematoso sistémico (BracciLaudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), la esclerosis múltiple (BracciLaudiero, et al, Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), la psoriasis (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. l'enereol. 78:84-86 (1998)), la artritis (Falcim, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), cistitis intersticial (Okragly, et al., J. Urology 161: 438-441 (1999)) y el asma (Braun, et al., Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)).

Consistentemente, un nivel elevado de NGF en los tejidos periféricos está asociado con la hiperalgesia y la inflamación y se ha observado en varias formas de artritis. La sinovia de los pacientes afectados por la artritis reumatoide expresa altos niveles de NGF, mientras que en la sinovia no inflamada el NGF es indetectable (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Se observaron resultados similares en ratas con artritis reumatoide inducida experimentalmente (Aloe, et al., Clin. Exp. Reumatol. 10:203-204 (1992)). Se han notificado niveles elevados de NGF en ratones artríticos transgénicos junto con un aumento del número de mastocitos (Aloe, et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspectos 15:139-143 (1993)).

La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas crónicas más comunes en los perros, y afecta al 20% de la población canina de más de un año de edad. El desarrollo de la OA es principalmente secundario a traumatismos, inestabilidad articular y enfermedades como la displasia de cadera. La osteoartritis es una enfermedad que afecta a toda la articulación, y tanto los cambios inflamatorios como los degenerativos de todas las estructuras articulares provocan discapacidad y signos clínicos de cojera y dolor. El dolor es la manifestación clínica más importante de la OA canina y es el resultado de una compleja interacción entre los cambios estructurales de la articulación, las alteraciones bioquímicas y moleculares, así como los mecanismos periféricos y centrales de procesamiento del dolor. Dentro de esta red, la activación y sensibilización de los nociceptores periféricos por mediadores inflamatorios e hiperalgésicos (por ejemplo, citoquinas, prostaglandinas y neuromediadores) es uno de los principales mecanismos periféricos responsables del dolor articular. El factor de crecimiento nervioso (NGF) es uno de los neuromediadores que ha recibido mayor atención como regulador clave implicado tanto en el dolor inflamatorio como en el neuropático. (Isola et al. Vet Comp Orthop Traumatol 4: 2011 pgs 279-284). El documento WO 02/096458 se refiere a los usos de los anticuerpos anti-NGF en el tratamiento de varios trastornos relacionados con el NGF, incluyendo el asma, la artritis y la psoriasis, sin tener un efecto adverso significativo en el sistema inmunológico del paciente.

Sumario de la invención

La invención proporciona una nueva proteína de unión a antígeno anti-NGF caninizada (como anticuerpos antagonistas anti-NGF caninizados), y polinucleótidos que codifican la misma. La invención proporciona además el uso de dichas proteínas de unión a antígenos y/o nucleótidos en el tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con el NGF, particularmente el dolor.

En una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno aislada o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al NGF canino. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de dominio específico, un anticuerpo de dominio eliminado, una proteína de fusión, una proteína de fusión ScFc, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento Fd. En algunas realizaciones dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones dicho anticuerpo es quimérico. En una o más realizaciones la proteína de unión a antígeno de la invención está caninizada. En una o más realizaciones la proteína de unión a antígeno de la invención es un anticuerpo canino.

En una o más realizaciones, la proteína de unión al antígeno que se une específicamente al NGF canino impide que el NGF canino se una a la TrkA canina y, en menor medida, a la p75, inhibiendo así la señalización a través de la TrkA canina y la p75, lo que ha demostrado reducir la señalización a través de las neuronas sensoriales, reduciendo así los niveles de dolor. En una o más realizaciones, la proteína de unión a antígeno de la invención no tiene ningún efecto adverso significativo en el sistema inmunitario de un canino.

En una o más realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada que se une específicamente al NGF canino trata un trastorno relacionado con el NGF en un canino. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el NGF en un canino y se selecciona del grupo que consiste en: enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, obesidad, diabetes, síndrome metabólico, dolor e inflamación. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con el NGF es el dolor. En algunas realizaciones el tipo de dolor se selecciona del grupo que consiste en: dolor crónico; dolor inflamatorio, dolor postoperatorio por incisión, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, neuralgia posherpética, dolor por cáncer, dolor resultante de quemaduras, dolor asociado a heridas, dolor asociado a traumatismos, dolor neuropático, dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos como la artritis reumatoide, la artrosis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares y la neuropatía periférica. En algunas realizaciones, el tipo de dolor es un dolor crónico. En algunas realizaciones, el tipo de dolor es el de la artrosis.

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno aislada y que comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en:

una cadena pesada variable (VH) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR 1) que tiene la secuencia de aminoácidos LIGYDIN (SEQ ID NO.1); LIQYDIN (SEQ ID NO.7) o LIEYDIN (SEQ ID NO.8);

una cadena pesada variable (VH) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos MIWGDGTTDYNSALKS (SEQ ID NO.2); o MIWGTTDYNSALKS (SEQ ID NO.13);

una cadena pesada variable (VH) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR3) con la secuencia de aminoácidos GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID NO.3); o GGYWYATSYFDY (SEQ ID NO.9); y

una variante de la misma que tenga una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en al menos una de las CDR1, CDR2 o CDR3.

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en:

una cadena pesada variable (VL) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR 1) que tiene la secuencia de aminoácidos ^rA^sQDISNHLN (SEQ ID NO.4); o RASQSISNNLN (SEQ ID NO.

10);

una cadena pesada variable (VL) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR 2) con la secuencia de aminoácidos YISRFHS (SEQ ID NO.5) o YISSFHS (SEQ ID NO. 11);

una cadena pesada variable (VL) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR 3) que tiene la secuencia de aminoácidos QQSKTLPYT (SEQ ID NO.6) o QQSHTLPYT (SEQ ID NO. 12); y una variante de la misma que tenga una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en al menos una de las CDR1, CDR2 o CDR3. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que tiene al menos una de las CDR de cadena ligera variable descritas anteriormente, y puede incluir además al menos una de las siguientes CDR de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en:

una cadena pesada variable (VH) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR 1) que tiene la secuencia de aminoácidos LIGYDIN (SEQ ID NO.1); LIQYDIN (SEQ ID NO.7) o LIEYDIN (SEQ ID NO. 8);

una variante de la misma que tenga una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en al menos una de las CDR1, CDR2 o Cd R3.

La proteína de unión a antígeno puede incluir al menos una de las siguientes:

una cadena pesada variable que comprende QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIGYDINWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGTTDYNSALKSR

LSISKDNSKSQVFLKMNSLRTDDTATYSCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSA

AQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHP

ASSTKVDKKIVPRD (SEQ ID NO. 14; MU-RN911-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIGYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17;

CAN-N2G9-VH);

EV QLVESGGDL ARPGGSLKLSC VV SGFSLIGYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYN SALK

SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AV Y Y C ARGGY WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 25;

CAN-LTM109-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIQYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AV Y Y CARGO Y WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 27;

CAN-SSM57-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLÍEYDÍNWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28;

CAN-SSM58-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIEYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGTGTTDYNSALK

SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AVY Y CARGGY WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 29;

CAN-SSM66-VH);

y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La proteína de unión a antígeno aislada puede incluir al menos una de las siguientes:

una cadena ligera variable que comprende

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGS

GTDYSLTISNLHQHDIATYFCQQSKTLPYTFGGGTKLBIKRA (SHQ ID N0.15; MU-RN911 -VL);

DIVMTQTPLSLSVSPGETASISCRASQDISNIILNWFRQKPGQSPQRLIYYISRF1ISGVPDRFSGGSGT DFTLRISRVEADDTGVYYCQQSKTLPYTFGAGTKLHIK (SEQ ID NO. 16; CAN-E3M-VL));

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQD1SNFILNWFRQKPGQSPQRLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG TDFTLRJSRVEADDAGVYYCQQSKTLPYTFGQGTKLEÍK (SEQ ID NO. 18; CAN-618-VL));

D1VMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNHLNWFRQKPDGTVKLLIYYISRFIISGVPSRFSGSGSG TDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSKTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO.19; CAN-QC23-VL));

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG TDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPYTFGGGTKLEI (SEQ ID NO. 20; CAN-618FW1-VL);

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNHLNWFRQKPGQSPQRLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG TDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPYTFGGGTKLEI (SEQ ID NO. 21; CAN-618FW2-VL);

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGS

GTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSKTLPYTFGGGTKLEI (SEQ ID NO. 22; CAN-618FW3-VL);

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGS GTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPYTFGQGTKLEI (SEQ ID NO. 23; CAN-618FW4-VL);

DIVMTQTPLSLSVSPGETASISCRASQSISNNLNWFRQKPGQSPQRLIYYISRFHSGVPDRFSGSGSG

TDFTLRISRVEADDTGVYYCQQSHTLPYTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO. 24; CAN-LTM109-VL);

DIVMTQTPLSLSVSPGETASISCRASQSISNNLNWFRQKPGQSPQRLIYYISSFHSGVPDRFSGSGSGT DFTLRISRVEADDTGVYYCQQSHTLPYTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO. 26; CAN-SSME3M-VL);

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQSISNNLNWFRQKPDGTVKLLIYYISSFHSGVPSRFSGSGSGT DFTLRISRVEADDAGVYYCQQSHTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 30; CAN-SSMQC23 - VL); y

variantes del mismo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que tiene al menos una de las cadenas ligeras variables descritas anteriormente, y puede incluir además al menos una de las siguientes cadenas pesadas variables del anticuerpo aislado o de la porción de unión a antígeno del mismo seleccionada del grupo que consiste en:

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIGYDINWVRQPPÜKGLHWLGMIWGDGTTDYNSALKSR

LSISKDNSKSQVFLKMNSLRTDDTATYSCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSA

AQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSHTVTCNVAUP

ASSTKVDKKIVPRD (SEQ ID NO. 14; MU-RN911-VIl);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIGYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRYEDTAVYYCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO; 17;

CAN-N2G9-VFI);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIGYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO; 25;

CAN-LTM109-Vil);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIQYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVBDTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27;

CAN-SSM57-VH);

EVQLVESüGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIEYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWüDGTTDYNSALK

SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28;

CAN-SSM58-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIEYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGTGTTDYNSALK

SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AVYY C ARGGYWY ATS Y YFDY WGQGTLVTV S S (SEQ ID NO: 29;

CAN-SSM66-VH);

y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

a) una cadena ligera variable que comprende:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGS

GTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ ID NO.15; MU-RN911-VL);

DIVMTQTPLSLSVSPGETASISCRASQDISNHLNWFRQKPGQSPQRLIYYISRFHSGVPDRFSGSGSG

TDFTLRISRVEADDTGVYYCQQSKTLPYTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO. 16; CAN-E3M-VL));

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNHLNWFRQKPGQSPQRLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG

TDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSKTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 18; CAN-618-VL));

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNHLNWFRQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG

TDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSKTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO.19; CAN-QC23-VL));

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNHLNWYQQKPDGTVKLLIYYISRFHSGVPSRFSGSGSG

TDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPYTFGGGTKLEI (SEQ ID NO. 20; CAN-618FW1-VL);

variantes del mismo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; y

b) una cadena pesada variable que comprende:

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIGYDINWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGTTDYNSALKSR LSISKDNSKSQVFLKMNSLRTDDTATYSCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSA AQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRD (SEQ ID NO. 14; MU-RN911-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSL1GYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARGGYYYGTSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17; CAN-N2G9-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIGYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AVYY CARGGY WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 25; CAN-LTM109-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFSLIQYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGDGTTDYNSALK SRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRYEDTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO; 27; CAN-SSM57-VH);

EV QLVE SGGDLARPGG SLKL SC VV SGFSLIEYDIN WVRQAPGKGLQ WVTMIWGDGTTD YN S ALK SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AVYY C ARGGY WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO; 28; CAN-SSM58-VH);

EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCWSGFSLIEYDINWVRQAPGKGLQWVTMIWGTGTTDYNSALK SRFT V SRDNAMNTVYLQMN SLRVEDT AVYY CARGO Y WY ATS YYFDY WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 29; CAN-SSM66-VPI);

y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno aislada en la que la cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO. 16 (CAN-E3M-VL) y la cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO. 17 (CAN-N2G9-VH).

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que comprende una cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO. 26 (CAN-SSME3M-VL) y la cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO. 27 (CAN-SSM57-VH).

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno aislada que comprende una cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO. 30 (CAN-SSMQC23-VL) y una cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO. 27 (CAN-SSM57-VH).

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona una composición veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las proteínas aisladas de unión a antígeno de la presente invención. En una o más realizaciones, la composición veterinaria de la invención no tiene ningún efecto adverso significativo en el sistema inmunitario de un canino.

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona una célula huésped que produce una o más de las proteínas de unión a antígeno de la presente invención.

La divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a antígeno caninizada seleccionada del grupo que consiste en: ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada variable (VH) seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 32 (MU-RN911-VHnt); SEQ ID NO: 34 (CAN-N2G9-VHnt); SEQ ID NO: 38 (CAN-LTM109-VHnt); SEQ ID NO: 40 (CAN-SSM57-VHnt); SEQ ID NO: 41 (CAN-SSM58-VHnt); SEQ ID NO: 42 (CAN-SSM66-VHnt); y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de ácido nucleico.

La divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a antígeno caninizada seleccionada del grupo que consiste en: ácidos nucleicos que codifican una cadena ligera variable (VL) seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 31 (MU-RN911-VLnt); SEQ ID NO: 33 (CAN-E3M-VLnt) ; SEQ ID NO: 35 (CAN-618-VLnt); SEQ ID NO: 36 (CAN-QC23-VLnt) ; SEQ ID NO: 37 (CAN-LTM109-VLnt); SEQ ID NO: 39 (CAN-SSME3M-VLnt); SEQ ID NO: 43 (CAN-SSMQC23-VLnt); y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de ácido nucleico.

La divulgación comprende además ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada variable (VH) seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 32 (MU-RN911-VHnt); SEQ ID NO: 34 (CAN-N2G9-VHnt); SEQ ID NO: 38 (CAN-LTMI09-VHnt); SEQ ID NO: 40 (CAN-SSM57-VHnt); SEQ ID NO: 41 (CAN-SSM58-VHnt); o SEQ ID NO: 42 (CAN-SSM66-VHnt); y sus variantes con una o más sustituciones conservadoras de ácido nucleico.

La divulgación proporciona ácido nucleico aislado en el que el ácido nucleico codifica la cadena ligera variable de una proteína de unión a antígeno anti-NGF caninizada que comprende la SEQ ID NO. 33 (CAN-E3M-VLnt) y el ácido nucleico que codifica la cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO. 34 (CAN-N2G9-VHnt).

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona ácido nucleico aislado en el que el ácido nucleico codifica la cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO: 39 (CAN-SSME3M-VLnt) y el ácido nucleico que codifica la cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO: 40 (CAN-SSM57-VHnt).

La divulgación proporciona ácido nucleico aislado en el que el ácido nucleico codifica la cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO: 43 (CAN-SSMQC23-VLnt) y el ácido nucleico que codifica la cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO: 40 (CAN-SSM57-VHnt).

En una o más realizaciones, la invención proporciona un vector que comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención.

En una o más realizaciones, la invención proporciona una célula huésped que comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención.

En una o más realizaciones, la invención proporciona una célula huésped que comprende el vector que comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención.

En una realización, la invención proporciona un método de producción de una proteína de unión a antígeno que comprende el cultivo de cualquiera de las células huésped de la presente invención como se describe en el presente documento, en condiciones que dan lugar a la producción de la proteína de unión a antígeno caninizada, y el aislamiento de la proteína de unión a antígeno del anticuerpo caninizado de la célula huésped o del medio de cultivo de la célula huésped.

En una realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un canino para un trastorno relacionado con el nGf que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición veterinaria de la invención. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con el NGF se selecciona del grupo que consiste en: enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, obesidad, diabetes, síndrome metabólico, dolor e inflamación. En algunas realizaciones de la presente invención el tipo de dolor se selecciona del grupo que consiste en: dolor crónico; dolor inflamatorio, dolor postoperatorio por incisión, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, neuralgia posherpética, dolor por cáncer, dolor resultante de quemaduras, dolor asociado a heridas, dolor asociado a traumatismos, dolor neuropático, dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos como la artritis reumatoide, la artrosis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares y la neuropatía periférica. En algunas realizaciones, el tipo de dolor es un dolor de artrosis.

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir la actividad del NGF en un canino mediante la administración de la composición veterinaria de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona un método para detectar o cuantificar los niveles de NGF en una muestra biológica, comprendiendo el método:

(a) incubar una muestra clínica o biológica que contenga NGF en presencia de cualquiera de los anticuerpos caninizados, proteínas de unión a antígeno o fragmentos de la presente invención; y

(b) detectar la proteína de unión al antígeno o los fragmentos que se unen al NGF en la muestra.

En algunas realizaciones, la proteína de unión al antígeno o los fragmentos están marcados de forma detectable. En algunas realizaciones, la proteína o los fragmentos de unión a antígeno no marcados se utilizan en combinación con una segunda proteína o fragmentos de unión a antígeno marcados de forma detectable. En una realización la invención comprende un kit que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1: es una representación esquemática de la estructura general de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) de ratón en la que se destaca el sitio de unión al antígeno.

La Figura 2: es una representación esquemática de la estructura general de una IgG quimérica de ratón/canina.

La Figura 3: es una ilustración que muestra la especiación o "caninización" de una IgG de ratón, las CDR de ratón se injertan en estructuras caninas.

La figura 4 es una ilustración de un "anticuerpo monoclonal heteroquimérico que combina la cadena ligera quimérica con una cadena pesada totalmente caninizada.

La figura 5 es una ilustración de las cadenas variables de los anticuerpos que muestra los cebadores para las regiones constantes y los cebadores degenerados dirigidos a las regiones variables del ratón.

La Figura. 6. (A) Modelado molecular del epítopo RN 911 en el p-NGF humano maduro. El NGF suele estar homodimerizado. Cada monómero de NGF se diferencia por las designaciones en gris claro y medio, y los residuos identificados que afectan a la unión de RN911 se muestran en negro. Cada una de las regiones variables que influyen en la unión de los distintos mAb murinos está etiquetada en consecuencia. (B) Conservación de la secuencia de aminoácidos en todas las especies del epítopo de unión a RN911 en p-NGF. Los aminoácidos críticos para la unión de RN911 a NGF están sombreados en gris.

La figura 7 es una representación gráfica de los niveles séricos de RN911 libre tras su administración intravenosa a perros beagle.

La figura 8 es una representación gráfica de los niveles séricos de "NGF unido" (es decir, NGF unido a RN911) después de la administración IV a perros beagle.

La Figura 9: es una representación gráfica del efecto de RN911 (3 mg/kg, IV) sobre la cojera en un modelo de dolor de sinovitis en beagle (inducido por LPS). * P < 0,1 en comparación con el vehículo PBS.

La Figura 10 es una representación esquemática de un ejemplo de sustituciones de marco realizadas en las cadenas ligeras para recuperar la expresión y mantener la unión.

La figura 11 resume los resultados de la expresión y las mutaciones de los derivados caninizados utilizando diferentes secuencias marco.

Las figuras 12A y B es una representación gráfica de los datos de afinidad del mAb caninizado (izquierda). (Derecha) datos de inhibición de trkA con mAb preincubado NGF. (Abajo)

La figura 13 es una representación gráfica de los datos de afinidad del mAb caninizado determinados por el ensayo basado en células utilizando la línea celular que expresa trkA para determinar la EC50 de cada mAb.

La figura 14 es una representación gráfica de los efectos del mAb caninizado Anti-NGF PF 06442590 (CANSSM57-VH/CAN SSME3M-VL)

La figura 15 es una ilustración del diseño de la biblioteca utilizada para la mutagénesis por observación (LTM) y la mutagénesis por saturación del sitio (SSM)

La figura 16 es una representación gráfica de un estudio de farmacocinética (PK) de anticuerpos monoclonales anti-NGF en perros medidos durante treinta y cinco días.

La figura 17 es una representación esquemática de la inducción de la inflamación mediante la inyección intraarticular de MIA utilizada para reproducir lesiones similares a las de la OA en ratas (modelo de dolor en ratas con MIA).

Las figuras 18 y 19 son una representación gráfica de los resultados tras el tratamiento del dolor (morfina, anticuerpos monoclonales) en el modelo de dolor de la rata MIA

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR1 denominada en el presente documento RN911-VH-CDR1

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR2, denominada en el presente documento RN911-VH-CDR2

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR2, denominada en el presente documento RN911-VH-CDR3

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR 1, denominada en el presente documento RN911-VL-CDR1

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR2 denominada en el presente documento RN911-VL-CDR2

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR3, denominada en el presente documento RN911-VL-CDR3

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR1 denominada en el presente documento SSM57-VH-CDR1

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR1 denominada en el presente documento SSM58-VH-CDR1

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable CDR3 denominada en el presente documento LTM109-VH-CDR3 y SSM57-VH CDR3

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR1 denominada en el presente documento LTM109-VL-CDR1

SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR2 denominada en el presente documento SSM57-VL-CDR2

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR3 denominada en el presente documento LTM109-VL-CDR3

SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable CDR2 denominada en el presente documento SSM66-VH-CDR2 y SSM57-VII CDR2

SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento MU-RN911-VH

SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento MU-RN911-VL

SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-E3M-VL

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-N2G9-VH

SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618-VL

SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-QC23-VL

SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618FW1-VL

SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618FW2-VL

SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618FW3-VL

SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618FW4-VL

SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-LTM109-VL

SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-LTM109-VH)

SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-SSME3M-VL)

SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM57-VH

SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM58-VH

SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM66-VH

SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSMQC23-VL

SEQ ID NO: 31 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en este documento MU-RN911-VLnt SEQ ID NO: 32 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento MU-RN911-VHnt)

SEQ ID NO: 33 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-E3M-VLnt SEQ ID NO: 34 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-N2G9-VHnt

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-618-VLnt

SEQ ID NO: 36 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-QC23-VLnt

SEQ ID NO: 37 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-LTM109-VLnt

SEQ ID NO: 38 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-LTM109-VHnt

SEQ ID NO: 39 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-SSME3M-VLnt

SEQ ID NO: 40 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM57-VHnt

SEQ ID NO: 41 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM58-VHnt

SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable denominada en el presente documento CAN-SSM66-VHnt

SEQ ID NO: 43 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera variable denominada en el presente documento CAN-SSMQC23-VLnt

SEQ ID NO: 44 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada canina, denominada en el presente documento CAN-65E-HC

SEQ ID NO: 45 es la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la cadena pesada canina, denominada en el presente documento CAN-65E-HCnt)

SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos de la región de la cadena ligera constante kappa canina y se denomina en el presente documento CAN-KAPPA-LC

SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos de la región de la cadena ligera constante kappa canina y se denomina en el presente documento CAN-KAPPA-LCnt

SEQ ID NO: 48 es la secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada canina, denominada en el presente documento CAN-65 HCnt

SEQ ID NO. 49 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada canina, denominada en el presente documento CAN-65 HC

SEQ ID NO. 50 es la secuencia de aminoácidos del Factor de Crecimiento Nervioso de Canis lupus familiaris Número de acceso del Genbank: AAY16195

SEQ ID NO. 51 es la secuencia de nucleótidos del factor de crecimiento nervioso de Canis lupus familiaris Descripción detallada de la invención

Se observa que cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo animal mediante terapia. La invención divulgada en el presente documento proporciona proteínas caninizadas de unión al antígeno NGF que se unen al NGF canino con alta afinidad. La invención proporciona además proteínas de unión a antígeno caninizadas y polipéptidos que también se unen al NGF canino que son variantes de dichas proteínas de unión a antígeno, así como métodos de fabricación y uso de estas proteínas de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la invención también proporciona polinucleótidos que codifican dichas proteínas y/o polipéptidos de unión a antígenos. La invención divulgada en el presente documento también proporciona métodos para prevenir y/o tratar el dolor en un canino mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas caninizadas de unión a antígenos anti-NGF.

Técnicas generales

Debe entenderse que la prsente invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en el presente documento y, como tales, pueden variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente determinadas realizaciones.

A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con los anticuerpos descritos en el presente documento tendrán el significado que comúnmente entienden los expertos en la materia. Además, salvo que el contexto exija lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular y la química e hibridación de proteínas y oligo o polinucleótidos descritos en el presente documento son las conocidas y utilizadas habitualmente en la técnica.

Se utilizan técnicas estándar para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo de tejidos y la transfección (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe, pero no se limita a las diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva, Ver por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3a ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) yAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Nueva York: Greene Publishing Association J Wiley Interscience), Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.,1984) Methods in Molecular Biology, Humana Press Biología Celular: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press Cultivo de células animales (R. 1. Freshney, ed. 1987); I Introduction to Cell and Tissue Culture (1. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths y D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987) Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987) PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994) Current Protocols in Immunology (E. Coligan et al., eds., 1991)Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997) Anticuerpos (P. Finch, 1997) Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988 1989) Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (Y. T. DeVita et al., eds. Lippincott Company, 1993).

Salvo en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en el presente documento deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente"

Definiciones

Antes de describir la presente invención en detalle, se definirán varios términos utilizados en el contexto de la presente invención. Además de estos términos, otros se definen en otras partes de la memoria descriptiva según sea necesario. A menos que se defina expresamente lo contrario, los términos de la técnica utilizados en esta memoria descriptiva tendrán su significado reconocido en la técnica.

Tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el" incluye referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "que comprende" pretende significar que las composiciones y los métodos incluyen los elementos recitados, pero sin excluir otros.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "factor de crecimiento nervioso" y "NGF" se refiere al factor de crecimiento nervioso y a sus variantes que conservan al menos parte de la actividad biológica del NGF.

"Receptor de NGF" se refiere a un polipéptido que está unido o activado por el NGF. Los receptores del NGF incluyen el receptor TrkA y, en menor medida, el receptor p75 de los caninos.

La "actividad biológica" del NGF se refiere generalmente a la capacidad de unirse a los receptores del NGF y/o activar las vías de señalización del receptor del NGF. Sin limitación, una actividad biológica incluye cualquiera o más de las siguientes: la capacidad de unirse a un receptor de NGF (como TrkA y/o p75); la capacidad de promover la dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA; la capacidad de activar una vía de señalización del receptor de NGF la capacidad de promover la diferenciación, la proliferación, la supervivencia, el crecimiento y otros cambios en la fisiología celular, incluyendo (en el caso de las neuronas, incluidas las neuronas periféricas y centrales) el cambio en la morfología neuronal, la sinaptogénesis, la función sináptica, la liberación de neurotransmisores y/o neuropéptidos y la regeneración tras un daño; la capacidad de promover la supervivencia de las neuronas trigeminales del ratón E13.5 del trigémino; y la capacidad de mediar el dolor, incluido el dolor postquirúrgico.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína de unión a antígeno anti-NGF" (denominada indistintamente "anticuerpo anti-NGF" y "anticuerpo antagonista anti-NGF") se refiere a una proteína de unión a antígeno que es capaz de unirse al NGF e inhibir la actividad biológica del NGF y/o la(s) vía(s) descendente(s) mediada(s) por la señalización del NGF. Un anticuerpo antagonista del NGF abarca los anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluso significativamente) la actividad biológica del NGF, incluidas las vías descendentes mediadas por la señalización del NGF y/o inhiben la unión del NGF a su receptor trkA, como la unión del receptor y/o la elicitación de una respuesta celular al NGF. A efectos de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista del NGF" abarca todos los términos, títulos y estados funcionales y características previamente identificados por los que el propio NGF, una actividad biológica del NGF (incluida, pero sin limitarse a ella, su capacidad de mediar en cualquier aspecto del dolor postquirúrgico), o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista del NGF se une al NGF e impide la dimerización del NGF y/o su unión a un receptor del NGF (como TrkA y/o p75). En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une al ⁿG^fe impide la dimerización del receptor TrkA y/o la autofosforilación de TrkA. En el presente documento se proporcionan ejemplos de anticuerpos antagonistas del NGF.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína de unión a antígeno", "anticuerpo" y similares, que pueden utilizarse indistintamente, se refiere a un polipéptido, o fragmento del mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno. En una realización de la presente invención, la proteína de unión a antígeno de la invención proporciona además una inmunoglobulina intacta capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Un anticuerpo intacto tiene dos cadenas ligeras y dos pesadas. Así, un anticuerpo intacto aislado puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico. El término "proteína de unión a antígeno" "anticuerpo' se refiere preferentemente a los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos, y a los equivalentes de unión inmunológica de los mismos que pueden unirse a la proteína NGF y a sus fragmentos. Los términos anticuerpo y proteína de unión a antígeno se utilizan para referirse a una molécula homogénea, o a una mezcla, como un producto sérico, compuesta por una pluralidad de entidades moleculares diferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término abarca no sólo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también sus fragmentos. A efectos de la presente invención, "anticuerpo" y "proteína de unión a antígeno" también incluyen fragmentos de anticuerpos, a menos que se indique lo contrario. Los fragmentos de anticuerpos ejemplares incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacuerpos, sus fragmentos de reconocimiento de antígeno, nanofármacos modulares pequeños (SMIP), moléculas IgNAR y similares, todos ellos reconocidos por un experto en la materia como una proteína de unión a antígeno o un fragmento de anticuerpo y cualquiera de los fragmentos mencionados anteriormente y sus homólogos manipulados química o genéticamente, así como otros fragmentos de anticuerpos y mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Los anticuerpos y las proteínas de unión a antígenos pueden fabricarse, por ejemplo, mediante técnicas tradicionales de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495-499 (1975)), métodos de ADN recombinante (Patente estadounidense n° 4.816.567), o las técnicas de visualización de fagos utilizando bibliotecas de anticuerpos (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). Para otras técnicas de producción de anticuerpos, véase Anticuerpos: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 así como otras técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.

Un "anticuerpo monoclonal", tal y como se define en el presente documento, es un anticuerpo producido por un único clon de células (específicamente, un único clon de células de hibridoma) y, por tanto, un único tipo homogéneo y puro de anticuerpo. Todos los anticuerpos monoclonales producidos a partir del mismo clon son idénticos y tienen la misma especificidad de antígeno. Los anticuerpos monoclonales son una población homogénea de anticuerpos en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y no natural) que participan en la unión selectiva de un antígeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, al estar dirigida contra un único sitio antigénico. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no sólo los anticuerpos monoclonales intactos y los anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también sus fragmentos (Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacuerpos, sus fragmentos que reconocen antígenos, pequeños nanocuerpos modulares inmunofarmacéuticos (SMIP) , Moléculas IgNAR y similares), mutantes de las mismas, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un antígeno. No pretende limitarse en cuanto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se fabrica (por ejemplo, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.).

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Normalmente, los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de las cadenas ligeras y pesadas se han construido, normalmente por ingeniería genética, a partir de genes de regiones variables y constantes de anticuerpos pertenecientes a especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes caninos. La FIG. 2 es una representación esquemática de la estructura general de una realización de un ratón: IgG canina. En esta realización, el sitio de unión al antígeno se deriva del ratón mientras que la porción Fc es canina.

El término "heteroquimérico", tal como se define en el presente documento, se refiere a un anticuerpo en el que una de las cadenas de anticuerpos (pesada o ligera) está caninizada mientras que la otra es quimérica. La FIG. 4 representa una forma de realización de una molécula heteroquimérica. En esta realización, una cadena pesada variable caninizada (donde todas las CDR son de ratón y todas las FR son caninas) se empareja con una cadena ligera variable quimérica (donde todas las CDR son de ratón y todas las FR son de ratón). En esta realización, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable están fusionadas a una región constante canina.

Las formas "caninizadas" de anticuerpos no caninos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos diseñados genéticamente que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no canina. La "caninización" se define como un método para transferir información de unión a antígenos no caninos de un anticuerpo donante a un aceptor de anticuerpos caninos menos inmunogénico para generar tratamientos útiles como terapéuticos en perros. Los anticuerpos caninizados son inmunoglobulinas caninas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de la región hipervariable de una especie no canina (anticuerpo donante) como, por ejemplo, el ratón, la rata, el conejo, el gato, el perro, la cabra, el pollo, el ganado bovino, el caballo, la llama, el camello, los dromedarios, los tiburones, los primates no humanos, el ser humano, la secuencia humanizada, la secuencia recombinante o una secuencia de ingeniería que tenga las propiedades deseadas, la especificidad, la afinidad y la capacidad. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina canina se sustituyen por los correspondientes residuos no caninos. Además, los anticuerpos caninizados pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar el rendimiento de los anticuerpos. Las modificaciones de las regiones hipervariables y/o de las regiones marco, tal y como se describen en el presente documento, se determinan para cada anticuerpo específico (caninizado) diseñado por separado, en base a la experimentación conocida por los expertos en la materia, y no pueden predecirse antes de dicha experimentación. En general, el anticuerpo caninizado incluirá sustancialmente todo al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no canina y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina canina. El anticuerpo caninizado opcionalmente también comprenderá una región constante de inmunoglobulina (Fc) completa, o al menos una porción de ella, típicamente la de una inmunoglobulina canina. La FIG. 3 es una ilustración de una realización que muestra la especiación o caninización de una IgG de ratón. En esta realización, las CDR de ratón se injertan en estructuras caninas. En algunos casos, se mantienen los marcos del ratón o los residuos de los mismos que están fuera de la región hipervariable.

La expresión "anticuerpo canino recombinante" incluye los anticuerpos caninos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos caninos recombinantes y combinados, los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina canina (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias genéticas de inmunoglobulina canina con otras secuencias de ADN.

El término "anticuerpo canino", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo canino que se genera contra una diana y se prepara mediante métodos de hibridoma bien conocidos por un experto en la materia y descritos en el presente documento.

Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" suelen ser glicoproteínas heterotetraméricas de unos 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (1) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. La FIG. 1 es un ejemplo de la estructura general de una inmunoglobulina G (IgG) nativa de ratón en la que se destaca el sitio de unión al antígeno.

El anticuerpo "parental" aquí presente es el que está codificado por una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de la variante. Preferiblemente, el anticuerpo parental tiene una región marco canina y, si está presente, tiene región(es) constante(s) de anticuerpo canino. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo caninizado o canino.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Actualmente existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2 (según se define por designación en ratones y humanos). Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en múltiples especies. La prevalencia de los isotipos individuales y las actividades funcionales asociadas a estos dominios constantes son específicas de cada especie y deben ser definidas experimentalmente.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (K) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (I) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia et al. (1989) Nature 342:877 AI-Iazikani et al (1997) J. Molec. Bioi. 273:927-948)). Tal y como se utiliza en el presente documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquiera de los dos enfoques o por una combinación de ambos.

El término "región hipervariable" como se utiliza en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (Kabat, et al. (1991), arriba) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Los residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, tal como se definen en el presente documento.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "región de unión a antígeno" se refiere a la porción de una molécula de anticuerpo que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. La región de unión del anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos "marco" necesarios para mantener la conformación adecuada de los residuos de unión al antígeno. Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión de C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión del receptor Fc; la unión del receptor neonatal; la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo.

Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" o una región Fc "mutada" o "mutante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, y puede o no conservar al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, de una a diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de una a cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La variante de la región Fc poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y más preferentemente al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con la misma. Una región Fc variante o mutada también puede eliminar esencialmente la función de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, las mutaciones de la región Fc pueden eliminar la función efectora del anticuerpo. En una realización de la invención el anticuerpo de la invención comprende una región Fc mutada. Tal y como se utilizan en el presente documento, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol, 9:457-92 Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587y Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249;.

Tal como se utiliza en el presente documento, "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y, posteriormente, causan la lisis de la célula diana. La actividad ADCC de una molécula de interés puede evaluarse utilizando un ensayo ADCC in vitro, como el descrito en las Pat. de EE.UU. N° 5.500.362 o 5,821,337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células NK. Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el divulgado en Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de un objetivo en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se utiliza un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos, 202: 163 (1996), puede realizarse.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')²que tiene dos sitios de combinación de antígenos y sigue siendo capaz de reticular el antígeno.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para el Fab' en el que los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')²se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha y no covalente. Es en esta configuración donde las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V^h-V^l. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo una especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Un "antígeno", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere al determinante antigénico reconocido por las CDR de la proteína de unión a antígeno o del anticuerpo tal y como se describe en el presente documento. En otras palabras, el epítopo se refiere a la parte de cualquier molécula capaz de ser reconocida por un anticuerpo y unida a él. A menos que se indique lo contrario, el término "epítopo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la región del NGF a la que se une una proteína/anticuerpo/agente de unión al antígeno anti-NGF.

El término "dominio de unión a antígeno", "fragmentos activos de un anticuerpo" o similares se refiere a la parte de un anticuerpo o de una proteína de unión a antígeno que comprende el área de unión específica o complementaria a una parte o a la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte concreta del antígeno. El "epítopo", los "fragmentos activos de un epítopo" o el "determinante antigénico" o similares son una porción de una molécula de antígeno que es responsable de las interacciones específicas con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un dominio de unión al antígeno puede ser proporcionado por uno o más dominios variables del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento del anticuerpo llamado Fd que consiste en un dominio VH). Un dominio de unión a antígeno puede comprender un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) (Patente de EE.UU. n° 5.565.332).

Los términos "porción de unión" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") o polipéptido de unión a antígeno o similares incluyen uno o más dominios completos, por ejemplo, un par de dominios completos, así como fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno, por ejemplo, NGF. Se ha demostrado que la función de unión de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab') 2, Fabc, Fd, dAb, Fv, cadenas simples, anticuerpos de cadena simple, por ejemplo, scFv, y anticuerpos de dominio simple (Muyldermans et al., 2001, 26:230-5), y una región aislada que determina la complementariedad (CDR). El fragmento Fab es un fragmento monovalente formado por los dominios VL, VH, CL y CH1. El fragmento F(ab^')2es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. El fragmento Fd está formado por los dominios VH y CH1, y el fragmento Fv está formado por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo. Un fragmento de dAb consiste en un dominio VH (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite fabricarlos como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Dichos anticuerpos de cadena simple también se incluyen en el término "porción de unión" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena única, como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Un anticuerpo o una porción de unión del mismo también puede formar parte de una molécula de inmunoadhesión más grande formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o la porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Entre los ejemplos de este tipo de moléculas de inmunoadhesión se incluye el uso de la región central de la estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Inmunol. 31:1047-1058). Los fragmentos de unión, como los fragmentos Fab y F(ab') 2, pueden prepararse a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, los anticuerpos, las porciones de anticuerpos y las moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse mediante técnicas estándar de ADN recombinante, como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica. Aparte de los anticuerpos "biespecíficos" o "bifuncionales", se entiende que un anticuerpo tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un "anticuerpo biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/luz diferentes y dos sitios de unión distintos. Un anticuerpo biespecífico también puede incluir dos regiones de unión al antígeno con una región constante intermedia. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por diversos métodos, como la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo Songsivilai et al., Clin. Exp. Inmunol. 79:315-321, 1990. Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148, 1547-1553.

El término "retro-mutación" se refiere a un proceso en el que algunos o todos los aminoácidos somáticamente mutados de un anticuerpo canino son sustituidos por los correspondientes residuos de la línea germinal de una secuencia homóloga de anticuerpos de la línea germinal. Las secuencias de la cadena pesada y ligera del anticuerpo canino de la invención se alinean por separado con las secuencias de la línea germinal para identificar las secuencias con mayor homología. Las diferencias en el anticuerpo canino de la invención se devuelven a la secuencia de la línea germinal mediante la mutación de posiciones nucleotídicas definidas que codifican dicho aminoácido diferente. El papel de cada aminoácido así identificado como candidato a la retro-mutación debe ser investigado para un papel directo o indirecto en la unión al antígeno y cualquier aminoácido que después de la mutación afecte a cualquier característica deseable del anticuerpo canino no debe ser incluido en el anticuerpo canino final; como ejemplo, los aminoácidos potenciadores de la actividad identificados por el enfoque de mutagénesis selectiva no serán objeto de retro-mutación. Para minimizar el número de aminoácidos sujetos a retromutación, aquellas posiciones de aminoácidos que se encuentren diferentes de la secuencia de la línea germinal más cercana pero idénticas al aminoácido correspondiente en una segunda secuencia de la línea germinal pueden permanecer, siempre que la segunda secuencia de la línea germinal sea idéntica y colineal a la secuencia del anticuerpo canino de la invención. Podría ser necesaria la mutación inversa de los residuos del marco de la diana seleccionados a los residuos donantes correspondientes para restaurar y o mejorar la afinidad.

Tal como se utiliza en el presente documento, la unión "inmunoespecífica" de los anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica con el antígeno que se produce entre el sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por dicho anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas). Un epítopo que se "une específicamente" o que se "une preferentemente" (utilizados indistintamente en el presente documento) a un anticuerpo o a un polipéptido es un término bien conocido en la técnica, y los métodos para determinar dicha unión específica o preferente también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula presenta una "unión específica" o una "unión preferente" si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia concreta que con otras células o sustancias alternativas. Un anticuerpo se "une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítopo del NGF es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros epítopos del NGF o a epítopos que no son del NGF. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o fracción o epítopo) que se une específica o preferentemente a una primera diana mayor puede no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" o "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa la unión preferente.

El término "específicamente" en el contexto de la unión de anticuerpos, se refiere a la alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno específico, es decir, un polipéptido, o epítopo. El anticuerpo que se une específicamente a un antígeno es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a otros antígenos. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil, pero detectable (por ejemplo, el 10% o menos de la unión mostrada al polipéptido de interés). Esta unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión del anticuerpo específico a un polipéptido sujeto, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados. En general, los anticuerpos específicos se unen a un antígeno con una afinidad de unión de 10-7 M o menos, por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, 10-9 M o menos, 10-10 o menos, 10 11 o menos, 10-12 o menos, o 10-13 o menos, etc.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión de un único sitio de combinación de antígenos con un determinante antigénico. La afinidad depende de la proximidad del ajuste estereoquímico entre los sitios de combinación del anticuerpo o la proteína de unión al antígeno y los determinantes del antígeno, del tamaño del área de contacto entre ellos, de la distribución de los grupos cargados e hidrofóbicos, etc. La afinidad de los anticuerpos puede medirse por análisis de equilibrio o por el método de Resonancia de Plasmón de Superficie-"SPR" (por ejemplo BIACORE™. El método SPR se basa en el fenómeno de la resonancia plasmónica superficial (SPR), que se produce cuando las ondas plasmónicas superficiales se excitan en una interfaz metal/líquido. La luz se dirige y se refleja en el lado de la superficie que no está en contacto con la muestra, y la SPR provoca una reducción de la intensidad de la luz reflejada en una combinación específica de ángulo y longitud de onda. Los eventos de unión bimolecular provocan cambios en el índice de refracción en la capa superficial, que se detectan como cambios en la señal SPR.

El término "Kd', tal y como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno. La constante de disociación, Kd, y la constante de asociación, Ka, son medidas cuantitativas de afinidad. En equilibrio, el antígeno libre (Ag) y el anticuerpo libre (Ab) están en equilibrio con el complejo antígeno-anticuerpo (Ag-Ab), y las constantes de velocidad, ka y kd, cuantifican las velocidades de las reacciones individuales. En equilibrio, ka [Ab][Ag]=kd [Ag-Ab]. La constante de disociación, Kd, viene dada por: Kd=kd/ka=[Ag][Ab]/[Ag-Ab]. El Kd tiene unidades de concentración, normalmente M, mM, pM, nM, pM, etc. Cuando se comparan las afinidades de los anticuerpos expresadas como Kd, un valor más bajo indica una mayor afinidad por el NGF. La constante de asociación, Ka, viene dada por: Ka=ka/kd=[Ag-Ab]/[Ag][Ab]. Ka tiene unidades de concentración inversa, más típicamente M-1, mM'1, pM-1, nM'1, pM'1, etc. Como se utiliza en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la fuerza de la unión antígeno-anticuerpo tras la formación de complejos reversibles. Los anticuerpos anti-NGF pueden caracterizarse en términos de la Kd para su unión a una proteína NGF, como la unión "con una constante de disociación (Kd) en el rango de aproximadamente (valor Kd inferior) a aproximadamente (valor Kd superior)"

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, dado que los polipéptidos de esta invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas.

El término "sustitución conservadora de aminoácidos" indica cualquier sustitución de aminoácidos para un residuo de aminoácidos dado, donde el residuo sustituto es tan químicamente similar al del residuo dado que no resulta una disminución sustancial de la función del polipéptido (por ejemplo, la actividad enzimática). Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son comúnmente conocidas en la técnica y se describen ejemplos de las mismas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU Números 6.790.639, 6.774.107, 6.194.167 o 5.350.576. En una realización preferida, una sustitución conservadora de aminoácidos será cualquiera que ocurra dentro de uno de los siguientes seis grupos:

• 1. Pequeños residuos alifáticos, sustancialmente no polares: Ala, Gly, Pro, Ser y Thr;

• 2. Grandes residuos alifáticos, no polares: lie, Leu y Val; Met;

• 3. Residuos polares con carga negativa y sus amidas: Asp y Glu;

• 4. Amidas de residuos polares con carga negativa: Asn y Gin; Su;

• 5. Residuos polares, con carga positiva: Arg y Lys; His; y

• 6. Grandes residuos aromáticos: Trp y Tyr; Phe.

En una realización preferida, una sustitución conservadora de aminoácidos será cualquiera de las siguientes, que se enumeran como pares de residuos nativos (sustituciones conservadoras): Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gin; His); Asp (Glu); Gin (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn;Gin); lie (Leu; Val); Leu (lie; Val); Lys (Arg; Gin; Glu); Met (Leu; lie); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); y Val (lie; Leu).

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y similares pueden utilizarse indistintamente en el presente documento y se refieren a una serie de bases nucleotídicas (también llamadas "nucleótidos") en el ADN y el ARN. El ácido nucleico puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. El término "ácido nucleico" incluye, por ejemplo, moléculas monocatenarias y bicatenarias. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, exones, intrones, una molécula de ADN (por ejemplo, ADNc), una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm), ácidos nucleicos recombinantes, plásmidos y otros vectores, cebadores y sondas. Se incluyen polinucleótidos de 5' a 3' (sentido) y de 3' a 5' (antisentido). Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a un polímero por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como los nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse aún más después de la polimerización, por ejemplo, mediante la conjugación con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, los "tapones", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, las modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen elementos colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), los que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquiladores, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilos normalmente presentes en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados a soportes sólidos. Los OH terminales 5' y 3' pueden estar fosforilados o sustituidos con aminas o grupos orgánicos de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares anoméricos, azúcares epiméricos como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos abásicos como el metil ribosido. Uno o más enlaces fosfodiésteres pueden ser sustituidos por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces de un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en este documento, incluidos el ARN y el ADN.

Tal y como se utiliza en este documento, "vector" significa una construcción, que es capaz de entregar, y preferiblemente expresar, uno o más gen(es) o secuencia(s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, como las células productoras. Los vectores, tal y como se describen en el presente documento, tienen secuencias de control de la expresión, es decir, una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión está "operablemente unida" a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está vinculado de forma operable al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está vinculado de forma operable a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está vinculado de forma operable a una secuencia codificante si se sitúa de forma que facilite la traducción. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. El enlace se realiza mediante la ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

Al igual que un polipéptido puede contener sustituciones conservadoras de aminoácidos, un polinucleótido del mismo puede contener sustituciones conservadoras de codones. Una sustitución de codones se considera conservadora si, al expresarse, produce una sustitución de aminoácidos conservadora, como se ha descrito anteriormente. La sustitución de codones degenerada, que no da lugar a ninguna sustitución de aminoácidos, también es útil en los polinucleótidos según la presente invención. Así, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado útil en una realización de la presente invención puede ser mutado por sustitución de codón degenerado con el fin de aproximar la frecuencia de uso de codón exhibida por una célula huésped de expresión para ser transformada con ella, o para mejorar de otro modo la expresión de la misma.

Un anticuerpo anti-NGF "variante" se refiere en el presente documento a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-NGF "parental" en virtud de la adición, supresión y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia del anticuerpo parental y conserva al menos una actividad deseada del anticuerpo anti-NGF parental. La variante de anti-NGF puede comprender sustituciones conservadoras de aminoácidos en la región hipervariable del anticuerpo, como se describe en el presente documento. Las actividades deseadas pueden incluir la capacidad de unirse al antígeno específicamente, la capacidad de reducir, inhibir o neutralizar la actividad del NGF en un animal. En una realización, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables y/o marco del anticuerpo original. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos una, por ejemplo de una a diez, y preferiblemente de dos a cinco, sustituciones en una o más regiones hipervariables y/o de marco del anticuerpo parental. Normalmente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo original, más preferiblemente al menos un 65%, más preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 95% de identidad de secuencia. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos del anticuerpo parental, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones N-terminal, C-terminal o internas en la secuencia del anticuerpo se interpretará como que afecta a la identidad u homología de la secuencia. La variante conserva la capacidad de unirse al NGF y preferiblemente tiene actividades deseadas que son iguales o superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede tener una mayor afinidad de unión, una mayor capacidad para reducir, inhibir o neutralizar la actividad del NGF en un animal, y/o una mayor capacidad para inhibir la unión del NGF a Trk A y p75.

Trk A, considerado el receptor de alta afinidad del NGF, es un miembro de la familia de los receptores neurotróficos de tirosina quinasa (NTKR). Esta quinasa es un receptor unido a la membrana que, al unirse a la neurotrofina, se fosforila a sí mismo (autofosforilación) y a los miembros de la vía MAPK. La presencia de esta quinasa conduce a la diferenciación celular y puede desempeñar un papel en la memoria descriptiva de los subtipos de neuronas sensoriales. El receptor p75 se considera el receptor de baja afinidad del NGF.

Un ácido nucleico "variante", se refiere en el presente documento a una molécula que difiere en la secuencia de un ácido nucleico "parental". La divergencia de la secuencia de polinucleótidos puede ser el resultado de cambios mutacionales como deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más nucleótidos. Cada uno de estos cambios puede ocurrir solo o en combinación, una o más veces en una secuencia determinada.

El término "aislado" significa que el material (por ejemplo, el anticuerpo o el ácido nucleico) está separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del material, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Con respecto al ácido nucleico, un ácido nucleico aislado puede incluir uno que esté separado de las secuencias 5' a 3' con las que normalmente está asociado en el cromosoma. En las realizaciones preferidas, el material se purificará a más del 95% en peso del material, y más preferiblemente a más del 99% en peso. El material aislado incluye el material in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del material no estará presente. Sin embargo, normalmente el material aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden utilizarse indistintamente. Todos estos términos incluyen también a su progenie, que son todas las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota (por ejemplo, células bacterianas, células de levadura, células de mamíferos y células de insectos) ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden localizarse en un animal transgénico. La célula huésped puede utilizarse como receptor de vectores y puede incluir cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un ácido nucleico heterólogo codificado por un vector.

La palabra "etiqueta" cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo o el ácido nucleico. La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, etiquetas radioisotópicas o fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.

Un "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal que necesita tratamiento y que puede ser afectado por las moléculas de la invención. Los animales que pueden ser tratados de acuerdo con la invención incluyen a los vertebrados, siendo los mamíferos como los caninos ejemplos particularmente preferidos.

Por "composición" se entiende una combinación de agente activo, ya sea una composición química, una composición biológica o bioterapéutica (en particular, proteínas de unión a antígenos como se describe en el presente documento) y otro compuesto o composición que puede ser inerte (por ejemplo, una etiqueta), o activo, como un adyuvante.

Como se define en el presente documento, los "portadores farmacéuticamente aceptables" adecuados para su uso en la invención son bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos portadores incluyen, sin limitación, agua, solución salina, solución salina tamponada, tampón fosfato, soluciones acuosas/alcohol, emulsiones o suspensiones. Se pueden añadir otros diluyentes, adyuvantes y excipientes empleados convencionalmente, de acuerdo con las técnicas convencionales. Dichos portadores pueden incluir el etanol, los polioles y sus mezclas adecuadas, los aceites vegetales y los ésteres orgánicos inyectables. También pueden emplearse tampones y agentes de ajuste del pH. Los tampones incluyen, sin limitación, sales preparadas a partir de un ácido o una base orgánica. Los tampones representativos incluyen, sin limitación, sales de ácidos orgánicos, como sales de ácido cítrico, por ejemplo, citratos, ácido ascórbico, ácido glucónico, histidina-Hel, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido Itálico, Tris, clorhidrato de trimetamina o tampones de fosfato. Los portadores parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa, trehalosa, sacarosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. Los portadores intravenosos pueden incluir reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Los conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, los antimicrobianos, los antioxidantes, los agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), los gases inertes y otros similares también pueden estar presentes en los portadores farmacéuticos. La presente invención no está limitada por la selección del portador. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables, a partir de los componentes descritos anteriormente, que tienen una isotonicidad de pH apropiada, estabilidad y otras características convencionales está dentro del conocimiento de la técnica. Véanse, por ejemplo, textos como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub!, 2000y The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al, APhA Publications, 2003.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" (o "cantidad efectiva") se refiere a una cantidad de un ingrediente activo, por ejemplo, un agente según la invención, suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados cuando se administra a un sujeto o paciente. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición según la invención puede ser fácilmente determinada por un experto en la materia. En el contexto de esta invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es aquella que produce un cambio objetivamente medido en uno o más parámetros asociados a la condición relacionada con el NGF suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos como el alivio o la reducción de la sensación de dolor. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. A efectos de esta invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para tratar, mejorar, reducir la intensidad y/o prevenir el dolor, incluyendo el dolor posquirúrgico, el dolor de la artritis reumatoide y/o el dolor de la artrosis. En algunas realizaciones, la "cantidad efectiva" puede reducir el dolor en reposo (dolor en reposo) o el dolor inducido mecánicamente (incluido el dolor tras el movimiento), o ambos, y puede administrarse antes, durante o después de un estímulo doloroso. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Así, una "cantidad efectiva" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad efectiva si, junto con uno o más agentes, puede lograrse o se logra un resultado deseable. Por supuesto, la cantidad terapéuticamente efectiva variará dependiendo del sujeto y la condición particular que se esté tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la condición, el compuesto particular elegido, el régimen de dosificación a seguir, el tiempo de administración, la forma de administración y similares, todo lo cual puede ser fácilmente determinado por un experto en la materia.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "terapéutico" abarca todo el espectro de tratamientos para una enfermedad, condición o trastorno. Un agente "terapéutico" de la invención puede actuar de manera profiláctica o preventiva, incluyendo aquellos que incorporan procedimientos diseñados para dirigirse a animales que pueden ser identificados como de riesgo (farmacogenética); o de manera que sea de naturaleza mejoradora o curativa; o puede actuar para ralentizar el ritmo o la extensión de la progresión de al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno que está siendo tratado.

En otro aspecto, la invención presenta composiciones veterinarias en las que se proporcionan anticuerpos de la presente invención para usos terapéuticos o profilácticos. La invención presenta un método para tratar a un sujeto canino que tiene un antígeno particular, por ejemplo, uno asociado a una enfermedad o condición. El método incluye la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo recombinante específico para el antígeno particular, con el anticuerpo recombinante descrito en el presente documento.

La cantidad de anticuerpo útil para producir un efecto terapéutico puede determinarse mediante técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la materia. Los anticuerpos se proporcionarán generalmente mediante una técnica estándar dentro de un tampón farmacéuticamente aceptable, y pueden administrarse por cualquier vía deseada. La vía de administración del anticuerpo o de la fracción de unión a antígeno de la invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. En una realización preferida, la vía de administración es parenteral. El término parenteral, tal como se utiliza en el presente documento, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal.

"Dolor", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al dolor de cualquier etiología, incluyendo el dolor agudo y crónico, y cualquier dolor con un componente inflamatorio. Entre los ejemplos de dolor se incluyen el dolor inflamatorio, el dolor postoperatorio por incisión, el dolor neuropático, el dolor por fractura, el dolor por fractura osteoporótica, la neuralgia posherpética, el dolor por cáncer, el dolor resultante de quemaduras, el dolor asociado a quemaduras o heridas, el dolor asociado a traumatismos (incluido el traumatismo craneoencefálico), el dolor neuropático, dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos como la artritis reumatoide, la artrosis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares, y el dolor asociado al cáncer (incluido el "dolor irruptivo" y el dolor asociado al cáncer terminal), la neuropatía periférica y la neuralgia posherpética.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejora o alivio de cualquier aspecto del dolor, incluyendo el dolor agudo, crónico, inflamatorio, neuropático, posquirúrgico, el dolor de la artritis reumatoide o el dolor de la osteoartritis. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: incluyendo la disminución de la gravedad, el alivio de uno o más síntomas asociados con el dolor, incluyendo cualquier aspecto del dolor (como la reducción de la duración del dolor, la reducción de la sensibilidad o sensación de dolor).

El trastorno relacionado con el NGF, tal como se describe en el presente documento, se refiere a un trastorno que incluye enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, dolor e inflamación. En algunas realizaciones de la presente invención, un trastorno relacionado con el NGF se refiere al dolor, en particular al dolor crónico, al dolor inflamatorio, al dolor postoperatorio por incisión, al dolor neuropático, al dolor por fractura, al dolor por fractura osteoporótica, a la neuralgia posherpética, al dolor por cáncer, al dolor resultante de los vómitos, al dolor asociado a la quemadura o a la herida, al dolor asociado al traumatismo (incluido el traumatismo craneal), el dolor neuropático, el dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares, y el dolor asociado al cáncer (incluido el "dolor irruptivo" y el dolor asociado al cáncer terminal), la neuropatía periférica y la neuralgia posherpética.

La "reducción de la incidencia" del dolor significa cualquiera de las reducciones de la gravedad (que puede incluir la reducción de la necesidad y/o la cantidad de (por ejemplo, la exposición a) otros fármacos y/o terapias generalmente utilizadas para estas condiciones, incluyendo, por ejemplo, los opiáceos), la duración y/o la frecuencia (incluyendo, por ejemplo, el retraso o el aumento del tiempo de dolor postquirúrgico en un individuo). Como entienden los expertos en la materia, los individuos pueden variar en cuanto a su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un "método de reducción de la incidencia del dolor de la artritis reumatoide o del dolor de la osteoartritis en un individuo" refleja la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF en base a una expectativa razonable de que dicha administración puede causar probablemente dicha reducción de la incidencia en ese individuo en particular. "Mejorar" un dolor o uno o más síntomas de un dolor (como el dolor de la artritis reumatoide o el dolor de la osteoartritis) significa una disminución o mejora de uno o más síntomas de un dolor en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-FNG. "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.

"Paliar" un dolor o uno o más síntomas de un dolor (como el dolor de la artritis reumatoide o el dolor de la osteoartritis) significa disminuir la extensión de una o más manifestaciones clínicas indeseables del dolor postquirúrgico en un individuo o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF de acuerdo con la invención.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "retrasar" el desarrollo del dolor significa aplazar, dificultar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión del dolor, como el dolor posquirúrgico, el dolor de la artritis reumatoide o el dolor de la osteoartritis. Este retraso puede ser de duración variable, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o de los individuos que se traten. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle dolor. Un método que "retrasa" el desarrollo del síntoma es un método que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un plazo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un plazo determinado, en comparación con la no utilización del método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos, con un número de sujetos estadísticamente significativo.

El "dolor postquirúrgico" (denominado indistintamente "dolor postincisional" o "dolor postraumático") se refiere al dolor que surge o resulta de un traumatismo externo como un corte, pinchazo, incisión, desgarro o herida en el tejido de un individuo (incluido el que surge de todos los procedimientos quirúrgicos, ya sean invasivos o no invasivos). Tal y como se utiliza en el presente documento, el dolor postquirúrgico no incluye el dolor que se produce (surge u origina) sin un traumatismo físico externo. En algunas realizaciones, el dolor posquirúrgico es un dolor interno o externo (incluido el periférico), y la herida, el corte, el traumatismo, el desgarro o la incisión pueden producirse accidentalmente (como en el caso de una herida traumática) o deliberadamente (como en el caso de una incisión quirúrgica). Tal y como se utiliza en el presente documento, el "dolor" incluye la nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor puede evaluarse objetiva y subjetivamente, utilizando puntuaciones de dolor y otros métodos bien conocidos en la técnica. El dolor postquirúrgico, tal y como se utiliza en el presente documento, incluye la alodinia (es decir, el aumento de la respuesta a un estímulo normalmente no nocivo) y la hiperalgesia (es decir, el aumento de la respuesta a un estímulo normalmente nocivo o desagradable), que a su vez puede ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas realizaciones, el dolor se caracteriza por la sensibilidad térmica, la sensibilidad mecánica y/o el dolor en reposo. En algunas realizaciones, el dolor postquirúrgico comprende el dolor inducido mecánicamente o el dolor en reposo. En otras realizaciones, el dolor postquirúrgico comprende el dolor en reposo. El dolor puede ser primario o secundario, como es bien sabido en la técnica.

Antes de que se describan los presentes métodos, debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos particulares y a las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente determinadas realizaciones.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

La invención divulgada en el presente documento se refiere a anticuerpos, que se utiliza indistintamente con el término "proteína de unión a antígeno" como se describe en el presente documento, que se unen específicamente al Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) y en particular a anticuerpos ya sean anticuerpos caninos producidos por tecnología de hibridoma o de visualización de fagos o anticuerpos monoclonales totalmente "caninizados" que se unen específicamente al NGF canino y, por lo tanto, impiden que el NGF canino se una a los receptores TrkA caninos y, en menor medida, a los receptores p75 caninos, sirviendo así de antagonista en el sentido de que se impide que la vía de señalización sea activada por el NGF.

El NGF fue la primera neurotrofina en ser identificada, y su papel en el desarrollo y la supervivencia de las neuronas periféricas y centrales ha sido bien caracterizado. Se ha demostrado que el NGF es un factor crítico de supervivencia y mantenimiento en el desarrollo de las neuronas sensoriales periféricas y embrionarias y de las neuronas colinérgicas del cerebro anterior (Smeyne et al. (1994) Nature 368:246-249 Crowley et al. (1994) Cell 76:1001-1011). El NGF regula la expresión de neuropéptidos en las neuronas sensoriales (Lindsay et al. (1989) Nature 337:362-364) y su actividad está mediada por dos receptores diferentes unidos a la membrana, el receptor TrkA y lo que se considera el receptor de neurotrofina común p75 de baja afinidad.

Se ha demostrado que el NGF está elevado en los trastornos relacionados con el NGF, en los que una cantidad elevada de NGF está presente en los tejidos lesionados o enfermos. Un trastorno relacionado con el NGF, puede definirse como un aumento del dolor debido a la elevación del NGF en un tejido lesionado, enfermo o dañado. El dolor, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un trastorno que incluye el dolor crónico, el dolor inflamatorio, el dolor postoperatorio por incisión, el dolor neuropático, el dolor por fractura, el dolor por fractura osteoporótica, la neuralgia posherpética, el dolor por cáncer, el dolor derivado de quemaduras, el dolor asociado a una quemadura o herida, el dolor asociado a un traumatismo (incluido el traumatismo craneoencefálico), el dolor neuropático, el dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos, como el dolor crónico, la artritis reumatoide, la artrosis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares, y el dolor asociado al cáncer (incluidos el "dolor irruptivo" y el dolor asociado al cáncer terminal), la neuropatía periférica y la neuralgia posherpética.

En una realización de la presente invención, un trastorno de NGF se define como osteoartritis en caninos. La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular degenerativa de progresión lenta que se caracteriza por la pérdida de cartílago articular y la consiguiente exposición del hueso subcondral en los caninos. Esto acaba provocando un trastorno insidioso que se autoperpetúa y que se caracteriza por el dolor articular. La formación de hueso nuevo se produce en respuesta a la inflamación crónica y al daño del tejido local en un intento de limitar tanto el movimiento como el dolor. Macroscópicamente, hay pérdida de cartílago articular, un estrechamiento del espacio articular, esclerosis del hueso subcondral y la producción de osteofitos articulares (Enfoque veterinario: Vol 17 No 3 ; 2007)

En los caninos, la aparición de la OA primaria depende de la raza. La edad media de inicio es de 3,5 años en los Rottweilers y de 9,5 años en los Caniches, por ejemplo, con un amplio rango de inicio para otras razas, así como para las razas mixtas. Las enfermedades ortopédicas del desarrollo y la osteoartritis asociada son las enfermedades articulares más comunes en los perros, y representan alrededor del 70% de las visitas médicas por enfermedades articulares y problemas relacionados dentro del esqueleto apendicular. El 22% de los casos eran perros de un año o menos. La incidencia de la OA aumenta por los traumatismos, así como por la obesidad, el envejecimiento y las anomalías genéticas. En particular, la edad puede ser un factor en la incidencia de la OA, ya que >50% de los casos de artritis se observan en perros de entre 8 y 13 años. Las enfermedades musculoesqueléticas son muy comunes en los pacientes geriátricos, y casi el 20% de los perros ancianos presentan trastornos ortopédicos. En los Labradores Retriever de más de 8 años, es típica la OA en varias articulaciones (codo, hombro, cadera, rodilla). Además, el tamaño del canino también influye en la aparición de la OA. El 45% de los perros con artritis son de raza grande. Entre ellos, más del 50% son perros de razas gigantes, mientras que sólo el 28% son perros de razas medianas y el 27% son perros de razas pequeñas. La necesidad de intervención farmacéutica para el alivio del dolor de la OA en los caninos es muy alta.

Como se indica en el presente documento, los niveles elevados de NGF son indicativos de un trastorno relacionado con el NGF, particularmente en la OA. Se han notificado niveles elevados de NGF en ratones artríticos transgénicos junto con un aumento del número de mastocitos (Aloe, et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspectos 15: 139 143 (1993)). La publicación PCT n° WO 02/096458 divulga el uso de anticuerpos anti NGF de ciertas propiedades en el tratamiento de varios trastornos relacionados con el NGF, como la condición inflamatoria (por ejemplo, la artritis reumatoide). Se ha informado de que un anticuerpo purificado contra el FNG inyectado en ratones transgénicos artríticos portadores del gen del factor de necrosis tumoral humano provocó una reducción del número de mastocitos, así como una disminución de los niveles de histamina y sustancia P en la sinovia de los ratones con artritis (Aloe et al., Rheumatol. Int. 14: 249-252 (1995)). Se ha demostrado que la administración exógena de un anticuerpo contra el NGF redujo el nivel elevado de TNFa que se produce en los ratones artríticos (Marmi et al., Rheumatol. Int. 18: 97-102 (1998)). Se ha informado de la existencia de anticuerpos anti-NGF en roedores. Véase, por ejemplo Hongo et al., Hybridoma (2000) 19(3): 215-227 Ruberti et al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5): 559 568. Sin embargo, cuando los anticuerpos de roedores se utilizan terapéuticamente en mamíferos no murinos, se desarrolla una respuesta de anticuerpos antimurinos en un número significativo de individuos tratados. Por lo tanto, existe una gran necesidad de proteínas de unión a antígenos antagonistas del NGF, incluyendo anticuerpos antagonistas del NGF de la presente invención para uso canino, particularmente para su uso en el tratamiento de la OA.

Aunque las propiedades de los anticuerpos los convierten en agentes terapéuticos muy atractivos, hay una serie de limitaciones. La gran mayoría de los anticuerpos monoclonales (mAb) son de origen roedor, como se ha señalado anteriormente. Cuando dichos anticuerpos se administran en una especie diferente, los pacientes pueden montar su propia respuesta de anticuerpos a dichos anticuerpos xenogénicos. Dicha respuesta puede resultar en la eventual neutralización y eliminación del anticuerpo. Como se ha descrito anteriormente, los ratones se utilizan ampliamente en la producción de anticuerpos monoclonales. Uno de los problemas que plantea el uso de anticuerpos producidos por una especie concreta, en general inicialmente en el ratón, es que los sujetos no murinos que son tratados con dichos anticuerpos reaccionan a los anticuerpos del ratón como si fueran una sustancia extraña, creando así un nuevo conjunto de anticuerpos contra los anticuerpos del ratón. Los anticuerpos de ratón son "vistos" por el sistema inmunitario no murino, por ejemplo el canino, como extraños, y el sujeto monta entonces una respuesta inmunitaria contra la molécula. Los expertos en la materia reconocerán la necesidad de poder tratar a un sujeto con un anticuerpo específico para el antígeno, pero que ese anticuerpo sea específico para la especie. Parte de la reacción generada por la administración de anticuerpos entre especies, por ejemplo un anticuerpo monoclonal de ratón que se administra a un canino, puede ir desde una forma leve, como una erupción, hasta una respuesta más extrema y potencialmente mortal, como la insuficiencia renal. Esta respuesta inmunitaria también puede disminuir la eficacia del tratamiento, o crear una reacción futura si el sujeto recibe un tratamiento posterior que contenga anticuerpos de ratón. En consecuencia, nos propusimos superar esta desventaja mediante la "caninización" de un anticuerpo. En particular, este proceso se centra en las regiones marco del dominio variable de la inmunoglobulina, pero también podría incluir las regiones determinantes del complemento (CDR) del dominio variable. En esta divulgación se describen los pasos de habilitación y la reducción a la práctica de este proceso.

El proceso de modificación de un anticuerpo monoclonal de un animal para hacerlo menos inmunogénico para la administración terapéutica a especies se ha perseguido agresivamente y se ha descrito en varias publicaciones (por ejemplo Antibody Engineering: Una guía práctica. Carl A. K. Borrebaeck ed. W.H. Freeman and Company, 1992). Sin embargo, este proceso no se ha aplicado para el desarrollo de terapias o diagnósticos para los no humanos, en particular los caninos, hasta hace poco. De hecho, se ha publicado muy poco con respecto a los dominios variables caninos. Wasserman y Capra, Biochem. 6, 3160 (1977), determinó la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de una cadena pesada de IgM canina y de IgA canina. Wasserman y Capra, Immunochem. 15, 303 (1978), determinó la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera K de una IgA canina. McCumber y Capra, Mol. Inmunol.

16, 565 (1979), revelan la secuencia completa de aminoácidos de una cadena mu canina. Tang et al., Vet. Inmunología Inmunopatología 80, 259 (2001), divulga un único ADNc de la cadena IgG-A canina y cuatro secuencias de proteínas de la cadena IgG-A canina. Describe la amplificación por PCR de una biblioteca de ADNc de bazo canino con un cebador oligonucleótido degenerado diseñado a partir de las regiones conservadas de las IgG humanas, de ratón, de cerdo y de bovino. La escasa información disponible sobre los anticuerpos caninos ha impedido su desarrollo como terapéutica para el tratamiento de enfermedades caninas.

Estas limitaciones señaladas han impulsado el desarrollo de tecnologías de ingeniería conocidas como "especiación" y son bien conocidas por los expertos en la materia en términos de "humanización" de los anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos humanizados pueden generarse como anticuerpos quiméricos o fragmentos de los mismos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos (es decir, "anticuerpo receptor" o "anticuerpo de la especie diana") en los que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (es decir, "anticuerpo donante" o "anticuerpo de la especie originaria"), como el ratón, con las propiedades deseadas, como la especificidad, la afinidad y la potencia. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Esta estrategia de humanización se denomina "injerto de CDR", tal y como se informó para la fabricación de anticuerpos humanizados (Winter, Pat. de EE.UU. N° 5.225.539). Podría ser necesaria la mutación inversa de los residuos del marco de la diana seleccionados a los residuos donantes correspondientes para restaurar y o mejorar la afinidad. Los métodos basados en la estructura también pueden emplearse para la humanización y la maduración de la afinidad, por ejemplo, como se describe para la humanización en Solicitud de Patente de EE.UU. Ser. N° 10/153.159 y aplicaciones relacionadas. La comparación de los residuos esenciales del armazón requeridos en la humanización de varios anticuerpos, así como el modelado informático basado en las estructuras cristalinas de los anticuerpos, revelaron un conjunto de residuos del armazón denominados "residuos de la zona Vernier" (Foote, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992)). Además, se ha sugerido que varios residuos en la zona de interfaz VH-VL son importantes para mantener la afinidad por el antígeno (Santos, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 60: 169-94 (1998) Kettleborough, et al., Protein Engin. 4:773-783 (1991)). Estrategias similares para la "caninización" de anticuerpos para su uso en perros se describen en el documento de EE.UU. 7.261.890.

Alternativamente, los anticuerpos humanizados pueden contener las CDR de una secuencia no humana injertada en grupos (por ejemplo, bibliotecas) de regiones marco humanas individuales. Este anticuerpo recién diseñado es capaz de unirse al mismo antígeno que el anticuerpo original. La región constante del anticuerpo se deriva de un anticuerpo humano. La metodología para llevar a cabo este aspecto se describe generalmente como barajar el marco (Dall'Acqua, Methods, 36:43-60 (2005)). Además, el anticuerpo humanizado puede contener secuencias de dos o más regiones marco derivadas de al menos dos secuencias de línea germinal de anticuerpos humanos con alta homología con la especie donante. Los anticuerpos diseñados con este método se describen como anticuerpos híbridos (Rother et al., Pat. De EE.UU. N° 7.393.648) y puede ser aplicable a la especiación fuera de la humanización, por ejemplo para la caninización.

Los enfoques descritos anteriormente utilizan esencialmente regiones marco enteras de una o más cadenas pesadas variables de anticuerpos o cadenas ligeras variables de la especie objetivo que están diseñadas para recibir las CDR de la especie donante. En algunos casos, se utiliza la mutación posterior de residuos seleccionados en la región variable para mejorar la presentación de las CDR. El diseño de anticuerpos que minimicen la reacción inmunogénica en un sujeto a las secuencias no nativas del anticuerpo, y que al mismo tiempo preserven las regiones de unión al antígeno del anticuerpo lo suficiente como para mantener la eficacia, ha demostrado ser un reto.

Otro desafío para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos dirigidos a proteínas es que los epítopos de la proteína homóloga en una especie diferente son frecuentemente diferentes, y el potencial de reactividad cruzada con otras proteínas también es diferente. En consecuencia, hay que fabricar, probar y desarrollar anticuerpos para el objetivo específico en la especie concreta que se va a tratar.

Los anticuerpos se dirigen a un antígeno a través de su unión a un epítopo específico en un antígeno mediante la interacción con la región variable de la molécula de anticuerpo. Además, los anticuerpos tienen la capacidad de mediar, inhibir (como en el caso de la proteína antagónica de unión a antígeno anti-NGF de la presente invención) y/o iniciar una variedad de actividades biológicas. Existe una amplia gama de funciones para los anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, los anticuerpos pueden modular las interacciones receptor-ligando como agonistas o antagonistas. La unión de anticuerpos puede iniciar la señalización intracelular para estimular el crecimiento celular, la producción de citoquinas o la apoptosis. Los anticuerpos pueden llevar agentes unidos a la región del Fe a sitios específicos. Los anticuerpos también provocan citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC), citotoxicidad mediada por complemento (CDC) y fagocitosis. También hay anticuerpos alterados en los que se han eliminado las funciones de ADCC, CDC, unión a C1q y fagocitosis. En una realización de la presente invención el anticuerpo de la presente invención comprende alteraciones en la región Fc del anticuerpo que altera la función efectora de dicho anticuerpo.

Caninización

Tal como se utiliza en el presente documento, "anticuerpo caninizado" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un canino y/o que ha sido fabricado utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica o divulgadas en el presente documento. Esta definición de anticuerpo caninizado incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada canina o al menos un polipéptido de cadena ligera canina. La "especiación", per se, de los anticuerpos, y en particular la humanización de los anticuerpos es un campo de estudio bien conocido por los expertos en la materia. Hasta hace poco se desconocía si la especiación de los anticuerpos más allá de la humanización daría lugar a un anticuerpo terapéutico que pudiera ser eficaz en cualquier otra especie. La presente invención ejemplifica la caninización de un anticuerpo anti-NGF para uso terapéutico en perros.

Los anticuerpos quiméricos comprenden secuencias de al menos dos especies diferentes. Como ejemplo, pueden utilizarse técnicas de clonación recombinante para incluir regiones variables, que contienen los sitios de unión al antígeno, de un anticuerpo no canino (es decir, un anticuerpo preparado en una especie no canina inmunizada con el antígeno) y regiones constantes derivadas de una inmunoglobulina canina.

Los anticuerpos caninizados son un tipo de anticuerpo quimérico en el que los residuos de la región variable responsables de la unión al antígeno (es decir, los residuos de una región determinante de la complementariedad, región determinante de la complementariedad abreviada o cualquier otro residuo que participe en la unión al antígeno) se derivan de una especie no canina, mientras que los residuos restantes de la región variable (es decir, los residuos de las regiones marco) y las regiones constantes se derivan, al menos en parte, de secuencias de anticuerpos caninos. Un subconjunto de residuos de la región marco y de la región constante de un anticuerpo caninizado puede proceder de fuentes no caninas. Las regiones variables de un anticuerpo caninizado también se describen como caninizadas (es decir, una región variable de cadena ligera o pesada caninizada). La especie no canina es típicamente la utilizada para la inmunización con antígeno, como el ratón, la rata, el conejo, el primate no humano u otra especie de mamífero no canino.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son residuos de las regiones variables de los anticuerpos que participan en la unión del antígeno. Existen varios sistemas de numeración para identificar las CDR de uso común. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia, y la de Clothia en la ubicación de las regiones estructurales del bucle. La definición de AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Clothia. Un anticuerpo caninizado de la invención puede ser construido para comprender una o más CDR. Además, las CDR pueden utilizarse por separado o en combinación en moléculas sintéticas como los SMIP y los pequeños anticuerpos miméticos.

Los residuos marco son aquellos residuos de las regiones variables de los anticuerpos que no son residuos hipervariables o CDR. Los residuos del marco pueden derivarse de un anticuerpo canino natural, como un marco canino que es sustancialmente similar a una región del marco del anticuerpo de la invención. También pueden utilizarse secuencias marco artificiales que representen un consenso entre secuencias individuales. Al seleccionar una región marco para la caninización, se pueden preferir las secuencias que están ampliamente representadas en los caninos sobre las secuencias menos pobladas. Pueden realizarse mutaciones adicionales de las secuencias aceptoras del marco canino para restaurar residuos murinos que se cree que están implicados en los contactos con el antígeno y/o residuos implicados en la integridad estructural del sitio de unión al antígeno, o para mejorar la expresión del anticuerpo.

El injerto de las CDR se realiza sustituyendo una o más CDR de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo caninizado u otro anticuerpo que comprenda residuos marco deseados) con las CDR de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo no caninizado). Los anticuerpos aceptores pueden seleccionarse en base a la similitud de los residuos de la estructura entre un anticuerpo aceptor candidato y un anticuerpo donante. Por ejemplo, se identifican las regiones marco caninas que tienen una homología de secuencia sustancial con cada región marco del anticuerpo no canino correspondiente, y las CDR del anticuerpo no canino se injertan en el compuesto de las diferentes regiones marco caninas.

El análisis de las estructuras tridimensionales de los complejos anticuerpo-antígeno, combinado con el análisis de los datos de la secuencia de aminoácidos disponibles, puede utilizarse para modelar la variabilidad de la secuencia en base a la disimilitud estructural de los residuos de aminoácidos que se producen en cada posición dentro de la CDR. Las CDR de la presente invención también pueden utilizarse en pequeños miméticos de anticuerpos, que comprenden dos regiones CDR y una región marco (Qui et al. Nature Biotechnology Vol 25;921-929; agosto de 2007).

Las estructuras receptoras para el injerto de las CDR o CDR abreviado pueden ser modificadas adicionalmente para introducir los residuos deseados. Por ejemplo, los marcos aceptores pueden comprender una región variable de cadena pesada de una secuencia consenso canina, opcionalmente con residuos donantes no caninos en una o más de las posiciones. Tras el injerto, se pueden realizar cambios adicionales en las secuencias donante y/o aceptora para optimizar la unión del anticuerpo y su funcionalidad. Véase, por ejemplo Publicación internacional n° WO 91/09967.

La presente invención proporciona además células y líneas celulares que expresan anticuerpos de la invención. Las células huésped representativas incluyen células bacterianas, de levadura, de mamífero y humanas, como las células CHO, las células HEK-293, las células HeLa, las células CV-1 y las células COS. Los métodos para generar una línea celular estable tras la transformación de una construcción heteróloga en una célula huésped son conocidos en la técnica. Entre las células huésped no mamíferas representativas se encuentran las de los insectos (Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3): 103-112). También se pueden producir anticuerpos en animales transgénicos (Houdebine (2002) Curr. Opinen. Biotechnol. 13(6):625-629) y plantas transgénicas (Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45).

Como se ha discutido anteriormente, los anticuerpos monoclonales, quiméricos y caninizados, que han sido modificados, por ejemplo, suprimiendo, añadiendo o sustituyendo otras porciones del anticuerpo, por ejemplo, la región constante, también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado de la siguiente manera: (i) suprimiendo la región constante; (ii) sustituyendo la región constante por otra región constante, por ejemplo, una región constante destinada a aumentar la vida media, la estabilidad o la afinidad del anticuerpo, o una región constante de otra especie o clase de anticuerpo; o (iii) modificando uno o más aminoácidos en la región constante para alterar, por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, la función de las células efectoras, la unión del receptor Fc (FcR), la fijación del complemento, entre otros. En una realización de la presente invención el anticuerpo de la invención comprende una región Fc alterada que altera la función efectora del anticuerpo.

Los métodos para alterar la región constante de un anticuerpo son conocidos en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector, como el FcR en una célula, o el componente C1 del complemento pueden producirse sustituyendo al menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo por un residuo diferente (véase por ejemplo EP 388.151 A1, Pat. de EE.UU. N° 5.624.821 y Pat. de EE.UU. N° 5.648.260).

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fc de un anticuerpo por un FcR (por ejemplo, Fc.gamma.R1), o por la unión de C1q sustituyendo el residuo o residuos especificados por un residuo o residuos que tengan una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o introduciendo un grupo funcional cargado, como glutamato o aspartato, o quizás un residuo aromático no polar como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N° 5.624.821). El anticuerpo o el fragmento de unión del mismo puede conjugarse con una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo. En una realización, la proteína que se conjuga es un anticuerpo o un fragmento del mismo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos no limitantes incluyen, calicheamicina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestoterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina y 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino), antraciclinas (p. ej, daunorubicina y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, bleomicina, mitramicina y antramicina) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Las técnicas para conjugar dichas moléculas con las proteínas son bien conocidas en la técnica.

Composiciones derivadas y métodos para fabricar las composiciones

La presente invención abarca composiciones, incluidas composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o polipéptidos de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos, proteínas de unión a antígeno o polipéptidos (que pueden o no ser un anticuerpo) que se unen al NGF canino, y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos o polipéptidos que se unen al NGF. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, como excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica. La invención también abarca realizaciones aisladas de anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos. La invención también abarca realizaciones de anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos sustancialmente puros.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona nuevos anticuerpos monoclonales caninizados que se unen específicamente al NGF canino. En una realización, un anticuerpo monoclonal de la invención se une al NGF e impide su unión a, y la activación de, sus receptores Trk A y en menor medida p75, impidiendo así la cascada de señalización como se describe en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales se identifican en el presente documento como "SM57", "SM58", "SM66", "CanE3M65-12" y "CANSSM-QC23-VL/CANSSM57-VH" ("SSMQC23HCLC")

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno caninizada aislada en la que la cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO. 16 (CAN-E3M-VL) y la cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO. 17 (CAN-N2G9-VH).

En una o más realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno caninizada aislada que comprende una cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO. 26 (CAN-SSME3M-VL) y la cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO. 27 (CAN-SSM57-VH).

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno caninizada aislada que comprende una cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO. 30 (CAN-QC23-VL) y una cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO. 27 (CAN-SSM57-VH).

Otra realización de la invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican las diversas proteínas de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente.

La presente invención proporciona anticuerpos y péptidos monoclonales recombinantes y sus usos en administraciones clínicas y procedimientos científicos, incluyendo procedimientos de diagnóstico. Con la llegada de los métodos de la biología molecular y la tecnología recombinante, es posible producir anticuerpos y moléculas similares a los anticuerpos por medios recombinantes y, por tanto, generar secuencias de genes que codifican secuencias de aminoácidos específicas que se encuentran en la estructura polipeptídica de los anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante la clonación de las secuencias genéticas que codifican las cadenas polipeptídicas de dichos anticuerpos o mediante la síntesis directa de dichas cadenas polipeptídicas, con ensamblaje de las cadenas sintetizadas para formar estructuras tetraméricas activas (H2L2) con afinidad por epítopos y determinantes antigénicos específicos. Esto ha permitido producir fácilmente anticuerpos con secuencias características de anticuerpos neutralizantes de diferentes especies y fuentes.

Independientemente de la fuente de los anticuerpos, o de cómo se construyan recombinantemente, o de cómo se sinteticen, in vitro o in vivo, utilizando animales transgénicos, grandes cultivos celulares de laboratorio o comerciales, utilizando plantas transgénicas, o por síntesis química directa sin emplear organismos vivos en ninguna etapa del proceso, todos los anticuerpos tienen una estructura tridimensional general similar. Esta estructura se suele denominar H2L2 y hace referencia al hecho de que los anticuerpos suelen estar formados por dos cadenas de aminoácidos ligeras (L) y 2 cadenas de aminoácidos pesadas (H). Ambas cadenas tienen regiones capaces de interactuar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Las regiones que interactúan con la diana se denominan regiones "variables" o "V" y se caracterizan por las diferencias en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de diferente especificidad antigénica. Las regiones variables de las cadenas H o L contienen las secuencias de aminoácidos capaces de unirse específicamente a las dianas antigénicas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región de unión a antígeno" se refiere a la porción de una molécula de anticuerpo que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. La región de unión del anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos "marco" necesarios para mantener la conformación adecuada de los residuos de unión al antígeno. Dentro de las regiones variables de las cadenas H o L que proporcionan las regiones de unión al antígeno hay secuencias más pequeñas denominadas "hipervariables" debido a su extrema variabilidad entre anticuerpos de diferente especificidad. Estas regiones hipervariables también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Estas regiones CDR representan la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica concreta.

Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, independientemente de la especie, se ha encontrado que las ubicaciones posicionales de estas secuencias críticas de aminoácidos dentro de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras tienen ubicaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y ligeras variables de todos los anticuerpos tienen cada una tres regiones CDR, cada una de ellas no contigua con las demás. En todas las especies de mamíferos, los péptidos de los anticuerpos contienen regiones constantes (es decir, altamente conservadas) y variables, y, dentro de estas últimas, están las CDR y las llamadas "regiones marco" formadas por secuencias de aminoácidos dentro de la región variable de la cadena pesada o ligera pero fuera de las CDR.

La presente invención proporciona además un vector que incluye al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Como el código genético es degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto. Utilizando el código genético, se pueden identificar una o más secuencias de nucleótidos diferentes, cada una de las cuales sería capaz de codificar el aminoácido. La probabilidad de que un oligonucleótido concreto constituya, de hecho, la secuencia de codificación real puede estimarse teniendo en cuenta las relaciones de emparejamiento de bases anómalas y la frecuencia con la que un codón concreto se utiliza realmente (para codificar un aminoácido concreto) en las células eucariotas o procariotas que expresan un anticuerpo o una porción de antiNGF. Tales "reglas de uso de codones" son divulgadas por Lathe, et aI., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Utilizando las "reglas de uso de codones" de Lathe, se puede identificar una única secuencia de nucleótidos, o un conjunto de secuencias de nucleótidos que contenga una secuencia teórica de nucleótidos "más probable" capaz de codificar secuencias anti-NGF. También se pretende que las regiones de codificación de anticuerpos para su uso en la presente invención puedan proporcionarse también mediante la alteración de genes de anticuerpos existentes utilizando técnicas biológicas moleculares estándar que den lugar a variantes (agonistas) de los anticuerpos y péptidos descritos en el presente documento. Dichas variantes incluyen, pero no se limitan a supresiones, adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos o péptidos anti-NGF.

Por ejemplo, una clase de sustituciones son las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Dichas sustituciones son las que sustituyen un aminoácido determinado en un péptido de anticuerpo anti-NGF por otro aminoácido de características similares. Típicamente se consideran sustituciones conservadoras los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu, y lie; el intercambio de los residuos hidroxilos Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amídicos Asn y Gin, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg, los reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr, y similares. La orientación relativa a los cambios de aminoácidos que probablemente sean fenotípicamente silenciosos se encuentra en Bowie et aI., 247 Science 1306-10 (1990).

Los anticuerpos o péptidos anti-NGF variantes o agonistas pueden ser totalmente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. Las variantes totalmente funcionales suelen contener sólo variaciones conservadoras o variaciones en residuos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener la sustitución de aminoácidos similares que no producen ningún cambio o un cambio insignificante en la función. Alternativamente, estas sustituciones pueden afectar positiva o negativamente a la función en algún grado. Las variantes no funcionales suelen contener una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones o truncamientos de aminoácidos no conservadores o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un residuo crítico o en una región crítica.

Los aminoácidos que son esenciales para la función pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica, como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina. Cunningham et aI., 244 Science 1081-85 (1989). Este último procedimiento introduce mutaciones de una sola alanina en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se someten a pruebas de actividad biológica, como la unión al epítopo o la actividad ADCC in vitro. Los sitios críticos para la unión entre el ligando y el receptor también pueden determinarse mediante análisis estructurales como la cristalografía, la resonancia magnética nuclear o el etiquetado por fotoafinidad. Smith et aI., 224 J. Mol. BioI. 899-904 (1992) de Vos et aI., 255 Science 306-12 (1992).

Además, los polipéptidos a menudo contienen aminoácidos distintos de los veinte aminoácidos "naturales". Además, muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos terminales, pueden ser modificados por procesos naturales, como el procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o por técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Las modificaciones conocidas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción de hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a las proteínas mediada por el ARN de transferencia, como la arginilación, y ubiquitinación. Estas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en la literatura científica. Varias modificaciones especialmente comunes, como la glicosilación, la fijación de lípidos, la sulfatación, la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de los textos básicos, como Proteins-Structure and Molecular Properties (2a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993). Existen muchas revisiones detalladas sobre este tema, como la de Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983) Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); y Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).

En consecuencia, los anticuerpos y péptidos de la presente invención también abarcan derivados o análogos en los que un residuo de aminoácido sustituido no es uno codificado por el código genético. Del mismo modo, las adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos, así como las variaciones y modificaciones que se acaban de describir, pueden ser igualmente aplicables a la secuencia de aminoácidos del antígeno NGF y/o al epítopo o péptidos del mismo, y por lo tanto están comprendidos en la presente invención. Como se ha mencionado anteriormente, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal según la presente invención son específicamente eficaces en el reconocimiento del NGF.

Derivados de anticuerpos

Los derivados de anticuerpos están incluidos en el ámbito de la presente invención. Un "derivado" de un anticuerpo contiene elementos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Las modificaciones covalentes de la proteína se incluyen en el ámbito de esta invención. Dichas modificaciones pueden introducirse en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente derivador orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Por ejemplo, la derivatización con agentes bifuncionales, bien conocidos en la técnica, es útil para reticular el anticuerpo o el fragmento a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros portadores macromoleculares.

Los derivados también incluyen anticuerpos monoclonales marcados radioactivamente. Por ejemplo, con yodo radiactivo (251,1311), carbono (4C), azufre (35S), indio, tritio (H3) o similares; conjugados de anticuerpos monoclonales con biotina o avidina, con enzimas, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la beta-D-galactosidasa, la glucosa oxidasa, la glucoamilasa, la anhidrasa de ácidos carboxílicos, la acetilcolina esterasa, la lisozima, la malato deshidrogenasa o la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y también conjugados de anticuerpos monoclonales con agentes bioluminiscentes (como la luciferasa), agentes quimioluminiscentes (como los ésteres de acridina) o agentes fluorescentes (como las ficobiliproteínas).

Otro anticuerpo bifuncional derivado de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, generado por la combinación de partes de dos anticuerpos separados que reconocen dos grupos antigénicos diferentes. Esto puede lograrse mediante técnicas de reticulación o recombinación. Además, pueden añadirse elementos al anticuerpo o a una parte del mismo para aumentar su vida media in vivo (por ejemplo, alargando el tiempo de eliminación del flujo sanguíneo). Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, la adición de elementos de PEG (también denominados pegilación), y son bien conocidas en la técnica. Véase la solicitud de Patente de los Estados Unidos. Pub. No 20030031671.

Expresión recombinante de anticuerpos

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal sujeto se introducen directamente en una célula huésped, y la célula se incuba en condiciones suficientes para inducir la expresión del anticuerpo codificado. Después de introducir los ácidos nucleicos en una célula, ésta se incuba normalmente a 37°C, a veces bajo selección, durante un período de 1 a 24 horas para permitir la expresión del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se secreta en el sobrenadante del medio en el que la célula está creciendo. Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales se han producido como moléculas nativas en líneas de hibridoma murino. Además de esa tecnología, la presente invención prevé la expresión de anticuerpos monoclonales mediante ADN recombinante. Esto permite la producción de anticuerpos caninizados, así como un espectro de derivados de anticuerpos y proteínas de fusión en una especie huésped de elección.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un anticuerpo, una porción o un polipéptido anti-NGF de la presente invención puede recombinarse con el ADN del vector de acuerdo con las técnicas convencionales, incluyendo extremos despuntados o escalonados para la ligadura, la digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, el relleno de los extremos cohesivos según corresponda, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y la ligadura con ligasas apropiadas. Las técnicas para tales manipulaciones se divulgan, por ejemplo, en Maniatis et al., MOLECULAR CLo NiNG, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 y 1989), y Ausubel et al. 1993 supra, puede utilizarse para construir secuencias de ácido nucleico que codifiquen una molécula de anticuerpo monoclonal o una región de unión a antígeno de la misma.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, como el ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de la transcripción y la traducción y dichas secuencias están "enlazadas de forma operativa" con secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Un enlace operable es un enlace en el que las secuencias de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se pretende expresar están conectadas de tal manera que permiten la expresión del gen como péptidos anti-NGF o porciones de anticuerpos en cantidades recuperables. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de los genes puede variar de un organismo a otro, como es bien sabido en la técnica análoga. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 supra; Ausubel et al., 1993 supra.

La presente invención abarca, en consecuencia, la expresión de un anticuerpo o péptido anti-NGF, en células procariotas o eucariotas. Los huéspedes adecuados incluyen huéspedes bacterianos o eucariotas, incluyendo bacterias, levaduras, insectos, hongos, aves y células de mamíferos in vivo, o in situ, o células huésped de origen mamífero, insecto, ave o levadura. La célula o tejido de mamífero puede ser de origen humano, de primate, de hámster, de conejo, de roedor, de vaca, de cerdo, de oveja, de caballo, de cabra, de perro o de gato, pero puede utilizarse cualquier otra célula de mamífero.

En una realización, la secuencia de nucleótidos de la invención se incorporará a un plásmido o vector viral capaz de replicarse de forma autónoma en el huésped receptor. Para ello, se puede emplear cualquiera de una amplia variedad de vectores. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1993 supra. Los factores de importancia en la selección de un plásmido o vector viral particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas de aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped particular; y si es deseable poder "trasladar" el vector entre células receptoras de diferentes especies.

Ejemplos de vectores procariotas conocidos en la técnica incluyen plásmidos como los capaces de replicarse en E. coli (como, por ejemplo, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184, .pi.vX). Tales plásmidos son, por ejemplo, divulgados por Maniatis et aI., 1989 supra; Ausubel et al, 1993 supra. Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221 , pT127, etc. Dichos plásmidos son divulgados porGryczan, en THE MOLEC. BIO. DE LOS BACILIOS 307 329 (Academic Press, NY, 1982). Entre los plásmidos de Streptomyces adecuados se encuentra el plJ101 (Kendall et aI., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987), y bacteriófagos de Streptomyces como el phLC31 (Chater et aI., en SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungría 1986). Los plásmidos de Pseudomonas se revisan en John et aI., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol.

729-42 (1978); y Ausubel et aI., 1993 supra.

Alternativamente, los elementos de expresión génica útiles para la expresión de ADNc que codifica anticuerpos o péptidos anti-NGF incluyen, pero no se limitan a (a) promotores de transcripción viral y sus elementos potenciadores, como el promotor temprano de SV40 (Okayama et aI., 3 Mol. Celular. BioI. 280 (1983), LTR del virus del sarcoma de Rous (Gorman et aI., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982), y el LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (Grosschedl et aI., 41 Cell 885 (1985); (b) regiones de empalme y sitios de poliadenilación como los derivados de la región tardía del SV40 (Okayarea et aI., 1983), y (c) sitios de poliadenilación como en el SV40 (Okayama et aI., 1983).

Los genes de ADNc de inmunoglobulina pueden expresarse como se describe en Weidle et aI., 51 Gene 21 (1987), utilizando como elementos de expresión el promotor temprano de SV40 y su potenciador, los potenciadores del promotor de la cadena H de inmunoglobulina de ratón, el empalme del ARNm de la región tardía de SV40, la secuencia intermedia de S-globina de conejo, los sitios de poliadenilación de inmunoglobulina y S-globina de conejo y los elementos de poliadenilación de SV40. Para los genes de inmunoglobulina compuestos en parte por ADNc y en parte por ADN genómico (Whittle et aI., 1 Protein Engin. 499 (1987", el promotor transcripcional puede ser citomegalovirus humano, los potenciadores del promotor pueden ser citomegalovirus e inmunoglobulina de ratón/humana, y las regiones de empalme y poliadenilación del ARNm pueden ser las secuencias cromosómicas nativas de la inmunoglobulina.

En una realización, para la expresión de genes de ADNc en células de roedores, el promotor transcripcional es una secuencia LTR viral, los potenciadores del promotor transcripcional son el potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón o ambos, y el potenciador LTR viral, la región de empalme contiene un intrón de más de 31 pb, y las regiones de poliadenilación y terminación de la transcripción se derivan de la secuencia cromosómica nativa correspondiente a la cadena de inmunoglobulina que se está sintetizando. En otras realizaciones, las secuencias de ADNc que codifican otras proteínas se combinan con los elementos de expresión citados anteriormente para lograr la expresión de las proteínas en células de mamífero.

Cada gen fusionado puede ser ensamblado en, o insertado en, un vector de expresión. Las células receptoras capaces de expresar el producto génico de la cadena de inmunoglobulina quimérica se transfectan entonces individualmente con un péptido anti-NGF o con un gen quimérico de la cadena H o L, o se transfectan conjuntamente con un gen quimérico de la cadena H y otro de la cadena L. Las células receptoras transfectadas se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados y las cadenas de inmunoglobulina expresadas o los anticuerpos intactos o fragmentos se recuperan del cultivo.

En una realización, los genes fusionados que codifican el péptido anti-NGF o las cadenas H y L quiméricas, o porciones de las mismas, se ensamblan en vectores de expresión separados que luego se utilizan para cotransfectar una célula receptora. Alternativamente, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas pueden ensamblarse en el mismo vector de expresión. Para la transfección de los vectores de expresión y la producción del anticuerpo quimérico, la línea celular receptora puede ser una célula de mieloma. Las células de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes de inmunoglobulina transfectados y poseen el mecanismo de glicosilación de la inmunoglobulina. Las células de mieloma pueden crecer en cultivo o en la cavidad peritoneal de un ratón, donde la inmunoglobulina secretada puede obtenerse del líquido de ascitis. Otras células receptoras adecuadas son las células linfoides, como los linfocitos B de origen humano o no humano, las células de hibridoma de origen humano o no humano, o las células de heterohibridoma interespecífico.

El vector de expresión que lleva un constructo de anticuerpo quimérico caninizado o un polipéptido anti-NGF de la presente invención puede introducirse en una célula huésped apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluyendo medios bioquímicos tales como la transformación, la transfección, la conjugación, la fusión de protoplastos, la precipitación de fosfato de calcio y la aplicación con policationes tales como el dextrano de dietilaminoetilo (DEAE), y medios mecánicos tales como la electroporación, la microinyección directa y el bombardeo de microproyectos. Johnston et at, 240 Science 1538 (1988).

La levadura puede proporcionar ventajas sustanciales sobre las bacterias para la producción de cadenas de inmunoglobulina H y L. Las levaduras llevan a cabo modificaciones postraduccionales de los péptidos, incluida la glicosilación. Actualmente existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y plásmidos de alto número de copias que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en la levadura. Las levaduras reconocen las secuencias líderes de los productos genéticos clonados de los mamíferos y secretan péptidos con secuencias líderes (es decir, prepéptidos). Hitzman et aI., 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, Francia, 1982).

Los sistemas de expresión génica de levadura pueden ser evaluados rutinariamente para los niveles de producción, secreción y la estabilidad de los péptidos anti-NGF, los anticuerpos y los anticuerpos murinos y quiméricos ensamblados, heteroquiméricos, caninizados, fragmentos y regiones de los mismos. Se puede utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresión génica de levadura que incorporan elementos promotores y de terminación de los genes expresados activamente que codifican las enzimas glicolíticas producidas en grandes cantidades cuando las levaduras se cultivan en medios ricos en glucosa. Los genes glicolíticos conocidos también pueden proporcionar señales de control de la transcripción muy eficaces. Por ejemplo, se pueden utilizar las señales del promotor y del terminador del gen de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Se pueden adoptar varios enfoques para evaluar los plásmidos de expresión óptimos para la expresión de ADNc de inmunoglobulina clonados en la levadura. Véase Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985).

Las cepas bacterianas también pueden utilizarse como huéspedes para la producción de moléculas de anticuerpos o péptidos descritos por esta invención. En relación con estos huéspedes bacterianos se utilizan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control derivadas de especies compatibles con una célula huésped. El vector lleva un sitio de replicación, así como genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Se pueden adoptar varios enfoques para evaluar los plásmidos de expresión para la producción de anticuerpos murinos, quiméricos, heteroquiméricos, caninizados, fragmentos y regiones o cadenas de anticuerpos codificados por los ADNc de inmunoglobulina clonados en bacterias (véase Glover, 1985 supra; Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra Colligan et aI., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001) Colligan et aI., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).

Las células de mamífero huésped pueden cultivarse in vitro o in vivo. Las células de mamífero aportan modificaciones postraduccionales a las moléculas de proteína de inmunoglobulina, incluyendo la eliminación del péptido líder, el plegado y ensamblaje de las cadenas Hand L, la glicosilación de las moléculas de anticuerpo y la secreción de la proteína de anticuerpo funcional. Las células de mamíferos que pueden ser útiles como huéspedes para la producción de proteínas de anticuerpos, además de las células de origen linfoide descritas anteriormente, incluyen células de origen fibroblástico, como las células Vero (ATCC CRL 81) o CHO-K1 (ATCC CRL 61). Hay muchos sistemas de vectores disponibles para la expresión de genes clonados de péptidos anti-NGF Hand L en células de mamíferos (véase Glover, 1985 supra). Se pueden seguir diferentes enfoques para obtener anticuerpos H2L2 completos. Es posible coexpresar las cadenas Hand L en las mismas células para lograr la asociación intracelular y la unión de las cadenas Hand L en anticuerpos H2L2 tetraméricos completos y/o péptidos anti-NGF. La coexpresión puede producirse utilizando el mismo o diferentes plásmidos en el mismo huésped. Los genes de las cadenas Hand L y/o de los péptidos anti-NGF pueden colocarse en el mismo plásmido, que luego se transfecta en las células, seleccionando así directamente las células que expresan ambas cadenas. Alternativamente, las células pueden transfectarse primero con un plásmido que codifique una cadena, por ejemplo la cadena L, seguido de la transfección de la línea celular resultante con un plásmido de cadena H que contenga un segundo marcador seleccionable, las líneas celulares que produzcan péptidos anti-NGF y/o moléculas H2L2 por cualquiera de las dos vías podrían transfectarse con plásmidos que codifiquen copias adicionales de péptidos, H, L, o H más L en conjunción con marcadores seleccionables adicionales para generar líneas celulares con propiedades mejoradas, como una mayor producción de moléculas de anticuerpos H2L2 ensambladas o una mayor estabilidad de las líneas celulares transfectadas.

Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, puede utilizarse la expresión estable. Por ejemplo, se pueden crear líneas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células huésped pueden transformarse con casetes de expresión de inmunoglobulinas y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, se puede dejar que las células manipuladas crezcan durante 1 o 2 días en medios enriquecidos, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en un cromosoma y crezcan hasta formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Estas líneas celulares de ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y evaluación de compuestos/componentes que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Una vez que se ha producido un anticuerpo de la invención, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente afinidad por el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía de columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. En muchas realizaciones, los anticuerpos se secretan desde la célula al medio de cultivo y se cosechan del medio de cultivo.

Aplicaciones farmacéuticas y veterinarias

Los anticuerpos o péptidos anti-NGF de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos relacionados con el NGF en perros. Más específicamente, la invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un anticuerpo o péptido según la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, heteroquimérico, caninizado, o de acuerdo con la presente invención. También se contemplan las inmunoglobulinas intactas o sus fragmentos de unión, como los Fab. El anticuerpo y las composiciones farmacéuticas del mismo de esta invención son útiles para la administración parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Los anticuerpos y/o péptidos anti-NGF de la presente invención pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Pueden administrarse solos, pero generalmente se administran con un soporte farmacéutico seleccionado en función de la vía de administración elegida y de la práctica farmacéutica habitual. La administración de los anticuerpos aquí divulgados puede llevarse a cabo por cualquier medio adecuado, incluyendo la inyección parenteral (como la inyección intraperitoneal, subcutánea o intramuscular), por vía oral o por administración tópica de los anticuerpos (típicamente transportados en una formulación farmacéutica) a una superficie de las vías respiratorias. La administración tópica a una superficie de las vías respiratorias puede llevarse a cabo mediante la administración intranasal (por ejemplo, mediante el uso de un gotero, un hisopo o un inhalador). La administración tópica de los anticuerpos a una superficie de las vías respiratorias también puede llevarse a cabo mediante la administración por inhalación, como por ejemplo creando partículas respirables de una formulación farmacéutica (incluyendo tanto partículas sólidas como líquidas) que contengan los anticuerpos como una suspensión en aerosol, y luego haciendo que el sujeto inhale las partículas respirables. Los métodos y aparatos para la administración de partículas respirables de formulaciones farmacéuticas son bien conocidos, y puede emplearse cualquier técnica convencional.

En algunas realizaciones deseadas, los anticuerpos se administran por inyección parenteral. Para la administración parenteral, los anticuerpos o péptidos anti-NGF pueden formularse como solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el vehículo puede ser una solución del anticuerpo o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, como un portador acuoso, tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, trehalosa o solución de sacarosa, o albúmina sérica al 5%, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. También pueden utilizarse liposomas y vehículos no acuosos, como los aceites fijos. Estas soluciones son estériles y, por lo general, no contienen partículas. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste y amortiguación del pH, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración de anticuerpos en estas formulaciones puede variar ampliamente, por ejemplo, desde menos de aproximadamente el 0,5%, por lo general en o al menos el 1%, hasta tanto como el 15% o el 20% en peso, y se seleccionará principalmente sobre la base de los volúmenes de fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante las técnicas habituales. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen con más detalle en, por ejemplo REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).

Los anticuerpos de esta invención pueden ser liofilizados para su almacenamiento y reconstituidos en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con las inmunoglobulinas convencionales. Puede emplearse cualquier técnica adecuada de liofilización y reconstitución. Los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad de los anticuerpos y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse para compensar. Las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos pueden administrarse para la prevención de la recurrencia y/o para tratamientos terapéuticos de la enfermedad existente. Los soportes farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESun texto de referencia estándar en este campo. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un sujeto que ya padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o detener o aliviar, al menos parcialmente, la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguirlo se define como "dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunitario del sujeto, pero generalmente oscilan entre unos 0,1 mg de anticuerpo por kg de peso corporal y unos 10 mg de anticuerpo por kg de peso corporal, preferentemente entre unos 0,3 mg de anticuerpo por kg de peso corporal y unos 5 mg de anticuerpo por kg de peso corporal. En vista de la minimización de sustancias extrañas y la menor probabilidad de rechazos por "sustancias extrañas" que se consiguen con los presentes anticuerpos caninos y de esta invención, puede ser posible administrar excesos sustanciales de estos anticuerpos.

La dosis administrada variará, por supuesto, en función de factores conocidos, como las características farmacodinámicas del agente concreto y su modo y vía de administración; la edad, la salud y el peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado.

Como ejemplo no limitante, el tratamiento de las patologías relacionadas con el NGF en perros puede proporcionarse como una dosis quincenal o mensual de anticuerpos anti-NGF de la presente invención en el rango de dosis descrito anteriormente. Los ejemplos de anticuerpos para uso terapéutico canino son anticuerpos de alta afinidad (también pueden ser de alta avidez), y fragmentos, regiones y derivados de los mismos que tienen una potente actividad in vivo contra el FNG, según la presente invención. Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples de las composiciones con niveles de dosis y patrones seleccionados por el veterinario tratante. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de anticuerpo(s) de esta invención suficiente para tratar eficazmente al sujeto.

Aplicaciones de diagnóstico

La presente invención también proporciona los anteriores anticuerpos y péptidos anti-NGF para su uso en métodos de diagnóstico para detectar el NGF en caninos que se sabe o se sospecha que tienen un trastorno relacionado con el NGF. En una realización de la invención, el trastorno relacionado con el NGF es el dolor. En otra realización, el trastorno relacionado con el NGF es la osteoartritis Los anticuerpos y/o péptidos anti-NGF de la presente invención son útiles para los inmunoensayos que detectan o cuantifican el NGF, o los anticuerpos anti-NGF, en una muestra. Un inmunoensayo para el NGF comprende típicamente la incubación de una muestra clínica o biológica en presencia de un anticuerpo o polipéptido anti-NGF de alta afinidad (o de alta avidez) marcado detectablemente de la presente invención capaz de unirse selectivamente al NGF, y la detección del péptido o anticuerpo marcado que se une en una muestra. Diversos procedimientos de ensayo clínico son bien conocidos en la técnica. Véase, por ej. IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S (Voller et al., eds., Univ. Park, 1981). Dichas muestras incluyen biopsias de tejido, muestras de sangre, suero y heces, o líquidos recogidos de sujetos animales y sometidos a análisis ELISA como se describe a continuación. Así, un anticuerpo o polipéptido anti-NGF puede fijarse en nitrocelulosa, o en otro soporte sólido capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. A continuación, el soporte puede lavarse con tampones adecuados, seguido de un tratamiento con el péptido específico de NGF marcado, el anticuerpo o la proteína de unión al antígeno. A continuación, el soporte en fase sólida puede lavarse con el tampón una segunda vez para eliminar el péptido o el anticuerpo no unido. La cantidad de etiqueta unida en el soporte sólido puede entonces detectarse mediante los pasos conocidos del método.

El "soporte en fase sólida" o "portador" se refiere a cualquier soporte capaz de unir péptidos, antígenos o anticuerpos. Los soportes o portadores más conocidos son el vidrio, el poliestireno, el polipropileno, el polietileno, el fluoruro de polivinilo (PVDF), el dextrano, el nailon, las amilasas, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble en cierta medida o insoluble a los efectos de la presente invención. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse al NGF o a un anticuerpo anti-NGF. Así, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana, como una lámina, una placa de cultivo, una tira de ensayo, etc. Por ejemplo, los soportes pueden incluir perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos, péptidos o antígenos, o pueden determinar los mismos mediante experimentación rutinaria. Pasos bien conocidos del método pueden determinar la actividad de unión de un lote dado de péptido y/o anticuerpo anti-NGF o proteína de unión a antígeno. Los expertos en la materia pueden determinar las condiciones operativas y óptimas del ensayo mediante la experimentación rutinaria.

El etiquetado detectable de un péptido y/o anticuerpo específico de NGF puede lograrse mediante la unión a una enzima para su uso en un inmunoensayo enzimático (EIA), o un ensayo inmunoenzimático (ELISA). La enzima enlazada reacciona con el sustrato expuesto para generar una fracción química que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden utilizarse para etiquetar de forma detectable los anticuerpos específicos de NGF de la presente invención incluyen, entre otras, la malato deshidrogenasa, la nucleasa estafilocócica, la delta5-esteroide isomerasa, la alcohol deshidrogenasa de levadura la alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, la triosa fosfato isomerasa, la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la asparaginasa, la glucosa oxidasa, la beta-galactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la glucosasfosfato deshidrogenasa, la glucoamilasa y la acetilcolinesterasa. Al marcar radioactivamente los anticuerpos específicos del NGF, es posible detectar el NGF mediante el uso de un radioinmunoanálisis (RIA). Véase Trabajo et al., LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM.. IN MOLEC. BIO(No. Holland Pub. Co., NY, 1978). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención incluyen: 3H, 125I, 131I, 35S y 14C.

También es posible marcar los anticuerpos específicos de NGF con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado con fluorescencia se expone a la luz de la longitud de onda adecuada, se puede detectar su presencia debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de etiquetado fluorescente más utilizados se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el oftaldehído y la fluorescamina. Los anticuerpos específicos del NGF o las proteínas de unión a antígenos también pueden marcarse deliciosamente utilizando metales emisores de fluorescencia como el 125Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo específico del NGF utilizando grupos quelantes de metales como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTa ).

Los anticuerpos específicos de NGF también pueden ser marcados de forma detectable mediante el acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina entonces detectando la presencia de la luminiscencia que surge en el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos quimioluminiscentes útiles son el luminol, el isoluminol, el éster teromático de acridinio, el imidazol, la sal de acridinio y el éster de oxalato.

Asimismo, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo, la porción, el fragmento, el polipéptido o el derivado específico de NGF de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en los sistemas biológicos en los que una proteína catalizadora aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para el etiquetado son la luciferina, la luciferasa y la aequorina.

La detección del anticuerpo, porción, fragmento, polipéptido o derivado específico de NGF puede realizarse mediante un contador de centelleo, por ejemplo, si la etiqueta detectable es un emisor gamma radiactivo, o mediante un fluorómetro, por ejemplo, si la etiqueta es un material fluorescente. En el caso de una etiqueta enzimática, la detección puede llevarse a cabo mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también puede llevarse a cabo mediante la comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de forma similar.

Para los propósitos de la presente invención, el NGF que es detectado por los ensayos anteriores puede estar presente en una muestra biológica. Puede utilizarse cualquier muestra que contenga NGF. Por ejemplo, la muestra es un fluido biológico como, por ejemplo, sangre, suero, linfa, orina, heces, exudado inflamatorio, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, un extracto u homogeneizado de tejido, y similares. Sin embargo, la invención no se limita a los ensayos que utilizan únicamente estas muestras, siendo posible para un experto en la materia, a la luz de la presente memoria descriptiva, determinar condiciones adecuadas que permitan el uso de otras muestras. La detección in situ puede lograrse extrayendo una muestra histológica de un sujeto animal, y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo (o una porción del mismo) puede proporcionarse aplicando o superponiendo el anticuerpo marcado (o una porción del mismo) a una muestra biológica. Mediante el uso de este procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de NGF, sino también su distribución en el tejido examinado. Con la presente invención, las personas con conocimientos ordinarios percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (como los procedimientos de tinción) puede modificarse para lograr dicha detección in situ .

El anticuerpo, fragmento o derivado de la presente invención puede adaptarse para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo de "dos sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o un fragmento de anticuerpo) se une a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se está analizando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Los anticuerpos pueden utilizarse para detectar cuantitativa o cualitativamente el NGF en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan el NGF. Esto puede lograrse mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado con fluorescencia (véase más adelante) junto con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o detección fluorométrica. Para fines de diagnóstico, los anticuerpos pueden estar marcados o no. Los anticuerpos no marcados pueden utilizarse en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que sean reactivos con el anticuerpo, como los anticuerpos específicos para las regiones constantes de las inmunoglobulinas caninas. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser marcados directamente. Puede emplearse una amplia variedad de etiquetas, como radionúclidos, fluorescentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Existen numerosos tipos de inmunoensayos, como los comentados anteriormente, que son bien conocidos por los expertos en la materia. Es importante destacar que los anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles para diagnosticar un trastorno relacionado con el NGF en los caninos. Más específicamente, el anticuerpo de la presente invención puede identificar la sobreexpresión de NGF en animales de compañía. Así, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionar una importante herramienta de inmunohistoquímica. Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en matrices de anticuerpos, muy adecuadas para medir perfiles de expresión génica. Kits

También se incluyen dentro del alcance de la presente invención los kits para practicar los métodos en cuestión. Los kits incluyen al menos uno o más de los anticuerpos de la presente invención, un ácido nucleico que codifica el mismo, o una célula que contiene el mismo. Un anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse, normalmente en forma liofilizada, en un recipiente. Los anticuerpos, que pueden estar conjugados con una etiqueta o toxina, o no conjugados, suelen incluirse en los kits con tampones, como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero, o similares. Por lo general, estos materiales estarán presentes en menos del 5% en peso en base a la cantidad de anticuerpo activo, y normalmente estarán presentes en una cantidad total de al menos alrededor del 0,001% en peso en base de nuevo a la concentración de anticuerpo. Frecuentemente, será deseable incluir un diluyente o excipiente inerte para diluir los ingredientes activos, donde el excipiente puede estar presente en aproximadamente, 1% a 99% en peso de la composición total. Cuando se emplea un segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo primario en un ensayo, éste suele estar presente en un vial separado. El segundo anticuerpo se suele conjugar con una etiqueta y se formula de forma análoga a las formulaciones de anticuerpos descritas anteriormente. Por lo general, el kit también incluye un conjunto de instrucciones de uso.

La invención se describirá ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

La presente invención se ilustra y apoya además con los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Identificación de un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce el factor de crecimiento nervioso (NGF) canino

Se produjo una serie de mAb murinos contra el p-NGF humano maduro (Patente estadounidense n° 7.727.527). Una vez generados estos mAb, se sometieron a diversos análisis, incluyendo el mapeo de epítopos y pruebas ^{in v itro} para 1) la unión a NGF y 2) la capacidad de bloquear la unión de NGF a sus receptores TrkA y en menor medida p75 y 3) la evaluación del antagonismo funcional asociado con el bloqueo de NGF (bloqueo de la autofosforilación de TrkA, bloqueo de la supervivencia de las neuronas dependiente de NGF). En base a estos resultados, se descubrió que los mAb que se unen a las regiones variables 1 (giro de p-hairpin A'-A"), 4 (p-strands C y D) y el carboxi-terminal son capaces de bloquear la unión de TrkA y p75. El modelado molecular del epítopo de unión al NGF de uno de estos mAb murinos, el RN911, se muestra en la Figura 6A. El RN911 ha demostrado su eficacia en modelos preclínicos de dolor asociados a la artritis, el cáncer y la incisión quirúrgica, así como en el dolor neuropático y el dolor visceral.

Terapia anti-NGF para el dolor articular en perros

La identidad de la secuencia de aminoácidos se conserva en un 100% dentro del epítopo de unión de RN911 en p-NGF en perros, ratones y humanos (Fig. 6B, arriba). Se verificó experimentalmente la unión de alta afinidad de RN911 al NGF canino recombinante (KD = 755 pM) y se evaluó la eficacia del mAb anti-NGF en un modelo de dolor de sinovitis canina que es utilizado rutinariamente por un experto en la materia para evaluar modelos de dolor y que se describe a continuación, utilizando RN911. El RN911 se produjo en cantidades suficientes utilizando técnicas de un experto en la materia, tanto para estudios de farmacocinética/toleración como de eficacia en beagles criados a propósito. Se diseñó un estudio de eficacia que incluía la inducción de sinovitis a los 3 y 7 días después de la inyección intravenosa de RN911 y la evaluación de cojera/dolores en múltiples momentos posteriores a la inducción de sinovitis. Antes del estudio de eficacia se realizó un estudio de farmacocinética/toleración, descrito en la siguiente sección, para ganar confianza en la seguridad de RN911 en los beagles y para recoger datos que ayudaran a guiar la selección de la dosis para el estudio de eficacia.

DMPK

Metabolismo y Disposición

Como todas las proteínas, se puede asumir que la RN911 se cataboliza a aminoácidos y otros componentes endógenos. Es poco probable que el RN911 sin modificar se excrete.

Farmacocinética

Se estudió la farmacocinética (PK) del mAb murino anti-NGF RN911 en perros tras una única administración IV . Tres perros fueron dosificados con placebo, 4 perros con 1,2 mg/kg, 4 perros con 3,5 mg/kg y 1 perro con 9,8 mg/kg. Sólo se utilizó un perro con la dosis más alta. Los datos farmacocinéticos mostraron una baja variabilidad y la forma similar de los perfiles de RN911 "libre" en todas las dosis sugirió que la disposición mediada por el objetivo no era un factor en la PK. Los datos mostraron una excelente proporcionalidad de la dosis. El T ^1/2 fue similar en todas las dosis, con una media de 102 ± 27 horas (n=9). El aclaramiento, de 0,00051 ± 0,00005 L/h/kg, fue muy lento. El volumen de distribución, de 0,072 ± 0,021 L/kg, se aproximó a lo que cabría esperar para una proteína que se limita al volumen sanguíneo del perro. La figura 7 muestra los datos del análisis del suero de los marcadores analizados en el estudio de eficacia de la sinovitis que se describe a continuación. Es evidente que las concentraciones séricas y la farmacocinética a 3 mg/kg en el estudio de eficacia fueron casi idénticas a los valores a 3,5 mg/kg en el estudio PK.

El RN911 "ligado" fue ensayado en ambos estudios usando un método ELISA (Figura 8) Las concentraciones son reportadas como equivalentes de NGF. Las concentraciones típicas de RN911-NGF, que permanecieron cerca de los niveles máximos durante al menos una semana, fueron de aproximadamente 0,5 ng/mL en equivalentes de NGF. Esto es aproximadamente 10 veces mayor que las concentraciones endógenas de NGF en el suero canino (-40-60 pg/mL).

La concentración sérica típica de RN911-NGF, cuando se convierte en equivalentes de RN911, fue de aproximadamente 5 ng/mL (0,5 ng/mL * relación de peso molecular, 150.000/13.425). Esto está muy por debajo de las concentraciones de RN911 libre medidas que se muestran en la primera figura y sugieren que el mAb puede permanecer en exceso (en comparación con las concentraciones de NGF) durante varias semanas a dosis >3 mg/kg.

Inmunidad

Se determinaron los títulos de anticuerpos anti-fármaco (ADA) antes de la dosis y al final del estudio. Como se muestra en la Tabla 1, hubo evidencia de un aumento de los títulos de ADA en al menos dos de los beagles (ver perros 8 y 12). No es sorprendente que el RN911 genere una respuesta inmunitaria en los beagles, dado que se trata de un mAb murino; no se intentó realizar estudios de dosis repetidas con este mAb.

Tabla 1

Tabla 1. Títulos de anticuerpos anti-fármaco (ADA) tras la inyección intravenosa de RN911

Metodología de los ensayos bioanalíticos

El ELISA de RN911 libre se basó en el uso de NGF canino recombinante como agente de captura y de IgG de burro anti-ratón conjugado con peroxidasa como anticuerpo de detección. En el ensayo se incluyeron tanto los controles de calidad como los estándares.

El ELISA de RN911-NGF ligado se basó en el uso de anti-NGF humano de conejo biotinilado adsorbido en una placa de estrepavidina. Este anticuerpo capturó tanto el NGF-RN911 como el NGF libre, pero el NGF-RN911 se detectó selectivamente utilizando IgG de burro antiratón conjugada con peroxidasa. Los estándares se prepararon incubando una concentración conocida de NGF canino con un ligero exceso molar de RN911.

El ELISA de anticuerpos anti-fármaco utilizó RN911 como agente de captura. Los ADA de las muestras de suero canino se capturaron en la placa y se detectaron utilizando una mezcla de anticuerpos de cabra anti-perro conjugados con peroxidasa que pudieron detectar las cuatro subclases de IgG caninas.

Farmacocinética/Farmacodinámica (PK/PD)

Se generaron datos de PK/PD con RN911 en la especie objetivo en un estudio de eficacia de la sinovitis. En el modelo de dolor por sinovitis, se induce una inflamación transitoria de la membrana sinovial en una sola rodilla mediante una inyección intraarticular de lipopolisacárido bacteriano (LPS). La cojera cuantificable se produce a las 2 horas de la inducción de la sinovitis, alcanza su punto máximo a las 3-4 horas, disminuye a las 6 horas y se resuelve por completo a las 24 horas. Desde el punto de vista de la IACUC, es aceptable inducir la sinovitis en dos ocasiones distintas (es decir, una vez en cada rodilla), siempre que la cojera asociada a la primera inducción de sinovitis se haya resuelto por completo. Por lo tanto, diseñamos un estudio en el que se indujo la sinovitis en el mismo beagle 3 días y 7 días después del tratamiento IV (RN911 o vehículo PBS). Después de cada inducción de sinovitis, se cuantificó la cojera mediante una escala visual analógica (EVA).

Los resultados de este estudio muestran que RN911 (3 mg/kg, IV) causó una disminución estadísticamente significativa de la cojera asociada a la sinovitis a los 3 días de la dosis (Fig. 4). En ese momento, las concentraciones séricas de RN911 libre eran en promedio 24400 ± 3900 ng/mL (170 ± 27 nM; Fig. 2). La RN911 fue aún más eficaz a los 7 días (Fig. 9), cuando la concentración sérica libre de RN911 fue de una media de 13200 ± 3500 ng/mL (91 ± 24 nM; Fig. 7).

Ejemplo 2

Estrategia de caninización

La generación de anticuerpos anti-fármaco (ADA) puede estar asociada con la pérdida de eficacia de cualquier proteína bioterapéutica, incluyendo los anticuerpos monoclonales. Una evaluación exhaustiva de la literatura ha demostrado que la especiación de los anticuerpos monoclonales puede reducir la propensión de los mAb a ser inmunogénicos, aunque se pueden encontrar ejemplos de mAb totalmente humanos inmunogénicos y de mAb quiméricos no inmunogénicos. Para ayudar a mitigar los riesgos asociados con la formación de ADA para el anticuerpo monoclonal de ratón anti-NGF, RN911, proporcionado en el presente documento, se empleó una estrategia de caninización. Esta estrategia de caninización se basa en la identificación de la secuencia de anticuerpos de la línea germinal canina más adecuada para el injerto de CDR (Figura 3). Tras un exhaustivo análisis de todas las secuencias de línea germinal canina disponibles para las cadenas pesada y ligera, se seleccionaron los candidatos de línea germinal por su homología con RN911, y se utilizaron las CDR de RN911 para sustituir las CDR caninas nativas. El objetivo era mantener una alta afinidad y actividad celular utilizando marcos totalmente caninos para minimizar el potencial de inmunogenicidad in vivo. Los mAb caninizados se optimizaron para su expresión en mamíferos, se expresaron y se caracterizaron por su capacidad de unirse al NGF mediante SPR. Estos resultados se describen a continuación en el Ejemplo 3. Sólo los mAb que conservaron tanto los niveles de expresión fiables como la capacidad de unirse al NGF tras la caninización se adelantaron para su posterior caracterización. Aquellos mAb que no se expresaron transitoriamente o que perdieron la capacidad de unirse al NGF fueron sistemáticamente disecados para identificar: 1) la cadena responsable de la pérdida de función o de la falta de expresión, 2) el marco responsable de la pérdida de expresión o de función y 3) el o los aminoácidos responsables de la pérdida de expresión o de función.

Ejemplo 3

Caninización del anticuerpo RN911

Se realizaron construcciones sintéticas que representan las cadenas pesadas y ligeras variables caninizadas del mAb RN911. Tras la subclonación de cada cadena variable en plásmidos que contenían la respectiva región constante canina pesada o kappa, los plásmidos fueron co-transfectados para la expresión del anticuerpo en células HEK 293. La región constante de la cadena pesada canina de la presente invención no se limita a ningún subtipo particular, sin embargo en algunas realizaciones la cadena pesada canina se describe como SEQ ID. NO. 45 o s Eq ID NO. 48. Las regiones constantes de la cadena ligera kappa canina no están limitadas a ninguna secuencia particular, sin embargo en algunas realizaciones de la presente invención la región constante kappa canina se describe como SEQ ID. NO. 47. Marcos utilizados para el mAb "canE3M65" expresado en el sistema de expresión transitoria HEK 293 y que retuvo la unión del NGF tras la caninización. (Seq ID NO.33 "CAN-E3M-VL", SEQ ID NO.

34. "CAN-N2G9-VH").

Por el contrario, las secuencias de la línea germinal utilizadas para la can618 (CAN-618-VL; CAN-N2G9-VH) dieron lugar a ciertos mAb no expresivos. Se expresaron y caracterizaron versiones quiméricas, heteroquiméricas y caninizadas del mAb RN911 para determinar su capacidad de unión al NGF canino mediante SPR. Estos resultados demostraron que el anticuerpo caninizado no expresaba. Además, con respecto a las heteroquimeras, la cadena pesada quimérica emparejada con la cadena ligera caninizada perdió expresión, mientras que la cadena pesada caninizada emparejada con la cadena ligera quimérica conservó la expresión en las células HEK293. A partir de los resultados obtenidos en las heteroquimeras, se dedujo que la cadena ligera caninizada era la responsable de la pérdida de expresión. En un esfuerzo por restaurar la expresión de las versiones caninizadas de RN911 en las que se perdió la expresión, se modificó la cadena ligera caninizada intercambiando secuencias marco. La figura 10 ofrece una visión general del trabajo de sustitución del marco de la cadena ligera can911. En este trabajo se identificó un anticuerpo que sustituye los residuos del marco II canino (FWII) por la secuencia del marco II de ratón y restablece la expresión en células HEK293 (SEQ ID NO.35 "CAN-618-VL", SEQ ID NO. 36 "CAN-QC23-VL", y la cadena pesada variable SEQ ID NO.34 "CAN-N2G9-VH").

La figura 11 resume los resultados tanto de la expresión como de las respectivas mutaciones. Estos datos demuestran que los derivados caninizados que utilizan los marcos 3 y 4 conservan niveles de expresión de HEK comparables a los de su molécula precursora y muestran la unión al NGF canino. El marco 1 conservó la expresión en menor medida, pero también mantuvo la unión al NGF canino.

Ejemplo 4

Caracterización de la unión del NGF canino a los mAb anti-NGF caninizados

Las afinidades de cada anticuerpo anti-NGF caninizado al NGF canino se midieron utilizando SPR (Resonancia de Plasmón de Superficie). Además, se desarrolló un ensayo funcional in vitro para medir las constantes de inhibición de la capacidad de los mAb para inhibir la unión de NGF a TrkA. Los datos mostrados en las figuras 12 y 13 para can6512 (CAN-N2G9-VH, CANE3M-VL, CAN-65E-HC, CAN-KAPPA-LC) y RN911 ilustran la alta afinidad de unión de los mAb al NGF y la potente inhibición por los mAb de la unión del NGF al receptor trkA. Sin embargo, se perdió algo de afinidad al caninizarse con el mAb CAN-N2G9-VH, CAN-E3M. Debido a esta pérdida de afinidad, el mAb caninizado fue madurado por afinidad (véase el Ejemplo 5 para más detalles) para recuperar la potencia. En las figuras 12 y 13 se incluyen los resultados de los productos madurados por afinidad, SSM57 (SEQ ID NO. 27 "CAN-SSM57-VH", SEQ ID NO. 26 "CAN-SSME3M-VL"), SSM58 (SEQ ID NO. 28 CAN-SSM58-VH, SEQ ID NO. 26 "CAN-SSME3M-VL"), y SSM66 (SEQ ID NO.29 CAN-SSM66, SEQ ID NO. 26 CAN-SSME3M-VL) en cada ensayo SPR.

Ejemplo 5

Maduración por afinidad del mAb caninizado anti-NGF

Maduración por afinidad de canE3M65 (SEQ ID NO. 16 "CAN-E3M-VL", SEQ ID NO. 17 "CAN-N2G9-VH") fue necesario para devolver la afinidad del mAb caninizado a la del anticuerpo progenitor de ratón. Se diseñaron dos bibliotecas de anticuerpos que contenían mutaciones puntuales individuales dentro de la secuencia del anticuerpo en las regiones CDR únicamente. En la Figura 15 se describe la estrategia de diseño de cada biblioteca Fab, en la que la biblioteca de mutagénesis por saturación (LTM) comprende mutaciones de sitio individuales limitadas a uno de los nueve residuos de aminoácidos representativos, mientras que la biblioteca de mutagénesis por saturación de sitio (SSM) puede muestrear cualquier aminoácido natural (aquí se excluyeron Cys y Met). La biblioteca LTM se construyó para identificar mutaciones beneficiosas en CDRH3, CDRL1 y CDRL3. Alternativamente, las mutaciones de la biblioteca SSM están localizadas en CDRH1, CDRH2 y CDRL2, lo que nos permite combinar las mutaciones beneficiosas de cada biblioteca.

La biblioteca LTM se construyó a partir de una serie de cebadores diseñados mediante un programa de diseño de oligonucleótidos comúnmente utilizado por los expertos en la materia. Los productos de pCr se combinaron para conseguir una biblioteca de Fab compuesta por mutaciones individuales en cada una de las tres CDR especificadas, así como combinaciones que incluían variaciones en CDRH3, CDRL1 y/o CDRL3. Se logró una eficiencia de ligación del 93% con un tamaño de biblioteca de ~10A4. Se llevaron a cabo cuatro rondas de barrido con cantidades decrecientes de NGF canino biotinilado y se seleccionaron las velocidades de reducción prolongadas mediante pasos de lavado prolongados durante la noche. La cantidad de antígeno NGF utilizada varió de 1ng/jL de perlas a 10pg/|jL de perlas y los Fab se eluyeron utilizando NGF no biotinilado en exceso. Después de la cuarta ronda de barrido, los resultados se clonaron en un vector TOPO y se secuenciaron. Las mutaciones enriquecidas se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Las construcciones indicadas se convirtieron en IgGs completas y se expresaron transitoriamente en células HEK293. Los resultados de la expresión de las mutaciones individuales y combinadas se muestran a continuación en las tablas 3 y 4

TABLA3

TABLA 4

_________

Se realizó SPR en los sobrenadantes como una pantalla inicial, se purificaron los buenos ligantes, y el mAb puro se ejecutó de nuevo mediante SPR para medir la unión al NGF canino (TABLA 5). Los constructos LTM109 y LTM135 fueron elegidos para progresar en función de las afinidades de unión.

TABLA 5

Varios KD corresponden a diferentes sensores, la densidad de la superficie varía ligeramente. Agr. indica que se ha observado una curva de unión que muestra signos de agregación de anticuerpos en al menos una ejecución.

Se realizaron cuatro rondas de visualización de fagos con la biblioteca SSM utilizando mutaciones de sitio único en la misma secuencia de tipo salvaje utilizada para el LTM. Las bibliotecas se analizaron contra el NGF canino biotinilado o libre y se seleccionaron para obtener una alta afinidad y una velocidad de reducción lenta después de cada ronda. Las selecciones se llevaron a cabo como se muestra a continuación, los resultados de la ronda 4 fueron clonados y secuenciados por TOPO.

Mutagénesis de saturación de sitio para la maduración de la afinidad del NGF - Estrategia de selección Muestras utilizadas:

(1) control negativo con perlas de estreptavidina sin antígeno

(2) antígeno bioNGF en perlas de estreptavidina.

(3) Inmunotubo con dNGF inmovilizado en el tubo

(4) Control positivo de E33 en perlas de estreptavidina con bioNGF

(5) Control positivo E33 con inmunotubo / antígeno dNGF

* tener en cuenta que los controles positivos verificarán la rigurosidad adecuada

Nota: Utilizar sólo la elución química (100mM TEA) para asegurar que no se filtren los aglutinantes más estrechos. Selección negativa para el inmunotubo = tubo sin dNGF inmovilizado. Selección negativa para las perlas de estreptococo = perlas sin bioNGF inmovilizado.

lavados prolongados se seleccionan para las velocidades de reducción muy lentas; la rigurosidad aumenta con las rondas.

La tabla 6 anterior muestra las salidas secuenciadas de la visualización de la biblioteca SSM, así como la diversidad inicial. Se seleccionaron los sitios enriquecidos para las mutaciones de sitio único y de sitio múltiple (combinaciones de sitios enriquecidos) y la posterior conversión de IgG. Se generaron mutaciones SSM para las cadenas pesadas y ligeras en tres plantillas: (1) mAb de tipo salvaje, (2) LTM109 (3) LTM135.

Los anticuerpos mutados se expresaron en células HEK293 y se evaluó su afinidad de unión al NGF canino (resultados a continuación; resultados de expresión en las Tablas 7-9). Anticuerpos SSM57 (SEQ ID NO. 27 "CAN-SSM57-VL, SEQ ID NO 26 "CAN-SSM-E3M-VL"), SSM58 (SEQ ID NO. 28 "CAN-SSM58-VII", SEQ ID NO. 26 ""CAN-SSM-E3M-VL"), y SSM66 (SEQ ID NO. 29 "CAN-SSM66-VH", SEQ ID NO. 26 "CAN-SSM-E3M-VL") mostraron las mayores afinidades

O O

oCL

TABLA 8.

TABLA 9

Ejemplo 6

Producción de anticuerpos caninizados a partir de plásmidos de glutamina sintetasa (GS)

Los genes que codifican los mAb RN911 caninizados se clonaron en los plásmidos GS pEE 6.4 y pEE 12.4, respectivamente (Lonza, Basilea, Suiza). Los plásmidos resultantes se digirieron según el protocolo del fabricante y se ligaron entre sí para formar un único plásmido de expresión para mamíferos. Cada plásmido se utilizó para transfectar células HEK 293 y la expresión se llevó a cabo en 20L de medio de cultivo. La proteína se aisló del medio HEK condicionado mediante cromatografía de afinidad con proteína A, de acuerdo con los métodos estándar de purificación de proteínas. El medio se cargó en resina cromatográfica y se eluyó por cambio de pH. La proteína eluida se ajustó al pH, se dializó y se sometió a filtrado estéril antes de su uso. El anticuerpo resultante era monomérico en más de un 99% por cromatografía de exclusión de tamaño analítica, sin que se observaran agregados de alto peso molecular. Este anticuerpo se utilizó posteriormente para su evaluación en el modelo de sinovitis canina para evaluar la eficacia in vivo.

Ejemplo 7

Evaluación del anticuerpo caninizado en el modelo de sinovitis de perro

El mAb caninizado (CAN-SSME3M-VL, CAN-SSM57-HC) fue probado en el modelo de sinovitis de perro a 5mg/kg IV y 5mg/kg SC. Los resultados del estudio se muestran en la Figura 14, induciendo la sinovitis a los 7 días y a los 28 días después de la dosis. El mAb caninizado demostró su eficacia en los regímenes de dosificación SC e IV tanto a los 7 como a los 28 días después de la dosis.

Ejemplo 8

Farmacocinética del anticuerpo caninizado

Se estudió la farmacocinética (PK) del mAb SSM57 caninizado (PF-06442591) en seis perros a 5 mg/kg mediante administración subcutánea (SC). Los perros fueron dosificados con mAb a 5 mg/kg SC una vez cada 14 días (Día 0, Día 14, Día 28) para un total de tres inyecciones y fueron eutanasiados en el Día 35 para una evaluación completa de la seguridad (ver Información de seguridad más abajo). Se recogieron muestras de suero de cada perro antes de cada dosis y periódicamente durante 35 días. La concentración de anticuerpos se midió en un formato basado en ELISA en el que se utilizó NGF canino para capturar mAb del suero. A continuación, se detectó el anticuerpo utilizando un anticuerpo marcado que reconoce la porción Fc de la subclase de anticuerpos. Los resultados se muestran en la figura 16.

Ejemplo 9

Evaluación del anticuerpo caninizado en el modelo de MIA de rata

La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular degenerativa caracterizada por el dolor articular y la pérdida progresiva del cartílago articular. La inyección intraarticular de MIA induce la pérdida de cartílago articular con la progresión de lesiones óseas subcondrales que imitan las de la OA. Este modelo ofrece un método rápido y mínimamente invasivo para reproducir lesiones similares a las de la OA en una especie de roedor.

El efecto analgésico de los anticuerpos anti-NGF caninizados en una dosis de MIA en el modelo de rata MIA de osteoartritis se demostró mediante la dosificación del mAb SSM57 caninizado (PF-06442591) dos veces durante el estudio en el día 7 y el día 14 del estudio. El dolor se evaluó mediante la prueba de carga de peso para el dolor sostenido y la prueba de compresión articular (Randall Selitto) para la hiperalgesia mecánica. Véase en la figura 17 un esquema del procedimiento de MIA para ratas.

Tabla 10

Preparación de los materiales de sensibilización:

Se preparó una concentración de 60 mg/ml de solución de MIA en solución salina. Cada rata fue dosificada con 50 pl de la solución preparada, es decir, 3 mg de MIA.

Preparación del vehículo (Grupo 1):

El control del vehículo fue la solución salina.

Preparación de morfina a una dosis de 10 mg/kg (Grupo 2):

1. Se añadieron 13,5 ml de suero salino a 1,5 ml de morfina.

2. Se inyectó 1 ml de la solución recibida por cada rata de 200 g de peso.

Preparación de los elementos de prueba (grupos 3-4):

Los anticuerpos eran de 5 mg/ml. Los compuestos se almacenaron a 2-8 °C y se protegieron de la luz antes de su uso. Sin agitación fuerte. Los compuestos se calentaron a temperatura ambiente durante 1 hora antes de la dosificación.

Tratamiento:

El vehículo (Grupo 1) y los mAb del elemento de prueba (Grupos 3 y 4) se administraron una vez vía SC en los días de prueba 7 y 14.

La morfina (Grupo 2), el control positivo en este estudio, se administró una vez vía SC en los días de prueba 7 y 14.

Vías de administración

Estadísticas/Evaluación

Todos los datos se presentan como media ± SEM (error típico o estándar de la media). Cada grupo de tratamiento se comparó con el grupo del vehículo mediante una prueba de ANOVA de una vía seguida de la prueba de Tukey (Prism V 4.0, GraphPad Software). Las comparaciones entre el grupo del vehículo y el grupo de la morfina y dentro del grupo del vehículo para evaluar el modelo se realizaron mediante la prueba T. Se considera que un valor p < 0,05 representa una diferencia significativa.

Cuidado y uso de los animales

El estudio se llevó a cabo tras la aprobación de un formulario de solicitud presentado al Comité para la Conducta Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio en el que se declaraba que el estudio cumplía con las normas y reglamentos establecidos.

Prueba de carga de peso:

Entrenamiento de ratas - Habituación al entorno de prueba:

Este régimen de entrenamiento fue necesario porque se previó que el nivel de variabilidad dentro del experimento es relativamente alto. Por lo tanto, el uso de este protocolo ayudaría a reducir la variabilidad y aumentaría la probabilidad de un estudio exitoso. Cada rata fue manipulada durante 1 minuto y luego colocada en el aparato de prueba (medidor de incapacidad) durante 5 minutos (habituación al aparato de prueba). Este procedimiento se realizó el día -2 del estudio.

Detalles de la evaluación con carga de peso:

Se midieron los déficits de carga de peso en todas las ratas el día -1 del estudio, esta medición sirvió como línea de base. A continuación, se registró la carga de peso en los días 9, 16, 21 y 28 del estudio. El medidor de incapacidad registra 3 mediciones durante un período de 5 segundos y luego las promedia para obtener 1 valor.

Hiperalgesia mecánica (prueba de Randall-Selitto):

Los umbrales mecánicos, expresados en gramos, se midieron en ratas con la prueba de Randall-Selitto utilizando un analgesímetro (Ugo Basile). La prueba se realizó aplicando una presión nociva en la pata trasera. Al pisar un pedal que activaba un motor, la fuerza aumentaba a un ritmo constante en la escala lineal. Cuando el animal mostraba dolor al retirar la pata o vocalizar, se soltaba inmediatamente el pedal y se leía el umbral nociceptivo en una escala. Se utilizó el límite de 400 g para evitar posibles lesiones en los tejidos. La prueba de Randall-Selitto se llevó a cabo en los días -1 (inicial) y 28 del estudio.

Signos clínicos:

A lo largo del estudio de 30 días, se realizaron exámenes clínicos cuidadosos al menos una vez al día. Si se observaba alguna anomalía, se registraba. Las observaciones incluyen cambios en la piel, el pelaje, los ojos, las membranas mucosas, la aparición de secreciones y excreciones (por ejemplo, diarrea), la actividad autonómica (por ejemplo, lagrimeo, salivación, piloerección, tamaño de las pupilas, patrón respiratorio inusual), la marcha, la postura y la respuesta a la manipulación, así como la presencia de un comportamiento inusual, temblores, convulsiones, sueño y coma.

Resultados:

Peso corporal medio del grupo para todos los grupos (g).

Tabla 11

Respuesta a la prueba de carga (diferencia entre piernas) (g):

*p<0,05 vs. Vehículo mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey.

El peso soportado de cada pierna se midió por separado mediante un aparato de soporte de peso (CITI, Serie 8, Modelo 600®). Esta prueba cuantifica los cambios posturales espontáneos que reflejan el dolor espontáneo midiendo de forma independiente, en dos sensores distintos, el peso que el animal aplica sobre cada pata trasera. Los resultados fueron calculados y representados como el porcentaje de peso que el animal apoyó en la pata derecha inyectada o en la pata izquierda intacta de la cantidad total de peso apoyado en las dos patas traseras. Luego se calcula la diferencia entre los dos valores de la pierna izquierda intacta menos la pierna derecha inyectada. La prueba de soporte de peso mide la capacidad del animal de soportar su peso sobre las patas traseras. En condiciones normales, el animal carga su peso por igual sobre ambas patas traseras (50% sobre la pata derecha y 50% sobre la pata izquierda). Por lo tanto, la diferencia entre el porcentaje de peso cargado en cada pierna será cercana al 0%. A medida que el animal experimenta dolor, esta situación cambia. El animal tenderá a cargar más peso en la pata no dolorosa y menos en la dolorosa. Como resultado, la diferencia entre el porcentaje de peso soportado en ambas piernas aumenta.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno aislada y caninizada que se une específicamente al Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) canino que comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (CAN-SSME3M-VL) y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (CAN-SSM57-VH).

2. La proteína de unión a antígeno caninizada según la reivindicación 1, en la que la proteína de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo multiespecífico, una proteína de fusión, una proteína de fusión ScFc, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento ScFv y un fragmento Fd.

3. Una célula huésped que produce la proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.

4. Una composición veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a antígeno caninizada de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Una composición veterinaria según la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de un canino para un trastorno relacionado con el NGF que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición veterinaria.

6. La composición veterinaria para el uso de la reivindicación 5, en el que el trastorno relacionado con el NGF se selecciona del grupo que consiste en: enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, dolor e inflamación.

7. La composición veterinaria para el uso de la reivindicación 6, en el que el trastorno relacionado con el NGF es el dolor y el tipo de dolor se selecciona del grupo que consiste en: dolor crónico, dolor inflamatorio, dolor postoperatorio por incisión, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, neuralgia posherpética, dolor por cáncer, dolor resultante de quemaduras, dolor asociado a heridas, dolor asociado a traumatismos, dolor neuropático, dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la espondilitis anquilosante, las artropatías seronegativas (no reumatoides), el reumatismo no articular y los trastornos periarticulares y la neuropatía periférica.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de unión a antígeno caninizada de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la cadena pesada variable está codificada por SEQ ID NO: 40 (CAN-SSM57-VHnt) y la cadena ligera variable está codificada por SEQ ID NO: 39 (CAN-SSME3M-VLnt).

9. Un vector o una célula huésped que comprende los ácidos nucleicos de la reivindicación 8, o una célula huésped que comprende el vector que comprende los ácidos nucleicos de la reivindicación 8.

10. Un método para detectar o cuantificar los niveles de NGF canino en una muestra biológica, comprendiendo el método:

(a) incubar una muestra clínica o biológica que contenga NGF canino en presencia de la proteína de unión a antígeno caninizada de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2; y

(b) detectar la proteína de unión a antígeno que se une al NGF en la muestra.

11. Un kit que comprende la proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.