WO2013191509A1 - N-말단이 제거된 유비퀴틴 c-말단 가수분해효소-l1(nt-uch-l1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

N-말단이 제거된 유비퀴틴 c-말단 가수분해효소-l1(nt-uch-l1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2013191509A1
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uch
disease
parkinson
protein
terminal
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이공주
김현정
김희정
정재은
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이화여자대학교 산학협력단
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    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs

Definitions

  • composition for the prevention and treatment of Parkinson's disease comprising N-terminal removed ubiquitin C-terminal hydrolase -Ll (NT-UCH-Ll) as an active ingredient
  • the present invention is to prevent the Parkinson's disease comprising N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase -Ll (N-terminal Truncated Ubiquit in C— terminal hydro lase-Ll, NT-UCH-L1) as an active ingredient And to therapeutic pharmaceutical compositions.
  • Parkinson's disease is the second most progressive disease of the degenerative nervous system. It is a refractory disease that is becoming a social and economic problem because the incidence rate continues to increase with the increase of the elderly population. About 4 million people are known to have this disease worldwide, and the number of patients in the United States is increasing by 50,000 each year. The incidence rate is one in 1,000, and the higher the age, the more frequent the occurrence. Clinical characteristics of the disease include dyskinesia, cognitive dysfunction, depression, and sleep disorders, such as bradykininesia, rigidity, and postural instabi 1ity. non-motor abnormalities accompanied by sleep disorder), pain, and the like (Korea Patent Publication 10-2010-0125843). The cause of Parkinson's disease is not known exactly, but the 'multiplicity hypothesis' that genetic and environmental factors interact with each other is the most widely accepted.
  • Parkinson's disease has not been known to be precisely known in its etiology, and thus, treatments for symptomatic improvement are used rather than radical treatment.
  • therapies currently in use or under development include: The most developed and used drugs include dopamine precursors such as levodopa, a dopamine complement, and dopamine receptor agonists (fenofibrate).
  • therapies used to treat Parkinson's disease include FDA-approved dopamine agonists, Cat echo 1 -0-methy 1 transferase inhibitor (COMT inhibitor), monoamine oxidase BCmonoamine oxidase B, MAO-B inhibitors, and anti-cholinergics.
  • Efforts have been made to use or develop brain neuroprotective agents, antioxidants, inhibitors of brain cell death, anti-brain function, and the like as therapeutic agents (Korean Patent Publication 10-2010-0097059).
  • brain neuroprotective agents antioxidants, inhibitors of brain cell death, anti-brain function, and the like.
  • the neuroprotective effects of Parkinson's disease and the neuroprotective effects of Parkinson's disease the acute inflammatory phase of Parkinson's disease has been studied for cell death due to mitochondrial dysfunction and oxidative stress.
  • Aging is known to be the leading cause of Parkinson's disease, and environmental factors, free radicals, and genetic factors (5-10%) caused by neurotoxins such as pesticides may affect the onset. It is known to be mad. Oxidative stress and mitochondria dysfunction have also been implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease (Grunblatt et al., J. Neural Transm. Ill: 1543-1573, 2004).
  • Genetic factors include a-synuclein, Parkin, Ubiquit in C-Terminal Hydro lase-Ll (UCH-Ll), DJ-1, and Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2 And synuclein-alpha (interacting protein, Synphi 1 in 1) and others (Dawson et al., Science 302: 819-822, 2003).
  • UCH-L1 protein is known to hydrolyze the C-terminal ubiquityl esters of ubiquitin to make monomers (Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11: 141-148, 2000), variability of the genes from one household to the isoleucine (isoleucine) of the amino acid at position 93 mutated to methionine (methionine) amino acids, the dominant traits of these genetic mutations have been reported search (Leroy etc. Nature 395: 451-452, 1998). However, pathological data related to such mutations have not been reported yet (Republic of Korea Patent Registration 10-0644364).
  • UCH-L1 various post-transcriptional modifications of UCH-L1, such as mono-ubiquitination at lysine 157 (Meray, et al, J Biol) Chem 282, 10567-10575 (2007). ), Farnesylation at cysteine 220 (farnesylation KLiu, Z. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106, 4635-4640 (2009)), oxidation at cysteine 220 (Choi, J.
  • UCH-L1 is a constituent of a protein family called Lewy bodies in the brain of Parkinson's disease, suggesting a possible link between UCH-L1 and Parkinson's disease (Lowe, J. et al., J Pathol 161, 153-160 (1990). In addition, Parkinson's disease caused by UCH-L1 mutation has been reported.
  • UCH-L1 is an enzyme that cleaves the link between ubiquitin and peptide. When this enzyme is inhibited by ubiquitin aldehyde in vitro, It was confirmed that the death of dopaminergic neurons and the formation of intracellular cytoplasmic inclusions stained with ⁇ -synulein (McNaught S, et al., J Neurochem 2002; 81: 301-306).
  • UCH-L1 is downregulated in idiopathic Parkinson's and Alzheimer's disease, and a direct link between oxidative damage and neuronal ubiquitination / diubiquitination mechanisms and sporadic Alzheimer's and Parkinson's disease has been suggested (Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264 (2004).
  • UCH-L1 has recently been found to play a major role in cancer metastasis and transformation.
  • a composition for diagnosing cancer metastasis using UCH-L1 a method for diagnosing cancer metastasis using the same, a composition for inhibiting cancer metastasis, a method for inhibiting metastasis using the same, a composition for screening cancer metastasis inhibitors, and a screening method using the same have been developed ( Republic of Korea Patent Registration 10-0732298).
  • the UCH-L1 is a causative target protein of cancer metastasis, and since its cell mobility increases according to its expression level, it can be used for diagnosing cancer metastasis using a monoclonal antibody, an antibody to N-terminal peptide or a substrate thereof. Can be. In addition, since cancer metastasis can be suppressed by inhibiting the expression or enzymatic activity of UCH-L1, it has been demonstrated that screening and developing an inhibitor of UCH-L1 can be useful as a drug for inhibiting cancer metastasis as an adjuvant of anti-cancer treatment. .
  • UCH-L1 is a component of Lewy body, a pathological marker of Parkinson's disease, and when the activity of UCH-L1 is inhibited, the death of dopaminergic neurons proceeds.
  • the base sequence of has been revealed, the in vivo function of mitochondrial stress and reactive oxygen species during the inflammatory stage of Parkinson's disease of NT-UCH-L1 has not been fully understood.
  • NT-UCH-L1 from which some amino acids at the N-terminus of UCH-L1 were removed, and to confirm the effects on mitochondrial stress and reactive oxygen species.
  • NT-UCH- By locating L1 in the mitochondria, it was confirmed that it plays a major role in the regulation of stress inducing active acid swelling and mitochondrial damage, and completed the present invention by confirming that it can be used as an active ingredient for Parkinson's disease prevention and treatment It was.
  • the object of the present invention is the N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 (N-terminal Truncated Ubiquit in C-terminal hydro l ase-Ll, NT ⁇ UCH -Ni) to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Parkinson's disease comprising as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing Parkinson's disease comprising N-terminal truncated Ubiquit in C-terminal hydro l ase-Ll, NT ⁇ UCH-L1 as an active ingredient.
  • a therapeutic pharmaceutical composition comprising N-terminal truncated Ubiquit in C-terminal hydro l ase-Ll, NT ⁇ UCH-L1 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • step 2) comparing the NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) with the NT-UCH-L1 protein expression level of a sample derived from a normal individual as a control;
  • a protein detection method for providing information on Parkinson's disease diagnosis comprising the step of determining that the risk of developing Parkinson's disease when the amount of NT-UCH-L1 protein expression is reduced compared to the control.
  • test compound or composition 1) treating the test compound or composition to a cell line expressing NT-UCH-L1 protein;
  • step 3 providing a method for screening a candidate drug for treating Parkinson's disease comprising selecting a test compound or composition in which the NT-UCH-L1 protein expression level of step 2) is increased compared to a control cell line which has not been treated with the test compound or composition. do .
  • Parkinson's disease candidate comprising the step of selecting an increased test compound or composition compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein treated with the test compound or composition
  • Parkinson's disease candidate comprising the step of selecting an increased test compound or composition compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein treated with the test compound or composition
  • the present invention provides a health food for preventing and improving Parkinson's disease comprising the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminus has been removed as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing and improving Parkinson's disease, comprising administering to a subject an ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminus has been removed.
  • the present invention provides a method for treating Parkinson's disease comprising administering the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminus has been removed to a subject with Parkinson's disease.
  • the present invention for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Parkinson's disease Provided is the use of the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 with the N-terminus removed.
  • the present invention provides the use of the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminal is removed for use as a health food for preventing and improving Parkinson's disease.
  • LKN-terminal Truncated Ubiquit in C-terminal hydroylase-Ll, NT-UCH-L1) is removed from the N-terminal 11 amino acids of UCH-L1. By doing so, it was confirmed that it plays a major role in the regulation of stress inducing reactive oxygen species and mitochondrial damage, it can be used as an active ingredient in Parkinson's disease prevention and treatment compositions.
  • FIG. 1 is a diagram showing the identification of NT-UCH-L1 and its structural and enzymatic differences with UCH-L1 in human lung cancer and neuroblastoma cell lines.
  • La is a diagram showing a variant of human UCH-L1 previously known.
  • FIG. Lb shows the results of 2D-PAGE and Western blot analysis of UCI-L derived from NCI-HI57 and SH-SY5Y.
  • FIG. Lc shows the mass spectroscopic analysis of proteomics including peptide fingerprinting with spot 1ol MALDI-T0F MS of FIG. Lb and peptide sequencing with nanoUPLOESI-q-TOF tandem MS. MS) shows the results of the analysis.
  • FIG. ID shows the results of analyzing the spot 3 of FIG. Lb by proteomic mass spectrometry method including peptide fingerprinting using MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS.
  • Figure le shows the substituted amino acid of the deleted N terminus of UCH-L1.
  • Figure lg is a diagram showing that the deleted N-terminal of UCH-L1 corresponds to the axon Kexon 1) of the UCH-L1 gene (PARK5).
  • Figure lh is a diagram showing the results of confirming the ubiquitin hydrolase activity of purified recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1.
  • Figure li is a diagram showing the results of comparing the hydrolase activity of Flag-UCH-Ll and Flag-NT-UCH-L1 immunoprecipitated from the lysate of NCI-H157 cells.
  • Lj is a diagram showing that NT-UCH-L1 has no cancer cell invasion ability through cell migration assay.
  • Lk and 11 show the results of hydrogen-deuterium exchange of UCH-L1 and NT-UCH-L1.
  • Figure lm shows the results of the analysis of UCH-Ll, NT-UCH-L1 and C90 / 132S NT-UCH-L1 purified by HDX study.
  • FIG. 2A shows immunoprecipitated NCI-H157 cells transiently transfected with an empty vector, either pcDNA3.1 UCH-Ll-myc or pcDNA3.1 NT—UCH—Ll-myc. Is also.
  • FIG. 2B is a diagram showing two bands with arrows of FIG. 2A and thermal analysis using nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS after trypsin digestion.
  • 2C immunoprecipitates NCI-H157 cells transiently transduced with empty vectors, pcDNA3.1 UCH-Ll-myc and pcDNA3.1 NT-UCH-Ll-myc, with anti-myc antibody, anti-myc and anti Is analyzed by Western blot using ubiquin antibody;
  • 2D is a diagram showing the MS range of NT-UCH-L1 peptide including Lysl5.
  • 2E is a diagram showing HEK293T cells transiently transduced with pcDNA3.1 plasmid containing various UCH-L1 forms.
  • NCI-H157 cells stably expressing the suggested form of UCH-L1 were immunoprecipitated with anti-myc antibodies, analyzed by SDS-PAGE, and immunized with anti-myc and anti-ubiquitin antibodies. It is a blot; *: Nonspecific bands.
  • FIG. 3 is a diagram analyzing that monoubiquitination of NT-UCH-L1 is a reservoir of NT-UCH-L1 and determines the location and function of NT-UCH-L1.
  • 3A is a diagram showing visualization of cells expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and K15 / 157R NHJCH-L1 with anti-myc and Alexa Fluor 488 secondary antibody (green);
  • Mitochondria and nuclei were stained with Mitotracker® ( red) and DAPI (blue), respectively.
  • Figure 3b is the result of fractionating the DMS0 or 10 yM CCCP treated cells into cytoplasm and mitochondrial fraction, immunoblot UCH-L1 with anti-myc antibody, immunoblot the mitochondrial marker protein Hsp60 with anti-Hsp60 Is a diagram showing.
  • 3C is a diagram showing CCCP induced degradation of NT-UCH-L1 in proteasomes.
  • 3D shows Mitotracker® staining of HeLa cells stably expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and K15 / 157R NT-UCH-Ll-myc.
  • FIG. 3E shows a thermal stratification to NCI-H157 cells stably expressing NT-UCH-Ll-myc, and after recovery, the cells were separated into soluble and insoluble fractions and immunoblotted using anti-myc antibody. Is a diagram showing.
  • Figure 3f is a diagram showing the results when the thermal shock to NCI-H157 cells stably expressing K15 / 157R NT-UCH-L1 and recovered in the condition with or without cycloheximide. '
  • Figure 4 is a diagram showing the aggregation phenomenon of NT-UCH-L1.
  • FIG. 4A shows that HeLa cells stably expressing UCH-Ll, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-U were treated with 10 g / ml cyclonucleide for the indicated time and using anti-myc antibody. Shows the results of immunoblotting.
  • FIG. 4B shows that 10 jt / g / ml cyclonucleide is treated with NCI H157 cells stably expressing UCH-Ll, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 for a given time, and the antibody is used. Shows the results of immunoblotting.
  • 4C shows stably expressing UCH-Ll, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 NCI H157 cells were treated with DMSO, 10 ⁇ MG132, 10 mM NH 4 C1 or 10 mM 3MA for 16 hours and immunoblotted using anti-myc.
  • Fig. 2 shows the results of immunoblotting using anti-myc antibody.
  • 4F stably expresses UCH-Ll, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1.
  • NCI H157 cells were treated with DMS0 or 10 ⁇ MG132 and fractionated into soluble and soluble fractions.
  • 4G is a diagram showing that cells were treated with DMS0 or 10 ⁇ MG132 for 16 hours, and after fixation and infiltration, myc-labeled proteins were detected with anti-myc and Alexa Flour 488 secondary antibodies (green);
  • Figure 4h is a diagram showing the results of transient transduction of pcDNA3.1 UCH-Ll, NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 into SN4741 cells, and separating the cells into soluble and insoluble fractions.
  • Figure 4i is a diagram showing the results of analysis of the SN4741 cells transiently transduced with various amounts of pcDNA3.1 NT-UCH-Ll-myc expression plasmid into soluble and insoluble fractions and analyzed on reducing and non-reducing gels.
  • 4j shows recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1 fractionated using FPLC; Fractions were analyzed on non-reducing and reducing SDS-PAGE gels. UCH-L1 and NT-UCH-L1 were immunoblotted using anti-UCH-L1 antibody.
  • Figure 4k is a diagram showing the results of treatment with various concentrations of H 2 0 2 for 1 hour at 37 ° C, and using a reducing and non-reducing gel;
  • UCH-L1 was immunoblotted using anti-myc antibody.
  • Cells were analyzed using reducing and non-reducing gels and immunoblotted using anti-myc antibodies.
  • 5A shows analysis of recombinant UCH-L1, NT-UCH-L1 and Cys variants thereof on a non-reducing SDS-PAGE gel.
  • 5B shows the region of representative disulfide bonds of recombinant NT-UCH-L1.
  • 5C is a diagram showing cysteine residues of the UCH-L1 3D structure.
  • 5D shows analysis of recombinant UCH-Ll, NT-UCH-L1 and Cys variants thereof on non-reducing SDS-PAGE gels.
  • FIG. 5e HeLa cells transiently expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and C90 / 132S NT-UCH-Ll-myc with anti-myc antibody and Alexa Fluor 488 secondary antibody (green) Shows the result of visualization;
  • 5F shows HeLa cells transiently expressing C 0 NT-UCH-Ll-myc. Or transiently expresses UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc, C90 / 132S NT-UCH-Ll-myc and C 0 NT-UCH-Ll-myc (all cysteines replaced with serine) HeLa cells were treated with 10 ⁇ g / ml CHX for the time indicated and immunoblot was performed using anti-myc antibody and GAPDH antibody.
  • Figure 6 shows that NT-UCH—L1 reduces intracellular R0S levels and protects cells from mitochondrial damaging reagents.
  • 6A shows HeLa cells stably expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and K15 / 157R NT-UCH-Ll-myc treated with DMS0 or 10 ⁇ CCCP;
  • CM- DCFDA CM- DCFDA cells were stained with CM- DCFDA and analyzed for intracellular reactive oxygen species level using FACS analyzer.
  • HeLa cells stably expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and K15 / 157R NT-UCH-Ll-myc when treated with DMS0, 25 y M or 50 ⁇ CCCP Shows growth observed using a real-time cell analyzer; Values are expressed as mean ⁇ SD.
  • 6C shows a diagram of the function of NT-UCH-L1
  • NT-UCH-L1 is in the mitochondria, while Ub-NT-UCH-Ll is in the cytoplasm.
  • Ub-NT-UCH-Ll and NT-UCH-L1 are in equilibrium (1).
  • soluble NT-UCH-L1 is reduced, ub-NT-UCH-Ll is deub juit inated.
  • the newly synthesized NT-UCH-L1 fills the losses, and when enough NT-UCH-L1 is available, Ub-NT-UCH-Ll is generated.
  • the amount of NT-UCH-L1 increases above the saturation level or when the mitochondria are stressed, they preferentially aggregate through intramolecular disulfide bonds containing Cys90 and Cysl32 (2). If NT-UCH-L1 is insoluble, it does not appear to return to the soluble fraction. The aggregates in the mitochondria are degraded by the proteasome (3). NT-UCH-L1 is degraded by proteasome in steady state (4).
  • Figure 6d shows DMS0, 10 nM, 100 nM or 1 ⁇ rotenone on HeLa cells stably expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and K15 / 157R NT-UCH-Ll-myc. ) Shows the results when the) is processed.
  • the present invention is the N-terminal removed ubiquitin C-terminal hydrolase -Ll (N-terminal
  • compositions for the prevention and treatment of Parkinson's disease comprising Truncated Ubiquit in C-terminal hydro lase-Ll, NT-UCH-L1) as an active ingredient.
  • the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • the NT-UCH-L1 protein may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the mRNA of the NT-UCH-L1 protein has been registered in the NCBI nucleotide database as protein gene product 9.5 (PGP9.5, accession number X04741), the authentication part is a cDNA "in the 32-th to 670 times, which is described in SEQ ID NO: 1 herein.
  • the vector may be linear DNA, plasmid DNA or recombinant viral vector, but is not limited thereto.
  • the recombinant virus may be any one selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, lentivirus, but is not limited thereto.
  • step 2) comparing the NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) with the NT-UCH-L1 protein expression level of a sample derived from a normal individual as a control;
  • 3) Provides a protein detection method for providing information of Parkinson's disease diagnosis, comprising the step of determining that the risk of Parkinson's disease when the NT-UCH-L1 protein expression level is reduced compared to the control.
  • NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) is Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining (i ⁇ unohistochemical staining), immunoprecipitation ( It may be detected by any one method selected from the group consisting of immunoprecipitation) and immunofluorescence (i ⁇ unofhiorescence), but is not limited thereto.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • immunohistochemical staining i ⁇ unohistochemical staining
  • immunoprecipitation It may be detected by any one method selected from the group consisting of immunoprecipitation
  • immunofluorescence i ⁇ unofhiorescence
  • test compound or composition 1) treating the test compound or composition to a cell line expressing NT-UCH-L1 protein;
  • step 3 providing a method for screening a candidate drug for treating Parkinson's disease comprising selecting a test compound or composition in which the amount of NT-UCH-L1 protein expression of step 2) is increased compared to a control cell line which has not been treated with the test compound or composition do.
  • the present invention 1) treating the test compound or composition to the NT-UCH-L1 protein;
  • Parkinson's disease therapeutic agent comprising the step of selecting the test compound or composition in which the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 2) is increased compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein untreated with the test compound or composition
  • a method for screening candidates Provides a method for screening candidates.
  • the present invention provides a health food for preventing and improving Parkinson's disease comprising the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 N-terminal removed as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing and improving Parkinson's disease, comprising administering to a subject an ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminus has been removed.
  • the present invention provides a method for treating Parkinson's disease comprising administering the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminus is removed to a subject with Parkinson's disease.
  • the present invention also provides the use of the N-terminal removed ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease.
  • the present invention provides the use of the ubiquitin C-terminal hydrolase -L1 from which the N-terminal is removed for use as a health food for preventing and improving Parkinson's disease.
  • the present invention when performing 2D-PAGE and Western blot analysis of UCH-L1 derived from NCI-H157 human lung cancer cell line, several spots related to UCH-L1 were identified, and spots 1 and 3 (See FIG. Lb upper panel).
  • Mass spectroscopic analysis of proteomics including peptide fingerprinting with MALDI-TOF MS and peptide sequencing with nanoUPLOESI-q-TOF tandem MS. , MS) method.
  • Spot 3 was UCH-L1 full length, while Spot 1 was NT-UCH-L1 (UCH-L1 lacking 11 N-terminal amino acids).
  • the presence of NT-UCH-L1 was detected in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y (see FIG. Lb right panel).
  • the deleted region corresponded to exon l (exon 1) of the UCH-L1 gene (PARK5) (see Figure lg).
  • the deleted 11 amino acids mRNA is protein gene product 9.5 It has been registered in the NCBI nucleotide database (PGP9.5, accession number X04741).
  • NT-UCH-L1 was inactivated when it was confirmed that NT-UCH-L1 had the ability to increase the ubiquitin hydrolase activity and cancer cell invasion of UCH-L1 (Fig. Lh). It was confirmed that it does not have the ability to increase cancer cell invasion (see FIG. Lj).
  • NT-UCH-L1 showed two distinct bands (FIG. 2C left panel, see lane 3). The above bands were identified as monoubiquitinated NT-UCH-Ll (Ub-NT-UCH-Ll) (see FIG. 2C right panel), whereas the whitish band detected was monoubiquitinated UCH-L1 (FIG. 2c left panel, see lane 2).
  • peptide sequencing and mutation studies were performed to identify monoubiquitinated lysine (lysine, Lys) residues.
  • Immunoprecipitated Ub-NT-UCH-Ll The peptide was analyzed by tandem MS. When lysine residues attach to ubiquitin, there is an increase of 114.04 Da (C-terminal Gly-Gly of ubiquitin).
  • Modified peptides of N JCH-L1 were identified and candidate ubiquitination sites were set in Lysl5 (see FIG. 2D).
  • Three variants of NT-UCH-L1, K157R, 15 / 157R and K60 / 157R, were constructed and monoubiquitination was confirmed by Western blot analysis (see FIG.
  • NT-UCH-L1 mitochondrial distribution of NT-UCH-L1 is related to mitochondrial damage. As a result, it was confirmed that the expression of NT-UCH-L1 or K15 / 157R NT-UCH-L1 in living cells did not affect the mitochondrial structure (see FIG. 3D).
  • NT-UCH-L1 has 8 hours recovery To normal levels in the soluble fraction, after which Ub-NT-UCH-Ll was made from NT-UCH-L1. Thus, Ub-NT-UCH-L1 appears to serve as a reservoir of NT-UCH-L1, which supplies NT-UCH-L1 when NT-UCH-L1 is decreased.
  • NT-UCH-L1 In both cells transiently or stably expressing NT-UCH-L1, the level of NT-UCH-L1 is less than that of UCH-L1. It was confirmed that NT-UCH-L1 is more easily degraded than UCH-L1. After inhibition of protein synthesis with CHX, UCH-Ll-tnyc, NT-UCH-Ll-myc and K15 in HeLa cells whose expression of UCH-L1 was naturally inhibited by methylation of the UCH-L1 gene. The degradation rate of / 157R NT-UCH-Ll-myc was compared.
  • NT-UCH-L1 is degraded by the ubiquitin-proteasome system at steady state.
  • NT-UCH-L1 aqueous and insoluble fractions of cell lysates was prepared as previously described (Ardley, H.C. et al., Mo I Biol Cell 14, 4541-4556). (2003)).
  • NT-UCH-L1 and its K15 57R variants readily accumulated in insoluble fractions and negligible levels of UCH-L1 were insoluble. Accumulated in the fractions (see FIG. 4E).
  • NT-UCH-L1, but not Ub-NT-UCH-Ll appeared in the insoluble fraction after MG132 treatment (see middle panel of FIG. 4E).
  • NT-UCH-L1 In order to explain the coarsening of NT-UCH-L1 in neurons, without MG132, most of UCH-L1 is present in the soluble fraction, while transiently expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 More than 20% of the dopamine neuronal progenitor cell line SN4741 was present in the insoluble fraction (see FIG. 4H). Insoluble fractions thereof increased with increasing expression of NT-UCH-L1 (see FIG. 4I). This may be the limit for the level of soluble NT-UCH-L1, indicating that below this limit NT-UCH-L1 maintains solubility in cells.
  • insoluble fractions of NT-UCH-L1 were analyzed under reduced conditions to determine if insoluble sparging of NT-UCH-L1 occurred from covalent or non-covalent disulfide formation.
  • the insoluble NT-UCH-L1 fraction contained disulfide crosslinked high molecular mass NT-UCH-LKS-S NT) which became monomeric under reducing conditions (see FIG. 4I).
  • NT-UCH-L1 eluted with a multimer greater than 66 kDa
  • NT-UCH-L1 When cells are stressed, it is assumed that NT-UCH-L1 will aggregate through intramolecular disulfide bonds. To test this hypothesis, HeLa cells were treated with varying concentrations of hydrogen peroxide (3 ⁇ 4) for 1 hour and isolated by SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions (see FIG. 4K). UCH-L1 did not form globules, but NT-XH-L1 and its K15 / 157R variant formed disulfide-linked multimers in cells treated with 3 ⁇ 40 2 or greater than 0.5 m. In addition, it was confirmed that this form is caused in response to mitochondrial stress, such as CCCP treatment. CCCP induced degradation of NT-UCH-Ll in the proteasome (see FIGS. 3B and 3C).
  • HeLa cells expressing NT-UCH-L1 were treated with CCCP and MG132, and when analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions, the loss of CCCP-induced NT-UCH-L1 was inhibited by the treatment of MG132 (FIG. 41). See panel lane 4 below). Taken together, both oxidative and mitochondrial stress were found to induce disulfide crosslinking in NT-UCH-L1.
  • Cysl32 formed a disulfide bond with all five cysteines including it (see FIG. 5C). Cys 132 and Cysl52 are two surface cysteine residues in UCH-L1. Six strains of NT-UCH-Ll (Cys replaced by Ser) were made and an attempt was made to find cysteine residues important for NT-UCH-L1 processing in the recombinant strain protein (FIG. 5A). Mutant C90S showed less polymer and more monomers of about 25 kDa size (see arrow in FIG. 5A). This indicates that C90 and C132 are responsible for disulfide crosslinking in NT-UCH-L1 (see FIG. 5D).
  • HeLa cells expressing UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc or C90 / 132S variants thereof transiently were treated with CHX and their half-life was measured.
  • NT-UCH-L1 disappeared within 6 hours, but C90 / 132S NT-UCH-L1 remained up to 24 hours, which had a half-life of C90 / 132S NT-UCH-Ll and that of UCH-L1. Suggest something similar.
  • NT-UCH-L1 The formation of intramolecular disulfide bonds in NT-UCH-L1 suggests that it is a protein sensitive to redox reactions.
  • NT-UCH-L1 affects intracellular R0S levels
  • expression of NT-UCH-L1 and K15 / 1157R NT-UCH-L1 decreased intracellular R0S levels compared to control mock and UCH-L1 expression.
  • FIG. 6A Cells expressing NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant showed lower R0S levels than cells expressing mock or UCH-L1, suggesting that NT-UCH-L1 reduces intracellular R0S levels. do.
  • CCCP is known to induce mitochondrial damage and cell death, leading to symptoms associated with the onset of Parkinson's disease.
  • CCCP induced cell damage and confirmed the cytoprotective effect of NT-UCH-L1
  • the cells expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 were not UCH-L1.
  • NT-UCH-L1 suggests protecting cells from CCCP-induced damage, as it deviated from cell induced induced cell death (see FIG. 6B).
  • NT-UCH-L1 from which the N-terminal 11 amino acids of UCH-L1 were removed is located in the mitochondria and plays a major role in the regulation of stress inducing intracellular reactive oxygen species and mitochondrial damage. It can be used as an active ingredient of a composition for preventing and treating Parkinson's disease.
  • the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples illustrate the present invention in detail, and the content of the present invention is not limited to the examples.
  • Human NCI-H157 lung cancer cell line
  • SH-SY5Y human-derived neuroblastoma cell line
  • HeLa cells were treated with 10% fetal bovine serum (FBS), streptomycin and penicillin G.
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin streptomycin
  • penicillin G penicillin G
  • RPMI 1640 dulbecco's modified eagle medium and mini mum essential medium. Media and components used for cell culture were purchased from Invitrogen.
  • Polyclonal antibodies against Ubiquitin C-terminal hydrolase (LCH, UCH-L1) and N-terminal peptides of the myc tag were identified by AbFrontier, Inc. (Korea) produced and characterized.
  • Materials for other antibodies are as follows: monoclonal anti-myc antibody (MilHpore), polyclonal anti-UCH-L1 antibody (Chemicon), anti-ubiquitin antibody (Chemicon), flag-antibody (M2) (Sigma), anti-tubulin antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.), goat anti-mouse antibody (Molecular Probes).
  • 2D gel electrophoresis was performed as previously described (Jeong, J. et al. Mol Cell Protean ics 10, (2011)). In summary, cells were treated with 9.5 M urea, 2% TritonX-100, 5% ⁇ mercaptoethanol (ptneixaptoethano, 1.6% pamalite 5-7 (pharmalyte 5-7), 0.4% pamalite 3-10 (pharmalyte). 3-10), 50 mM DTT, protease inhibitor cocktail and 5 mM Na 3 V0 4 were dissolved in a buffer containing I ⁇ obline Drystrip 4-7 linear gels (GE Healthcare). After equilibration (50 mM tris pH 8.8), 6 M urea 2% SDS, 30% glycerol and strips 11% two-dimensional SDS- Placed on a PAGE plate gel and analyzed for protein.
  • Example 1 to determine if there are other variants of UCH-L1 (Strausberg, RL et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 16899-16903 (2002) (Fig. La)).
  • Protein gel spots prepared at were isolated and digested with trypsin, and the resulting peptides were purified by Jeong, J. et al., Mol Cell Protean ics 10, MHO 000513 (2011), Seo, J. et al. J Proteome Res 7, 587-602 (2008), and Lee, E. et al., PLoS one 4, e7949 (2009)
  • the digested peptides were nanoacquity UPLC TM ESI / MS.
  • Samples were trap column cartridges (ID 180 ⁇ x 20 mm, Sy ⁇ etry C18, Waters) prior to desalting, initially the flow rate was set to 300 nl / min and the capillary voltage (2.5 keV) was applied to the LC mobile phase before injection. Chromatography was performed in-line with MS. The MS parameter for efficient data dependent acquisition was the intensity of at least 10 and three elements that were converted from mass spectrometry to MS / MS. The individual MS / MS ranges were combined, smoothed "with a single LC operation resulting in the same results as the Micromass ProteinLynx Global Server (PLGSTM) 2.1 data processing software and the sole MASCOT-searchable peak list (.pkl) file.
  • PGSTM Micromass ProteinLynx Global Server
  • the vertex listing file was used with the following variables to question the SwissProt database using the MASC0T (global search engine): peptide mass tolerance , 0.2 Da; MS / MS ion mass tolerance, 0.2 Da; trypsin degradation up to 1 Site tolerance; Acetylation, deamidation, pyro-ghi (N-term E, Q), oxidat ion, formylat ion, phosphorylation, caramido Various formulas were considered, such as carbamidomethyl and cysteine propionamide, but the formulas were not fixed; The enzyme was not limited to trypsin; The taxonomy (toxonomy) was not limited to mice. All reported challenges were confirmed by automatic and manual interpretation of the range from MASCOT.
  • the deleted site corresponded to the axon Kexon 1) of the UCH-L1 gene (PARK5) (FIG. Lg).
  • the mRNA of the 11 amino acid-deleted protein has been registered in the NCBI nucleotide database as protein gene product 9.5 (PGP9.5, accession number X04741).
  • Lentivirus vectors for UCH-L1 and NT-UCH-L1 wild type gene expression were constructed by introducing PCR gene fragments into the Xba I-EcoR V region of the Lent i Ml.4 vector. Gastric lentiviral was constructed as described previously, and UCH-L1 Used for stable expression (Dull, T. et al., J Virol 72, 8463-8471 (1998) and Follenzi, A., Ailles, LE, Bakovic, S., Geuna, M. & Naldini, L., Nat Genet 25, 217-222 (2000).
  • the ubiquitin-C-terminal hydrolase activity of the ubiquitin-C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin (ub i qu i U nCt erm i na 1 7— am i do-4-methy 1 coumar in, Ub —AMC) (AG scientific) and measured as previously described (Kim, HJ et al., Oncogene 28, 117-127 (2009)).
  • NT-UCH-LI does not have the ability of ubiquitin hydrolase activity.
  • ubiquitin-AMC derived hydrolytically released fluorescence was compared with purified recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1.
  • NT-UCH-L1 was inactivated (FIG. Lh). This was confirmed by comparing the hydrolase activity of Flag-UCH-Ll and Flag-NT-UCH-L1 immunoprecipitated from lysates of NCI-H157 cells. Flag-UCH-Ll showed hydrolase activity, but Flag-NT-UCH-Ll did not (FIG. Li).
  • NT-UCH-L1 does not have the ability of UCH-L1 to increase cancer cell invasion (FIG. Lj).
  • the cover banung a 25 mM citric acid tri was sodium (tr isodium citrate) / 25 mM disodium succinate complete cheungaek (disodiutn succinate buffer), kaenchi (quenche) to pH 2.3 (which was adjusted with formic acid)
  • porcine pepsin (1 / ⁇ ) was added to each canned protein sample and incubated for 3 minutes at 0 ° C. after injection (Hoofnagle, AN, Resing, KA & Ahn, NG, Methods Mol Biol).
  • NT-UCH-L1 has a looser structure than UCH-L1.
  • the loose sites were identified by HDX analysis in peptides digested with pepsin (FIG. Lm). More deuterium exchange occurred at the N and C termini of NT-UCH-Ll than UCH-Ll. Peptides containing the cysteine active site of NT-UCH-L1 ( 82 MKQTIGNSCGTIGL 95 ) had less deuterium exchange than UCH-L1 (FIG. In).
  • Example 6 Confirmation of Monoubiquitination in Lysl5 or Lysl57 of NT-UCH-L1 To confirm monoubiquitination in Lysl5 or Lysl57 of NT-UCH-L1, immunoprecipitation was performed.
  • Cells were immunoprecipitated lysate (50 mM Tris-HCl, pH7.4, 50 mMNaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF). , 5 / ml aprotinin (31) 1 ⁇ 01: ⁇ 10), 10 g / ml leupeptin, 10 tg / ml pepstatin, 1 mM Na 3 V0 4 , 0.5% NP-40 ).
  • the lysates were centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes and the supernatants with anti-flag or anti-myc antibodies crosslinked to protein G sepharose beads at 4'C for 3 hours. Incubated. The beads were washed three times with immunoprecipitation supernatant and the bound protein was gel sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 10% (w / v) glycerol, 5% ⁇ mercaptoethanol, 2.3% SDS) was eluted with SDS-PAGE.
  • NCI-H157 cell-derived lysates expressing UCH-Ll-myc and NT-UCH-Ll-myc were treated with anti-myc antibody temporarily and the resulting immunoprecipitation was analyzed.
  • UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc and several other bands were detected and confirmed by ⁇ tandem MS.
  • the band precipitated together with the UCH-L1 was identified as ubiquitin (Fig. 2a arrow). This was confirmed by immunoprecipitation (FIG. 2C right panel arrow head).
  • the two bands that settled together with NT-UCH-L1 were identified as a mixture of UCH-L1 and ubiquitin ( Figure 2b). Since the molecular mass difference between NT-UCH-Ll-myc and the two bands is close to that of ubiquitin, western blot of immune complexes with anti-myc and anti-ubiquitin antibodies was performed.
  • NT-UCH-L1 showed two distinct bands (FIG. 2C left panel, third lane).
  • peptide sequencing and mutation studies were combined to identify monoubiquitinated lysine (lysine) residues.
  • Immunoprecipitated Ub-NT-UCH-Ll was analyzed by peptide sequencing with tandem MS. When lysine residues attach to ubiquitin, there is an increase of 114.04 Da (Gly-Gly of ubiquitin).
  • Modified peptides of NT-UCH-L1 were identified and candidate ubiquitination sites were set in Lysl5 (FIG. 2D).
  • Three variants of NT-UCH-L1, K157R, K15 / 157R and K60 / 157R was constructed and monoubiquitination in these strains was confirmed by Western blot analysis (FIG.
  • Cells were treated at room temperature for 1 hour with 33 ⁇ 4> BSA, 0.2% Tween 20 and 0.2% gelatin PBS to block adsorption of unspecific proteins.
  • Cells were incubated at 37 ° C for 1 hour with monoclonal anti-myc antibody diluted 1: 250 in HBSS containing 1% BSA and 1% sucrose. After washing three times with PBS, the cells were incubated at 37 ° C for 1 hour with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti mouse IgG diluted 1:50.
  • Cells were analyzed under Zeiss LSM 510 META confocal microscope.
  • Predotar and MitoProt ⁇ -vl.lOl programs for predicting mitochondrial targeting, were applied.
  • UCH-Ll-myc was mainly distributed in the cytoplasm, but NT-UCH-Ll-myc was distributed in both the cytoplasm and mitochondria, and K15 / 157R NT-UCH- L1 was distributed only in the mitochondria.
  • FIG. 3A This distribution is derived from HeLa cells Western blot studies of cytoplasm and mitochondrial fractions were confirmed (FIG. 3B). Deletion of 11 N-terminal amino acids from UCH-Ll increased the likelihood of mitochondrial targeting: predictive scores of 0.0003 and 0.41 in Predotar and 0.1032 and 0.4606 in MitoProt II for UCH-L1 and NT-UCH-L1, respectively.
  • NT-UCH-L1 mitochondrial distribution of NT-UCH-L1 is related to mitochondrial damage.
  • Mitochondrial fractions of cells were prepared as previously described (Shim, JH et a /., Mitochondrion 11, 707-715 (2011)). Cells were suspended in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, supplemented with a protease inhibitor complex and 10 mM NEM and passed through a gauge needle 20 times. After addition of 40 ⁇ cold 1.5 M sucrose solution, after centrifugation at 600 X g for 10 minutes, the supernatant was centrifuged at 14,000 g for 10 minutes and mixed with an equal volume of 2 ⁇ 3 ⁇ 4 sample buffer.
  • NT-UCH-L1 recovered to normal levels in soluble fraction by 8 h recovery, after which Ub-NT-UCH-Ll was made from NT-UCH-L1.
  • Ub-NT-UCH-Ll appears to serve as a reservoir of NT-UCH-L1, which supplies NT-UCH-L1 when NT-UCH-L1 is reduced.
  • NT-UCH-L1 The level of NT-UCH-L1 is less than that of UCH-L1. We confirmed that NT-UCH-L1 is more easily degraded than UCH-L1. After inhibiting protein synthesis with CHX, UCH-Ll-tnyc, NT-UCH-Ll-myc and NT-UCH-Ll-myc and Hepatocytes were naturally inhibited in the expression of UCH-L1 by methylation of the UCH-L1 gene. The degradation rates of K15 / 157R NT-UCH-Ll-myc were compared.
  • MG132 inhibitor of proteasomal degradat ion
  • inhibitor of NH4CK lysosomal degradat ion inhibitor of NH4CK lysosomal degradat ion
  • 3-methyl adenine NT-UCH-L1 was quantified after 3MA, an inhibitor of autophagy
  • Only MG132 treatment was found to cause accumulation of NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant in HeLa cells (FIG. 4D) as well as NCI-H157 (FIG. 4C).
  • NT-UCH-L1 is degraded by the ubiquitin-proteasome system.
  • NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant easily accumulated in the insoluble fraction and negligible levels of UCH-L1 accumulated in the insoluble fraction (FIG. 4E).
  • NT-UCH-L1 appeared in the insoluble fraction (FIG. 4E middle panel). This was more evident with the K15 / 157R NT-UCH-L1, a monoubiquitination-deficient variant that mostly accumulates in the insoluble fraction (panel below FIG. 4E). This was also seen in NCI-H157 cells (FIG. 4F).
  • NT-UCH-L1 coagulation in neurons
  • MG132 dopamine neuronal progenitor cell lines SN4741
  • Insoluble fractions thereof increased with increasing expression of NT-UCH-L1 (FIG. 4I). This may be the limit for the level of soluble NT-UCH-L1, indicating that below this limit NT-UCH-L1 maintains solubility in cells.
  • insoluble NT-UCH-L1 under reducing conditions Analysis of the fractions confirmed that insoluble pooling of NT-UCH-L1 occurred from covalent or non-covalent disulfide formation.
  • the insoluble NT-UCH-L1 fraction contained disulfide crosslinked high molecular mass NT-UCH-L SS NT) which became monomeric under reducing conditions (FIG. 4I).
  • PET 17b plasmids containing various UCH-Ll-6His forms were transformed into BL2KDE3) and grown at 37 ° C until 0D reached 0.6-0.8 at 600 nm.
  • cells were incubated with IPTG for 2 hours at 25 ° C., harvested, and lysed complete solution (PBS with 0.16 mg / ml lysozyme, 0.1% Triton C-100, 2 ug /) Dissolve in ice for 30 minutes in ml aprotinin, 1 mM PMSF, 10 raM imidazole.
  • the cell lysates were centrifuged at 65,000 rpm, 4 ° C.
  • NT-UCH-L1 eluted with a multimer greater than 66 kDa, whereas recombinant UCH-L1 eluted mainly as a monomer (about 30 kDa). It did not decompose into monomers under non-reducing conditions (FIG. 4J). This represents the NT-UCH-L1 form insoluble aggregate with intramolecular disulfide bonds sharing electron pairs.
  • NT-UCH-L1 When cells are stressed, it is assumed that NT-UCH-L1 will aggregate through intramolecular disulfide bonds. To test this hypothesis, HeLa cells were treated with varying concentrations of hydrogen peroxide (3 ⁇ 40 2 ) for 1 hour and isolated by SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions (FIG. 4K). UCH-L1 did not form aggregates, but NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variants treated more than 0.5 mM of 3 ⁇ 40 2 . Intracellular disulfide-linked multimers were formed. In addition, it was confirmed that this form caused by reaction to mitochondrial stress such as CCCP treatment.
  • CCCP induced degradation of NT-UCH-L1 in proteasomes (FIGS. 3B and 3C).
  • HeLa cells expressing NT-UCH-L1 were treated with CCCP and MG132, and when analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions, the loss of CCCP-induced NT-UCH-L1 was inhibited by the treatment of MG132 (FIG. 41). 4) bottom panel lane.
  • NT-UCH-L1 was maintained, but not in its original position (upper panel arrow), but instead dispersed in the higher molecular weight range, which dissociated the disulfide cross-linked multimer prior to proteasome analysis. Suggest forming. Taken together, both oxidative and mitochondrial stress were found to induce disulfide crosslinking in NT-UCH-L1.
  • NT—UCH-L1 increased the solubility
  • NT-UCH—L1 had 6 cysteine residues containing Cys 90 at its active site, non-reducing conditions. It was confirmed that the multimer was formed in (Fig. 5a lane 1).
  • Algorithm DBond and nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS were applied in parallel to identify disulfide sites, and the formation of disulfide bonds in NT-UCH-L1 was confirmed. Many disulfides containing peptides were detected, but the trypsin peptides containing Cys47 were found to be too long for MS analysis (Table 1 and FIG. 5B).
  • Cysl32 formed a disulfide bond with all five sasteins including it (FIG. 5C).
  • Cys 132 and Cysl52 are two surface cysteine residues in UCH-L1.
  • Six variants of NT-UCH-Ll (Cys replaced by Ser) were made and attempted to find cysteine residues important for NT-UCH-L1 processing in recombinant variant proteins (FIG. 5A).
  • Mutant C90S showed less polymer and more monomers of about 25 kDa size ( Figure 5A arrow). This shows that C90 and C132 are responsible for disulfide crosslinking in NT-UCH-L1 (FIG. 5D).
  • NT-UCH-L1 Temporarily to UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc or its C90 / 132S variant Expressing HeLa cells were treated with CHX and their half-lives were measured. As shown, NT-UCH-L1 disappeared within 6 hours, but C90 / 132S NT-UCH-L1 remained up to 24 hours, with a half-life of C90 / 132S NT-UCH-L1 similar to that of UCH-L1. Present that.
  • NT-UCH-L1 intramolecular disulfide bonds in NT-UCH-L1 suggests that this is a protein sensitive to redox reactions.
  • CM-H 2 DCFDA Invitrogen
  • trypsin treated cells were washed and resuspended in 0.5 ml HBSS. 3 ⁇ 0.5 mM CM-3 ⁇ 4DCFDA was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After a brief wash with HBSS, cells were analyzed with a BD FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences).
  • NT-UCH—L1 and K15 / 1157R NT-UCH-L1 reduced intracellular R0S levels compared to control mock and UCH-L1 expression (panel above FIG. 6A).
  • Cells expressing NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant showed lower R0S levels than cells expressing mock or UCH-L1, suggesting that NT-UCH-L1 reduces intracellular R0S levels. do.
  • CCCP is known to induce mitochondrial damage and cell death, leading to phenomena associated with the onset of Parkinson's disease.
  • 5,000 HeLa cells were used for 96-well E-plates for xCELLigence (Roche Applied Science), a real-time cell analyzer. Put on. After 24 hours, cells were treated with CCCP of 0, 10 and 25 ⁇ , and cell growth was observed by measuring the xCELLigence, a real-time cell analyzer every 30 minutes, with the impedance of electrical voltage and current. The sample was repeated three times.
  • NT-UCH-L1 was not CCCP-induced damage because cells expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1, but not UCH-L1, were free of CCCP-induced apoptosis.
  • FIG. 6B To protect cells from (FIG. 6B).

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Abstract

본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 N-말단 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)이 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -Ll(NT-UCH-Ll)를 유효성분 으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -Ll(N-terminal Truncated Ubiqui t in C— terminal hydro lase-Ll, NT-UCH-L1)를 유효성분으로 포함하 는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
파킨슨병은 퇴행성 신경계 질환 중 두 번째를 차지하는 진행성 질환으로 노인 인구의 증가와 함께 그 발병률이 계속 증가하고 있어서 사회 및 경제적으로 문제가 되고 있는 난치성 질환이다. 현재 전세계적으로 약 4 백만 명이 이 질환에 걸려 있는 것으로 알려져 있으며, 미국의 경우 매년 약 5만 명씩 환자가 증가하고 있는 것으로 파악되고 있다. 발병률은 1천명 중 한 명 꼴로 연령이 높을수록 발생 빈도가 높다. 이 질환의 임상적 특징으로는 운동완서 (Bradykinesia), 경직 (Rigidity), 자세불안정 (Postural instabi 1 ity)과 같은 운동성 이상 증상들과 인지기능장애 (cognitive dysfunction), 우을증 (Depression)， 수면장애 (sleep disorder), 통증 (pain) 등을 동반하는 비운동성 이상 증상들이 있다 (대한민국 공개특허 10-2010-0125843). 파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만， 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다.
이와 같이 파킨슨병은 그 병인이 정확히 알려져 있지 않기 때문에, 근본적인 치료보다 주로 증상개선을 위한 치료방법들이 이용되고 있다. 현재 사용되고 있거나 개발중인 치료제들은 다음과 같다. 가장 많이 개발되어 사용되고 있는 약물로는 도파민 보층제인 레보도파 (Levodopa)와 같은 도파민 전구체와 도파민 수용체 효현제 (fenofibrate)등이 있다. 그 외에도, 파킨슨병을 치료하기 위하여 사용되고 있는 치료제로는 FDA허가된 도파민 작용제 (Dopamine Agonists), 카테콜 -0-메틸트랜스퍼레이즈 ( cat echo 1 -0-methy 1 transferase inhibitor, COMT inhibitor), 모노아민 산화효소 BCmonoamine oxidase B, MAO-B inhibitors), 항— 콜린작용제 (Anti-cholinergics) 등이 있으며， 뇌신경세포 보호제제， 항산화제， 뇌세포 고사 억제제， 뇌기능 항진제 등을 치료제로 이용하거나 개발하려는 노력들이 계속되고 있다 (대한민국 공개특허 10-2010-0097059). 파킨슨병의 치료 기술이나 약물의 신경보호 효과에 대해서는， 파킨슨병의 급성 염증 단계로서 미토콘드리아의 기능 손상과 산화적 스트레스 (oxidative stress)로 인한 세포 사멸에 대한 것이 연구되고 있는 실정이다.
파킨슨병을 유발하는 요인으로서， 노화가 가장 큰 연관이 있는 것으로 알려져 있고, 농약 등과 같은 신경 독소들에 의한 환경적 요인， 활성 산소 그리고 유전적 요인 (5-10% 정도) 등이 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한， 산화적 스트레스 (oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전 (mitochondria dysfunction)도 파킨슨병 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다 (Grunblatt 등,. J. Neural Transm. Ill: 1543-1573, 2004) . 유전적 요인으로는 알파시누클레인 (a-synuclein), 파킨 (Parkin), UCH-Ll(Ubiquit in C- Terminal Hydro lase-Ll) , DJ-1, NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), 신필린一 Synuclein一 alpha— interact ing protein, Synphi 1 in一 1)등과 같은 유전자 돌연변이와 연관되어 있다고 알려져 있다 (Dawson 등， Science 302:819-822, 2003).
UCH-L1 단백질은 유비퀴틴의 C-말단의 유비퀴틸 에스테르 (ubiquityl esters)를 가수분해 (hydrolyze)하여 단량체 (monomer)를 만드는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고 (Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11:141-148， 2000), 이 유전자의 변이는 93번 위치의 이소루신 (Isoleucine) 아미노산이 메티오닌 (Methionine) 아미노산으로 변이된 것으로 한 가계에서' 이러한 변이가 우성형질로 유전됨이 보고되었다 (Leroy 등， Nature 395:451-452， 1998) . 그러나， 이와 같은 변이와 관련된 병리학적 데이터 (Pathological data)는 아직 보고되지 않고 있다 (대한민국 등록특허 10-0644364). 아울러, UCH-L1의 다양한 전사 후 변형， 예를 들면, 리신 (lysine) 157에서 모노 -유비퀴틴화 (Meray, et al, J Biol Chem 282, 10567-10575(2007) . ) , 시스테인 (cysteine) 220에서 파르네실화 (farnesylationKLiu, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4635- 4640(2009)), 시스테인 220에서 산화 (Choi, J. et al. , J Biol Chem 279, 13256- 13264(2004)) 및 시스테인에서 152에서 15-deoxy-A 12， 14-prostaglandin J2(15d- PGJ2)의 접합 (Koharudin, L.M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107, 6835- 6840(2010))이 보고된 바 있다.
UCH-L1은 파킨슨 병의 뇌에서 루이 체 (Lewy bodies)라고 불리는 단백질 웅집체의 구성 성분이며， 이는 UCH-L1 및 파킨슨병 사이에 가능한 연관성을 제시한다 (Lowe, J. et al., J Pathol 161， 153-160(1990)). 또한, UCH-L1 변이에 의한 파킨슨병이 보고되었으며， UCH-L1은 유비퀴틴 (ubiquitin)과 펩티드 (peptide) 사이의 연결을 절단하는 효소로 시험관내에서 유비퀴틴 알데히드 (aldehyde)로 이 효소를 억제하였을 때， 도파민성 신경 세포의 사멸과 α-시눌린 ( d-synulein)로 염색되는 세포질 내 봉입체가 형성된 것이 확인되었다 (McNaught S, et al., J Neurochem 2002;81:301-306). UCH-L1이 특발성 파킨슨병 및 알츠하이머병에서 하향조절되어 있으며， 산화적인 손상과 신경의 유비퀴틴화 /디유비퀴틴화 기작 및 산발적인 알츠하이머병 및 파킨슨병 사이의 직접적인 관련성이 제시된 바 있다 (Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264(2004)).
또한, 최근에 UCH-L1는 암 전이 및 변형에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 구체적으로， UCH-L1을 이용한 암전이 진단용 조성물 및 이를 이용한 암전이 진단방법， 암전이 억제용 조성물 및 이를 이용한 암전이 억제방법， 암전이 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법이 개발된바 있다 (대한민국 등록특허 10-0732298). 상기 UCH-L1은 암전이의 원인적 표적 단백질로서, 이의 발현 정도에 따라 세포이동도가 증가하므로， 이에 대한 모노클로날 항체， N-말단 펩티드에 대한 항체 또는 기질을 이용하여 암전이 진단에 사용할 수 있다. 또한， UCH-L1의 발현 또는 효소활성을 저해함으로써 암전이를 억제할 수 있으므로， UCH-L1의 억제제를 스크리닝하여 개발함으로써 항암치료의 보조제로서 암전이 억제용 약제로서 유용하게 사용될 수 있음을 개진하였다.
이와 같이， UCH-L1는 파킨슨병의 병리 표식자인 루이체의 구성 성분이며， UCH-L1의 활성을 억제하였을 때， 도파민성 신경 세포의 사멸이 진행되는 것이 확인된 바 있고， UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -Ll(N-terminal Truncated Ubiqui t in C-terminal hydro lase-Ll , NT- UCH-L1)의 염기서 열이 밝혀진 바 있으나， NT-UCH-L1의 파킨슨병의 염증단계에서 나타나는 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 생체내 기능은 완전히 밝혀지지 않았다. 따라서， 본 발명자들은 UCH-L1의 N-말단의 일부 아미노산이 제거된 NT-UCH- L1의 특징을 확인하고， 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 효과를 확인 하고자 하였으며， 결과적으로， NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치함으로써， 활성산 소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였고， 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다 .
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 본 발명의 목적은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1(N- terminal Truncated Ubiqui t in C-terminal hydro l ase-Ll , NTᅳ UCH -니)를 유효성분으 로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기 과제를 해결하기 위하여 본 . 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소ᅳ니 (N-terminal Truncated Ubiqui t in C-terminal hydro l ase-Ll , NTᅳ UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은
1) 실험군으로서 피검 체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계 ;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계 ; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험 이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계 ;
2) 단계 . 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리 한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다 .
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처 리하는 단계 ;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성 이 피검 화합물 또는 조성물을 무처 리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별 하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다 . 또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 유효 성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 개체 에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 파킨 슨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료방법을 제공한다 . 또한， 본 발명은 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 N-말단이 제거된 유비퀴 틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도를 제공한다. 아울러， 본 발명은 파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소- LKN-terminal Truncated Ubiqui t in C-terminal hydro l ase-Ll , NT-UCH-L1)이 미토 콘드리아에 위치함으로써， 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스 의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로， 이를 파킨슨병 예방 및 치 료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다 .
【도면의 간단한 설명】
도 1은 인간 폐암 및 신경아세포종 세포주에서 NT-UCH-L1의 확인 및 이의 UCH-L1와의 구조 및 효소적 차이 점을 나타낸 도이다 .
도 la는 기존에 밝혀진 인간 UCH-L1의 변종을 나타낸 도이다.
도 lb는 NCI-HI57 및 SH-SY5Y 유래 UCH-L를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 lc는 상기 도 lb의 스팟 1올 MALDI-T0F MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 ( f ingerpr int ing) 및 nanoUPLOESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 (mass spectroscopic , MS) 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 Id는 상기 도 lb의 스팟 3을 MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 le는 UCH-L1의 결실된 N말단의 대체된 아미노산을 나타낸 도이다.
도 If는 UCH-L1의 결실된 N말단을 펩티드 서열분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 lg는 UCH-L1의 결실된 N말단이 UCH-L1 유전자 (PARK5)의 액손 Kexon 1)에 해당하는 것을나타낸 도이다. 도 lh는 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 유비퀴틴 가수분해 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다 .
도 li는 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역 침강된 Flag-UCH-Ll 및 Flag- NT-UCH-L1의 가수 분해 효소 활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 lj는 세포 이동 분석을 통한 NT-UCH-L1의 암세포 침입 능력 이 없음을 나타낸 도이다 .
도 lk 및 11은 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 수소-중수소 교환 결과를 나타낸 도이다.
도 lm은 HDX연구로 정제된 UCH-Ll, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 In은 시스테인 활성 부위 (82MKQTIGNSCGTIGL95)를 포함하는 UCH-L1 및 NT- UCH-L1 펩티드의 대표적 인 HDX 영역을 나타낸 도이다 .
도 2는 NT-UCH-L1의 Lysl5 및 Lysl57 잔기의 모노유비퀴틴화 (Monoubiqui t inat ion)을 나타낸 도이다.
도 2a는 pcDNA3.1 UCH-Ll-myc 또는 pcDNA3.1 NT— UCH— Ll-myc인 빈 백터가 일시 적으로 형질도입된 (transfected) NCI-H157 세포를 항 -myc 항체를 이용하여 면역침강한 도이다 .
도 2b는 도 2a의 화살표가 있는 두 밴드를 자르고 , 트립신 분해 후에 nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용하여 서 열분석한 것을 나타낸 도이다.
도 2c는 pcDNA3.1 UCH-Ll-myc 및 pcDNA3.1 NT-UCH-Ll-myc인 빈 백터가 일시적으로 형질도입된 NCI-H157 세포를 항 -myc 항체로 면역 침강하고， 항 -myc 및 항-유비퀴틴 (ubiqu in) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석한 도이다;
* : 비특이 적인 밴드들 .
도 2d는 Lysl5를 포함하는 NT-UCH-L1 펩티드의 MS 범위를 나타낸 도이다. 도 2e는 다양한 UCH-L1 형 태를 포함하는 pcDNA3.1 플라스미드가 일시 적으로 형질도입된 HEK293T 세포를 나타낸 도이다.
도 2f는 UCH-L1의 제시된 형 태를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포를 항- myc 항체를 이용하여 면역침강하고, SDS-PAGE로 분석하며 , 항 -myc 및 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역블랏한 도이다; *: 비특이적 밴드들.
도 3은 NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화가 NT-UCH-L1의 저장소이며, NT-UCH- Ll의 위치 및 기능을 결정하는 것을 분석한 도이다.
도 3a는 UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NHJCH-L1을 발현하는 세포를 항 -myc 및 Alexa Fluor 488 2차 항체 (녹색)으로 가시화한 것을 나타낸 도이다;
미토콘드리아 및 핵을 Mitotracker®(붉은색) 및 DAPI (파란색)로 각각 염색하였다.
도 3b는 DMS0 또는 10 yM CCCP 처리된 세포를 세포질 및 미토콘드리아 분획물로 분획하고, UCH-L1을 항 -myc 항체 이용하여 면역블랏하여, 항 -Hsp60을 이용하여 미토콘드리아마커 단백질인 Hsp60을 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다. 도 3c는 프로테아좀 (proteasome)에서 NT-UCH-L1의 CCCP로 유도된 분해를 나타낸 도이다.
도 3d는 UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포의 Mitotracker® 염색을 나타낸 도이다.
도 3e는 NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포에 열층격을 주고, 회복한 후 세포를 용해성 및 블용성 분획물로 분리하고， 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 3f는 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI-H157세포에 열충격을 주고， 사이클로핵시마이드 (cycloheximide)가 있거나 없는 조건에서 회복하였을 때 결과를 나타낸 도이다. '
도 4는 NT-UCH-L1의 응집 현상을 나타낸 도이다.
도 4a는 UCH-Ll, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-U를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 10 g/ml 사이클로핵시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 UCH-Ll, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 10 jt/g/ml 사이클로핵시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 UCH-Ll, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 DMSO, 10 μΜ MG132, 10 mM NH4C1 또는 10 mM 3MA를 16시간 동안 처리하고 항 -myc를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4d는 UCH-Ll, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMS0, 10 μΜ MG132, 10 mM NH4C1 및 10 mM 3MA로 16시간 동안 처리하고， 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4e는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMS0 또는 10 μΜ MG132를 9 시간 동안 처리하고， 용해성 및 불용성 분획물로 분리한 것을 나타낸 도이다. 시료는 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4f는 UCH-Ll, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는
NCI H157 세포에 DMS0 또는 10 μΜ MG132를 처리하고 용해성 및 블용성 분획물로 분획한 것을 나타낸 도이다.
도 4g는 세포에 16시간 동안 DMS0 또는 10 μΜ MG132를 처리하고， 고정 및 침투 후에， myc가 붙은 단백질을 항 -myc 및 Alexa Flour 488 2차 항체 (녹색)로 탐지한 것을 나타낸 도이다;
파란색: DAPI 염색.
도 4h는 SN4741 세포에 pcDNA3.1 UCH-Ll, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH- L1를 일시적으로 형질도입하고, 세포를 용해성 및 불용해성 분획물로 분리한 결과를 나타낸 도이다.
도 4i는 다양한 양의 pcDNA3.1 NT-UCH-Ll-myc 발현 플라스미드가 일시적으로 형질도입된 SN4741세포를용해성 및 불용해성 분획물로 분뫼하고, 환원 및 비환원 젤에서 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4j는 FPLC를 이용하여 분획된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 나타낸다; 분획물을 비환원 및 환원 SDS-PAGE 젤에서 분석하였다. UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 항 -UCH-L1 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4k는 세포에 다양한 농도의 H202를 1시간 동안 37°C에서 처리하고, 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다;
UCH-L1는 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 41는 K15/157R NHJCH-L1를 발현하는 HeLa 세포에 10 μΜ CCCP를， MG132가 있거나 없이 , 6시간 동안 처리한 결과를 나타낸 도이다 ;
세포를 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석하였고， 항 -myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 5는 C90/132S NT-UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 비교를 나타낸 도이다.
도 5a는 재조합 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 이 의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다 .
도 5b는 재조합 NT-UCH-L1의 대표적인 이 황화 결합의 영 역을 나타낸다. 도 5c는 UCH-L1 3D 구조의 시스테인 잔기를 나타낸 도이다.
도 5d는 재조합 UCH-Ll, NT-UCH-L1 및 이의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다.
도 5e UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc 및 C90/132S NT-UCH-Ll-myc을 일시 적으로 발현하는 HeLa 세포를 항 -myc 항체 및 Alexa Fluor 488 2차 항체 (녹색 )으로 가시화한 결과를 나타낸 도이다 ;
붉은색 : Mitotracker® ; 및
파란색 : DAPI .
도 5f는 C0 NT-UCH-Ll-myc를 일시 적으로 발현하는 HeLa 세포를 나타낸다. 도 는 UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc , C90/132S NT-UCH-Ll-myc 및 C0 NT-UCH- Ll-myc (모든 시스테인이 세린으로 대체된)을 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 10 ^g/ml CHX으로 제시된 시간 동안 처리하고， 항 -myc 항체 및 GAPDH 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 NT-UCH— L1가 세포내 R0S 수준을 감소시키고 , 미토콘드리아 손상 시약으로부터 세포를 보호하는 것을 나타낸 도이다 .
도 6a는 DMS0 또는 10 μ Μ CCCP가 처리된 UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 나타낸 도이다;
세포를 CM- DCFDA로 염색하였고， FACS 분석기를 이용하여 세포내 활성산소종 수준을 분석하였다.
도 6b UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 DMS0, 25 y M 또는 50 μ Μ CCCP로 처리하였을 때， 세포 생장을 실시간 세포 분석기를 이용하여 관측한 것을 나타낸 도이다; 값은 평균 土 SD로 나타낸다.
도 6c는 NT-UCH-L1의 기능의 도해를 나타낸다 ;
NT-UCH-L1는 미토콘드리아에 있는 반면 , Ub-NT-UCH-Ll는 세포질에 있다. Ub-NT-UCH-Ll 및 NT-UCH-L1는 평형 상태에 있다 (①) . 용해성 NT-UCH-L1가 감소되면 , ub-NT-UCH-Ll는 디유비퀴틴화 (deub juit inated)된다. 또한, 새로이 합성된 NT-UCH-L1는 손실을 채우고， 충분한 NT-UCH-L1이 사용가능해졌을 때 , Ub- NT-UCH-Ll이 발생된다 . NT-UCH-L1의 양이 상기 포화수준 이상으로 증가할 때나 미토콘드리아가 스트레스를 받았을 때， 우선적으로 Cys90 및 Cysl32를 포함하는 분자내 이 황화 결합을 통해 응집한다(②) . NT-UCH-L1이 불용성이 되면， 용해성 분획물로 돌아가지 않는 것으로 보인다. 미토콘드리아안의 상기 웅집 체는 프로테아좀에 의해 분해된다 (③) . NT-UCH-L1는 정상 상태에서 프로테아좀에 의해 분해된다(④) .
도 6d는 UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMS0, 10 nM, 100 nM 또는 1 μ Μ 로테논 (rotenone)을 처리하 였을 때 결과를 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형 태】
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -Ll(N-terminal
Truncated Ubiquit in C-terminal hydro lase-Ll, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다 .
또한， 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터 , 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 NT-UCH-L1 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 NT-UCH-L1 단백질의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (nucleot ide database)에 등록된바 있고 (PGP9.5, accession number X04741), 이 증 cDNA 부분은 '32번째에서 670번까지이며 이는 본 명세서에서 서열번호 1로 기재된다.
상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스， 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스， 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한， 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계 ;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계 ; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏 (Western blotting), 효소-면역화학 검출법 (Enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법 (i画 unohistochemical staining) , 면역침강 (immunoprecipitation) 및 면역형광법 (i讓 unofhiorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
또한， 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계 ;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계 ;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다 . 또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 파킨슨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료방법을 제공한다 . 또한， 본 발명은 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도를 제공한다.
아울러， 본 발명은 파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도를 제공한다. 본 발명의 구체적인 실시 예에서， NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였을 때 , 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟 (spot )이 확인되었으며 , 스팟 1 및 3(도 lb 왼쪽 위 패널 참조)을 잘랐고 , MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 (f ingerprint ing) 및 nanoUPLOESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 (mass spectroscopic , MS) 방법으로 이들을 분석하였다 . 스팟 1이 스팟 3(도 Id)에서 제시되는 펩티드 ¾QLKPMEINPEMLNK15( 1815.9144 Da) (도 lc 참조)가 부족하였으나， 펩티드 서 열분석으로 입증함으로써 (도 If 참조) 새로운 펩티드 12MLNK15( 505.2905 Da) (도 le 참조)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면， 스팟 1은 NT-UCH-L1이 었다 (N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1) . 또한， 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다 (도 lb 오른쪽 패널 참조) . 결실된 부위는 UCH-L1 유전자 (PARK5)의 엑손 l(exon 1)에 해당하였다 (도 lg 참조) . 상기 결실된 11 개 아미노산의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (nucleot ide database)에 등록된바 있다 (PGP9.5, accession number X04741) .
또한 , UCH-L1의 유비퀴틴 (ubiquit in) 가수분해 효소 활성 능력 및 암세포 침입을 증가시키는 능력을 NT-UCH-L1이 가지는지 확인하였을 때， NT-UCH-L1은 불활성화였고 (도 lh) , 암세포 침 입 증가 능력을 가지지 않음을 확인하였다 (도 lj 참조) .
UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비 교하고자， 수소-중수소 교환을 이용하였을 때， 수소-중수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나， 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다 (도 lk 및 11 참조) . 이 것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였을때 (도 lm 참조)， UCH-L1보다 NT-UCH-L1의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어난 것을 확인하였다. NT-UCH-L1의 시스테인 ' 활성 부위 (82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다 (도 In 참조) .
NT-UCH-L1의 Lysl5 또는 Lysl57에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자, 면역침강을 수행하였다 . 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를， 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다 (도 2a 화살표 참조) . 이 것을 면역 침강으로 확인하였다 (도 2c 오른쪽 패널 화살표 참조) . NT-UCH-L1 (도 2a 화살표 참조)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다 (도 2b 참조) . NT-UCH-Ll-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에， 항 -myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다 (도 2c 왼쪽 패널 , 세 번째 레인 참조) . 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NT-UCH-Ll(Ub-NT-UCH-Ll)로 확인한 (도 2c 오른쪽 패널 참조) 반면， 탐지된 상기 회미 한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1 (도 2c 왼쪽 패널， 두 번째 레인 참조)이었다.
또한 , 모노유비퀴틴화된 리신 ( lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여 , 펩티드 서 열분석 및 돌연변이 연구를 병 행하였다 . 면역침강된 Ub-NT-UCH-Ll는 tandem MS로 펩티드 서뎔분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때, 114.04 Da의 증가 (유비퀴틴의 C-말단 Gly-Gly)가 있다. N JCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며， Lysl5에서 후보 유비퀴틴화 (ubiquitination) 부위를 설정하였다 (도 2d 참조). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, 15/157R및 K60/157R를 구축하였고, 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석 (도 2e 참조) 및 면역침강 (도 2f 참조)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-Ll의 두 개의 개체군이 있으며， 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고， 다른 하나는 K157에 되지만 둘 다는 아닌 것을 제시한다.
미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은， 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것， 또는미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에, 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. HeLa 세포에서， UCH-Ll-myc은 세포질에 주로 분포하였으나， NT-UCH-Ll-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포한였으며, 15/157R NT-UCH-L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다 (도 3a 참조). 이러한 분포를 He 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아 분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다 (도 3b 참조).
NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 그 결과， 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R NT-UCH-L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을주지 않는 것을 확인하였다 (도 3d 참조).
Ub-NT-UCH-Ll의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa세포에 열 층격을 수행하였고, 37°C에서 회복하였을 때， 열 층격 회복동안에 사라지는 불용성 NT-UCH-L1을 유도하였다 (도 3e 참조). 단백질 합성 저해제 사이클로핵사마이드 (cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에， 상기 불용성 NT-UCH-L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다 (도 3f 참조). 용해성 NT-UCH- L1이 감소할 때에， Ub-NT-UCH-Ll이 이를 보층한다. NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고， 그 후에 Ub-NT-UCH-Ll은 NT- UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서， Ub-NT-UCH-Ll이 NT-UCH-L1가 감소될 때， NT- UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다.
NT-UCH-L1를 일시 적으로 발현하거나， 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서 NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다 . NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽 게 분해되는지 확인하였다. CHX로 단백질 합성을 저해한 후에， UCH-L1 유전자의 메틸레이션 Oiiethyl at ion)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-Ll-tnyc , NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc의 분해 속도를 비교하였다.그 결과, NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다 (도 4a 참조) . 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH— Ll-myc은 Ub-NT-UCH-Ll보다 더 쉽게 사라졌다. NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자， MG132(프로테아좀 분해 (proteasomal degradat ion)의 저해제 )， NH4CK리소좀 분해 ( lysosomal degrada't ion)의 저해제 ) 및 3- 메틸아테닌 (3-methylademne) (3MA, 자식작용의 (autophagy)의 저해제 )를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다 . MG132 처리만이 NCI-H157(도 4c 참조) 뿐만 아니라 HeLa 세포 (도 4d 참조)에서 NT-UCH-L1 및 이 것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다. 따라서 , 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴- 프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 것을 확인하였다.
NT-UCH-L1 웅집 정도를 확인하기 위해 , 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기 재한 바와 같이 제조하였다 (Ardley , H .C . et al . , Mo I Biol Cell 14 , 4541-4556(2003) ) . 그 결과， MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때， NT-UCH-L1 및 그것의 K15 57R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고， 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다 (도 4e 참조) . MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-Ll은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다 (도 4e 중간 패널 참조) . 이 것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화 -결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다 (도 4e 아래 패널 참조) . 또한， 이 것은 NCI-H157 세포에서 보였다 (도 4f 참조) . 또한, 공초점 현미경을 이용하여 Hela 세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때， UCH-L1은 아니지만， NT-UCH-L1의 웅집은 MG132 처리 후에 증가하였다 (도 4g 참조). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 웅집되고， UCH- L1보다프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가 응집을 저해하는 것을 나타낸다.
신경세포에서 NT-UCH-L1의 웅집 현상을 설명하기 위해서， MG132없이, UCH- L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면, 일시적으로 발현하는 NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1의 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다 (도 4h 참조). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다 (도 4i 참조). 이것은 블용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고， 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아을러， 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 웅집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-LKS-S NT)을 포함하였다 (도 4i 참조).
다양한 UCH-Ll-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드 (plasmid)를
BL2KDE3)에 형질전환하였고, 생장시킨 후상기 재조합 단백질을 Superdex 200, HR 10/30 (GE Healthcare)에서 분리하였고， 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 그 결과， FPLC에서， NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면, 재조합 UCH-L1은 주로 단량체 (약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다 (도 4j 참조). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 응집체를 나타낸다.
세포가 스트레스를 받을 때， NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정올 시험하기 위해， HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소 (¾ )를 1 시간 동안 처리하였고, 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다 (도 4k 참조). UCH-L1은 웅집체를 형성하지 않았으나, NT-XH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 ¾02 를 0.5 m 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다. 또한， 이러한 웅집이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 야기되는 것을 확인하였다. CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-Ll의 분해를 유도하였다 (도 3b 및 도 3c 참조) . NT-UCH-L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고， 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였을 때， CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다 (도 41 아래 패널 레인 4 참조) . 종합하면， 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다 .
Cys90 및 Cysl32에서 Ser으로 돌연변이가 NT-UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고， NT-UCH-L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를, 포함하는 6개 시스테인 (cysteine) 잔기를 가지며 , 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다 (도 5a 레인 1 참조) . 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC- ESI-q-TOF tandem MS를 병 행하여 적용하여， NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나， Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다 (표 1 및 도 5b 참조) . Cysl32는 이를 포함하는 모든 5 개의 시스테인과 이황화 결합을 형성하였다 (도 5c 참조) . Cys 132 및 Cysl52은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기 이다. NT- UCH-Ll(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며， 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 웅집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다 (도 5a) . 돌연변이 C90S는 적은 폴리머 (polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다 (도 5a 화살표 참조) . 이 러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다 (도 5d 참조) .
NT-UCH-Ll C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다 . 일시 적으로 NT-UCH-Ll-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역 염색하였고, 공초점 현미경으로 가시화하였다 (도 5e 참조) . 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때， UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며， NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cysl32이 미토콘드리아 분포에 중요한 것인지를 확인하고자， 모든 6 개 시스테인 (cysteines)이 세린 (ser ines)으로 돌연변이 되어 있는 변종 (C0 NT-UCH- Ll)의 분포를 조사하였고 , 응집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다 (도 5f 참조) . 상기 C90/132S NT-UCH- LI의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다 (도 lm 참조) . 이 것은 NT-UCH-L1의 전체적 인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인 (cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다 . 그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-Ll-myc , NT-UCH-Ll-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고， 그들의 반감기를 측정하였다. 도 5g와 같이， NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며， 이는 C90/132S NT- UCH-Ll의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다 .
NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이 것이 산화환원반웅에 민감한 단백질인 것을 제시 한다. 세포내 R0S의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH- Ll의 분포는 R0S의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한 잠재력 있는 역할을 제시한다. NT-UCH-L1가 세포내 R0S 수준에 영향을 주는지 확인한 결과， NT-UCH-L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH-L1 발현에 비해， 세포내 R0S 수준을 감소시켰다 (도 6a 위의 패널 참조) . NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock 또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 R0S 수준을 보였으며 , 이는 NT-UCH-L1가 세포내 R0S 수준을 감소시키는 것을 제시한다.
CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여 , 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다 . CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때， NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하였을 때 , UCH-L1은 아니지 만 , NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포 사멸을 벗어났으므로， NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제시 한다 (도 6b 참조) . 다른 미토콘드리아 손상 시 약 (복합체 저해제 )인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다 (도 6d 참조) .
따라서， UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치하면서 세포 내 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로， 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다 . 이하 , 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명 한다 . 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며， 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> N-말단이 제거된 UCH-L1의 확인
<1-1>세포 배양
인간 NCI-H157(폐암세포주), SH-SY5Y (인간 유래 신경아세포종 세포주) 및 HeLa 세포를 각각 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 페니실린 G(penicillin G)가 있는 RPMI 1640, dulbecco's modified eagle medium 및 mini mum essential medium에서 유지하였다. 세포배양에 쓰인 배지 및 성분은 Invitrogen에서 구입하였다.
<1-2>항체
유비퀴틴 (ubiquitin) Ο말단 가수분해 효소 (Ubiquitin C-terminal hydro lase-Ll, UCH-L1) 및 myc tag의 N-말단 펩티드에 대한 폴리클로날 (Polyclonal) 항체를 AbFrontier, Inc. (한국)에서 제작하였고, 특징화하였다. 다른 항체의 재료는 하기와 같다: 모노클로날 항 -myc 항체 (MilHpore), 폴리클로날 항 -UCH-L1 항체 (Chemicon), 항-유비퀴틴 (ubiquitin) 항체 (Chemicon)， flag-항체 (M2) (Sigma)， 항-튜불린 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), 염소 항-마우스 항체 (Molecular Probes) .
<1-3> 2D젤 전기영동 (2D gel electrophoresis)
기존에 기재된 바와 같이 2D 젤 전기영동을 수행하였다 (Jeong, J. et al. Mol Cell Protean ics 10,(2011)). 요약하면, 세포를 9.5 M 요소 (urea), 2% TritonX-100, 5% β머캅토에탄올 ( ptneixaptoethano , 1.6% 파말라이트 5- 7(pharmalyte 5-7), 0.4% 파말라이트 3-10(pharmalyte 3-10), 50 mM DTT, 단백질 분해 효소 저해제 흔합제 (protease inhibitor cocktail) 및 5 mM Na3V04이 포함된 완충액에 용해하였다. 단백질을 I麵 obline Drystrip 4-7 linear gels(GE Healthcare)에서 일렉트로포커스 (electrofocuse)하였다. 평형 후에 (50 mM tris(pH 8.8), 6 M 요소 (urea) 2% SDS, 30% 글리세를 (glycerol)， 스트립을 11% 2차원 SDS- PAGE 평판 젤에 두었고, 단백질을 분석하였다.
<1-4>질량분광분석 (Mass spectrometry, MS)
기존에 밝혀진 UCH-L1의 몇개의 변종 (Strausberg, R.L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99， 16899-16903(2002) (도 la)외에 다른 변종이 있는지 확인하고자 상기 실시예 <1-3>에서 준비한 단백질 젤 스팟 (spot)을 분리하였고, 이를 트립신 (trypsin)으로 소화시켰으며， 상기 결과 펩티드를 Jeong, J. et al., Mol Cell Protean ics 10, MHO 000513(2011)， Seo, J. et al. J Proteome Res 7, 587-602(2008), 및 Lee, E. et al., PLoS one 4, e7949(2009)에 기재한 바와 같이 분석하였다. 소화된 펩티드를 nanoacquity UPLC™ESI/MS(SYNAPT™HDMS™Waters)로 분석하였다. 통합된 electrospray ionization PicoTip™ (土 10 μ(η, New Objective)가 있는 C18 reversed— phase 75 μπι ID x 150 mm analytical column(1.7 μιη particle size, BEH130 C18, Waters)를 이용하여 펩티드를 분리하였다. 7 id 펩티드 (peptide) 흔합물을 완충액 A(물 /포름산 (formic acid); 100:0.1， v/v)에 용해하였고， 컬럼 (column)에 주입하였으며, 5-80 % 완충액 B (아세토니트릴 (acetonitril)/포름산; 100:0.1， v/v)의 선형 경사도로 120분 이상 용출하였다. 시료를 trap column cartridge(ID 180 μπι x 20 mm, Sy議 etry® C18, Waters)로 분리 전에 탈염하였다. 초기에， 상기 흐름 속도는 300 nl/분으로 설정하였고, 상기 모세관 전압 (capillary voltage) (2.5 keV)를 분사 전에 LC 이동상으로 적용하였다. 크로마토그래피 (Chromatography)를 MS에 일렬로 수행하였다.. 효율적인 데이터 의존적인 수득을 위한 MS 한도 (parameter)는 질량분광분석부터 MS/MS까지로 전환되는 10개 및 3 개 요소 이상의 강도였다. 상기 개별적인 MS/MS 범위를 Micromass ProteinLynx Global Server (PLGSTM) 2.1 data processing 소프트웨어 및 단독 MASCOT-searchable 정점 목록 (peak list)(.pkl) 파일과 같은 결과로 단독 LC 운용올 조합하고, 매끄럽게" 하였고， 디아이소토프 (deisotoped)하였고, 센트로이드 (centroided)하여 각 전구체로부터 수득하였다. 상기 정점 목록 파일을 MASC0T(global search engine)를 사용하여， SwissProt database에 의문을 제기하는데 하기 변수와 함께 사용하였다: 펩티드 질량 관용， 0.2 Da; MS/MS 이온 질량 관용， 0.2 Da; 1까지 손실된 트립신 분해 부위 허용; 아세틸레이션 (acetylation), 디아미데이션 (deamidation), 피로- 글루 (pyro-ghi)(N-term E, Q), 산화 (oxidat ion) , 포르밀화 (formylat ion) , 인산화 (phosphorylation), 카바미도메틸 (carbamidomethyl) 및 시스테인 프로피온아미드 (cysteine propionamide)와 같은 다양한 수식을 고려하였지만, 수식을 고정하지 않았고; 효소를 트립신으로 한정하지 않았으며; 분류학 (toxonomy)을 마우스로 한정하지 않았다. 모든 보고된 과제는 MASCOT로부터 범위의 자동적 및 수동적 해석으로 확인하였다.
그 결과， NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 불랏 분석을 수행하였을 때， 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟 (spot)이 확인되었다. 상기 대웅하는 은이 염색된 2D 젤 (도 lb 왼쪽 증간 패널)로부터 스팟 1 및 3을 (도 lb 왼쪽 위 패널) 잘랐고， MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 (fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 (mass spectroscopic, MS) 방법으로 이들을 분석하였다. 스팟 1이 스팟 3(도 Id)에서 제시되는 펩티드 ¾}υίΡΜΕΙΝΡΕΜίΝΚ15(1815.9144 Da) (도 lc)가 부족하였으나, 펩티드 서열분석으로 입증함으로써 (도 If) 새로운 펩티드 12MLN 15( 505.2905 Da) (도 le)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면， 스팟 1은 NT-UCH-L1이었다 (N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1) . 제거된 구조를 확인하고자， 상기 합성 펩티드 ¾QLKPMEINPEU에 대한토끼 항체를 얻어냈다. 스팟 1이 N-말단 펩티드에 대한 항체로 탐지될 수 없는 것을 확인하였다 (도 lb 왼쪽 바닥 패널). 또한， 인간신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다 (도 lb 오른쪽 패널). 결실된 부위는 UCH-L1 유전자 (PARK5)의 액손 Kexon 1)에 해당하였다 (도 lg). 상기 11 개 아미노산이 결실된 단백질의 mRNA은 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (nucleotide database)에 등록된 바있다 (PGP9.5, accession number X04741).
<실시예 2> UCH-L1을발현하는 안정화된 세포주의 수립
UCH-L1 및 NT-UCH-L1 야생형 유전자 발현을 위한 렌티바이러스 백터를 Lent i Ml.4 백터의 Xba I-EcoR V 부위로 PCR 유전자 단편을 도입함으로써 구축하였다. 기존에 기재된 바와 같이 위형 렌티바이러스를 제작하였고, UCH-L1의 안정한 발현을 위해 사용하였다 (Dull, T. et al., J Virol 72， 8463-8471(1998) 및 Follenzi, A. , Ailles, L.E., Bakovic, S. , Geuna, M. & Naldini, L. , Nat Genet 25, 217-222(2000)). <실시예 3> UCH-L1 및 NT-UCH-L1활성의 측정
상기 유비퀴틴 -C-말단 가수분해 효소 활성을 유비퀴틴 -C-말단 7-아미도 -4- 메틸쿠마린 ( ub i qu i U n-C-t erm i na 1 7— am i do-4-methy 1 coumar i n , Ub—AMC) (AG scientific)를 사용하껴 기존에 기재된 바와 같이 측정하였다 (Kim, H.J. et al., Oncogene 28, 117-127(2009)).
그 결과, NT-UCH— LI은 유비퀴틴 (ubiquitin) 가수분해 효소 활성 능력을 가지지 않는 것을 확인하였다. NT-UCH-L1이 UCH-L1 효소 활성을 나타내는지 시험하기 위해, 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1로 유비퀴틴 (ubiquitin)-AMC 유래 가수분해적 방출된 형광을 비교하였다. NT-UCH-L1는 불활성화였다 (도 lh). 이것은 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역침강된 Flag-UCH-Ll 및 Flag-NT-UCH- L1의 가수 분해 효소 활성을 비교함으로써 확인하였다. Flag-UCH-Ll은 가수 분해 효소 활성을 나타냈지만, Flag-NT-UCH-Ll은 나타내지 않았다 (도 li).
<실시예 4>세포 이동분석을통한 ΝΓ-UCH-Ll의 암세포 침입 능력 확인
세포 이동 분석을 24-웰 케모텍시스 챔버 트랜스웰 (24-well chemotaxis chamber transwel 1 )(Corning, NY) 및 마트리젤 (matrigel)(Matrigel™ basement membrane matrix, BD Bioscience)을 이용하여 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Kim, H.J. et al., Oncogene 28, 117-127(2009)).
그 결과, NT-UCH-L1는 암세포 침입을 증가시키는 UCH-L1의 능력을 가지지 않음을 확인하였다 (도 lj).
<실시예 5> 수소 / 중수소 교환 (Hydrogen/Deuterium exchange, HDX)을 이용한 T- UCH-L1의 3차구조 확인
UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비교하기 위해， 단백질 구조의 동역학 및 변화를 특징화하기 위한 유용한 도구인 수소 /중수소 교환 (hydrogen/deuterium exchange, HDX)을 이용하였다. 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-Ll를 증수소 (D20)에서 다양한 시간으로 배양하였고, 온전한 단백질을 tandem MS를 이용하여 분석하였다. 구체적으로， UCH-Ll, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1 (약 1 를 10배 표지 완층액 ( 0 안의 20 mM PBS, H 7.4)으로 회석하였고， 몇몇의 시간의 척도 동안 25°C에서 유지하였다. 상기 표지 반웅을 25 mM 시트르산삼나트륨 (tr isodium citrate)/25 mM 디소듐 숙신산 완층액 (disodiutn succinate buffer), pH 2.3로 캔치 (quenche)하였다 (이것은 포름산으로 적정하였다). 펩신 소화를 위해, 돼지 펩신 (1 / βί)을 각 캔치된 단백질 시료에 첨가하였고, 주입 후에 0°C에서 3분 동안 배양하였다 (Hoofnagle, A.N. , Resing, K.A. & Ahn, N.G. , Methods Mol Biol 250， 283-298(2004) 및 Lee, T., Hoofnagle et al. , J Mol Biol 353, 600- 612(2005)). 펩신 펩티드를 기존에 기재된 바와 같이 탈염하였고， 분리하였다 (Jeong, J. et al., Mol Cell Proteomics 10， MHO 000513(2011)). autosampler chamber를 5°C로 설정하였다. 증수소 역-교환을 최소화하기 위해 트랩 (trap), 분석 컬럼 및 모든 배관을 얼음 배스 (bath)에 두었다. 이동상 (mobile phase) 병 둘 다를 얼음에 두었고， 이동상 들 다는 0.1% FA를 포함하였다. 상기 경사도 크로마토그래피를 0.6 분의 흐름 속도에서 수행하였고, nanoAcqu i ty™/ES I /MS ( SYNAPT™ HDMS™, Waters)로 일렬로 분사하였다. 모든 질량 범위 측정을 모세관 전압 (capillary voltage) 2.5 kV, 콘 전압 (cone voltage) 35 V 추출 콘 전압 (extract ion cone voltage) 4.0 V， 재료 온도 80°C에서 수행하였다. T0F mode scan을 ml z 300- 1500의 범위에서 1초의 스캔 시간으로 수행하였다.
그 결과， 수소-증수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나, 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다 (도 lk 및 11). 이것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였다 (도 lm). UCH-Ll보다 NT-UCH-Ll의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어났다. NT-UCH-L1의 시스테인 활성 부위 (82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다 (도 In).
<실시예 6> NT-UCH-L1의 Lysl5또는 Lysl57에서 모노유비퀴틴화 확인 NT-UCH-L1의 Lysl5 또는 Lysl57에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자， 면역침강을 수행하였다ᅳ 세포를 면역침강 완층액 (50 mM Tris-HCl, pH7.4, 50 mMNaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 /ml 아프로티닌(31)1ᅳ01:^10)， 10 g/ml 류펩틴 (leupeptin), 10 tg/ml 펩스타틴 (pepstat in)， 1 mM Na3V04, 0.5% NP-40)으로 용해하였다. 용해물을 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고， 상기 상층액을 3시간 동안 4'C에서 단백질 G 세파로오스 비드 (protein G sepharose beads)에 가교결합된 항 -flag 또는 항 -myc 항체와 함께 배양하였다. 비드를 면역침강 완층액으로 3회 세척하였고, 결합된 단백질을 젤 시료 완충액 (62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 10%(w/v) glycerol, 5% β머캅토에탄올， 2.3% SDS)으로 용출하였고， SDS- PAGE로 분리하였다. 일시적으로 UCH-Ll-myc 및 NT-UCH-Ll-myc를 발현하는 NCI- H157 세포 유래 용해물에 항ᅳ myc 항체를 처리하였고， 결과로 초래되는 면역침강을 분석하였다. UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc 및 몇몇의 다른 밴드를 탐지하였고ᅳ tandem MS로 그들을 확인하였다.
그 결과, 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를， 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다 (도 2a 화살표). 이것을 면역침강으로 확인하였다 (도 2c 오른쪽 패널 화살표 머리). NT-UCH-L1 (도 2a화살표)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다 (도 2b). NT-UCH-Ll-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에， 항— myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다 (도 2c 왼쪽 패널， 세 번째 레인). 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NTᅳ UCH-Ll(Ub-NT-UCH-Ll)로 확인한 (도 2c 오른쪽 패널) 반면, 탐지된 상기 희미한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1 (도 2c 왼쪽 패널, 두 번째 레인)이었다.
또한， 모노유비퀴틴화된 리신 (lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여， 펩티드 서열분석 및 돌연변이 연구를 병행하였다. 면역침강된 Ub-NT-UCH-Ll는 tandem MS로 펩티드 서열분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때， 114.04 Da의 증가 (유비퀴틴의 Ο말단 Gly-Gly)가 있다. NT-UCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며, Lysl5에서 후보 유비퀴틴화 (ubiquitination) 부위를 설정하였다 (도 2d). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, K15/157R 및 K60/157R를 구축하였고， 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석 (도 2e) 및 면역침강 (도 2f)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT- UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-Ll의 두 개의 개체군이 있으며， 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고, 다른 하나는 K157에 되지만둘 다는 아닌 것을 제시한다.
<실시예 7> Ub-NT-UCH-Ll및 NT-UCH-L1의 세포 내 위치 확인
<7-1> 면역조직화학염색 및 공초점 현미경을 이용한 Ulr T-UCH-Ll 및 T- UCH-L1의 세포 내 위치 확인
미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은， 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것， 또는 미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에， 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. 세포를 Secureslip™ cell culture cover slip(Gracebiolab)에서 생장시켰다. 세포를 HBSS에서 250 nM of MitoTracker® Red 580와 함께 37°C에서 30분 동안 배양하였고, 4¾ 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 10분 동안상온에서 고정하였다. 침투화를 0.1% Triton Χ-100 HBSS에서 15분 동안 상온에서 수행하였다. 세포는 불특정 단백질의 흡착을 차단하기 위해 3¾> BSA, 0.2% Tween 20 및 0.2% 젤라틴 (gelatin) PBS로 1시간 동안 상온에서 처리하였다. 세포를 1% BSA 및 1% 수크로스 (sucrose)를포함하는 HBSS에 1:250으로 희석된 모노클로날 항 -myc 항체와 함께 1시간 동안 37°C에서 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후， 세포를 1:50으로 희석된 Alexa Fluor 488이 접합된 염소 항 마우스 IgG 와 함께 1시간 동안 37°C에서 배양하였다. 세포를 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경하에서 분석하였다. 또한, 미토콘드리아 표적화를 예측하는 프로그램인 Predotar 및 MitoProt Π-vl.lOl를 적용하였다.
그 결과, HeLa 세포에서， UCH-Ll-myc은 세포질에 주로 분포하였으나, NT- UCH-Ll-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포하였으며， K15/157R NT-UCH- L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다 (도 3a). 이러한 분포를 HeLa 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다 (도 3b). UCH-Ll 유래 11개의 N-말단 아미노산의 결실은 미토콘드리아표적화 가능성을 증가시켰다: UCH-L1 및 NT-UCH-L1에 대한 각각 Predotar에서 0.00 및 0.41 및 MitoProt II에서 0.1032 및 0.4606의 예측 점수.
<7-2>미토콘드리아분획물의 제조
NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 세포의 미토콘드리아 분획물을 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다 (Shim, J.H. et a/., Mitochondrion 11， 707-715(2011)). 세포를 단백질 분해효소 저해제 흔합물 및 10 mM NEM로 보충된 10 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 부유하였고， 게이지 바늘을 통해 20회 통과시켰다. 차가운 1.5 M 수크로스용액 40≠를 첨가한 후, 600 X g에서 10분 동안 원심분리 후에, 상기 상층액을 14,000 g 에서 10분 동안 원심분리하였고, 동일 부피의 2x ¾ 시료 완충액과 함께 흔합하였다. 상기 미토콘드리아 분획물을 포함하는 펠렛을 50 fd 10 mM Tris-HCl, PH 7.5으로 2회 세척하였고， 30 ≠ 2x 젤 시료 완충액에서 용해하였다. 젤 시료 완층액 안의 동일 부피의 상기 상충액 및 젤 시료 완층액 혼합물 및 미토콘드리아 분획물을 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.
그 결과， NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R NT-UCH-L1 둘 다 세포질 또는 미토콘드리아분획물에서 각각 6시간 이내에 사라졌으나， UCH-L1의 수준은 변하지 않았다 (도 3b). CCCP는 프로테아좀 (proteasome)에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다 (도 3c). 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R N HJCH—L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을주지 않는 것을 확인하였다 (도 3d).
<실시예 8>모노유비퀴틴화된 형태 (Monoubiquitinated form)가용해성 T-UOW 의 저장소인 것을 확인
Ub-NT-UCH-Ll의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-Ll-myc를 안정하게 발현하는 HeLa세포에 45°C에서 30 분 동안 열 층격을 수행하였고， 37°C에서 회복하였다. 그 결과, 열 층격은 회복 동안에 사라지는 블용성 NT-UCH-L1을 유도하였다 (도 3e). 단백질 합성 저해제 사이클로핵사마이드 (cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에， 상기 블용성 NT-UCH- L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다 (도 3f ) . 용해성 NT-UCH-L1이 감소할 때에 , Ub-NT-UCH-Ll이 이를 보층한다 . NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고 , 그 후에 Ub-NT-UCH-Ll은 NT-UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서， Ub- NT-UCH-Ll이 NT-UCH-L1가 감소될 때， NT-UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다.
<실시예 9> NT-UCH-L1의 전환 정도 확인
NT-UCH-L1를 일시 적으로 발현하거나， 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서
NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다 . NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽 게 분해되는지 확인하였다 . CHX로 단백질 합성을 저해한 후에， UCH-L1 유전자의 메틸레이션 (methyl at ion)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-Ll-tnyc , NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc의 분해 속도를 비교하였다 .
그 결과， NT-UCH-Ll-myc 및 K15/157R NT-UCH-Ll-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다 (도 4a) . 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH-Ll- myc은 Ub-NT-UCH-Ll보다 더 쉽게 사라졌다. 또한， 내생의 UCH-L1를 상당히 발현하는 NCI-H157 세포에서 이러 한 분해 패턴을 보였다 (도 4b) . NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자， MG132(프로테아좀 분해 (proteasomal degradat ion)의 저해제 ) , NH4CK리소좀 분해 ( lysosomal degradat ion)의 저해제 ) 및 3-메틸아데닌 (3-methyl adenine) (3MA, 자식작용의 (autophagy)의 저해제 )를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다. MG132 처 리만이 NCI-H157(도 4c) 뿐만 아니라 HeLa 세포 (도 4d)에서 NT-UCH-L1 및 이 것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다 . 따라서， 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴- 프로테아좀 시스템에 의해 분해된다.
<실시예 10> NT-UCH-L1 웅집 정도 확인
<10-1> 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다 (Ardley, H.C. et al., Mo J Biol Cell 14， 4541-4556(2003)). 요약하면， 100 mm 세포 배양 플레이트의 세포를 500 ≠ RIPA 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 1 (ν/ν) NP-40, 0.5%(wt/vol) 소듐데옥시콜레이트 (sodium deoxycholate) 및 0.1%(wt/vol) SDS, 단백질 분해 효소 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktai 1 )(sigma) , 10 mM NEM)에 26.5-게이지 (gauge) 바늘을 통해 10회 통과함으로써 용해하였다. 12,000 X g에서 20 분 동안 원심분리 후에， 펠렛 (pel let)을 200 μΐ 젤 시료 완층액에서 재부유하였다. 상기 상층액을 2χ ¾ 시료 완층액의 동일 부피와 함께 혼합하였고， 10% SDS-PAGE에서 각 분획물의 20 ^을 분석하였다. MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때, HeLa 세포를 MG132로 처리하였고, 세제로 용해성 (soluble, S) 및 불용성 (insoluble, I) 분획물로 분리하였다.
그 결과, NT-UCH-L1 및 그것의 K15/157R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고, 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다 (도 4e). MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-Ll은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다 (도 4e 중간 패널). 이것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화 -결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다 (도 4e 아래 패널). 또한， 이것은 NCI-H157세포에서 보였다 (도 4f). 또한， 공초점 현미경을 이용하여 Hela세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때, UCH-L1은 아니지만， NT- UCH-L1의 응집은 MG132 처리 후에 증가하였다 (도 4g). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 웅집되고， UCH— L1보다 프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가웅집을 저해하는 것을 나타낸다.
신경세포에서 NT-UCH-L1의 웅집 현상을 설명하기 위해서， MG132없이, UCH- L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면， NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH- L1이 일시적으로 발현하는 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다 (도 4h). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다 (도 4i). 이것은 블용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고, 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아을러， 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 웅집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-L S-S NT)을 포함하였다 (도 4i).
<10-2>재조합단백질의 제조, 그들의 분리 및 FPLC
다양한 UCH-Ll-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드 (plasmid)를 BL2KDE3)에 형질전환하였고， 0D가 600 nm에서 0.6 ~ 0.8에 도달할 때까지 37°C에서 생장시켰다. 단백질의 도입을 위해， 세포를 IPTG와 함께 25°C에서 2시간 동안 배양하였고， 수확하였으며， 용해 완층액 (0.16 mg/ml 리소자임 (lysozyme)이 있는 PBS, 0.1% Triton Χ-100, 2 ug/ml 아프로티닌 (aprotinin), 1 mM PMSF, 10 raM 이미다졸 (imidazole))에서 30분 동안 얼음에서 용해하였다. 상기 세포 용해물을 65,000 rpm, 4°C에서 1시간 동안 원심분리하였고， 상층액을 Ni-NTA-agarose beads column(Qiagen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 Superdex 200， HR 10/30CGE Healthcare)에서 분리하였고， 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE상에서 분석하였다.
그 결과, FPLC에서， NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면， 재조합 UCH-L1은 주로 단량체 (약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다 (도 4j). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 웅집체를 나타낸다.
<실시예 11>산화적 및 미토콘드리아스트레스의 NT-UCH-L1내의 이황화가교결합 유도확인
세포가 스트레스를 받을 때, NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 시험하기 위해, HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소 (¾02)를 1 시간 동안 처리하였고， 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다 (도 4k). UCH-L1은 응집체를 형성하지 않았으나, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 ¾02 를 0.5 mM 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다 . 또한， 이 러한 웅집 이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반웅으로 야기되는 것을 확인하였다.
CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다 (도 3b 및 도 3c) . NT-UCH- L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고 , 환원 조건에서 SDS- PAGE로 분석하였을 때 , CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다 (도 41 아래 패널 레인 4) . 하지만， 비환원 상태에서 , NT-UCH-L1은 유지하였으나， 이의 원래 위치가 아니지만 (위 패널 화살표)， 대신에 더 높은 분자량 범위에 분산되었으며， 이는 프로테아좀 분석 전에 이황화 가교결합된 다량체를 형성하는 것을 제시한다 . 종합하면， 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다 .
<실시예 12> Cys90 및 Cysl32에서 Ser으로 돌연변이가 OT-UCH-L1의 용해성에 주는 영향 확인
Cys90 및 Cysl32에서 Ser으로 돌연변이는 NT— UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고 , NT-UCH— L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를 포함하는 6 시스테인 (cysteine) 잔기를 가지며， 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다 (도 5a 레인 1) . 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC-ESI-q- TOF tandem MS를 병 행하여 적용하여 , NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나， Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다 (표 1 및 도 5b) . Cysl32는 이를 포함하는 모든 5 개의 사스테인과 이황화 결합을 형성하였다 (도 5c) . Cys 132 및 Cysl52은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기이다. NT-UCH- Ll(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며， 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 웅집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다 (도 5a) . 돌연변이 C90S는 적은 폴리머 (polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다 (도 5a 화살표) . 이러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다 (도 5d) .
【표 1】 ' No. of matched
disulfide bonds peptide Peptides with disulfide bonds
fragments
C90-C132 2 aTIGNSGGTIGLIHAVANNQD -CFEK
C90-C201 4 QTIGNSCGTIGLIHAVAN QD - VCR
G90-C220 2 QTIGNSCGTIGUHAVANNQD - FSAVALCK
C132-C132 1 CFEK-GFE
C132-C152 3 CFEK - NEAIQAAHDAVAQEGQeR
G132-C201 1 AKCFEK -VCR
G132-C220 2 CFE -FSAVALC
1 AKCFEK -FSAVALGK
NEAIQAAHDAVAQEGQCR-
C152-C152 1
NEAIQAAHDAVAQEGQCR
G152-C201 3 NEAIQAAHDAVAQE6QCR - VCR
C152-C220 2 NEAIQAAHDAVAQEGQCR- FSAVALCK
C201-G220 4 VCR- FSAVALCK
1 VCREFTER- FSAVALCK
<실시예 13> T-UCH-L1 C90/132S변종의 분포 위치 및 안정성 확인
NT-UCH-L1 C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다. 일시적으로 NT-UCH-Ll-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역염색하였고， 공초점 현미경으로 가시화하였다 (도 5e). 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때， UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며， NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cysl32이 미토콘드리아 분포에 증요한 것인지를 확인하고자， 모든 6 개 시스테인 (cysteines)이 세린 (serines)으로 돌연변이 되어 있는 변종 (C0 NT-UCH- L1)의 분포를 조사하였고, 웅집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다 (도 5f). 상기 C90/132S NT-UCH-L1의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다 (도 lm). 이것은 NT- UCH-L1의 전체적인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인 (cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다.
그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-Ll-myc, NT-UCH-Ll-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고， 그들의 반감기를 측정하였다. 도 와 같이， NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며, 이는 C90/132S NT-UCH-L1의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다.
<실시예 14> NT-UCH-L1가세포내 R0S수준에 주는 영향확인
NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이것이 산화환원반응에 민감한 단백질인 것을 제시한다. 세포내 R0S의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH- Ll의 분포는 R0S의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한잠재력있는 역할을 제시한다.
NT-UCH-L1가 세포내 R0S 수준에 영향을 주는지 확인하고자， 세포내 R0S를
CM-H2DCFDA(Invitrogen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다. 요약하면, 트립신을 처리한 세포를 세척하였고 0.5 ml HBSS에서 재부유 하였다. 3 μ 0.5 mM CM-¾DCFDA를 첨가하였고 37°C에서 15분 동안 배양하였다. HBSS로 간단히 세척한 후에， 세포를 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)로 분석하였다.
그 결과， NT-UCH— L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH- L1 발현에 비해， 세포내 R0S 수준을 감소시켰다 (도 6a 위의 패널). NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 R0S 수준을 보였으며， 이는 NT-UCH-L1가 세포내 R0S 수준을 감소시키는 것을 제시한다.
<실시예 15> CCCP로유도된 손상으로부터 NT-UCH-L1의 세포보호효과확인
CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여, 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때， NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하고자, 5,000 개의 HeLa 세포를 실시간 세포 분석기인 xCELLigence(Roche Applied Science)를 위해 96-웰 E-플레이트 (E- plate)에 두었다. 24시간 후에, 세포를 0， 10 및 25 μΜ의 CCCP로 처리하였고， 세포 생장을 전기적 전압과 전류의 비 (impedance)로 매 30분 마다 실시간 세포 분석기인 xCELLigence로측정함으로써 관측하였다. 시료는 3회 반복하였다. 그 결과， UCH-L1은 아니지만， NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포사멸을 벗어났으므로， NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상 으로부터 세포를 보호하는 것을 제시한다 (도 6b). 다른 미토콘드리아 손상 시약 (복합체 저해제)인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다 (도 6d).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -Ll(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydro lase-Ll, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항의 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백 터, 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 NT-UCH-L1 단백질은 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성 물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서, 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA또는 재조합 바이 러스성 백터인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5]
제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러 스， 아테노부속 바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스， 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약 학적 조성물.
【청구항 6】
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계 ; 2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계 ; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험 이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 파킨슨 병 진단의 정보를 제 공하기 위한 단백질 검출 방법 .
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏 (Western blott ing) , 효소-면역화학 검출법 (Enzyme一 l inked immunosorbent assay, ELISA) , 면역조직화학 염 색법 ( immunohi stochemical staining) , 면역 침강 ( immunoprecipi tat i on) ¾ 면역 형광법 ( immunof luorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백잘 검출 방법 .
【청구항 8】
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계 ;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처 리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계 를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 9】
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계 ;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성 이 피검 화합물 또는 조성물을 무처 리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별 하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 10]
N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품 .
【청구항 11】
N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 및 개선 방법 .
【청구항 12】
N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1을 파킨슨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료방법 .
【청구항 13】
파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도 .
【청구항 14】
파킨슨병 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위 한 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 -L1의 용도 .
PCT/KR2013/005509 2012-06-22 2013-06-21 N-말단이 제거된 유비퀴틴 c-말단 가수분해효소-l1(nt-uch-l1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 WO2013191509A1 (ko)

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