WO2003002146A1

WO2003002146A1 - Composition medicinale

Info

Publication number: WO2003002146A1
Application number: PCT/JP2002/006461
Authority: WO
Inventors: Masaya Tohyama; Taiichi Katayama; Takayuki Manabe; Kazunori Imaizumi; Yoko Ikeda
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2003-01-09
Also published as: JP2003012548A; EP1413314A4; JP4000313B2; AU2002346223B2; JPWO2003002146A1; CA2451850A1; US20050065102A1; KR20040028796A; CN1592637A; EP1413314A1

Description

明細書医薬組成物技術分野

本発明は、 HMG_ Iタンパク質とプレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害しうる阻害剤、神経細胞死を抑制することができる神経細胞死抑制剤、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損型スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物、該疾患の治療又は予防方法及び該阻害剤の使用に閬する。背景技術

神経変性疾患の 1つであるアルツハイマー病（AD) は、 9 0%を超える AD 患者の疾患が孤発性アルツハイマー病（sAD) に分類される。 sAD患者の大脳皮質及び海馬 C A 1領域のそれぞれのアポトーシス性維体細胞に、プレセニリンー 2遺伝子のバリアントがコードする異常タンパク質（PS 2 V) が存在することが知られている [サトウ（Sato, N.)ら, J. Biol. Chem.. 276, 2108-2114 ( 2001)]。

PS 2 Vは、ヒト神経芽細胞腫 SK - N - SH培養細胞において低酸素刺激により誘導され、酸化ストレス及び SK— N— S H細胞での新たなタンパク質合成に依存することが示されている [サトウ（Sato, N.)ら， J. Neurochera. , 72, 249 8-2505 (1999)]。

前記 PS 2 Vにより、小胞体（ER) ストレス応答性分子シャペロンであるグルコース調節タンパク質（GRP 78) が減少し、 PS 2 V発現細胞において/ δ 一アミロイドタンパク質の產生が増加することが知られている [サトウ（Sato, N .)ら， J. Biol. Chem. , 276, 2108-2114 (2001)]。しかしながら、 P S 2 Vが s A Dにおけるニューロン死の重要な因子の 1つである可能性は示唆されているものの、 P S 2 Vの生成、疾患発症におけるメカ二ズムの詳細が十分に知られていないのが現状である。また、前記 P S 2 Vの生成に起因する疾患の有効な治療法が求められているのが現状である。発明の開示

本発明は、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5との結合を阻害しうる阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明は、 HM G - Iタンパク質とプレセニリンー 2 mR NAェキソン 5との結合を阻害し、プレセニリン— 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制し、それにより神経細胞死を抑制することができる神経細胞死抑制剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、細胞死、特に、神経細胞死を抑制すること、細胞への導入効率に優れること、生体内における安定性に優れること及びプレセニリンー 2 mR NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害、神経変性疾患等の治療又は予防の少なくとも 1つを達成することが可能な、医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、プレセ二リン一 2 m R N Aェキソン 5欠損スブライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害、神経変性疾患等の治療又は予防を、より効率よく、持続的に行なうことが可能な、プレセ二リン _ 2 m R NAェキソン 5欠損スブライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防方法を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、

C 1〕 HMG - Iタンパク質とプレセニリンー 2 mR NAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、 HMG— Iタンパク質とプレセニリン— 2遺伝子との間の結合の阻害剤、

〔 2〕該化合物が、 (A)配列番号： 1に示される塩基配列及び/又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する RNA分子、

(B)配列番号： 1に示される塩基配列に対応する DNA配列及び Z又は配列番号： 2に示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する DNA分子、

(C)前記（A)の RNA分子又は（B)の DNA分子のいずれかに相補的なァンチセンス分子、

(D)前記（A)の RNA分子又は（B)の DNA分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、及び

(E)前記（C)のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、前記〔1〕記載の阻害剤、

〔 3〕該化合物が、

(a)配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる RNA分子、

(b)配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる DNA分子

(e)前記（c)のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、前記〔2〕記載の阻害剤、

〔4〕該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0—メチルオリゴ RNA分子である、前記〔1〕又は〔2〕記載の阻害剤、

(5〕 HMG- Iタンパク質とプレセニリン一 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2遺伝子との間の結合の阻害剤を有効成分として含有してなる神経細胞死抑制剤、

〔 6〕該化合物が、

(A)配列番号： 1に示される塩基配列及び Z又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する RNA分子、

(D)前記（A) の RNA分子又は（B)の DNA分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、及び

(E)前記（C)のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、前記〔5〕記載の神経細胞死抑制剤、〔 7〕該化合物が、

(b)配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列に対応ずる DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる DNA分子

(e)前記（c) のアンチセンス分子のアナログ分子、からなる群より選択された 1種である、前記〔6〕記載の神経細胞死抑制剤、〔8〕該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0—メチルオリゴ RNA分子である、前記〔5〕又は〔6〕記載の神経細胞死抑制剤、〔9〕 HMG- Iタンパク質とプレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2遺伝子との間の結合の阻害剤、又は

該阻害剤を有効成分として含有した神経細胞死抑制剤

を有効成分として含有してなる医薬組成物、

〔1 0〕該化合物が、

(A)配列番号： 1に示される塩基配列及びノ又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する RNA分子、

(B)配列番号： 1に示される塩基配列に対応する DNA配列及び又は配列番号： 2に示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する DNA分子、

(C)前記（A) の RNA分子又は（B) の DNA分子のいずれかに相補的なァンチセンス分子、

(D)前記（A) の RNA分子又は（B) の DNA分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、及び

(E)前記（C) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、前記〔9〕記載の医薬組成物、〔1 1〕該化合物が、

(b)配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる DNA分子 (c) 前記（a) の RNA分子又は（b) の DN A分子のいずれかに相補的なァンチセンス分子、

(d) 前記（a) の RNA分子又は（b) の DN A分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、及び

(e) 前記（c) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、前記〔1 0〕記載の医薬組成物、〔1 2〕該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0— メチルオリゴ RNA分子である、前記〔9〕又は〔 1 0〕記載の医薬組成物、〔1 3〕スプライシング異常を抑制する作用を有する、前記〔9〕〜〔 1 2〕いずれか 1項に記載の医薬組成物、

〔1 4〕プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生を抑制する作用を有する、前記〔9〕〜〔 1 3〕いずれか 1項に記載の医薬組成物、

〔1 5〕プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアン卜の産生に起因する脳障害又は神経変性疾患を治療又は予防しうる、前記〔9〕

〜（： 1 4〕いずれか 1項に記載の医薬組成物、

〔1 6〕該脳障害が、虚血性脳疾患又は脳神経変性疾患である、前記〔1 5〕記載の医薬組成物、

〔1 7〕該脳障害が、脳血管性痴呆、パーキンソン症候群及びアルツハイマー病からなる群より選ばれた疾患である、前記（ 1 6〕記載の医薬組成物、

〔1 8〕該神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、前記（1 5〕記載の医薬組成物、

〔1 9〕ブレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセ二リン一 2 mR N Aェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造のための、前記〔1〕〜4いずれか 1項に記載の阻害剤若しくは前記〔5〕〜〔8〕レ、ずれか 1項に記載の神経細胞死抑制剤の使用、並びに

〔20〕プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアン卜の産生に起因する疾患の個体に、前記〔1；) 〜〔4〕いずれか 1項に記載の阻害剤若しくは前記〔5：！〜〔8〕いずれか 1項に記載の神経細胞死抑制剤を治療上有効量投与することを特徴とする、プレセ二リン— 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防方法、に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、 sADの脳及び培養細胞株における PS 2 Vの発現を示す図である。左パネルは、代表的な s A D脳又は年齢がマッチした対照脳由来の増幅産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化工チジゥム染色により可視化した結果である。右パネルは、正常酸素状態、低酸素曝露、ッニカマイシン（TM)、 β 一アミロイドの各ストレス下の種々の細胞由来の全 R Ν Αを R Τ— P C Rに供し、得られた PC R産物をボリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化工チジゥム染色により可視化した結果である。図中、黒矢印は、 PS 2 (上部）及び PS 2V (下部）に対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 2図は、 sAD脳及び対照脳のそれぞれにおける PS 2 Vの免疫組織化学検出を行なった結果を示す図である。厚さ 1 0 mの対照及び s ADの脳切片を作製し、続いて抗 S SMAG抗体を用いる P S 2 Vの免疫組織化学的検出をおこなつた。これらの結果は、少なくとも 3種の異なる対照及び ADの脳を解析し、同様の結果を得たものである。

第 3図は、 p r e—mRNA結合実験法の概略を示す図である。 SK— N— S H細胞を、酸素正常状態又は低酸素刺激の 2 1時間後に回収した後、核抽出液を調製し、続いて PS 2 p r e— mRNA断片の各プローブと結合反応させる。反応液に紫外（UV) 光を照射した後、 RNァーゼ Aを用いてプローブを消化し、続いて SDS処理を行なう。 SDS処理した試料を、 SDS— PAGEアツセィにより分離した後、 B a s用イメージングブレートを用いて結合陽性バンドを検出する。

第 4図は、 PS 2 p r e— mRNAプローブの概略図である。図中、結合実験法のための PS 2 p r e— mRNA断片の 6種のプローブを概略的に示す。枠で囲んだ領域及び下線部は、それぞれェキソン及びイントロンを表す。全てのプローブは、インビトロ転写により標識される。

第 5図は、 p r e— mRNA結合実験法の結果を示す図である。 SK— N— S H細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の 2 1時間後に回収した。各放射性標識プローブを用いる p r e— mRNA結合実験法により、回収した細胞由来の核抽出液を解析した。次いで、濃度勾配（ 1 0〜20%) ポリアクリルアミドゲル上で SDS— PAGEに供した後、 Ba s用イメージングブレートに曝した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 6図は、 p r e— mRNA結合実験法の結果を示す図である。 SK— N— S H細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の 2 1時間後に回収した。核抽出液を各³⁵ S—非標識コールドプローブとともに結合条件下で前ィンキュベ一トした。前ィンキュベ一トした反応液を用いる p r e一 mRNA結合実験法を、各³⁵ S—標識ホットプローブの添加により開始し、次いで、 1 5%ポリアクリルアミドゲル上で SDS— PAGEに供した後、 Ba s用イメージングプレートに曝した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 7図は、低酸素ストレス下のヒト神経芽細胞腫 SK— N—SH細胞核抽出液由来の N 0. 5プローブ結合活性を有するフラクションの精製プロフィ一ルを示す。精製方法はイタリック体で示す。個々のフラクションをローマ数字で示す。第 8図は、第 7図に示される各精製段階におけるタンパク質（25 β 1/フラクシヨン）を 1 5%SDS— PAGE及び銀染色により解析した結果を示す図である。図中、 Mは、分子量（kDa) マーカーを示す。

第 9図は、 ³⁵S—標識 No. 5プローブと各精製段階におけるフラクション（ 15 / 1Zフラクション）との結合活性を示す図である。

第 1 0図は、 HMG— IZYタンパク質に対する抗体を用いたスーパ一シフトアツセィの結果を示す図である。 SK-N— SH細胞を酸素正常状態（左図）又は低酸素（右図）の刺激の 21時間後に回収した。放射能標識した No. 5プロ —ブと反応させる前に、 HMG— IZYタンパク質に対する抗体の存在下又は非存在下で、通常のバッファ一中で核抽出液をインキュベートした。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びォ一トラジオグラフィーに供した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得た。

第 1 1図は、 PS2 p r e— mRNAの 7種類の構造を示す図である。図中、ェキソンを大文字で示し、イントロンを小文字で示す。 2個の類似配列を太字で示し、下線を付す。

第 1 2図は、 HMG— Iタンパク質の PS 2 p r e— mRNAにおける結合部位を調べた結果を示す図である。 S K - N - S H細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の 21時間後に回収する。各放射能標識プローブを用いる P r e - mRNA結合実験法により、回収した細胞由来の核抽出液を解析する。次いで、 SDS— PAGEに供した後、 Ba s用イメージングプレートに曝す。図中、黒矢印は、対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 1 3図は、培養細胞における HMG— I mRNA (図中、 HMG I mR NA)及び該 mRNAに対応するタンパク質の発現に対する種々のストレスの影響をノーザンブロット解析により調べた結果を示す図である。左バネル及び中央パネルは、酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、曝露の 21時間後に回収した細胞株について解析した結果を示す。右パネルは、ッニカマイシン処理し、 24 時間後に回収した SK— N— S H細胞について解析した結果を示す。全 R N Aをホルムアルデヒドーホルムアミドゲル電気泳動し、放射能標識した HMG— I cDNAプローブを用いたノーザンプロットアツセィに供す。図中、分子量点を黒矢印で示す。

第 14図は、培養細胞における HMG— I mRNA及び該 mRNAに対応するタンパク質の発現に対する種々のストレスの影響をゥエスタンブロット解析により調べた結果を示す図である。各細胞株を、酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の 21時間後に回収する。得られた核抽出液を SDS— PAGE及び HMG- IZYタンパク質に対する抗体を用いてィムノブロットアツセィに供す。図中、黒矢印は、 HMG— I (上部、図中、「HMG I J ) 及び HMG— Y ( 下部、図中、「HMGYj ) タンパク質の対応する分子量点を示す。

第 15図は、 SK— N— SH細胞における免疫反応性 HMG— Iタンパク質の細胞下局在に対する低酸素の影響を示す図である。 S K - N— S H細胞を酸素正常状態又は低酸素に 21時間曝露する。細胞を、一次免疫反応のために抗 HMG 一 IZY (図中、「HMG IZYj ) 抗体及び抗 SC 35抗体で免疫染色した後、 F I TC結合二次抗体及び Cy 3結合二次抗体で染色する。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである

第 16図は、培養細胞における PS 2遺伝子のェキソン 5スキッピングに対する HMG— I又は HMG— Yの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。各細胞株に mo c k又は HMG— Iのトランスフヱクシヨンを行った後、トランスフヱクシヨンの 24時間後に回収した。核抽出液を SDS— PAGE、及び H MG- IZYに対する抗体を用いてィムノブロットアツセィに供した。黒矢印は、 HMG- Iタンノ、。ク質（図中、「HMG I」）の対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 1 7図は、培養細胞における PS2遺伝子のェキソン 5スキッピングに対する HMG— I又は HMG— Yの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。各細胞株に、異なる量の mo ck、 HMG- I (図中、「HMG IJ )又は HM G— Y (図中、「HMGY」）のトランスフヱクシヨンを行った後、トランスフェクシヨンの 24時間後に回収した。回収した細胞由来の全 RNAを、文献 [サトウ（Sato)ら、 J. Neurochem. , 72, 2498-2505 (1999)]の方法により RT— P C Rに供した。増幅産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化工チジゥム染色により可視化した。黒矢印は、 PS2 (上部）及び PS 2V (下部）の対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 1 8図は、 Ul (70K) snRNPのPS2 p r e— mRNAへの結合に対する HMG— I (図中、「HMG I J ) の効果を調べた結果を示す図である。回収した細胞由来の核抽出液を、上部パネルに示した No. 12のプローブ（ ³²P標識）と反応させる前に、 HMG— IZYタンパク質に対する抗体の存在下又は非存在下で、通常のバッファ一中でインキュベートした。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びオートラジオグラフィ一に供した。図中、黒矢印は、遊離、結合及びスーパ一シフトしたプローブを示す。また、図中 Abは、抗 U l s n RNP抗体を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 4回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 1 9図は、 HMG— IZYと U 1 (70 K) s n RN Pとの相互作用を示す図である。上部パネルは、抗 Ul (70K) s nRNP抗体を用いてィムノブ口ットアツセィを行なった結果を示す。酸素正常状態又は低酸素に曝露した SK— N— SH細胞を刺激の 24時間後に回収した後、核抽出液を調製した。核抽出液を抗 HMG— I/Y抗体（図中、「抗 HMG IZY抗体」 ) により免疫沈降させた後、抗 Ul (7 OK) s nRNP抗体を用いてィムノブロットアツセィを行なつた。下部パネルは、抗 HMG— I/Y抗体を用いてィムノブロットアツセィを行なった結果を示す。核抽出液を抗 U1 (7 OK) s nRNP抗体により免疫沈降させた後、抗 HMG— IZY抗体を用いてィムノブロットアツセィを行なった。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも 3回繰り返し、同様の結果を得たものである。

第 20図は、 PS2 p r e— mRNA上の異常スプライシング機構の仮説の概略図である。

第 21図は、 s AD脳における HMG— I /Yタンパク質の発現をウェスタンプロット解析により調べた結果を示す図である。全ライセ一ト、サイトゾルフラクシヨン及び核フラクションを、 3例の異なる sAD脳及び年齢がマッチした対照の海馬から調製した。これらのフラクションを SDS— PAGE、及び HMG 一 IZYタンパク質に対する抗体を用いるィムノブロットアツセィに供した。黒矢印は、 HMG— I (上部、図中、「HMG I J ) 及び HMG— Y (下部、図中、「HMGYj ) タンパク質の対応する分子量点を示す。

第 22図は、 s AD脳における HMG— I ZYタンパク質の発現を免疫組織化学により調べた結果を示す図である。少なくとも 3種の異なる対照及び ADの脳を解析し、常に同様の結果を得たものである。厚さ 10 /111の対照及び5八0の脳切片を作製し、続いて免疫反応性 HMG - IZYの免疫組織化学的検出をおこなった。少なくとも 3種の異なる対照及び ADの脳を解析し、常に同様の結果を得たものである。

第 23図は、合成された各オリゴヌクレオチドを示す図である。慣用の方法によりした。 24マ一又は 60マーの塩基長を有する 2種の相補的なオリゴヌクレォチドを用いてアニーリングを行ない、 No. l〜No. 1 1の各二本鎖 DNA を得た。なお、図中、各オリゴヌクレオチドにおいて、 PS 2のェキソン 5の各断片を下線を付し、太字で示す。第 24図は、 2' — 0—メチルオリゴ RNAによるプレセ二リン一 2遺伝子ェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生抑制効果を調べた結果を示す図であ Oo

第 25図は、イン ' ビトロでの低酸素誘導 HMG— I結合における 2' — 0— メチルオリゴ RNAの影響を調べた結果を示す図である。図中、レーン 1の ΓΝ J は、正常酸素条件、レーン 2の「Hj は、低酸素条件を示す。また、 2' — 0 —メチルオリゴ RNAの使用量は、レーン 3については、 0. 5 g、レーン 4 については、 5 Ci g、レーン 5については、 50〃g、レーン 6については、 5 00 gである。

第 26図は、細胞内における 2' —O—メチルオリゴ RNAの取り込み、安定性及び導入効率を調べた結果を示す図である。バネル Aにおいて、パネル aは、 SK— N— SH細胞の各画分における 2' — 0—メチルオリゴ RN Aの取り込み量を示し、パネル bは、 SK— N— SH細胞への前記 2' — 0_メチルオリゴ R NAの導入効率を示す。パネル Bは、 SK— N— SH細胞への前記 2' — 0 -メチルオリゴ RNAの導入後、 48時間の時点での 2' — 0—メチルオリゴ RNA の安定性を調べた結果を示す。

第 27図は、 HMG— Iの DNA認識モチーフを決定するための合成 DNAの配列を示す図である。最上段は、 HMG— I認識モチーフのコンセンサス配列を示す。

第 28図は、 SK— N— SH細胞由来の核抽出液中の HMG— Iの DNA結合における 2' —0—メチルオリゴ RN Aの作用を調べた結果を示す図である。パネル Aは、ゲルシフトアツセィの結果を示し、パネル Bは、バネル Aを数値化したデータを示す。

第 29図は、細胞死に対する 2' -0—メチルオリゴ RN Aの作用を調べた結果を示す。パネル Aは、低酸素条件とッニカマイシンとにより誘導された細胞死について調べた結果、バネル Bは、 HMG— Iの一過性発現とッニカマイシンとにより誘導された紬胞死について調べた結果である。発明を実施するための最良の形態

本発明の阻害剤は、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5との間の結合を阻害する化合物を有効成分として含有することに 1つの特徵がある。本発明の阻害剤は、前記化合物を含有しているため、 HMG— Iタンパク質とプレセニリン— 2 mRNAとの間の結合を阻害することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の阻害剤によれば、前記プレセ二リン一 2 mRNAのスプライシング異常、特にプレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の阻害剤は、プレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制できるため、さらに神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を発揮する。

プレセニリン— 2遺伝子は、アルツハイマー病における原因遺伝子の 1つとして考えられている遺伝子である。前記プレセニリンー 2遺伝子にコードされる夕ンパク質は、小胞体ゴルジ体に存在する膜タンパク質であって、アミロイド代謝又は沈着に閼係するタンパク質である。前記プレセ二リン一 2遺伝子は、 1 2のェキソンから構成され、このうち、 1 0のェキソンがタンパク質をコードする [ 例えば、レビーラハド（Levy-Lahad)ら, Genomics, 34, 198-204, (1996);レビーラハドら, Science, 269, 973-977 (1995); ロゲフ（Rogaev)ら. Nature, 376, 7 75-778 (1995) 等を参照のこと〗。

なお、本明細書において、「プレセニリン一 2遺伝子」とは、プレセ二リン一 2タンパク質をコードする mRNA、 DNA (例えば、ゲノム DNA、 cDNA ) のいずれをも含むことを意味する。なお、プレセ二リン一 2遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、例えば、ジーンバンク（Ge nBa nk) のァクセッション番号： XM002 1 27、 XM 002 1 28、 XP 002 1 27等に記載されている。

本発明で用いられる「HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2 mR NAェキソン 5との間の結合を阻害する化合物」は、例えば、特定部位において、該結合を特異的に拮抗し、それにより、該結合を完全に阻害する化合物、又は、特定部位において、該結合を特異的に拮抗し、それにより、該結合の結合強度を減少させる化合物のいずれでもよい。

前記「特定部位」としては、具体的には、例えば、 ①配列番号： 1に示される塩基配列からなる領域、 ②配列番号： 2に示される塩基配列からなる領域、 ③配列番号： 1に示される塩基配列と配列番号： 2に示される塩基配列とを含有した領域；④前記①〜③それぞれに対応する DNA上における連続した配列からなる領域等が挙げられる。

また、本発明においては、前記「特定部位」には、（ i ) HMG— Iタンパク質のアミノ酸配列において、 HMG— Iタンパク質とブレセニリン— 2遺伝子との間の結合に関与する連続した配列からなる領域；（ii) HMG— Iタンパク質中に存在するアミノ酸残基であって、かつ HMG— Iタンパク質とプレセニリン一 2遺伝子との間の結合に関与する複数のアミノ酸残基から形成される空間的な領域をも含まれる。

前記「結合に閟与するアミノ酸残基」としては、例えば、他のアミノ酸残基に置換された場合、得られたタンパク質のプレセニリンー 2遺伝子への結合能を消失させる残基等が挙げられる。

前記配列番号： 1に示される塩基配列及び配列番号： 2に示される塩基配列は、プレセ二リン一 2遺伝子の mRNAに存在する配列であり、 HMG— Iタンパク質との結合に重要であることが、本発明者らにより見出された塩基配列であり、本発明は、かかる本発明者らの知見に基づく。

本発明においては、前記配列番号： 1又は 2は、前記配列番号： 1又は 2において、少なくとも 1残基の変異を有する配列であって、かつ HMG— Iタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応する D N A配列であってもよく、前記配列番号： 1若しくは配列番号： 2の塩基配列と少なくとも 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上の配列同一性を有する配列であって、かつ HMG—〖タンパク質との結合能を呈する配列であってもよい。

前記化合物は、低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。前記化合物としては、例えば、 RNA、 DN A等の核酸；有機合成化合物等が挙げられる。前記核酸は、 1本鎖でも 2本鎖であってもよく、直鎖状であっても環状であってもよい。

前記化合物としては、例えば、 HMG— Iタンパク質中に存在するアミノ酸配列であって、かつ HMG— Iタンパク質とブレセニリン— 2遺伝子との結合に関与するアミノ酸配列からなる領域をブロックする化合物（例えば、核酸、核酸ァナログ等）； HMG— Iタンパク質中に存在するアミノ酸残基であって、かつ H MG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2遺伝子との結合に関与する複数のァミノ酸残基から形成される空間的な領域をブロックする化合物（例えば、該空間的な領域に適合する有機合成化合物等）；プレセニリン一 2 mR NAェキソン 5中に存在する塩基配列からなる領域であって、かつ HMG— Iタンパク質とプレセ二リン - 2遺伝子とが会合する領域をブロックする化合物（例えば、核酸、核酸アナログ等）等が挙げられる。

また、本発明においては、前記配列番号： 1に示される塩基配列及び Z又は配列番号： 2に示される塩基配列を介して、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2遺伝子とが結合することを阻害しうる化合物も本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書において、「配列同一性」とは、配列番号： 1又は 2に示される塩基配列からなる核酸分子と比較対象の核酸分子との間の対応残基の同一性をいう。前記「配列同一性」には、 2 ' — 0—メチル誘導体、脱ァミノ誘導体（例えば、イノシン等）、アデノシン誘導体（例えば、イソペンテニルアデニン、トレオニノカルボニルアデニン等）、含硫誘導体（4一チォゥリジン、 2—チォピリミジン誘導体）等の修飾塩基等を介して、配列番号： 1又は 2に示される塩基配列の残基に類似する場合をも含むことを意図する。前記「配列同一性」は、比較対象の塩基配列の領域にわたつて、最適な状態にァラインメントされた 2つの塩基配列を比較することにより決定されうる。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の塩基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に 1 0 0をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメント及びホモロジ一を得るためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Smi th) らの局所ホモロジ一アルゴリズム [Add. APL Math. , 2, 482 (1981) ]、ニードルマン（Needleman) らのホモロジ一アラインメントアルゴリズム [J. ol. Biol, 48, 443 (1970) ]、パールソン（Pearson) らの相同性検索法 [Proc. Nat l. Acad. Sci . USA, 85, 2444 (1988) ] 等が挙げられる。より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルティ法、 Smi th-Watermanアルゴリズム、 Good-Kan ehisa アルゴリズム、 BLASTアルゴリズム、 FASTA アルゴリズム等が挙げられる o

前記化合物としては、具体的には、（A) 配列番号： 1に示される塩基配列及び又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する R NA分子が挙げられる。前記（A) の R NA分子によれば、前記（ i ) 又は（i i) のいずれかの領域をブロックすることができる。

前記（A) の R NA分子としては、具体的には、例えば、（a ) 配列番号： 3 、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる R NA分子等が挙げられる。

また、配列番号： 1に示される塩基配列を含有した核酸、配列番号： 2に示される塩基配列を含有した核酸、及び配列番号： 1に示される塩基配列と配列番号： 2に示される塩基配列とを含有した核酸からなる群より選ばれた 1種と H M G 一 Iとの間の結合親和性の点において、同等の結合親和性を呈するものであれば、前記（A) の RNA分子から得られる核酸誘導体も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明においては、前記配列番号： 1又は 2は、前記配列番号： 1 又は 2において、少なくとも 1残基の変異を有する配列であって、かつ HMG— Iタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応する D NA配列であってもよく、前記配列番号： 1又は 2は、前記配列番号： 1若しくは配列番号： 2の塩基配列と少なくとも 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上の配列同一性を有する配列であって、かつ HMG— Iタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応する DNA配列であってもよく、かかる配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる前記結合親和性は、 HMG— Iタンパク質との結合を、サウスウェスタン解析、ゲルシフトアツセィ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパク質一核酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法により評価されうる。

具体的には、核酸及び核酸誘導体としては、例えば、

( B) 配列番号： 1に示される塩基配列に対応する DNA配列及び Z又は配列番号： 2に示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する DNA分子、

(C) 前記（A) の RNA分子又は（B) の DNA分子のいずれかに相補的なァンチセンス分子、

(D) 前記（A) の RNA分子又は（B) の D NA分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、

( E) 前記（C) のアンチセンス分子のアナログ分子、

等が挙げられる。

前記（B) の D NA分子によれば、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5中における領域であって、 HMG— Iタンパク質とプレセユリンー 2遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。ここで、前記（B) において、「配列番号： 1に示される塩基配列に対応する DNA配列」又は「配列番号： 2に示される塩基配列に対応する DNA配列」とは、配列番号： 1又は配列番号： 2 に示される配列の逆転写産物の相補鎖を意味する。前記（B) の DNA分子としては、具体的には、例えば、（b ) 配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列に対応する DNA配列（uが tに変換されたもの）を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる DNA分子が挙げられる。

前記（C ) において、前記（A) の RNA分子に相補的な分子（アンチセンス分子）によれば、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5中における領域であつて、 HMG— Iタンパク質とプレセニリンー 2遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。一方、前記（B) の DNA分子に相補的なアンチセンス分子によれば、前記（i ) 又は（ii) の領域をブロックすることが期待される。前記（C ) に示されるアンチセンス分子としては、前記（a ) の RNA分子又は（b ) の DNA分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子が挙げられる。前記（D) において、アナログ分子としては、前記（A) の RN A分子又は（ B ) の DNA分子において、リン酸ジエステル結合における酸素原子がィォゥ原子で置換されたチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（S—才リゴ）、又は、リン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフヱ一ト基で置換されたォリゴヌクレオチド等の生体内でォリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変されたオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、前記アナログ分子は、いわゆるペプチド核酸といわれる核酸であってもよい。前記アナ口グ分子としては、具体的には、配列番号： 2 7に示される塩基配列を有する 2 ' — 0—メチルオリゴ RNA、該配列番号： 2 7に示される塩基配列を有する 4— チォゥリジン含有 RNA、該配列番号： 2 7に示される塩基配列を有する 2—チォピリミジン含有 RNA等が挙げられる。これらのアナログ分子は、例えば、生体内における安定性に優れる点が特に有利である。

前記（D) において、前記（A) の RNA分子のアナログであって、かつ HM G— Iタンパク質と結合するアナログ分子によれば、前記（i ) 又は（ii) の領

1 g 域をブロックすることが期待される。また、前記（B) の DNA分子のアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子によれば、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5中における領域であって、 HMG— Iタンパク質とプレセユリン— 2遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。前記（D) に示されるアナログ分子としては、具体的には、例えば、前記（a ) の RNA分子又は（b ) の DNA分子のいずれかのアナログであって、かつ H MG - Iタンパク質と結合するアナログ分子が挙げられる。

前記（E) において、アナログ分子としては、前記（C) のアンチセンス分子において、リン酸ジエステル結合における酸素原子がィォゥ原子で置換されたチォリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（S—オリゴ）；リン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフヱ一ト基で置換されたオリゴヌクレォチド等の生体内でォリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、前記アナログ分子の場合、いわゆるペプチド核酸といわれる核酸であってもよい。具体的には、（e ) 前記（c ) のアンチセンス分子のアナログ分子が挙げられる。

本発明の阻害剤に用いられる化合物は、核酸又は核酸誘導体を用いる場合、慣用の遺伝子組換え技術、核酸合成法、部位特異的変異導入法により得られうる。例えば、核酸又は核酸誘導体は、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法に従い、例えば、 DNA合成装置を用いて直接合成してもよく、これらの核酸又は核酸誘導体（特に、変異体）を含む核酸又はその一部を合成した後、 P C R法又はクローニングベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。さらに、 DNA分子の場合、これらの方法により得られた DNA分子を、制限酵素等により切断し、ついで、 DNAリガ一ゼ等を用いて適切なベクター等に連結し、得られた組換えベクターを適切な宿主に導入して、得られた形質転換体から核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定な核酸誘導体を得るために、前記核酸の塩基、糖、リン酸部分を化学修飾を施してもよい。前記部位特異的変異導入法としては、例えば、ギャップド 'デュプレックス (g apped duplex) 法 [例えば、 ucleic Acids Research, 12, 9441-9456(1984) 等を参照のこと] 、クンケル (Kunkel)法 [例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82， 488-492(1985)等を参照のこと] 、変異導入用プライマーを用いた P C Rによる方法等が挙げられる。

前記核酸合成法としては、リン酸トリエステル法、ホスホルアミダイト法、 H 一ホスホネート法等が挙げられる。

本発明の阻害剤の薬理評価は、例えば、被検物質（薬理評価対象物）の存在下において、前記（A) の核酸、より具体的には、配列番号： 4に示される塩基配列を有する核酸と HMG— Iタンパク質との結合を検出すること又は該結合の結合強度（例えば、結合親和性等）を測定することにより行なわれうる。

すなわち、被検物質の存在下に、前記（A) の核酸、より具体的には、配列番号： 4に示される塩基配列を有する核酸と HMG— Iタンパク質とを接触させる工程を行ない、 I ) 被検物質の存在下において、該核酸と該 HMG— Iタンパク質との結合が検出されない場合、又は I I) 被検物質の存在下における該核酸と該 HMG - Iタンパク質との結合の結合強度 aが、被検物質の非存在下における該核酸と該 HMG— Iタンパク質との結合の結合強度 bよりも小さい場合、該被検物質が、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5と HMG— Iタンパク質との間の結合に対する阻害剤であることの指標となる。また、前記被検物質について、結合親和性を調べる。前記結合及び結合強度（例えば、結合親和性等）は、例えば、前記サウスウェスタン解析、ゲルシフトアツセィ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパク質一核酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法により評価できる。

具体的には、前記結合及び結合強度（例えば、結合親和性等）は、被検物質の存在下において、例えば、適切な支持体上に前記（A) の核酸、より具体的には、配列番号： 4に示される塩基配列を有する核酸又は HMG— Iタンパク質を固定化されたマトリックスを用い、該マトリックスに固定した物質に対応する物質を接触させ、質量の変化、蛍光の変化等を指標として、例えば、前記共鳴プラズモン相互作用解析等により測定することができる。

なお、前記 HMG - Iタンパク質は、例えば、適切な細胞を、通常の酸素条件下に培養し、ついで、低酸素条件下に培養し、それにより細胞内で発現させうる通常の酸素条件としては、用いる細胞に応じて適宜設定できるが、例えば、 S K— N - S H細胞の場合、 5 % C 0₂ 下、 3 7ででの培養等の条件等が挙げられる。低酸素条件としては、例えば、低酸素圧（8 t 0 r r ) の条件が挙げられる。具体的には、例えば、低酸素圧（8 t 0 r r ) の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバ一を備えたインキュベーターを用い、 3 7 'Cで低酸素条件下に 2 1時間、培養物を維持することにより、細胞に低酸素刺激を与えることができる。前記細胞としては、例えば、神経钿胞、グリア細胞、星状細胞等の中枢神経系細胞、織維芽細胞等が挙げられ、より具体的には、例えば、 S K— N— S H細胞 (A T C C HT B - 1 1 ) 等が挙げられる。

また、必要により、慣用のタンパク質精製手法〔塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー等〕により精製してもよい。

本発明の阻害剤においては、有効成分が核酸又は核酸誘導体である場合、使用目的に応じて、核酸又は核酸誘導体を、適宜、細胞への導入に適したベクターリポソーム、金属粒子、正電荷ボリマー等に保持せしめてもよい。

前記ベクターとしては、例えば、無毒化したヘルぺスウィルスベクタ一、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、無毒化したレトロウイルスベクター等が挙げられる。

前記リボソームとしては、 HV J—リボソーム、正電荷リボソーム等が挙げられる。本発明の阻害剤における有効成分量は、使用目的等に応じて、結合阻害作用を発揮する範囲で適宜設定されうる。例えば、有効成分が、 0. 01〜10 Omg 好ましくは、 3〜1 0 Omgであることが望ましい。

本発明の阻害剤は、プレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制し、それにより、神経細胞死を抑制することができるため、該阻害剤により、神経細胞死抑制剤が提供されうる。かかる神経細胞死抑制剤も本発明の範囲に含まれる。

本発明の神経細胞死抑制剤は、前記阻害剤を有効成分として含有することを 1 つの大きな特徴とする。したがって、神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を発揮する。

本発明の神経細胞死抑制剤における有効成分の含有量は、投与対象の個体の体重、年齢、投与目的により適宜設定することができる。

また、本発明の神経細胞死抑制剤においては、投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与量は、例えば、 RNA分子を含有する場合、例えば、有効成分が、 0. 0 1〜1 0 Omg、好ましくは、 3〜1 0 Omgであることが望ましい o

本発明の神経細胞死抑制剤の投与方法としては、直接体内に導入する i n v i vo法等が挙げられる。

前記 i n v i vo法により投与する場合、投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択され、例えば、静脈注射、鼻粘膜吸入等が挙げられる。

例えば、核酸又は核酸誘導体を含有した阻害剤を有効成分として神経細胞死抑制剤を血液内投与する場合、一般には 1日あたり、有効成分量として、 0. 0 1 〜1 0 0111 、好ましくは3〜1 0 Omgであることが望ましい。

また、本発明の神経細胞死抑制剤には、神経細胞等への導入を容易にしうる物質、通常の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を含有してもよい。

本発明の神経細胞死抑制剤の薬理評価は、前記阻害剤における薬理評価と共に以下に示す手法により行ないうる。すなわち、被検物質（神経細胞死抑制剤の候補）を導入した S K— N—S H細胞〔被検細胞〕と導入していない S K— N— S H細胞〔対照細胞〕とについて、それぞれ低酸素条件（低酸素圧（8 t 0 r r ) の条件等〕下、ッニカマイシン等により引き起こされる神経細胞死を調べることにより薬理評価が行なわれうる。ここで、被検細胞における神経細胞死が、対照細胞における神経細胞死よりも抑制される場合、前記被検物質が、神経細胞死抑制剤であることの指標となる。また、 HM G— Iを一過性発現し、かつ被検物質 (神経細胞死抑制剤の候補）を導入した S K - N - S H細胞〔被検細胞〕と、 H MG— Iを一過性発現する S K— N - S H細胞〔対照細胞〕とについて、ッニカマイシン等により引き起こされる神経細胞死を調べることにより薬理評価が行なわれうる。ここで、被検紬胞における神経細胞死が、対照細胞における神経細胞死よりも抑制される場合、前記被検物質が、神経細胞死抑制剤であることの指標となる。

かかる神経細胞死の抑制について、 MT T法 [モッスマン（Mossman，T. )ら， J.

Immunol. Methods, 65. 55-59(1985) ] により確認してもよく、慣用の 3— ( 4 , 5—ジメチルチアゾ一ルー 2—ィル）一 5— （3—カルボキシメトキシフエ二ル）一 2— （4一スルホフエニル）一 2 H—テトラゾリゥムアツセィ（MT Sァッセィという）を行なって、細胞の生存率を測定し、被検細胞と対照細胞とを比較することにより確認してもよい。

前記低酸素条件として、具体的には、例えば、低酸素圧（8 t 0 r r ) の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバ一を備えたインキュベータ一を用い、 3 7 V で低酸素下に 2 1時間、培養物を曝露することにより、細胞に低酸素刺激を与える条件が挙げられる。本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、プレセ二リン一 2 m R NAのスプライシング異常、特にプレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物が提供されうる。かかる医薬組成物も本発明に含まれる。また、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製造に使用されうる。本発明の医薬組成物は、前記阻害剤又は前記神経細胞死抑制剤を有効成分として含有することに 1つの特徴がある。本発明の医薬組成物は、スプライシング異常を抑制する作用、プレセ二リンー 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生を抑制する作用等を有する。したがって、本発明の医薬組成物は、ブレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防への応用が期待される。

本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患としては、例えば、脳組織におけるプレセニリンー 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する神経変性疾患等が挙げられる。

前記脳障害としては、虚血性脳疾患、脳神経変性疾患等が挙げられる。より具体的には、脳血管性痴呆、パーキンソン症候群、アルツハイマー病等が挙げられる。

前記神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。

本発明の医薬組成物の投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与量は、例えば、 R NA分子を含有する場合、有効成分量として、 0 . 0 1〜1 0 O m g、好ましくは 3〜1 0 O m gであることが望ましい。

本発明の医薬組成物は、有効成分が、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内に取り込まれるような剤形であればよく、単独で、もしくは、慣用の担体と混合して、非経口投与、局所投与で投与される。

投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択され、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸入等が挙げられる。

医薬組成物が、例えば、核酸又は核酸誘導体を含有するものであり、血液内投与する場合、一般には 1日あたり、有効成分量として、 3〜1 0 O m gを 1日 1 回から数回投与することができる。

また、本発明の医薬組成物は、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレツト製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはォスモチックポンプ等を用いて患部に連続的に徐々に投与することもできる。

本発明の医薬組成物は、必要に応じ、疾患部位への導入を容易にしうる物質、各種の担体、助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クェン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ぺクチン、落下生油、ォリーブ油、カカオバター、エチレングリコール等をさらに含有してもよい。

本発明の医薬組成物の薬理評価は、前記阻害剤及び神経細胞死と同様の評価方法により行なわれうる。また、対象となる疾患に応じて、慣用の薬理評価を行なうこともできる。

本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、ブレセ二リン一 2 m R NAのスプライシング異常、特にプレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセ二リン一 2 mR NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、例えば、脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防方法が提供されうる。かかる治療又は予防方法も本発明の範囲に含まれる。

本発明の治療又は予防方法は、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの產生に起因する疾患、例えば、脳障害の個体又は神経変性疾患の個体に、治療上有効量の本発明の阻害剤又は本発明の神経細胞死抑制剤を投与することを 1つの特徴とする。本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、プレセニリンー 2 mR NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防が期待される。

また、本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、神経細胞死の抑制作用を、より効率よく、より持続的に発揮させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防を、より効率よく、より持続的に行なうことができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、 HMG— Iが DNA結合部位において DNAと結合することにより発揮される HMG— I本来の機能を損なうことなく、 R NA結合部位を阻害するという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の治療又は予防方法によれば、 HMG— Iと DNAとの結合に基づく本来の機能を損失させることによる影響を生じないという優れた効果を発揮する。

「治療上有効量」とは、神経細胞死を抑制することができ、プレセ二リン一 2 mR NAのスプライシング異常、特にプレセニリン— 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制することができる量を意味する。

個体への阻害剤又は神経細胞死抑制剤の投与は、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸入等により、 1日あたり、阻害剤又は神経細胞死抑制剤の有効成分量として、 3〜1 0 0 111 8を1日 1回から数回投与することにより行なわれうる。

本発明の治療又は予防方法の効果は、対象となる疾患の病理学的特徴等の発現の抑制を指標として評価されうる。例えば、脳虚血のモデルとして、特に限定されないが、先天的に W i 1 1 i s動脈輪の形成が不完全な動物の両側総頸動脈を一過性に閉塞して、ついで再開通させることにより得られる遅発性神経細胞死のモデル動物；中大脳動脈を永久又は一過性に閉塞して得られる局所脳虚血モデル動物等を用い、該モデルに前記阻害剤又は神経抑制剤を投与し、症状の改善等を調べることにより、本発明の治療又は予防方法の効果を評価することができる。さらに、マウスに対して、長期的にアルミニウムや鉄等を負荷して得られる化学的低酸素モデル動物；加齢により生じる微小管梗塞低酸素を反映する老齢マウス等のモデル動物に、前記阻害剤又は神経抑制剤を投与し、症状の改善等を調べることにより、本発明の治療又は予防方法の効果を評価することもできる。

また、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、プレセ二リン一 2 m R NAのスブライシング異常、特にプレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を製造することができる。しらがって、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセ二リン一 2 m R N Aェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を製造するための、本発明の阻害剤又は神経細胞死抑制剤の使用も本発明に含まれる。実験例 1 細胞培養、低酸素刺激及び一過性トランスフクシヨン

サトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 J. Biol. Chem.. 276, 2108-2114, (200 1)] に従い、以下のように、細胞培養及び低酸素刺激を行なった。

ヒト神経芽細胞腫 SK— N— SH細胞を、 1 0%ゥシ胎仔血清を含有した M EM 〔ギブコビー ·アール ·エル（G I BCO BRL) 社製〕中において、 5%C0₂ 、 37でで培養した。前記細胞が 1 76. 6 cm² 培養皿にてコンフルェントに達したとき、培養物中の血清含有 α— MEMを、無血清 αΜΕΜと交換した。培地交換後の培養物を、さらに 4時間培養した。

ΗΕΚ- 29 3 Τ細胞及び He L a細胞については、それぞれ 1 0%ゥシ胎仔血清を含有したダルべッコ最小必須培地（ギブコビー ·アール ·エル社製〕中において、 5% C0₂ 、 37°Cで培養した。前記細胞のそれぞれが 1 76. 6 cm² 培養皿にてコンフルェントに達したとき、培養物中の血清含有ダルベッコ最小必須培地を、無血清ダルベッコ最小必須培地と交換した。培地交換後の培養物を、さらに 4時間培養した。

低酸素刺激を与える場合、低酸素圧（8 t 0 r r) の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバ一を備えたインキュベーターを用い、得られた培養物を 37°Cで低酸素下に 2 1時間曝露した。

種々の構築物の一過性トランスフヱクシヨンを、リボフヱクタミン 2000 ( L e p 0 f e c t AM I NE™ 2000) 〔ギブコビー 'アール 'エル社製〕を用いて行なった。

また、オリゴ RNAの一過性トランスフヱクシヨンを、ォリゴフヱクタミン（ 01 i go f e c t Am i n e) (ギブコビー ·アール ·エル社製〕を用いて行なつた。実験例 2 全 R N Aの調製及び R T-PCR

サトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 J. Neurochem. , 72, 2498-2505, (1999) ] に従い、以下のように、種々のストレス下の神経芽細胞腫 SK - N— SH細胞、 HEK - 293 T細胞及び He La細胞それぞれ由来の全 RNAの調製、並びに RT— PCRを行なった。

RNe a s yトータル RNAキット〔キアゲン（Q i a g e n) 社製〕を用い、製造者の説明書に従い、酸素正常状態、低酸素曝露又は HMG - Iの過剰発現時における SK— N— SH紬胞及び HEK— 293 T細胞のそれぞれから全 RN Aを抽出、精製した。

ついで、得られた全 RNAと、マウスモロニ一白血病ウィルス逆転写酵素〔プ口メガ（P r ome ga) 社製〕とを用いて、 42でで 1時間逆転写反応を行なつた。ついで、得られた反応物を铸型として、ネステイツド PCRを行なった。

PCRのサ一マルプロファイルは、 95°C30秒- 60^eC30秒— 72°C 1分（最終サイクルにおいては 2分）を 1サイクルとした 30サイクルである。 1次 P CRには、プライマ— p s 25 1 C5' -attcagacctctctgcggcc-3' (配列番号： 9 ) 〕とプライマ一 p s 23 1 C5' -aagcgggagccaaagtctgg-3' (配列番号： 1 0) 〕とを用いた。 2次 PCRには、プライマ一 p s 252 C5' -gttcgtggtgcttccag agg-3' (配列番号： 1 1 ) 〕とプライマー p s 233 C5' -ggaccactctgggaggtac a-3' (配列番号： 1 2) 〕とを用いた。

得られた産物を、 5%ボリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、臭化工チジゥム染色により可視化した。実験例 3 核抽出液の調製

核抽出液を、シュレイバー（Shreiber)らの方法の改良方法 [ヨネダ (Yoneda, Y .)ら、 Neuroscience, 90, 519-533 (1999)] に従い、以下のように調製した。なお、使用した緩衝液及びその他の溶液は、いずれも、使用前に、その都度、孔径 220 nmの S t e r i t 0 p 〔ミリポア（M i 1 i p o r e ) 社製〕により濾過して滅菌した。各細胞構造物のホモジナイズについては、特に断りのないかぎり、 1 OmM KC 1と ImM EDTAと ImM EGTAと 5mM ジチオトレイトール（ DTT) と ImM (p—アミジノフヱニル）メタンスルホニルフルオリド（P MSF) とを含有する 1 0mM HEPES-NaOH (pH7. 9 ) 50容量〔31 5〃 1Zプレート〕中 2。Cで行なった。

ついで、得られたホモジネートに 1 0 % Non i de t P— 40を添加して終濃度を 0. 6%とした。得られた混合物を 1 5000 r pmで 5分間遠心分離した。ついで、得られたペレットを、 400 mM KC 1と ImM EDTA と ImM EGTAと ImM DTTと ImM PMS Fとを含有した 20 mM

Tr i s— HC 1 (pH7. 5) 1 0容量〔0. 1ml〕中に懸濁し、 30分間、氷冷した。氷冷後の懸濁物を、 1 5000 r pmで 5分間遠心分離した。得られた上清を、 p r e— mRNA結合アツセィ、ゲルシフトアツセィ及びスーパ一シフトアツセィのための核抽出液として用いた。なお、前記核抽出液は、使用まで、一 80てで保存した。実験例 4 サイトゾルフラクション及び核フラクションの調製

核フラクションを、マナべ（Manabe)らの文献 [マナべ（Manabe)ら， Neuroscien ce, 100. 453-463, (2000)] に従い、以下のように調製した。

1 OmM KC 1と ImM EDTAと ImM EGTAと 5mM DTTと ImM PMSFとを含有した 1 OmM HE P E S— N a OH緩衝液（p H 7 . 9) 〔31 5 z 1 プレート〕中 2°Cで脳構造物をホモジナイズした。得られたホモジネートに、 10% Non i de t P— 40を添加して終濃度を 0. 6%に調製した。得られた混合物を、 1 5000 r pmで 5分間遠心分離して、ペレツト〔核フラクション（NP— 40不溶性）〕と上清〔サイトゾルフラクシヨン（NP— 40可溶性）〕とを得た。また、前記ペレットを、 ImM EDT Aと ImM EGTAと PMSFとを含有した 5 OmM Tr i s -HC 1 (p H7. 5) 〔50 1〕中に懸濁し、核フラクション（NP— 40不溶性）とし

実験例 5 DN A構築物の調製

第 23図に示す各オリゴヌクレオチドを慣用の方法により合成した。 24マ一又は 60マ一の塩基長を有する 2種の相補的なォリゴヌクレオチドを用いてァニ一リングを行ない、 No. l〜No. 1 1 (配列番号： 1 3〜23) の各二本鎖 DNA断片を得た。なお、図中、各オリゴヌクレオチドにおいて、 PS 2のェキソン 5の各断片を下線を付し、太字で示す。

得られた二本鎖 DNA断片を、それぞれ、 pcDNA3 ( + ) ベクターに組み込み、 DNA構築物を得た。 DNAシークェンサ一 373 A型〔アプライドバイォシステム（App l i ed b i o s ys t em)社製〕を用いて、前記二本鎖 DNA断片のそれぞれについて、配列解析を行なった。実験例 6 pr e一 mRNAプローブの調製

実験例 5で得られた DN A構築物を、 Ec oR Iを用いて直鎖状にし、それにより铸型 DNAを得た。ついで、前記铸型 DNAを、 [ 一³⁵ S]標識 UTP ( 62. 5〃C i)又は [ 一³² P]標識 UTP (50〃C i) と 0. 25mM UTPと 0. 5mM ATPと 0. 5mM CTPと 0. 5mM GTPと T7

RNAボリメラーゼ用緩衝液と 20Uの T7 RNAポリメラ一ゼ〔プロメガ (P r omega)社製〕と 40単位の RNァーゼインヒビター（東洋紡社製）とを含有した転写用緩衝液中 37でで 1時間インキュベートすることにより、ィンビトロ転写を行ない、 pr e— mRNAプローブ（RNAプローブ No 1〜1 1 ) を得た。実験例 7 p r e— mRNA結合アツセィタンパク質量 5 g相当量の核抽出液を、 10〃£：の11¾ 八と各³⁶3—標識 RNAプローブ（1 zg) とともに、インキュベーション緩衝液〔6 OmM K C 1と 4mM MgC l ₂ と ImM EDTAと ImM EGTAと ImM D TTと 1 0 %グリセロールと 1 mM PMSFとを含有した 1 2mM HEPE S— N a OH緩衝液（pH7. 9)〕中 25。Cで 30分間インキュベートした（全容量 25 1 )。

ついで、得られた反応物に、 UV照射器（ 254 nm、 60W)下、 1 5分間室温で紫外線（UV)照射した。その後、 UV照射後の反応物に 1 O zgORN ァ一ゼ Aを添加し、 25でで 30分間インキュベーションして、前記反応物中のプローブを消化した。

得られた産物を、 1 0% グリセロールと 2% SDSと 0. 01% ブロモフエノールブルーと 5% 2—メルカプトエタノールとを含有した 1 OmM T r i s - HC 1緩衝液（pH6. 8 ) と体積比 1 ： 4で混合して、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)処理を行なった。 SDS処理した溶液を、 0. 1%の SD Sを含有する 10〜20%グラジヱントボリアクリルアミドゲル又は 1 5%ポリアクリルアミドゲル上、 15mA/プレートの一定電流で 2時間、室温での電気泳動に供した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、イメージングプレートに曝した。実験例 8 ノーザンプロットアツセィ

ノーザンプロットアツセィを、前記サトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 J. B iol. Chem.. 276, 2108-2114, (2001)] に記載の方法に従って、下記のように行なった。すなわち、全 RNAの 20 zg相当量を、ホルムアルデヒド一ホルムァミドゲルを用いて電気泳動し、得られたゲルをナイロンフィルターにプロットした。ついで、前記ナイロンフィルターに転写された RNAと標識ヒト HMG— I cDNAとをハイブリダィズさせた。なお、前記標識ヒト HMG— I cDN Aを、 Ra n d om— Lab e 1 i ngキット（宝酒造社製）を用いて標識して作製した。実験例 9 ィムノブロットアツセィ

ィムノブロットアツセィを、前記マナべ (Manabe)らの文献 [マナべ (Manabe)ら . Neuroscience, 100, 453-463, (2000)] の記載に従って、下記のように行なつた。すなわち、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラクション及び核フラクシヨンについて、タンパク質量を測定した。ついで、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラクション及び核フラクションの各ァリコートと、緩衝液〔 1 0m M Tr i s—HC l、 1 0% グリセロール、 2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 、 0. 0 1 % プロモフヱノールブルー、 5% メルカプトエタノール、（pH6. 8) 〕とを体積比 1 ： 4で混合した。得られた混合液を 1 0 0°C で 1 0分間煮沸した。一定量の各ァリコート（核抽出液においては 25〃gタンパク質相当量、全ライセートとサイトゾルフラクションと核フラクションとにおいては 50 gタンパク質相当量）を、 0. 1 % SDSを含有した 1 5% ポリアクリルアミドゲル上、 1 5 mAZプレートの一定電流で 2時間、室温で電気泳動した。電気泳動後のゲルを、 1 00% メタノールにより活性化させたボリビニリデンジフルオリド（PVDF) 膜にブロットした。ブロット後の PVDF 膜を、 5% スキムミルクを含有した 0. 0 5% Twe e n— 20含有 PBS でブロックした。ついで、 PVDF膜を、 1 %スキムミルクを含有した 0. 0 5 % Twe e n- 20含有 P B Sに希釈した抗 HMG— IZY抗体と反応させた。アルカリホスファターゼ結合抗ャギィムノグロブリン G ( I gG) 抗体と反応させた。免疫反応性を、 1 0 OmM NaC 1と 5mM MgC 1₂ と 6 6. 7 % 4一二トロブルーテトラゾリゥムクロリド（NTB) と 33. 3¾> X—ホスフェート 5—ブロモー 4一クロロー 3—インドリルホスフエート（ B C I P ) とを含有した 1 0 OmM Tr i s— HC 1緩衝液（pH9. 5) 中で可視化した c 実験例 1 0 免疫沈降

免疫沈降を、前記サトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 J. Biol. Chem. , 276， 2108-2114, (2001)] に記載の条件に従って、下記のように行なった。

酸素正常状態の S Κ - Ν - S Η細胞由来の核抽出液又は低酸素曝露した S Κ— Ν— SH細胞由来の核抽出液を、抗 HMG— I抗体（サンタクルツバイオテクノロジ一社製）とともに 4でで 8時間インキュベートした。得られた産物をプロテイン一 Gァガロース（フアルマシアバイオテク（Pha rma c i a B i o t e ch)社製〕と混合し、 4^eCで 1時間維持した。得られた混合物を、 3000 r pmで 5分間遠心分離し、得られた沈殿物を PBSに懸濁した。さらに、得られた懸濁物を、 3000 r pmで 5分間遠心分離した。得られた沈殿物を、 M i 1 i一 Q水に懸濁した。この懸濁液を、 SDS処理し、得られた溶液を、 SDS — PAGEに供した。得られたゲルについて、 U 1 (70K) snRNPに対する抗体を用い、ィムノブロットアツセィを行なった。

また、前記抗 HMG— I抗体の代わりに、抗 Ul (70K) snRNP抗体（サン夕クルツバイオテクノロジー社製）を用いて免疫沈降を行ない、前記 U1 ( 7 OK) s nRNPに対する抗体の代わりに、 HMG— I /Yに対する抗体〔抗 HMG- I/Y抗体；サンタクルツバイオテクノロジー社製〕を用いてィムノブロットァッセィを行なつた。実験例 1 1 免疫細胞化学

免疫細胞化学的検査を SK— N—SH細胞で行なった。すなわち、 SK— N— SH細胞を酸素正常状態に維持するか、あるいは、該細胞を低酸素条件下に 21 時間曝露した。ついで、得られた細胞を、 4%パラホルムアルデヒド中に室温で 2時間固定し、 0. 3% Tr i t on— XI 00中で少なくとも 5分間透過させた。固定及び透過させた細胞を PBSで 3回洗浄した。洗浄細胞を、抗 HMG 一 IZY抗体及び抗 SC 35抗体〔シグマ（S i gma)社製〕と 4でで 12時間免疫反応させた。細胞を PBSで 3回洗浄し、 F I TC結合抗ャギ I gG抗体及び Cy 3結合抗マウス I gG抗体とともに室温で 2時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質を、コンピューターに接続した顕微鏡下で 488 nm励起フィルターを用いて観察した。実験例 1 2 免疫組織化学

免疫組織化学法を、前記サトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 Biol. Chem. , 276, 2108-2114, (2001)] に記載の改良ィムノペルォキシダーゼ法を用いて行なった。すなわち、対照又は sADの脳切片を室温で 2時間固定し、ついで、 H MG- IZY免疫組織化学の処理を行なった。抗 HMG— 1ノ丫抗体又は抗33 1^八〇抗体を1 : 1 000の希釈律で使用した。ピオチニル化抗ャギ抗体又はビォチニル化抗ゥサギ I gG 〔ベクタス夕チンエラィト（Ve c t a s t a i n E l i t e)社製〕を二次抗体として使用した。免疫反応性を、 5 OmM Tr i s (pH7. 6) 中 0. 05%DAB及び 0. 0 1 %過酸化水素で可視化した

実験例 1 3 スーパーシフトアツセィ

5 /gタンパク質相当量の核抽出液を、 1 gの抗 HMG— I/Y抗体（サン夕クルツバイオテクノロジー社製）又は 0. 5〜2. O igの抗 U1 (70K) s nRNP抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とともに 4でで 8時間インキュベートし、前処理を行なった。得られた前処理産物を、インキュベーシヨン緩衝液〔組成： 6 OmM KC 1と 4mM MgC l ₂ と ImM EDTA と ImM EGTAと ImM DTTと 10 %グリセロールと 1 mM PMSF とを含有した 12mM HEPES— NaOH緩衝液（pH7. 9 ) 〕中 2 /z g 若しくは 1 O zgの t RNAとともにインキュベートした。ついで、 ³²P標識 R NAプローブ〔1 、第 4図に示される No. 5プローブ〕を添加して、 25 °Cで 30分間インキュベーションした（全容量 50 1 )。

得られた反応物を、 5 0mM 丁1" 1 3と0. 381^グリシンと2111]^ ED TAとを含有した緩衝液（pH8. 5) 中、 4%ボリアクリルアミドゲル上、 1 1 VZcmの一定電圧で 1. 5時間、 4 °Cで電気泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついで X線フィルムに曝した。実施例 1 孤発性アルツハイマー病患者脳及び培養細胞中における PS 2 Vの発現

(1) 孤発性アルツハイマー病患者の脳における PS 2 Vの発現

孤発性アルツハイマー病（sAD) 脳由来の全 RN A又は年齢がマッチした対照脳由来の全 RNAを、 RT— PCRでアツセィした。

sAD脳及び対照脳のそれぞれから、アンウォー（Anwar R.)ら [アンウォー（A nwar R.)ら, J. Neurochem. , 66. 1774-1777 (1996)]記載の方法に従い、 mRN Aを単離した。

ついで、得られた mRNAと、マウスモロニ一白血病ウィルス逆転写酵素〔プ口メガ（P r ome g a) 社製〕とを用いて、逆転写反応を行なった。 PCRにおけるサ一マルプロファイルは、変性： 95で、 2分 Z95°C、 30秒、ァニーリング： 60。C、 30秒、伸長： 72で、 1分を 1サイクルとする 30サイクルである。また、 1次プライマ一として、前記プライマー p S 2 5 1と p s 23 1 とを用い、 2次プライマーとして、ブライマ一 p s 252と p s 233とを用い得られた反応物を 5%ボリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。増幅産物を臭化工チジゥム染色により可視化した。その結果を第 1図に示す。第 1図の左パネルのレーン 1と、サトウ（Sato)らの文献 [サトウ（Sato)ら、 J.

Neurochem.. 72， 2498-2505 (1999)]とに示されるように、対照脳においては、全長 PS 2が主要な RT— PCR産物として検出されることがわかる。一方、第

1図の左バネルのレーン 2に示されるように、 sAD脳においては、全長 PS 2 に加え、より短鎖の産物が検出されることがわかる。ダイレクトシ一クェンシングの結果、前記短鎖の産物は、 PS 2遺伝子のェキソン 5が欠失したバリアント

(以下、 PS 2 Vという）であることが示される。

(2) 培養細胞における PS 2 Vの発現

sADのモデルのように、培養細胞において、 PS 2 Vの生成を効率よく再現するために、前記と同様の実験によりあらゆる種類のストレス下における種々の細胞株由来の全 RNAについて、 PS 2 Vの発現を測定した。その結果を第 1図の右パネルに示す。

第 1図の右パネルのレーン 1〜 3に示されるように、酸素正常状態に曝露した種々の細胞株、すなわち He L a細胞、 HE K— 293 T細胞及びSK-N-S H細胞において、全長 PS 2のみが検出されることがわかる。また、第 1図の右パネルのレーン 4及び 5に示されるように、同様の結果が低酸素条件に曝露した H e L a細胞及び HEK— 293 T細胞において見られる。

しかしながら、低酸素条件に曝露した SK— N— SH細胞〔第 1図、右パネルのレーン 6 ；サトウ（Sato)ら、 J. Neurochem. , 72, 2498-2505 (1999) 〕並びに sAD脳においては、 PS 2と、ダイレクトシ一クェンシングにより PS 2Vであることが確認された短鎖の産物とが検出されることがわかる。

—方、検出可能な PS 2Vは、他のストレスであるッニカマイシン（第 1図、右パネルのレーン 7) 、ーアミロイド（第 1図、右パネルのレーン）及び過酸化水素 [サトウ（Sato)ら、 J. Neurochem.. 72. 2498-2505 (1999)]においては観察されなかった。ついで、 PS 2 Vタンパク質に対する抗体（抗 SSMAG抗体）を用いて、免疫組織化学的染色法により、 PS 2Vの局在を調べた。結果を第 2図に示す。第 2図及びサトウらの文献 [サトウ（Sato N)ら、 J. Biol. C em. , 276, 2108- 2114, (2001)] に示されるように、 PS 2 Vに対する免疫反応性が、 sAD脳組織の海馬 C A 1領域の錐体細胞層及び側頭皮質の維体細胞層に観察される。したがって、 s AD脳組織の海馬 C A 1領域の錐体細胞層及び側頭皮質の錐体細胞層において、 PS 2 Vが局在することがわかる。実施例 2 低酸素曝露細胞における PS 2 p r e— mRNA結合因子の検出低酸素曝露細胞における PS 2 p r e— mRNA結合因子を検出するため、第 4図に示す種々の³⁵ S—標識 p r e - mRNAプローブ（RNAプローブ）を調製した。第 3図に示されるストラテジーにより、第 4図に示す種々のプローブを用いる独自の p r e— mRNA結合アツセィを構築した。結果を第 5図に示す

0

その結果、 No. 0の³⁵ S—標識プローブを用いた p r e— mRNA結合アツセィにより、第 5図、レーン 1に示されるように、酸素正常状態の神経芽細胞腫 SK— N— SH細胞由来の核抽出液においては、黒矢印で示した分子量（約 20 kDa) の位置にシグナルが検出されず、低酸素条件に 2 1時間曝露した神経芽細胞腫 SK— N— SH細胞由来の核抽出液においては、第 5図、レーン 2に示されるように、黒矢印で示した分子量（約 20 kDa) の位置にシグナルが検出された。したがって、低酸素曝露神経芽細胞腫 SK— N— SH細胞由来の核抽出液において、 PS 2 p r e— mRNA結合活性を呈する因子が存在することがわかる。 p r e— mRNA結合アツセィに使用する前における核抽出液の加熱により、 PS 2 p r e—mRNA結合活性がほぼ完全に消失するため、この結合活性がタンパク質由来であり、核酸、脂質等の他の因子由来ではないという可能性が高い。また、第 5図のレーン 3〜1 2に示されるように、低酸素条件に曝露された S K一 N— SH細胞由来の核抽出液中に見出された PS 2 p r e— mRNA結合活性を呈する因子は、 PS 2ェキソン 5の 3' 部位に結合することがわかる。さらに、低酸素条件に曝露された SK— N—SH細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子と No. 0プローブとの結合に対する非標識の No. 1〜5の各プローブの影響を、 p r e— mRNA結合アツセィにより調べた。結果を第 6図に示す。

第 6図に示されるように、低酸素曝露 S K -N-S H細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子と No. 0プローブとの結合は、 No. 5の³⁵ S—非標識プローブの添加により阻害されるが、他の非標識プローブ（No. 1〜4) では阻害されないことがわかる。

さらに、刺激後の異なる時点で得た核抽出液における No. 5プローブに対する結合活性の誘導における酸素正常状態及び低酸素の影響を調べた。その結果、酸素正常状態曝露 SK— N— SH細胞由来の核抽出液においては、使用した条件下の No. 5プローブについて顕著な結合活性は認められなかった。しかしながら、刺激後 1 6〜2 1時間の間の核抽出液では低酸素による結合活性の増強が認められ、少なくとも 24時間持続することが示された。

本実施例における全ての実験は、別の細胞培養物を用いて、少なくとも 4回繰り返され、同様の結果が得られた。したがって、低酸素により誘導される結合活性は、 No. 5プローブに特異的であることが示唆される。実施例 3 ヒト PS 2ェキソン 5結合タンパク質の精製及び同定

実施例 2における N 0 , 5ブローブへの結合活性を有する因子を精製するため、被検フラクションを、 p r e—mRNA結合性反応物に加え、 No. 5のプローブに対する結合活性の増加を測定することによりアツセィした。

精製手順の概略を第 7図に示す。第 7図に示された（ I) 〜（V) の各フラクシヨンを、銀染色（第 8図）及び RN A結合アツセィ（第 9図）によりアツセィした。

実施例 1と同様に低酸素条件に曝露した SK— N-SH細胞由来の核抽出液（第 9図、レーン 1) を、 60%飽和硫酸アンモニゥムで分画し、上清として、 N 0. 5 RNAプローブへの結合活性を有するフラクション〔フラクション（Π ) 、第 7図（II) 〕を得た。なお、前記フラクション（II) の銀染色の結果を第 8図、レーン 2に示し、 RNA結合アツセィの結果を第 9図、レーン 2に示す。前記フラクション（II) を、それぞれ 5 Lの 5 OmM Tr i s— HC 1緩衝液（pH7. 5) 中、 4°Cで 4時間、 2回透析し、それにより、硫酸アンモニゥムを除去した。得られた透析物を、 DEAEカラム（フアルマシアバイオテク（ Pha rma c i a B i o t e ch)社製〕による陰イオン交換クロマトグラフィ一に供し、その後、カラムを 1 0mlの 50 mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 5)で洗浄した。ついで、 1M Na C 1を含有した 5 OmM Tr i s— HC 1緩衝液（pH7. 5) 1 Om 1を用いて溶出を行ない、 No. 5 RNAプローブへの強い結合活性を有するフラクション（フラクション（III) 、第 7図（UI) 〕を得た。なお、前記フラクション（ΠΙ) について、銀染色の結果を第 8図、レーン 3に示し、 RNA結合アツセィの結果を第 9図、レーン 3に示す。

前記フラクション（III) を、 51^の501111^ Tr i s— HC 1緩衝液（pH 7. 5) に対して、 4°Cで 4時間、 2回透析した。ついで、得られた透析物を、 5 ' 一アミノー 2' — 0—メチルオリゴ RNA (5' -aucuucuugguggugcucuacaag uaccgcugcuacaaggugaggcccu -3' 配列番号： 24)結合 CNB r活性化セファロ —ス 4 B 〔フアルマシアバイオテク（Pha rma c i a B i o t e ch)社製〕ァフィ二ティ一カラムに供した。前記ァフィ二ティ一カラムを、前記インキュベーシヨン緩衝液 1 Omlで洗浄し、 1M NaC 1を含有したインキュベーシヨン緩衝液 15m 1を用いて溶出して、 No. 5 RNAプローブへの結合活性を有するフラクション〔フラクション（IV) 、第 7図（IV) 〕を得た（第 9図、レーン 4) 。フラクション（IV) について、銀染色の結果を第 8図、レーン 4 に示し、 RNA結合アツセィの結果を第 9図、レーン 4に示す。

銀染色の結果より、第 8図、レーン 4に示すように、完全には精製されていないことがわかった。

ついで、前記フラクション（IV) を、 5 Lの Mi 1 i一 Q水に対して、 4でで 4時間、 2回透析した。得られた透析物を完全に凍結乾燥した後、 0. 1 %TF Aを含有した Mi 1 i一 Q水に再溶解した。

得られた溶液を、 Wa t e r s 5 C 1 8 -MS (4. 6mmx 1 50mm) カラムを用いた逆相クロマトグラフィーに供した。すなわち、 0. 1 %TFAを含有した Mi 1 i一 Q水でカラムを洗浄した。その後、 0〜1 00%のリニアグラジヱントァセトニトリルの 0. 1 % TFA含有 Mi 1 i— Q水溶液 25m 1 、続いて 0. 1 % TFA含有 1 00%ァセトニトリル 5m 1を用いて溶出を行なつ τこ。

その結果、 20〜25%ァセトニトリルで溶出された単一ピークのフラクション〔フラクション（V) 、第 7図（V) 〕を得た。かかるフラクションは、 SD S— PAGE後の銀染色により、第 8図、レーン 5に示されるように、黒矢印で示した分子量の位置において単一のバンドを示した。しかしながら、最終フラクシヨンの結合活性は、先のステップ（第 7図（IV) 〕のものと比較して劇的に低下した。結合反応溶液におけるァセトニトリルの最終濃度を 30 %とすることにより、もとのフラクション中のプローブ No. 5に対する結合活性がほぼ完全に消失したため、最終フラクションの結合活性の減少は、逆相クロマトグラフィー用溶離緩衝液に含まれるァセトニトリルに依存することがわかる。

得られたフラクションを、 0. 1 % SDSを含有した 1 2%ポリアクリルァミドゲルで、 1 5mAZプレートの一定電流にて 2時間、室温で電気泳動して分離した。その後、分離されたタンパク質バンドを含むゲル断片を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行なった。溶出したペプチド断片を、 TSKゲル 0 DS- 8 OTs QAカラム（2. 0 mm x 250 mm、東ソ一社製）を用いた HPLCにより分離した。ついで、分離されたペプチド断片を、自動タンパク質シークェンサ一（HP G 1 005 A Pr o t e i n Sequen c i ng Sy s t em) により解析した。得られたペプチド配列情報をデータベースの検索に使用した。

最終フラクション中の単一バンドについてペプチド配列解析を行ない、 1 7個のアミノ酸配列を得た。得られたペプチド配列を、配列データベースの既知の夕ンパク質と比較した結果、低酸素曝露 S K— N— S H細胞由来の核抽出液中の P S 2 p r e— mRNA結合性タンパク質は、 HMG— Iに完全にマッチした（ジーンバンクァクセッション番号 P 1 7096 ) 。実施例 4 HMG- Iの結合活性の評価

実施例 3の結果に基づき、 HMG— Iが、実際に結合活性を有する物質であることを確認するため、 HMG— Iタンパク質に対する抗体と、低酸素曝露 SK— N-S H細胞由来の核抽出液又は酸素正常状態の S K - N - S H細胞由来の核抽出液とを用いて、実験例 1 3に従い、下記のように、ス一バーシフトアツセィを行なつた。

すなわち、 5 zgタンパク質相当量の核抽出液を、 0. 5〜2. 0 gの抗H MG- IZY抗体〔サンタクルツバイオテクノロジー（San t a Cruz B i o t e chno l ogy)社製〕とともに、 4。Cで 8時間インキュベートし、前処理を行なった。前処理した核抽出液を、インキュベーション緩衝液中 1 0 gの t RNAとともにインキュベートし、ついで、得られた産物に、全容量 5 0 1の³² Ρ標識 RNAプローブ〔1 ii g、第 4図に示される No. 5プローブ〕を添加して、 25てで 30分間インキュベーションした。結合プローブと遊離プローブとを、 50mM 丁1： 1 3と0. 38Mグリシンと 2mM EDTAとを含有した緩衝液（pH8. 5) 中、 4%ポリアクリルアミドゲル上、 1 1VZ 0111の一定電圧で1. 5時間、 4でで電気泳動することにより分離した。ゲルを固定し、乾燥した。ついで、乾燥ゲルを、 X線フィルムに曝して、オートラジオグラフィーを行なった。

その結果、低酸素曝露 SK - N— SH細胞由来の核抽出液を用いた場合、第 1 0図、右パネルのレーン 1及び 2に示すように、酸素正常状態の SK— N— SH 細胞由来の核抽出液を用いた場合よりも強い結合活性が見られた。また、この結合活性の増加は、第 1 0図、右パネルのレーン 3〜5に示すように、抗 HMG— IZY抗体での前処理により、抗体濃度依存的にスーパ一シフトされることがわかる。しかしながら、第 1 0図、左パネルに示すように、対照実験としての酸素正常状態の SK— N— SH細胞由来の核抽出液では、 HMG - IZY抗体の添加による顕著な効果は観察されなかった。

これらの結果により、プローブ No. 5に対する結合活性を有する低酸素曝露 SK— N— SH細胞由来物質は、 HMG— Iであることが示される。

また、 HMG— Iタンパク質の低酸素曝露細胞におけるプローブ No. 5に対する結合活性は、 p r e— mRNA結合アツセィでは UV照射に依存しないことが示される。実施例 5 PS 2 p r e— mRNA結合部位の決定

本発明者らは、第 4図のプローブ No. 5の PS 2ェキソン 5の 3' 末端における 2回繰り返した類似配列（反復配列）に着目し、 HMG— Iタンパク質がこれらの反復配列に結合することを予想した。そこで、プローブ No. 5の誘導体として、第 1 1図に示した 6種の RNAプローブ（プローブ No. 6〜1 1) を調製し、得られたプローブを用いて、前記実験例 7に従い、 p r e— mRNA結合アツセィを行なった。その結果を第 12図に示す。なお、前記反復配列は、第 1 1図のプローブ No. 5中における下線部の配列であり、それぞれ配列番号： 1及び 2に示される。

第 1 2図のレーン 1に示すように、プローブ No. 5に対する結合活性は、酸素正常状態曝露 S K— N— S H細胞由来の核抽出液において検出できなかつた。一方、プローブ No. 5に対する結合活性は、第 5図及び第 6図と同様、第 1 2 図のレーン 2に示すように、低酸素曝露 S K— N— S H細胞由来の核抽出液を用いることにより、黒矢印で示した分子量の位置において強く増加することがわかる。

しかしながら、低酸素曝露によるこの結合活性の増大は、第 1 2図のレーン 3 に示すように、配列番号： 1及び 2の配列を欠いたプローブ（第 1 1図のプロ一ブ No. 6) を使用することにより消失した。一方、低酸素曝露 SK— N— SH 細胞由来の核抽出液において、配列番号： 1及び 2のそれぞれを直接結合させた配列を含むプローブ No. 7 (第 1 1図）を使用することにより、結合が強く上昇した（第 1 2図、レーン 4) 。また、配列番号： 1及び 2の配列において、それぞれの Cを Aに置換された配列を含むプローブ No. 8 (第 1 1図）を用いた場合、第 1 2図のレーン 5に示すように、ほとんどの部分で完全に結合活性が消失した。さらに、配列番号： 1又は 2のいずれか一方を結合アツセィに使用し、結合活性を観察すると（第 1 2図、レーン 6及び 8) 、両配列を有するプローブ No. 1 0に対する結合活性が最も強かった（第 1 2図、レーン 7) 。これらの結果は、配列番号： 1又は 2のいずれか又は両方が、 PS 2 p r e-mRNA に対する HMG— Iタンパク質の結合活性に必要であることを意味する。

第 1 2図は、配列番号： 1又は 2のいずれか又は両方が、 PS 2 p r e— m RNAに対する HMG— Iの結合活性に必要であることを示す。前記配列番号： 1及び配列番号： 2の配列をデータベースの他の遺伝子と比較するために相同性を調べたところ、前記配列番号： 1及び 2は、これまでのところ、 PS 2のェキソン 5に特有の配列であることが示される。

以上の結果は、 HMG— I/Yタンパク質が一本鎖 RN Aに結合することを示し、 HMG— Iタンパク質が、 gcucuacaag (配列番号： 1 ) 及び又は gcugcu acaag (配列番号： 2) を含有した配列からなる部位を認識し、結合することを示す。実施例 6 HMG- I mRNA及び免疫反応性 HMG— Iタンパク質の発現に対する低酸素の影響

結合活性の増加が HMG - Iの発現の増加に依存するか否かを調べるため、 H MG- Iの mRNA及びタンパク質の発現レベルについて、酸素正常状態の場合と低酸素曝露した場合とを比較した。

第 1 3図の上部左パネルに示されるように、ノーザンブロット解析により、 H MG- Iの mRNAレベルは、神経芽細胞腫 S K— N— S H細胞において P S 2 Vを発現する条件である低酸素曝露により劇的に増加することがわかる。しかしながら、 PS 2 Vを誘導しない低酸素曝露 HE K— 293 T細胞を用いた場合（第 13図、上部中央バネル）又は PS 2 Vを誘導しないッニカマイシン処理 SK 一 N— SH細胞を用いた場合（第 1 3図、上部中央パネル）では、ストレス下での顕著な増加は見られないことがわかる。

その結果、第 14図、左パネルにおける上側の矢印に示されるように、抗 HM G— IZY抗体を用いたィムノブロット解析により、免疫反応性 HMG— Iタンパク質は、低酸素曝露 SK- N - SH細胞核抽出液において、酸素正常状態条件下の細胞の場合よりも多く発現することがわかる。しかしながら、第 14図の左パネルにおける下側の矢印に示されるように、免疫反応性 HMGYタンパク質は、 SK—N— SH細胞由来の核抽出液において低酸素ストレスによる影響を受けないことがわかる。第 14図の右パネルに示されるように、低酸素曝露 HEK— 293 T細胞では、抗 HMG— IZY抗体による顕著な免疫反応性が見られないことがわかる。

低酸素曝露 HEK— 293 T細胞及びツユ力マイシン処理 SK— N— SH細胞を用いる実験により示された結果は、低酸素により初期事象として HMG— \/ Y mRNAの定常状態の細胞レベルが増加し、それに伴って HMG_ IZYタンパク質が増加するという先の報告 [ジー（Ji, Y. S.) ら、 Circ. Res., 83, 29 5-304, (1998)]と矛盾する。この明白な矛盾は、各細胞株の相違を反映しているのかもしれない。実施例 7 HMG- Iタンパク質の細胞レベルでの局在

細胞下の局在を調べるため、 SK- N— SH細胞培養物を低酸素条件に 21時間曝露し、抗 HMG— 1//丫抗体と抗3〇35抗体とを用いて免疫蛍光顕微鏡により HMG— Iタンパク質を検出した。なお、前記抗 SC 35抗体は、スプライシングの必須因子である SC 35タンパク質に対する抗体である。本実施例においては、前記抗 SC35抗体を、スプライシング因子存在点であるスペックルのマーカーとして使用して、免疫細胞化学的検査を行なった。

免疫細胞化学的検査を行なった結果、酸素正常状態下の細胞では、第 1 5図の酸素正常状態の図に示されるように、 HMG— Iタンパク質は、主に核に局在し、弱く、散在的な免疫反応が、核スペックルのみに存在する免疫反応性 SC 35 夕ンパク質と共一局在することなく細胞質において得られることがわかる。

しかしながら、 SC 35が共一局在する核スペックルにおいて、より強い免疫反応性が得られ、細胞質の免疫反応性は、低酸素曝露 SK - N- SH細胞において、酸素正常状態の細胞よりも低下した。したがって、 HMG— Iタンパク質が SK— N— SH細胞において低酸素刺激により誘導されるだけでなく、細胞質から核に蓄積され、 HMG— Iの発現と PS 2Vの誘導との間に相関関係があると考えられる。実施例 8 イン · ビボにおける PS 2遺伝子のェキソン 5スキッピングへの HM G - I及び HMG Yの一過性トランスフヱクションの効果前記サトウ（Sato)らの文献 [サトウ（Sato)ら、 J. Neurochem. , 72, 2498-2505 (1999)]に記載の方法に従い、孤発性アルツハイマー病の脳及び低酸素曝露 SK 一 N— SH細胞のそれぞれから、ェキソン 5を欠損した選択的スプライシング型の PS 2遺伝子を得た。

PS 2遺伝子のェキソン 5欠損を伴う選択的スプライシングが HMG— I/Y により起こるか否かを調べるため、 SK— N— SH培養細胞及び HEK— 29 3 T培養細胞における P S 2 Vの誘導に対する HMG― Iの一過性発現の効果を調ベた。ィムノブロット解析の結果を第 1 6図に示し、 RT— PCRの結果を第 1 7図に示す。

第 1 6図に示すように、 HMG— I トランスフエクト SK— N— SH細胞由来の核抽出液及び HMG— I トランスフヱクト HEK— 293 T細胞由来の核抽出液のそれぞれにおいて、これらの mo c kトランスフエクト細胞由来の核抽出液よりも、より強い免疫反応性 HMG— Iタンパク質の発現が見出された。さらに、第 1 7図のレーン 1に示すように、 mo c kトランスフエクト SK— N— SH 細胞由来の全 RNAの RT— PCRアツセィにおいて、全長 PS 2遺伝子が対応する分子量の位置において主要転写産物（第 1 7図中、 PS 2) として検出されることがわかる。対照的に、 HMG— I トランスフエクト細胞由来の全 RNAを用いた場合、 RT— PCRアツセィにより、第 1 7図のレーン 2及びレーン 3に示されるように、全長 PS 2である主転写産物（第 1 7図中、 PS 2) だけでなく、 HMG— I量依存的に、より短鎖の RT - PCR産物（第 1 7図中、 PS 2 V) も検出されることがわかる。

異常 RT— PCR産物は、ダイレクトシークェンス解析により、ェキソン 5を欠く PS 2のオルタナティブスプライシング產物であることが示される。それに対し、第 1 7図のレーン 4及びレーン 5に示すように、 HMG— Yの一過性トランスフヱクシヨンにより、 PS 2Vの弱い誘導が、 SK— N— SH細胞において見られるが、 HMGYタンパク質は、 SK— N— SH細胞由来核抽出液において低酸素により誘導されない。さらに、第 1 7図に示すように、 PS2Vが低酸素により誘導されない細胞株（第 2図）である HEK— 293 T細胞において、 H MG- Iの過剰発現により PS 2 Vが検出される。

スプライシングの必須因子の 1つである U1 (7 OK) snRNPは、通常、 5' スプライシング部位に結合することが知られている。したがって、 HMG— Iは、 Ul s nRNPの p r e— mRNAへの結合を阻害しうることが予想される。そこで、 SK— N— SH細胞由来の核抽出液における U 1 (70K) s nR NPの p r e一 mRNAへの結合活性に対する HMG— Iの効果を調べた。

U 1 (7 OK) s nRNPに対する抗体〔抗 U 1 (70 K) s nRNP抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）〕を用い、実験例 13に従い、下記のように、スーパ一シフトアツセィを行なった。

すなわち、 5 gタンパク質相当量の核抽出液を、 1 zgの抗 HMG— IZY 抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とともに 4でで 8時間インキュべートし、前処理を行なった。得られた前処理産物を、インキュベーション緩衝液

〔組成： 60mM KC 1と 4mM MgC l ₂ と ImM EDTAと ImM EGTAと ImM DTTと 1 0 %グリセロールと 1 mM PMSFとを含有した 1 2mM HEPES— NaOH緩衝液（pH7. 9) 〕中 2xigの tRNA とともにインキュベートした。ついで、 ³² P標識 RN Aプローブ〔1〃g、第 4 図に示される No. 5プローブ〕を添加して、 25でで 30分間インキュベーシヨンした（全容量 50 1 ) 。得られた反応物を、 5 OmM 丁1* 1 3と0. 3 8Mグリシンと 2mM EDTAとを含有した緩衝液（pH8. 5 ) 中、 4%ポリアクリルアミドゲル上、 1 1 VZcmの一定電圧で 1. 5時間、 4°Cで電気泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついで X線フィルムに曝した。その結果を第 1 8図に示す ο

第 18図の左パネルに示すように、 Mockトランスフエクト SK— N— SH

4 Θ 細胞由来の核抽出液におけるプローブ No. 12に対する結合活性は、抗 U 1 ( 7 OK) s nRNP抗体による前処理によって抗体濃度依存的にスーパ一シフトすることがわかる。また、第 1 8図の左パネルのレーン 1、右パネルのレーン 1 に示すように、 HMG— I トランスフヱクト SK— N— SH細胞由来の核抽出液では、 Mockトランスフクト細胞由来の核抽出液よりも強い結合活性が見られる。

しかしながら、これらの結合活性は、第 1 8図、レーン 2〜4、右バネルに示されるように、 HMG— I トランスフエクト SK— N— SH細胞核抽出液では、抗 U l (70K) s nRNP抗体の添加による影響を受けないことがわかる。すなわち、これらの結果により、 HMG— Iは、 p r e— mRNAに対する U 1 ( 7 OK) s nRNPの結合活性を阻害することが示される。

さらに、 HMG- Iによる p r e -mRNAに対する U 1 (7 OK) s nRN Pの結合活性の阻害を調べた結果を第 1 9図に示す。

第 1 9図に示されるように、 HMG— Iは、低酸素曝露 SK— N— SH細胞由来の核抽出液においては、 U 1 (7 OK) s nRNPと直接結合するが、酸素正常状態曝露細胞由来の核抽出液においては、 U1 (7 OK) s nRNPと結合しないことがわかる。

31<— ]^—3^1細胞での11^[0— I一過性トランスフヱクシヨンは、 PS 2 V の発現を誘導した（第 17図）。さらに、低酸素曝露により PS 2 Vが発現されない細胞株である HEK - 293 T細胞（第 2図）での HMG— Iの過剰発現により、検出可能な PS 2Vが観察された（第 1 7図）。したがって、 PS 2Vは、細胞で HMG— I過剰発現させるだけで誘導されるといえる。低酸素刺激よりも HMG— I発現の増加が PS 2 Vの誘導に必要であることが示唆される。

U 1 (70K) s nRNPは、スプライシングの必須因子であり、 5' スプライシング部位を認識し、該 5' スプライシング部位に結合する。 Ul (70K) s nRNP認識配列及び HMG - I認識配列は、 No. 5プローブ上で互いに近接している。 Ul (7 OK) s nRNPの PS 2mRNAへの結合活性は、 HM G— I トランスフエクト SK— N— SH由来の核抽出液においてインビトロで阻害された（第 18図）。

さらに、 HMG— Iタンパク質は、低酸素曝露 SK— N— SH細胞由来の核抽出液において Ul (70K) s nRNPと結合した（第 19図）。本実施例で観察された HMG— Iと及び U 1 (7 OK) s nRNPの会合は、 SF2ZASF と Ul (70K) s nRNPとの結合を阻害した後、その結果として U1 (70 K) s nRNPの p r e—mRNAへの結合活性を抑制すると思われる。

また、 HMG— Iが、 p r e—mRNA又は第 20図に示すような他のスプライシング因子への Ul (70K) s nRNPの結合を阻害することによって、 U 1 (70K) snRNPの PS2 p r e— mRNAに対する作用を抑制する可能性が示される。実施例 9 s AD脳における HMG— IZYタンパク質の発現

本当に HMG— Iタンパク質が、 PS 2のェキソン 5を欠く選択的スプラインングを誘導するならば、対照脳よりも s AD脳においてより強い HMG— Iの発現が観察されるはずであることが考えられる。そこで、ィムノブロットアツセィにより、対照脳における HMG— Iの発現レベルを sAD脳における場合と比較した。その結果を第 21図に示す。

第 21図の左パネル及び右パネルに示すように、 HMG— Iタンパク質及び Y タンパク質はともに、年齢がマッチした対照と比べると増加しており、 3名の異なる sAD患者の海馬由来の全ライセ一ト及び核フラクションにおいて発現することがわかる。しかしながら、第 21図の中央図に示されるように、海馬のサイトゾルフラクションでは、 sAD患者と対照との間に顕著な差はみられないことがわかる。

海馬の HMG— IZY発現領域を特定するため、抗 HMG— IZY抗体を用いて免疫組織化学解析を行なった。その結果を第 22図に示す。第 22図に示すように、 sAD脳の海馬 C A 1領域の錐体細胞層において、対照よりも強い免疫反応性の発現が認められる。

免疫組織化学的解析において、免疫反応性 HMG— IZYタンパク質は、対照脳の海馬由来の核フラクションにおいて検出されたが（第 21図）、対照脳の海馬 CA 1領域では HMG— I/Yタンパク質は、ほとんど検出されなかった（第 22図）。これは、 HMG— IZYが対照の海馬の多孔層から分子層にわたって発現したためであり、 sAD脳との比較において違いはなかった。

s ADの海馬核フラクションでは、 HMG— I夕ンパク質及び Yタンパク質の両方について対照よりも強い発現が観察されたが、サイトゾルフラクションでは観察されなかった（第 21図）。また、免疫組織学的検査により、 HMG— \/ Yタンパク質は、 sAD脳の海馬 C A 1領域の錐体細胞において検出された（第 22図）。これらの結果は、 HMG— IZYタンパク質が、 PS2 p r e— m RNAに結合し、 s ADの脳及び細胞株において P S遺伝子のェキソン 5を欠くスプライシングバリアントを実際に誘導する可能性を示す。実施例 1 0

前記サトウらの文献に従レ、、神経芽細胞腫 SK— N - SH細胞の全 RNAの調製及び RT— PCRを行ない、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' 一 0—メチルオリゴ RN Aによるプレセニリンー 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生抑制効果について、以下のように検討した。神経芽細胞腫 SK - N - SH細胞を 1 0%ゥシ胎仔血清を含有したダルべッコ最小必須培地〔ギブコビー 'アール 'エル社製〕 8mlに播種し、各 0、 1 0 、 1 5 /gの 2' — 0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) (それぞれ、 0 〃 1、 20 / 1、 45〃 1) を、ォリゴフヱクタミンを用いてトランスフエクションした。ォリゴフェクタミンのみ（それぞれ、 0 z l、 20 / 1、 45 z l) を用いた場合には、顕著な変化は認められなかった。

前記細胞を 5%C0₂ 、 37°C条件下にて 1 6時間培養した。培養 1 2時間後に培地を交換した。その後、得られた細胞を低酸素チャンバ一（酸素圧 8 t 0 r r) 中において、さらに 2 1時間培養した。

ついで、前記と同様に、 RNe a s yトータル RNAキット〔キアゲン（Q i a g e n) 社製〕を用い、全 RNAを抽出、精製した。

得られた全 RNAと、マウスモロニ一白血病ウィルス逆転写酵素〔プロメガ（ P r om e g a) 社製〕とを用いて、 42 °Cで 1時間逆転写反応を行なった。得られた反応物を铸型として、 1次 PC Rを行ない、さらに得られた PC R産物を铸型として 2次 PC Rを行なった。

PCRのサーマルプロファイルは、 95°C30秒ー 60°C3 0秒一 72で 1分 (最終サイクルにおいては 72。C2分）を 1サイクルとした 30サイクルである o 1次 PCRには、プライマ一 p s 25 1 (配列番号： 9) とプライマ一 p s 2 3 1 (配列番号： 1 0) とを用いた。 2次 PCRには、プライマー p s 252 ( 配列番号： 1 1) とプライマー p s 233 (配列番号： 1 2) とを用いた。

得られた産物を、 5%ポリアクリルアミドゲル（TBE) を用いて電気泳動し、臭化工チジゥム染色により可視化した。

なお、対照として、 2' — 0—メチルオリゴ RNAを導入しない神経芽細胞腫 SK— N— SH細胞由来の RNAを用いた。結果を第 24図に示す。

第 24図に示されるように、 2' — 0—メチルオリゴ RNAを導入ない場合に比べ、導入した場合、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアント（図中、 PS 2V) の産生が抑制されることがわかった。実施例 1 1

イン . ビトロで、 PS 2 p r e—mRNAへの低酸素誘導された HMG— I の結合における 2' — 0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) の影響を調べた。

正常酸素条件又は低酸素条件で、 SK-N-SH細胞を5%CO₂、 37で条件下にて、 2 1時間培養した。得られた細胞から、核抽出液を調製した。その後、得られた核抽出液と、 ³²P標識 RNAプローブ No. 5と、各種使用量の 2' — 0—メチルオリゴ RNA (レーン 3、 0. 5〃g レーン 4、 5 z g レーン 5、 50 //g レーン 6、 500 g) とを、 25。Cで 30分間インキュべ一シヨンした。結合プローブと遊離プローブとを、 5 OmM Tr i sと 0. 38M グリシンと 2mM EDTAとを含有した緩衝液（pH8. 5) 中、 4%ポリアクリルァミドゲル上、 1 1 VZ c mの一定電圧で 1. 5時間、 4でで電気泳動することにより分離した。その後、電気泳動後のゲルを固定し、乾燥した。ついで、乾燥ゲルを、 X線フィルムに曝して、オートラジオグラフィ一を行なった。結果を第 25図に示す。

第 25図のレーン 1及びレーン 2に示されるように、配列番号： 3に示される配列を有する RNAプローブ No. 5への HMG - I結合は、酸素正常条件で培養した SK— N— S H細胞に比べ、低酸素条件下で培養した S K— N - S H細胞の核抽出液において増加した。これらの結合の増加は、前記 2' — 0—メチルォリゴ RNAの添加により、用量依存的に阻害されたため、前記 2' — 0—メチルオリゴ RNAが、 HMG— Iと PS 2 p r e— mRN A上の標的部位との低酸素誘導された結合活性を阻害することがわかった。実施例 1 2

³² P標識した 2' —0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) をオリゴフエクタミンを用いて、 SK— N— SH細胞に導入した。ついで、全溶解物、核画分、及びサイトゾル画分のそれぞれを抽出した。その後、全溶解物、核画分、及びサイトゾル画分のそれぞれにおける放射活性を測定することにより、 SK— N— SH細胞中における 2' — 0—メチルオリゴ RN A (配列番号： 27) の安定性と、該 SK— N— SH細胞への 2' — 0—メチルオリゴ RNAの導入効率とを調ベた。結果を第 2 6図のパネル Aに示す。

第 2 6図のパネル Aの aに示されるように、前記 2' — 0—メチルオリゴ RN Aは、消失することなく、 SK— N— SH細胞に導入され、用量依存的に核に送達されることがわかった。また、第 2 6図のパネル Aの bに示されるように、 S K一 N— SH細胞への前記 2' — 0—メチルオリゴ RN Aの導入効率は、 2 0 g/1 0 cmディッシュの 2' — 0—メチルオリゴ RNAを用いた場合、割合が最ちくなつ 7"こ。

しかしながら、第 2 6図のパネル Aから、取り込み量は、約 1 O c mディッシュの 2' — 0—メチルオリゴ RNAであると推定されるため、以後の細胞導入の際の最高用量を 1 0 cmディッシュに設定した。

さらに、 SK— N— SH細胞への 2' — 0—メチルオリゴ RNAの導入後 4 8 時間の時点において、核における導入された 2' — 0—メチルオリゴ RN Aの安定性を調べた。その結果を、第 2 6図のパネル Bに示す。

第 2 6図のパネル Bに示すように、導入後、 4 8時間後においても、 2' — 0 一メチルオリゴ RN Aは、オリジナルフラクション中に存在していた分子量にほぼ同等であること、すなわち、該 2' — 0—メチルオリゴ RNAは、 4 8時間後も核内に入り、分解されずに安定であることがわかった。実施例 1 3

SK— N— SH細胞由来の核抽出液中の HMG— Iの DNA結合における 2' 一 0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 2 7) の作用を調べた。

最初に、イン ' ビトロ DNA選別アツセィにより、 HMG— I認識モチーフの塩基配列を決定した。イン ' ビトロ DNA選別アツセィ手順は、以下のとおりである。 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA- 3' (配列番号： 6 7) と、 5' -GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' (配列番号 : 6 8) とをプライマ一として用い、 (94。C 1分— 53。C 1分一 72°C 1分〕を 1サイクルとした 7サイクルの P C Rにより、 3 1 ヌクレオチドのランダムな配列（ 1 6クローンのダイレクトシ一クエンスにより、 20. 1% A、 22. 1% C、 3 1. 5% T、 25. 1 % G) を含む合成 DN A [5' -GGTGATCAGATTCTGATCCA(N₃ TGAAGCTTGGATCCGTCG C-3' ] を増幅した。

得られた産物を、インキュベーション緩衝液〔6 OmM KC 1 と 4mM M gC l ₂ と ImM EDTAと ImM EGTAと ImM DTTと 1 0%グリセロールと ImM PMSFとを含有した 1 2mM HEPES-NaOH (p H7. 9) 〕中、大腸菌発現組換え HMG— I (r HMG— Iと表記する）とともに 25。Cで 3 0分間インキュベートした。

得られた反応溶液について、 HMG— Iに対する抗体を用いた免疫沈降を行ない、免疫沈降した産物を铸型とし、 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATC CA-3' (配列番号： 67) と、 5' -GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' (配列番号： 68) とをプライマーとして用い、〔94°C 1分— 53で1分一 72°C1分〕を 1サイクルとした 7サイクルの PC Rを行なった。得られた PC R産物を ρ GEM— T ベクター（プロメガ社製）にクローン化し、ダイレクトシークェンスで解析したその結果、第 27図の最上段に示されるコンセンサス配列が、 HMG— I認識モチーフであることが示唆された。

ついで、前記 HMG— I認識モチーフを含む³² P -標識 DNAプローブ〔gcgG (A)GT(A)A(T)ATTTcgc (配列番号： 6 6) 〕と HMG— Iとの結合における 2' — 0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) の作用を調べた。

核抽出液のタンパク質含有量を測定した後、前記インキュベーション緩衝液にタンパク質相当量の抽出液と、 1 g ボリ d I dCと、各濃度の 2

， _0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) とを添加し、ついで、 1 gの ³²P標識 DNAプローブ CgcgG(A)GT(A)A(T)ATTTcgc (配列番号 : 6 6 ) 〕を添加し、全 50 / 1とし、さらに、 25°Cで 30分間インキュベートした。

その後、 50mM トリスと 0. 38M グリシンと 2 mM EDTAとを含む緩衝液中、 l lVZcm 定常電圧、 4で、 1. 5時間での 4% ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、結合プローブと、遊離プローブとを分離した。泳動後のゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィ一により解析した。

その結果、第 28図のパネル A及びパネル Bのそれぞれのレーン 1及びレーン 2に示されるように、 SK— N— SH細胞における HMG— Iの過剰発現により、前記 HMG— I認識モチーフを含む³² P—標識 DNAプローブと HMG— Iとの結合は、劇的に上昇した。

しかしながら、第 28図のパネル A及びパネル Bのそれぞれのレーン 3及び 4 に示されるように、前記 DNAプローブへの HMG— Iの結合活性の上昇に関して、前記 2' — 0—メチルオリゴ RNAによる顕著な影響は観察されなかった。したがって、前記 2' — O—メチルオリゴ RNAの阻害作用は、 RNAへの H MG- Iの結合に特異的であるが、 DNAへの HMG— Iの結合には特異的でないことが示された。実施例 14

2' _0—メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) を導入した SK— N— SH 細胞〔被検細胞〕と導入していない SK— N - SH細胞〔対照細胞〕とを、それぞれ低酸素圧（8 t 0 r r)の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバ一を備えたインキュベーターを用い、 37でで低酸素条件下又は正常酸素条件下、 21時間培養し、ついで、 2 M ッニカマイシンの存在又は非存在下、 10時間培養した。

その後、プロメガ社製商品名： Ce l l Ti t e r 96^R AQu e ου s One So l u t i on Pr o l i f e r a t i on As s ayを用レヽ、 3— (4, 5—ジメチルチアゾ一ル一 2—ィル）一 5— （3—力ルポキシメトキシフヱニル）一 2— （4ースルホフヱニル）一 2 H—テトラゾリゥムアツセィ (MTSアツセィという）を行なうことにより、細胞の生存率を解析した。

その結果、第 29図のパネル Aのレーン 4〜7に示されるように、低酸素刺激とッニカマイシンとにより誘導された細胞死は、前記 2' —0—メチルオリゴ R NAの導入により、用量依存的に、和らげられることがわかった。

また、 HMG— Iを一過性発現し、かつ 2' — 0_メチルオリゴ RNA (配列番号： 27) が導入された SK - N— SH細胞（被検細胞〕と、 HMG— Iを一過性発現する SK— N— SH細胞と、 SK— N— SH細胞とを、それぞれ、 2〃 M ッニカマイシンの存在又は非存在下、 1 0時間培養した。

その後、 MTSアツセィを前記と同様に行なうことにより、細胞の生存率を解折した。

その結果、第 29図のパネル Bのレーン 4〜7に示されるように、 HMG— I の一過性発現とッニカマイシンとにより誘導された細胞死は、前記 2' — 0—メチルオリゴ RNAの導入により、用量依存的に、顕著に、和らげられることがわ力、つ τこ。配列表フリーテキスト

配列番号： 1は、結合領域の配列を示す。

配列番号： 2は、結合領域の配列を示す。

配列番号： 3は、 RNAプローブ No. 5の配列を示す。

配列番号： 4は、 RNAプローブ No. 7の配列を示す。

配列番号： 5は、 RNAプローブ No. 9の配列を示す。

配列番号： 6は、 RNAプローブ No. 1 0の配列を示す。

配列番号： 7は、 RNAプローブ No. 1 1の配列を示す。

配列番号： 8は、 RNAプローブ No. 8の配列を示す。

配列番号： 9は、プライマー p s 251の配列を示す。配列番号： 10は、プライマー p s 231の配列を示す。

配列番号： 1 1は、プライマー p s 252の配列を示す。

配列番号： 12は、プライマー p s 233の配列を示す。

配列番号： 13は、 DNAプローブ No. 1の配列を示す。

配列番号： 14は、 DNAプローブ No. 2の配列を示す。

配列番号： 15は、 DNAプローブ No. 3の配列を示す。

配列番号： 1 6は、 DNAプローブ No. 4の配列を示す。

配列番号： 17は、 DNAプローブ No. 5の配列を示す。

配列番号： 18は、 DNAプローブ No. 6の配列を示す。

配列番号： 1 9は、 DNAプローブ No. 7の配列を示す。

配列番号： 20は、 DNAプローブ No. 8の配列を示す。

配列番号： 21は、 DNAプローブ No. 9の配列を示す。

配列番号： 22は、 DNAプローブ No, 10の配列を示す。

配列番号： 23は、 DNAプローブ No. 1 1の配列を示す。

配列番号： 24は、ァフィ二ティ一カラムのリガンドとして用いた 5' —アミノー 2' — 0—メチルオリゴ RN Aの配列を示す。

配列番号： 25は、 RNAプローブ No. 6の配列を示す。

配列番号： 26は、 RNAプローブ No. 12の配列を示す。

配列番号： 27は、配列番号： 24中に存在する HMG— Iタンパク質結合領域の配列に対応する 2 ' — O—メチルォリゴ RN Aの配列を示す。

配列番号： 28は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 29は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 30は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

5 Θ 配列番号： 3 1は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 2は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 3は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 4は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 5は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 6は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 7は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 8は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 3 9は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 0は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 1は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 2は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 3は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。配列番号： 4 4は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 5は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 6は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 7は、 HMG - I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 8は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 4 9は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 0は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 D NAの配列を示す。

配列番号： 5 1は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 2は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 3は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 4は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 5は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 6は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。配列番号： 5 7は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 8は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 5 9は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 0は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 1は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 2は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 3は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 4は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 5は、イン ' ビトロ DNA選別アツセィに用いられた合成 DNA の配列を示す。 nは、 G又は A又は T又は Cを示す。

配列番号： 6 6は、 HMG— I認識モチーフを含有した合成 DNAの配列を示す。

配列番号： 6 7は、イン ' ビトロ DNA選別アツセィに用いられたプライマーの配列を示す。

配列番号： 6 8は、イン · ビトロ DNA選別アツセィに用いられたプライマーの配列を示す。産業上の利用可能性本発明の阻害剤によれば、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン一 2 mR N Aェキソン 5との結合を阻害することができ、それにより、スプライシング異常に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患を治療及び/又は予防することが可能になるという優れた効果を奏する。また、本発明の神経細胞死抑制剤によれば、プレセ二リン一 2ェキソン 5欠損型スプラインング異常を抑制し、それにより神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の医薬組成物によれば、神経細胞死を抑制することでき、プレセ二リン一 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の治療又は予防方法によれば、プレセ二リン— 2 m R NAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防を、より効率よく、持続的に行なうことができるという優れた効果を奏する。

Claims

請求の範囲

1. HMG- Iタンパク質とプレセニリン一 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、 HMG— Iタンパク質とプレセニリン一 2遺伝子との間の結合の阻害剤。

2. 該化合物が、

(E)前記（C) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 1記載の阻害剤。

3. 該化合物が、

(b)配列番号： 3、 4、 5、 6若しくは 7のいずれかに示される塩基配列に対応ずる DN A配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合しうる DN A分子

(c)前記（a) の RNA分子又は（b)の DNA分子のいずれかに相補的なァンチセンス分子、

(d)前記（a)の RNA分子又は（b) の DNA分子のいずれかのアナログであって、かつ HMG— Iタンパク質と結合するアナログ分子、及び

(e)前記（c)のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 2記載の阻害剤。

4. 該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0—メチルォリゴ RN A分子である、請求項 1又は 2記載の阻害剤。

5. HMG- Iタンパク質とプレセニリン一 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リンー 2遺伝子との間の結合の阻害剤を有効成分として含有してなる神経細胞死抑制剤。

6. 該化合物が、

(A)配列番号： 1に示される塩基配列及び/又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG- Iタンパク質と結合する RNA分子、

(E)前記（C)のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 5記載の神経細胞死抑制剤。

7. 該化合物が、

(e)前記（c) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 6記載の神経細胞死抑制剤。

8. 該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0—メチルォリゴ RN A分子である、請求項 5又は 6記載の神経細胞死抑制剤。

9. HMG- Iタンパク質とプレセニリンー 2 mRNAェキソン 5との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、 HMG— Iタンパク質とプレセ二リン— 2遺伝子との間の結合の阻害剤、又は

該阻害剤を有効成分として含有した神経細胞死抑制剤

を有効成分として含有してなる医薬組成物。

1 0. 該化合物が、

(A)配列番号： 1に示される塩基配列及び又は配列番号： 2に示される塩基配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する RNA分子、 (B)配列番号： 1に示される塩基配列に対応する DNA配列及び Z又は配列番号： 2に示される塩基配列に対応する DNA配列を含有し、かつ HMG— Iタンパク質と結合する DNA分子、

(E)前記（C) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 9記載の医薬組成物。

1 1. 該化合物が、

(e)前記（c) のアンチセンス分子のアナログ分子、

からなる群より選択された 1種である、請求項 10記載の医薬組成物。

12. 該化合物が、配列番号： 27に示される塩基配列を有する 2' — 0—メチルオリゴ RN A分子である、請求項 9又は 10記載の医薬組成物。

1 3. スプライシング異常を抑制する作用を有する、請求項 9〜1 2いずれか 1項に記載の医薬組成物。

1 4. プレセ二リン一 2 mRN Aェキソン 5欠損スプライシングバリアントの產生を抑制する作用を有する、請求項 9〜1 3いずれか 1項に記載の医薬組成物。

1 5. プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害又は神経変性疾患を治療又は予防しうる、請求項 9〜 1 4いずれか 1項に記載の医薬組成物。

1 6. 該脳障害が、虚血性脳疾患又は脳神経変性疾患である、請求項 1 5記載の医薬組成物。

1 7. 該脳障害が、脳血管性痴呆、パーキンソン症候群及びアルツハイマー病からなる群より選ばれた疾患である、請求項 1 6記載の医薬組成物。

1 8. 該神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項 1 5記載の医薬組成物。

1 9. プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセ二リン一 2 mRN Aェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造のための、請求項 1〜4いずれか 1項に記載の阻害剤若しくは請求項 5〜 8いずれか 1項に記載の神経細胞死抑制剤の使用。

20. プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に、請求項 1〜4いずれか 1項に記載の阻害剤若しくは請求項 5〜 8いずれか 1項に記載の神経細胞死抑制剤を治療上有効量投与することを特徴とする、プレセ二リン一 2 mRNAェキソン 5欠損スプライシングバリアントの產生に起因する疾患の治療又は予防方法。