KR20140000733A - Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20140000733A
KR20140000733A KR1020120067410A KR20120067410A KR20140000733A KR 20140000733 A KR20140000733 A KR 20140000733A KR 1020120067410 A KR1020120067410 A KR 1020120067410A KR 20120067410 A KR20120067410 A KR 20120067410A KR 20140000733 A KR20140000733 A KR 20140000733A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
uch
protein
disease
parkinson
terminal
Prior art date
Application number
KR1020120067410A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101384642B1 (ko
Inventor
이공주
김현정
김희정
정재은
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이화여자대학교 산학협력단 filed Critical 이화여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020120067410A priority Critical patent/KR101384642B1/ko
Priority to PCT/KR2013/005509 priority patent/WO2013191509A1/ko
Publication of KR20140000733A publication Critical patent/KR20140000733A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101384642B1 publication Critical patent/KR101384642B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 N-말단 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)이 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.

Description

Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 Ｃ―말단 가수분해효소―Ｌ１（ＮＴ―ＵＣＨ―Ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition containing N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as a active ingredient for the prevention and treatment of parkinson's disease}
본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
파킨슨병은 퇴행성 신경계 질환 중 두 번째를 차지하는 진행성 질환으로 노인 인구의 증가와 함께 그 발병률이 계속 증가하고 있어서 사회 및 경제적으로 문제가 되고 있는 난치성 질환이다. 현재 전세계적으로 약 4 백만 명이 이 질환에 걸려 있는 것으로 알려져 있으며, 미국의 경우 매년 약 5만 명씩 환자가 증가하고 있는 것으로 파악되고 있다. 발병률은 1천명 중 한 명 꼴로 연령이 높을수록 발생 빈도가 높다. 이 질환의 임상적 특징으로는 운동완서(Bradykinesia), 경직(Rigidity), 자세불안정(Postural instability)과 같은 운동성 이상 증상들과 인지기능장애(cognitive dysfunction), 우울증(Depression), 수면장애(sleep disorder), 통증(pain) 등을 동반하는 비운동성 이상 증상들이 있다(대한민국 공개특허 10-2010-0125843). 파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만, 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다.
이와 같이 파킨슨병은 그 병인이 정확히 알려져 있지 않기 때문에, 근본적인 치료보다 주로 증상개선을 위한 치료방법들이 이용되고 있다. 현재 사용되고 있거나 개발중인 치료제들은 다음과 같다. 가장 많이 개발되어 사용되고 있는 약물로는 도파민 보충제인 레보도파(Levodopa)와 같은 도파민 전구체와 도파민 수용체 효현제(fenofibrate)등이 있다. 그 외에도, 파킨슨병을 치료하기 위하여 사용되고 있는 치료제로는 FDA 허가된 도파민 작용제(Dopamine Agonists), 카테콜-0-메틸트랜스퍼레이즈(catechol-O-methyltransferase inhibitor, COMT inhibitor), 모노아민 산화효소 B(monoamine oxidase B, MAO-B inhibitors), 항-콜린작용제(Anti-cholinergics) 등이 있으며, 뇌신경세포 보호제제, 항산화제, 뇌세포 고사 억제제, 뇌기능 항진제 등을 치료제로 이용하거나 개발하려는 노력들이 계속되고 있다(대한민국 공개특허 10-2010-0097059). 파킨슨병의 치료 기술이나 약물의 신경보호 효과에 대해서는, 파킨슨병의 급성 염증 단계로서 미토콘드리아의 기능 손상과 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인한 세포 사멸에 대한 것이 연구되고 있는 실정이다.
파킨슨병을 유발하는 요인으로서, 노화가 가장 큰 연관이 있는 것으로 알려져 있고, 농약 등과 같은 신경 독소들에 의한 환경적 요인, 활성 산소 그리고 유전적 요인(5-10% 정도) 등이 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전(mitochondria dysfunction)도 파킨슨병 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다(Grunblatt 등, J. Neural Transm. 111: 1543-1573, 2004). 유전적 요인으로는 알파시누클레인(a-synuclein), 파킨(Parkin), UCH-L1(Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1), DJ-1, NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), 신필린-1(Synuclein-alpha-interacting protein, Synphilin-1)등과 같은 유전자 돌연변이와 연관되어 있다고 알려져 있다(Dawson 등, Science 302:819-822, 2003).
UCH-L1 단백질은 유비퀴틴의 C-말단의 유비퀴틸 에스테르(ubiquityl esters)를 가수분해(hydrolyze)하여 단량체(monomer)를 만드는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11:141-148, 2000), 이 유전자의 변이는 93번 위치의 이소루신(Isoleucine) 아미노산이 메티오닌(Methionine) 아미노산으로 변이된 것으로 한 가계에서 이러한 변이가 우성형질로 유전됨이 보고되었다(Leroy 등, Nature 395:451-452, 1998). 그러나, 이와 같은 변이와 관련된 병리학적 데이터(Pathological data)는 아직 보고되지 않고 있다(대한민국 등록특허 10-0644364). 아울러, UCH-L1의 다양한 전사 후 변형, 예를 들면, 리신(lysine) 157에서 모노-유비퀴틴화(Meray, et al, J Biol Chem 282, 10567-10575(2007).), 시스테인(cysteine) 220에서 파르네실화(farnesylation)(Liu, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4635-4640(2009)), 시스테인 220에서 산화(Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264(2004)) 및 시스테인에서 152에서 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2)의 접합(Koharudin, L.M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107, 6835-6840(2010))이 보고된 바 있다.
UCH-L1은 파킨슨 병의 뇌에서 루이 체(Lewy bodies)라고 불리는 단백질 응집체의 구성 성분이며, 이는 UCH-L1 및 파킨슨병 사이에 가능한 연관성을 제시한다(Lowe, J. et al., J Pathol 161, 153-160(1990)). 또한, UCH-L1 변이에 의한 파킨슨병이 보고되었으며, UCH-L1은 유비퀴틴(ubiquitin)과 펩티드(peptide) 사이의 연결을 절단하는 효소로 시험관내에서 유비퀴틴 알데히드(aldehyde)로 이 효소를 억제하였을 때, 도파민성 신경 세포의 사멸과 α-시눌린(α-synulein)로 염색되는 세포질 내 봉입체가 형성된 것이 확인되었다(McNaught KS, et al., J Neurochem 2002;81:301-306). UCH-L1이 특발성 파킨슨병 및 알츠하이머병에서 하향조절되어 있으며, 산화적인 손상과 신경의 유비퀴틴화/디유비퀴틴화 기작 및 산발적인 알츠하이머병 및 파킨슨병 사이의 직접적인 관련성이 제시된 바 있다(Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264(2004)).
또한, 최근에 UCH-L1는 암 전이 및 변형에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 구체적으로, UCH-L1을 이용한 암전이 진단용 조성물 및 이를 이용한 암전이 진단방법, 암전이 억제용 조성물 및 이를 이용한 암전이 억제방법, 암전이 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법이 개발된바 있다(대한민국 등록특허 10-0732298). 상기 UCH-L1은 암전이의 원인적 표적 단백질로서, 이의 발현 정도에 따라 세포이동도가 증가하므로, 이에 대한 모노클로날 항체, N-말단 펩티드에 대한 항체 또는 기질을 이용하여 암전이 진단에 사용할 수 있다. 또한, UCH-L1의 발현 또는 효소활성을 저해함으로써 암전이를 억제할 수 있으므로, UCH-L1의 억제제를 스크리닝하여 개발함으로써 항암치료의 보조제로서 암전이 억제용 약제로서 유용하게 사용될 수 있음을 개진하였다.
이와 같이, UCH-L1는 파킨슨병의 병리 표식자인 루이체의 구성 성분이며, UCH-L1의 활성을 억제하였을 때, 도파민성 신경 세포의 사멸이 진행되는 것이 확인된 바 있고, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)의 염기서열이 밝혀진 바 있으나, NT-UCH-L1의 파킨슨병의 염증단계에서 나타나는 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 생체내 기능은 완전히 밝혀지지 않았다.
따라서, 본 발명자들은 UCH-L1의 N-말단의 일부 아미노산이 제거된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하고, 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 효과를 확인하고자 하였으며, 결과적으로, NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)이 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
도 1은 인간 폐암 및 신경아세포종 세포주에서 NT-UCH-L1의 확인 및 이의 UCH-L1와의 구조 및 효소적 차이점을 나타낸 도이다.
도 1a는 기존에 밝혀진 인간 UCH-L1의 변종을 나타낸 도이다.
도 1b는 NCI-HI57 및 SH-SY5Y 유래 UCH-L를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 상기 도 1b의 스팟 1을 MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 상기 도 1b의 스팟 3을 MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 UCH-L1의 결실된 N말단의 대체된 아미노산을 나타낸 도이다.
도 1f는 UCH-L1의 결실된 N말단을 펩티드 서열분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1g는 UCH-L1의 결실된 N말단이 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하는 것을나타낸 도이다.
도 1h는 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 유비퀴틴 가수분해 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1i는 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역침강된 Flag-UCH-L1 및 Flag-NT-UCH-L1의 가수 분해 효소 활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 1j는 세포 이동 분석을 통한 NT-UCH-L1의 암세포 침입 능력이 없음을 나타낸 도이다.
도 1k 및 1l은 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 수소-중수소 교환 결과를 나타낸 도이다.
도 1m은 HDX연구로 정제된 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1n은 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)를 포함하는 UCH-L1 및 NT-UCH-L1 펩티드의 대표적인 HDX 영역을 나타낸 도이다.
도 2는 NT-UCH-L1의 Lys15 및 Lys157 잔기의 모노유비퀴틴화(Monoubiquitination)을 나타낸 도이다.
도 2a는 pcDNA3.1 UCH-L1-myc 또는 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc인 빈 벡터가 일시적으로 형질도입된(transfected) NCI-H157 세포를 항-myc 항체를 이용하여 면역침강한 도이다.
도 2b는 도 2a의 화살표가 있는 두 밴드를 자르고, 트립신 분해 후에 nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용하여 서열분석한 것을 나타낸 도이다.
도 2c는 pcDNA3.1 UCH-L1-myc 및 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc인 빈 벡터가 일시적으로 형질도입된 NCI-H157 세포를 항-myc 항체로 면역침강하고, 항-myc 및 항-유비퀴틴(ubiquitin) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석한 도이다;
*: 비특이적인 밴드들.
도 2d는 Lys15를 포함하는 NT-UCH-L1 펩티드의 MS 범위를 나타낸 도이다.
도 2e는 다양한 UCH-L1 형태를 포함하는 pcDNA3.1 플라스미드가 일시적으로 형질도입된 HEK293T 세포를 나타낸 도이다.
도 2f는 UCH-L1의 제시된 형태를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포를 항-myc 항체를 이용하여 면역침강하고, SDS-PAGE로 분석하며, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역블랏한 도이다;
*: 비특이적 밴드들.
도 3은 NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화가 NT-UCH-L1의 저장소이며, NT-UCH-L1의 위치 및 기능을 결정하는 것을 분석한 도이다.
도 3a는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1을 발현하는 세포를 항-myc 및 Alexa Fluor 488 2차 항체(녹색)으로 가시화한 것을 나타낸 도이다;
미토콘드리아 및 핵을 Mitotracker?(붉은색) 및 DAPI(파란색)로 각각 염색하였다.
도 3b는 DMSO 또는 10 μM CCCP 처리된 세포를 세포질 및 미토콘드리아 분획물로 분획하고, UCH-L1을 항-myc 항체 이용하여 면역블랏하여, 항-Hsp60을 이용하여 미토콘드리아 마커 단백질인 Hsp60을 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 프로테아좀(proteasome)에서 NT-UCH-L1의 CCCP로 유도된 분해를 나타낸 도이다.
도 3d는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포의 Mitotracker? 염색을 나타낸 도이다.
도 3e는 NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포에 열충격을 주고, 회복한 후 세포를 용해성 및 불용성 분획물로 분리하고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 3f는 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI-H157세포에 열충격을 주고, 사이클로헥시마이드(cycloheximide)가 있거나 없는 조건에서 회복하였을 때 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 NT-UCH-L1의 응집 현상을 나타낸 도이다.
도 4a는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 10 ㎍/ml 사이클로헥시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 10 ㎍/ml 사이클로헥시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH4Cl 또는 10 mM 3MA를 16시간 동안 처리하고 항-myc를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4d는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH4Cl 및 10 mM 3MA로 16시간 동안 처리하고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4e는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO 또는 10 μM MG132를 9 시간 동안 처리하고, 용해성 및 불용성 분획물로 분리한 것을 나타낸 도이다. 시료는 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4f는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 DMSO 또는 10 μM MG132를 처리하고 용해성 및 불용성 분획물로 분획한 것을 나타낸 도이다.
도 4g는 세포에 16시간 동안 DMSO 또는 10 μM MG132를 처리하고, 고정 및 침투 후에, myc가 붙은 단백질을 항-myc 및 Alexa Flour 488 2차 항체(녹색)로 탐지한 것을 나타낸 도이다;
파란색: DAPI 염색.
도 4h는 SN4741 세포에 pcDNA3.1 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 일시적으로 형질도입하고, 세포를 용해성 및 불용해성 분획물로 분리한 결과를 나타낸 도이다.
도 4i는 다양한 양의 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc 발현 플라스미드가 일시적으로 형질도입된 SN4741세포를 용해성 및 불용해성 분획물로 분리하고, 환원 및 비환원 젤에서 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4j는 FPLC를 이용하여 분획된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 나타낸다; 분획물을 비환원 및 환원 SDS-PAGE 젤에서 분석하였다. UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 항-UCH-L1 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4k는 세포에 다양한 농도의 H2O2를 1시간 동안 37℃에서 처리하고, 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다;
UCH-L1는 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4l는 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 HeLa 세포에 10 μM CCCP를, MG132가 있거나 없이, 6시간 동안 처리한 결과를 나타낸 도이다;
세포를 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석하였고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 5는 C90/132S NT-UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 비교를 나타낸 도이다.
도 5a는 재조합 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 이의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다.
도 5b는 재조합 NT-UCH-L1의 대표적인 이황화 결합의 영역을 나타낸다.
도 5c는 UCH-L1 3D 구조의 시스테인 잔기를 나타낸 도이다.
도 5d는 재조합 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 이의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다.
도 5e UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 C90/132S NT-UCH-L1-myc을 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 항-myc 항체 및 Alexa Fluor 488 2차 항체(녹색)으로 가시화한 결과를 나타낸 도이다;
붉은색: Mitotracker?;및
파란색: DAPI.
도 5f는 C0 NT-UCH-L1-myc를 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 나타낸다.
도 5g는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc, C90/132S NT-UCH-L1-myc 및 C0 NT-UCH-L1-myc(모든 시스테인이 세린으로 대체된)을 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 10 ㎍/ml CHX으로 제시된 시간 동안 처리하고, 항-myc 항체 및 GAPDH 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키고, 미토콘드리아 손상 시약으로부터 세포를 보호하는 것을 나타낸 도이다.
도 6a는 DMSO 또는 10 μM CCCP가 처리된 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 나타낸 도이다;
세포를 CM-H2DCFDA로 염색하였고, FACS 분석기를 이용하여 세포내 활성산소종 수준을 분석하였다.
도 6b UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 DMSO, 25 μM 또는 50 μM CCCP로 처리하였을 때, 세포 생장을 실시간 세포 분석기를 이용하여 관측한 것을 나타낸 도이다;
값은 평균 ± SD로 나타낸다.
도 6c는 NT-UCH-L1의 기능의 도해를 나타낸다;
NT-UCH-L1는 미토콘드리아에 있는 반면, Ub-NT-UCH-L1는 세포질에 있다. Ub-NT-UCH-L1 및 NT-UCH-L1는 평형 상태에 있다(①). 용해성 NT-UCH-L1가 감소되면, ub-NT-UCH-L1는 디유비퀴틴화(deubiquitinated)된다. 또한, 새로이 합성된 NT-UCH-L1는 손실을 채우고, 충분한 NT-UCH-L1이 사용가능해졌을 때, Ub-NT-UCH-L1이 발생된다. NT-UCH-L1의 양이 상기 포화수준 이상으로 증가할 때나 미토콘드리아가 스트레스를 받았을 때, 우선적으로 Cys90 및 Cys132를 포함하는 분자내 이황화 결합을 통해 응집한다(②). NT-UCH-L1이 불용성이 되면, 용해성 분획물로 돌아가지 않는 것으로 보인다. 미토콘드리아안의 상기 응집체는 프로테아좀에 의해 분해된다(③). NT-UCH-L1는 정상 상태에서 프로테아좀에 의해 분해된다(④).
도 6d는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO, 10 nM, 100 nM 또는 1 μM 로테논(rotenone)을 처리하였을 때 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 NT-UCH-L1 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 NT-UCH-L1 단백질의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된바 있고(PGP9.5, accession number X04741), 이 중 cDNA 부분은 32번째에서 670번까지이며 이는 본 명세서에서 서열번호 1로 기재된다.
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였을 때, 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟(spot)이 확인되었으며, 스팟 1 및 3(도 1b 왼쪽 위 패널 참조)을 잘랐고, MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 이들을 분석하였다. 스팟 1이 스팟 3(도 1d)에서 제시되는 펩티드 1MQLKPMEINPEMLNK15(1815.9144 Da)(도 1c 참조)가 부족하였으나, 펩티드 서열분석으로 입증함으로써(도 1f 참조) 새로운 펩티드 12MLNK15(505.2905 Da)(도 1e 참조)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면, 스팟 1은 NT-UCH-L1이었다(N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1). 또한, 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다(도 1b 오른쪽 패널 참조). 결실된 부위는 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하였다(도 1g 참조). 상기 결실된 11 개 아미노산의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된바 있다(PGP9.5, accession number X04741).
또한, UCH-L1의 유비퀴틴(ubiquitin) 가수분해 효소 활성 능력 및 암세포 침입을 증가시키는 능력을 NT-UCH-L1이 가지는지 확인하였을 때, NT-UCH-L1은 불활성화였고(도 1h), 암세포 침입 증가 능력을 가지지 않음을 확인하였다(도 1j 참조).
UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비교하고자, 수소-중수소 교환을 이용하였을 때, 수소-중수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나, 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다(도 1k 및 1l 참조). 이것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였을때(도 1m 참조), UCH-L1보다 NT-UCH-L1의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어난 것을 확인하였다. NT-UCH-L1의 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다(도 1n 참조).
NT-UCH-L1의 Lys15 또는 Lys157에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자, 면역침강을 수행하였다. 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를, 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다(도 2a 화살표 참조). 이것을 면역침강으로 확인하였다(도 2c 오른쪽 패널 화살표 참조). NT-UCH-L1(도 2a 화살표 참조)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다(도 2b 참조). NT-UCH-L1-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다(도 2c 왼쪽 패널, 세 번째 레인 참조). 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NT-UCH-L1(Ub-NT-UCH-L1)로 확인한(도 2c 오른쪽 패널 참조) 반면, 탐지된 상기 희미한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1(도 2c 왼쪽 패널, 두 번째 레인 참조)이었다.
또한, 모노유비퀴틴화된 리신(lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여, 펩티드 서열분석 및 돌연변이 연구를 병행하였다. 면역침강된 Ub-NT-UCH-L1는 tandem MS로 펩티드 서열분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때, 114.04 Da의 증가(유비퀴틴의 C-말단 Gly-Gly)가 있다. NT-UCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며, Lys15에서 후보 유비퀴틴화(ubiquitination) 부위를 설정하였다(도 2d 참조). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, K15/157R 및 K60/157R를 구축하였고, 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석(도 2e 참조) 및 면역침강(도 2f 참조)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-L1의 두 개의 개체군이 있으며, 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고, 다른 하나는 K157에 되지만 둘 다는 아닌 것을 제시한다.
미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은, 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것, 또는 미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에, 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. HeLa 세포에서, UCH-L1-myc은 세포질에 주로 분포하였으나, NT-UCH-L1-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포하였으며, K15/157R NT-UCH-L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다(도 3a 참조). 이러한 분포를 HeLa 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아 분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다(도 3b 참조).
NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 그 결과, 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R NT-UCH-L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 3d 참조).
Ub-NT-UCH-L1의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 열 충격을 수행하였고, 37℃에서 회복하였을 때, 열 충격 회복 동안에 사라지는 불용성 NT-UCH-L1을 유도하였다(도 3e 참조). 단백질 합성 저해제 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에, 상기 불용성 NT-UCH-L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다(도 3f 참조). 용해성 NT-UCH-L1이 감소할 때에, Ub-NT-UCH-L1이 이를 보충한다. NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고, 그 후에 Ub-NT-UCH-L1은 NT-UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서, Ub-NT-UCH-L1이 NT-UCH-L1가 감소될 때, NT-UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다.
NT-UCH-L1를 일시적으로 발현하거나, 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서 NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다. NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽게 분해되는지 확인하였다. CHX로 단백질 합성을 저해한 후에, UCH-L1 유전자의 메틸레이션(methylation)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc의 분해 속도를 비교하였다.그 결과, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다(도 4a 참조). 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH-L1-myc은 Ub-NT-UCH-L1보다 더 쉽게 사라졌다. NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자, MG132(프로테아좀 분해(proteasomal degradation)의 저해제), NH4Cl(리소좀 분해(lysosomal degradation)의 저해제) 및 3-메틸아데닌(3-methyladenine)(3MA, 자식작용의(autophagy)의 저해제)를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다. MG132 처리만이 NCI-H157(도 4c 참조) 뿐만 아니라 HeLa 세포(도 4d 참조)에서 NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다. 따라서, 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 것을 확인하였다.
NT-UCH-L1 응집 정도를 확인하기 위해, 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Ardley, H.C. et al ., Mol Biol Cell 14, 4541-4556(2003)). 그 결과, MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때, NT-UCH-L1 및 그것의 K15/157R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고, 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다(도 4e 참조). MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-L1은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다(도 4e 중간 패널 참조). 이것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화-결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다(도 4e 아래 패널 참조). 또한, 이것은 NCI-H157 세포에서 보였다(도 4f 참조). 또한, 공초점 현미경을 이용하여 Hela 세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1의 응집은 MG132 처리 후에 증가하였다(도 4g 참조). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 응집되고, UCH-L1보다 프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가 응집을 저해하는 것을 나타낸다.
신경세포에서 NT-UCH-L1의 응집 현상을 설명하기 위해서, MG132없이, UCH-L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면, 일시적으로 발현하는 NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1의 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다(도 4h 참조). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다(도 4i 참조). 이것은 불용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고, 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아울러, 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 응집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-L1(S-S NT)을 포함하였다(도 4i 참조).
다양한 UCH-L1-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드(plasmid)를 BL21(DE3)에 형질전환하였고, 생장시킨 후 상기 재조합 단백질을 Superdex 200, HR 10/30(GE Healthcare)에서 분리하였고, 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 그 결과, FPLC에서, NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면, 재조합 UCH-L1은 주로 단량체(약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다(도 4j 참조). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 응집체를 나타낸다.
세포가 스트레스를 받을 때, NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 시험하기 위해, HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)를 1 시간 동안 처리하였고, 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다(도 4k 참조). UCH-L1은 응집체를 형성하지 않았으나, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 H2O2 를 0.5 mM 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다. 또한, 이러한 응집이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 야기되는 것을 확인하였다. CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3b 및 도 3c 참조). NT-UCH-L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고, 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였을 때, CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다(도 4l 아래 패널 레인4 참조). 종합하면, 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다.
Cys90 및 Cys132에서 Ser으로 돌연변이가 NT-UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고, NT-UCH-L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를 포함하는 6개 시스테인(cysteine) 잔기를 가지며, 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다(도 5a 레인1 참조). 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 병행하여 적용하여, NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나, Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다(표 1 및 도 5b 참조). Cys132는 이를 포함하는 모든 5 개의 시스테인과 이황화 결합을 형성하였다(도 5c 참조). Cys132 및 Cys152은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기이다. NT-UCH-L1(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며, 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 응집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다(도 5a). 돌연변이 C90S는 적은 폴리머(polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다(도 5a 화살표 참조). 이러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다(도 5d 참조).
NT-UCH-L1 C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다. 일시적으로 NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역염색하였고, 공초점 현미경으로 가시화하였다(도 5e 참조). 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때, UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며, NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cys132이 미토콘드리아 분포에 중요한 것인지를 확인하고자, 모든 6 개 시스테인(cysteines)이 세린(serines)으로 돌연변이 되어 있는 변종(C0 NT-UCH-L1)의 분포를 조사하였고, 응집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다(도 5f 참조). 상기 C90/132S NT-UCH-L1의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다(도 1m 참조). 이것은 NT-UCH-L1의 전체적인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인(cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다. 그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고, 그들의 반감기를 측정하였다. 도 5g와 같이, NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며, 이는 C90/132S NT-UCH-L1의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다.
NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이것이 산화환원반응에 민감한 단백질인 것을 제시한다. 세포내 ROS의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH-L1의 분포는 ROS의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한 잠재력있는 역할을 제시한다. NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준에 영향을 주는지 확인한 결과, NT-UCH-L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH-L1 발현에 비해, 세포내 ROS 수준을 감소시켰다(도 6a 위의 패널 참조). NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock 또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 ROS 수준을 보였으며, 이는 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키는 것을 제시한다.
CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여, 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때, NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포 사멸을 벗어났으므로, NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제시한다(도 6b 참조). 다른 미토콘드리아 손상 시약(복합체 저해제)인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다(도 6d 참조).
따라서, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치하면서 세포 내 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> N-말단이 제거된 UCH - L1 의 확인
<1-1> 세포 배양
인간 NCI-H157(폐암세포주), SH-SY5Y(인간 유래 신경아세포종 세포주) 및 HeLa 세포를 각각 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 페니실린 G(penicillin G)가 있는 RPMI 1640, dulbecco's modified eagle medium 및 minimum essential medium에서 유지하였다. 세포배양에 쓰인 배지 및 성분은 Invitrogen에서 구입하였다.
<1-2> 항체
유비퀴틴(ubiquitin) C-말단 가수분해 효소(Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, UCH-L1) 및 myc tag의 N-말단 펩티드에 대한 폴리클로날(Polyclonal) 항체를 AbFrontier, Inc.(한국)에서 제작하였고, 특징화하였다. 다른 항체의 재료는 하기와 같다: 모노클로날 항-myc 항체(Millipore), 폴리클로날 항-UCH-L1 항체(Chemicon), 항-유비퀴틴(ubiquitin) 항체(Chemicon), flag-항체(M2)(Sigma), 항-튜뷸린 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.), 염소 항-마우스 항체(Molecular Probes).
<1-3> 2D 젤 전기영동(2D gel electrophoresis )
기존에 기재된 바와 같이 2D 젤 전기영동을 수행하였다(Jeong, J. et al . Mol Cell Proteomics 10,(2011)). 요약하면, 세포를 9.5 M 요소(urea), 2% TritonX-100, 5% β머캅토에탄올(βmercaptoethanol), 1.6% 파말라이트5-7(pharmalyte 5-7), 0.4% 파말라이트 3-10(pharmalyte 3-10), 50 mM DTT, 단백질 분해 효소 저해제 혼합제(protease inhibitor cocktail) 및 5 mM Na3VO4 이 포함된 완충액에 용해하였다. 단백질을 Immobline Drystrip 4-7 linear gels(GE Healthcare)에서 일렉트로포커스(electrofocuse)하였다. 평형 후에(50 mM tris(pH 8.8), 6 M 요소(urea) 2% SDS, 30% 글리세롤(glycerol), 스트립을 11% 2차원 SDS-PAGE 평판 젤에 두었고, 단백질을 분석하였다.
<1-4> 질량 분광분석( Mass spectrometry , MS )
기존에 밝혀진 UCH-L1의 몇개의 변종(Strausberg, R.L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16899-16903(2002)(도 1a)외에 다른 변종이 있는지 확인하고자, 상기 실시예 <1-3>에서 준비한 단백질 젤 스팟(spot)을 분리하였고, 이를 트립신(trypsin)으로 소화시켰으며, 상기 결과 펩티드를 Jeong, J. et al ., Mol Cell Proteomics 10, M110 000513(2011), Seo, J. et al . J Proteome Res 7, 587-602(2008), 및 Lee, E. et al., PLoS one 4, e7949(2009)에 기재한 바와 같이 분석하였다. 소화된 펩티드를 nanoacquity UPLCTMESI/MS(SYNAPTTM HDMSTM Waters)로 분석하였다. 통합된 electrospray ionization PicoTipTM(± 10 μm, New Objective)가 있는 C18 reversed-phase 75 μm ID × 150 mm analytical column(1.7 μm particle size, BEH130 C18, Waters)를 이용하여 펩티드를 분리하였다. 7 ㎕ 펩티드(peptide) 혼합물을 완충액 A(물/포름산(formic acid); 100:0.1, v/v)에 용해하였고, 컬럼(column)에 주입하였으며, 5-80 % 완충액 B(아세토니트릴(acetonitril)/포름산; 100:0.1, v/v)의 선형 경사도로 120분 이상 용출하였다. 시료를 trap column cartridge(ID 180 μm × 20 mm, Symmetry? C18, Waters)로 분리 전에 탈염하였다. 초기에, 상기 흐름 속도는 300 nl/분으로 설정하였고, 상기 모세관 전압(capillary voltage)(2.5 keV)를 분사 전에 LC 이동상으로 적용하였다. 크로마토그래피(Chromatography)를 MS에 일렬로 수행하였다. 효율적인 데이터 의존적인 수득을 위한 MS 한도(parameter)는 질량분광분석부터 MS/MS까지로 전환되는 10개 및 3 개 요소 이상의 강도였다. 상기 개별적인 MS/MS 범위를 Micromass ProteinLynx Global Server(PLGSTM) 2.1 data processing 소프트웨어 및 단독 MASCOT-searchable 정점 목록(peak list)(.pkl) 파일과 같은 결과로 단독 LC 운용을 조합하고, 매끄럽게 하였고, 디아이소토프(deisotoped)하였고, 센트로이드(centroided)하여 각 전구체로부터 수득하였다. 상기 정점 목록 파일을 MASCOT(global search engine)를 사용하여, SwissProt database에 의문을 제기하는데 하기 변수와 함께 사용하였다: 펩티드 질량 관용, 0.2 Da; MS/MS 이온 질량 관용, 0.2 Da; 1까지 손실된 트립신 분해 부위 허용; 아세틸레이션(acetylation), 디아미데이션(deamidation), 피로-글루(pyro-glu)(N-term E, Q), 산화(oxidation), 포르밀화(formylation), 인산화(phosphorylation), 카바미도메틸(carbamidomethyl) 및 시스테인 프로피온아미드(cysteine propionamide)와 같은 다양한 수식을 고려하였지만, 수식을 고정하지 않았고; 효소를 트립신으로 한정하지 않았으며; 분류학(toxonomy)을 마우스로 한정하지 않았다. 모든 보고된 과제는 MASCOT로부터 범위의 자동적 및 수동적 해석으로 확인하였다.
그 결과, NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였을 때, 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟(spot)이 확인되었다. 상기 대응하는 은이 염색된 2D 젤(도 1b 왼쪽 중간 패널)로부터 스팟 1 및 3을(도 1b 왼쪽 위 패널) 잘랐고, MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 이들을 분석하였다. 스팟 1이 스팟 3(도 1d)에서 제시되는 펩티드 1MQLKPMEINPEMLNK15(1815.9144 Da)(도 1c)가 부족하였으나, 펩티드 서열분석으로 입증함으로써(도 1f) 새로운 펩티드 12MLNK15(505.2905 Da)(도 1e)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면, 스팟 1은 NT-UCH-L1이었다(N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1). 제거된 구조를 확인하고자, 상기 합성 펩티드 1MQLKPMEINPE11에 대한 토끼 항체를 얻어냈다. 스팟 1이 N-말단 펩티드에 대한 항체로 탐지될 수 없는 것을 확인하였다(도 1b 왼쪽 바닥 패널). 또한, 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다(도 1b 오른쪽 패널). 결실된 부위는 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하였다(도 1g). 상기 11 개 아미노산이 결실된 단백질의 mRNA은 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된 바있다(PGP9.5, accession number X04741).
< 실시예 2> UCH - L1 을 발현하는 안정화된 세포주의 수립
UCH-L1 및 NT-UCH-L1 야생형 유전자 발현을 위한 렌티바이러스 벡터를 LentiM1.4 벡터의 Xba I-EcoR V 부위로 PCR 유전자 단편을 도입함으로써 구축하였다. 기존에 기재된 바와 같이 위형 렌티바이러스를 제작하였고, UCH-L1의 안정한 발현을 위해 사용하였다(Dull, T. et al ., J Virol 72, 8463-8471(1998) 및 Follenzi, A., Ailles, L.E., Bakovic, S., Geuna, M. & Naldini, L., Nat Genet 25, 217-222(2000)).
< 실시예 3> UCH - L1 및 NT - UCH - L1 활성의 측정
상기 유비퀴틴-C-말단 가수분해 효소 활성을 유비퀴틴-C-말단 7-아미도-4-메틸쿠마린(ubiquitin-C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin, Ub-AMC)(AG scientific)를 사용하여 기존에 기재된 바와 같이 측정하였다(Kim, H.J. et al ., Oncogene 28, 117-127(2009)).
그 결과, NT-UCH-L1은 유비퀴틴(ubiquitin) 가수분해 효소 활성 능력을 가지지 않는 것을 확인하였다. NT-UCH-L1이 UCH-L1 효소 활성을 나타내는지 시험하기 위해, 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1로 유비퀴틴(ubiquitin)-AMC 유래 가수분해적 방출된 형광을 비교하였다. NT-UCH-L1는 불활성화였다(도 1h). 이것은 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역침강된 Flag-UCH-L1 및 Flag-NT-UCH-L1의 가수 분해 효소 활성을 비교함으로써 확인하였다. Flag-UCH-L1은 가수 분해 효소 활성을 나타냈지만, Flag-NT-UCH-L1은 나타내지 않았다(도 1i).
< 실시예 4> 세포 이동 분석을 통한 NT - UCH - L1 의 암세포 침입 능력 확인
세포 이동 분석을 24-웰 케모텍시스 챔버 트랜스웰(24-well chemotaxis chamber transwell)(Corning, NY) 및 마트리젤(matrigel)(MatrigelTM basement membrane matrix, BD Bioscience)을 이용하여 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(Kim, H.J. et al ., Oncogene 28, 117-127(2009)).
그 결과, NT-UCH-L1는 암세포 침입을 증가시키는 UCH-L1의 능력을 가지지 않음을 확인하였다(도 1j).
< 실시예 5> 수소/ 중수소 교환( Hydrogen / Deuterium exchange , HDX )을 이용한 NT - UCH - L1 의 3차 구조 확인
UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비교하기 위해, 단백질 구조의 동역학 및 변화를 특징화하기 위한 유용한 도구인 수소/중수소 교환(hydrogen/deuterium exchange, HDX)을 이용하였다. 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 중수소(D2O)에서 다양한 시간으로 배양하였고, 온전한 단백질을 tandem MS를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, UCH-L1, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1(약 1 ㎍/㎕)를 10배 표지 완충액(D2O 안의 20 mM PBS, pH 7.4)으로 희석하였고, 몇몇의 시간의 척도 동안 25℃에서 유지하였다. 상기 표지 반응을 25 mM 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)/25 mM 디소듐 숙신산 완충액(disodium succinate buffer), pH 2.3로 캔치(quenche)하였다(이것은 포름산으로 적정하였다). 펩신 소화를 위해, 돼지 펩신(1 ㎍/㎕)을 각 캔치된 단백질 시료에 첨가하였고, 주입 후에 0℃에서 3분 동안 배양하였다(Hoofnagle, A.N., Resing, K.A. & Ahn, N.G., Methods Mol Biol 250, 283-298(2004) 및 Lee, T., Hoofnagle et al., J Mol Biol 353, 600-612(2005)). 펩신 펩티드를 기존에 기재된 바와 같이 탈염하였고, 분리하였다(Jeong, J. et al., Mol Cell Proteomics 10, M110 000513(2011)). autosampler chamber를 5℃로 설정하였다. 중수소 역-교환을 최소화하기 위해 트랩(trap), 분석 컬럼 및 모든 배관을 얼음 배스(bath)에 두었다. 이동상(mobile phase) 병 둘 다를 얼음에 두었고, 이동상 둘 다는 0.1% FA를 포함하였다. 상기 경사도 크로마토그래피를 0.6 ㎕/분의 흐름 속도에서 수행하였고, nanoAcquityTM/ESI/MS(SYNAPTTM HDMSTM, Waters)로 일렬로 분사하였다. 모든 질량 범위 측정을 모세관 전압(capillary voltage) 2.5 kV, 콘 전압(cone voltage) 35 V, 추출 콘 전압(extraction cone voltage) 4.0 V, 재료 온도 80℃에서 수행하였다. TOF mode scan을 m/z 300-1500의 범위에서 1초의 스캔 시간으로 수행하였다.
그 결과, 수소-중수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나, 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다(도 1k 및 1l). 이것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였다(도 1m). UCH-L1보다 NT-UCH-L1의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어났다. NT-UCH-L1의 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다(도 1n).
< 실시예 6> NT - UCH - L1 의 Lys15 또는 Lys157 에서 모노유비퀴틴화 확인
NT-UCH-L1의 Lys15 또는 Lys157에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자, 면역침강을 수행하였다. 세포를 면역침강 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 50 mMNaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 ㎍/ml 아프로티닌(aprotinin), 10 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 10 ㎍/ml 펩스타틴(pepstatin), 1 mM Na3VO4, 0.5% NP-40)으로 용해하였다. 용해물을 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상기 상층액을 3시간 동안 4℃에서 단백질 G 세파로오스 비드(protein G sepharose beads)에 가교결합된 항-flag 또는 항-myc 항체와 함께 배양하였다. 비드를 면역침강 완충액으로 3회 세척하였고, 결합된 단백질을 젤 시료 완충액(62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 10%(w/v) glycerol, 5% β머캅토에탄올, 2.3% SDS)으로 용출하였고, SDS-PAGE로 분리하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc 및 NT-UCH-L1-myc를 발현하는 NCI-H157 세포 유래 용해물에 항-myc 항체를 처리하였고, 결과로 초래되는 면역침강을 분석하였다. UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 몇몇의 다른 밴드를 탐지하였고, tandem MS로 그들을 확인하였다.
그 결과, 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를, 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다(도 2a 화살표). 이것을 면역침강으로 확인하였다(도 2c 오른쪽 패널 화살표 머리). NT-UCH-L1(도 2a 화살표)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다(도 2b). NT-UCH-L1-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다(도 2c 왼쪽 패널, 세 번째 레인). 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NT-UCH-L1(Ub-NT-UCH-L1)로 확인한(도 2c 오른쪽 패널) 반면, 탐지된 상기 희미한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1(도 2c 왼쪽 패널, 두 번째 레인)이었다.
또한, 모노유비퀴틴화된 리신(lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여, 펩티드 서열분석 및 돌연변이 연구를 병행하였다. 면역침강된 Ub-NT-UCH-L1는 tandem MS로 펩티드 서열분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때, 114.04 Da의 증가(유비퀴틴의 C-말단 Gly-Gly)가 있다. NT-UCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며, Lys15에서 후보 유비퀴틴화(ubiquitination) 부위를 설정하였다(도 2d). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, K15/157R 및 K60/157R를 구축하였고, 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석(도 2e) 및 면역침강(도 2f)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-L1의 두 개의 개체군이 있으며, 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고, 다른 하나는 K157에 되지만 둘 다는 아닌 것을 제시한다.
< 실시예 7> Ub - NT - UCH - L1 및 NT - UCH - L1 의 세포 내 위치 확인
<7-1> 면역조직화학염색 및 공초점 현미경을 이용한 Ub - NT - UCH - L1 및 NT -UCH-L1의 세포 내 위치 확인
미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은, 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것, 또는 미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에, 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. 세포를 SecureslipTM cell culture cover slip(Gracebiolab)에서 생장시켰다. 세포를 HBSS에서 250 nM of MitoTracker? Red 580와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분 동안 상온에서 고정하였다. 침투화를 0.1% Triton X-100 HBSS에서 15분 동안 상온에서 수행하였다. 세포는 불특정 단백질의 흡착을 차단하기 위해 3% BSA, 0.2% Tween 20 및 0.2% 젤라틴(gelatin) PBS로 1시간 동안 상온에서 처리하였다. 세포를 1% BSA 및 1% 수크로스(sucrose)를 포함하는 HBSS에 1:250으로 희석된 모노클로날 항-myc 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 1:50으로 희석된 Alexa Fluor 488이 접합된 염소 항 마우스 IgG 와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경하에서 분석하였다. 또한, 미토콘드리아 표적화를 예측하는 프로그램인 Predotar 및 MitoProt II-v1.101를 적용하였다.
그 결과, HeLa 세포에서, UCH-L1-myc은 세포질에 주로 분포하였으나, NT-UCH-L1-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포하였으며, K15/157R NT-UCH-L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다(도 3a). 이러한 분포를 HeLa 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아 분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다(도 3b). UCH-L1 유래 11개의 N-말단 아미노산의 결실은 미토콘드리아 표적화 가능성을 증가시켰다: UCH-L1 및 NT-UCH-L1에 대한 각각 Predotar에서 0.00 및 0.41 및 MitoProt II에서 0.1032 및 0.4606의 예측 점수.
<7-2> 미토콘드리아 분획물의 제조
NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 세포의 미토콘드리아 분획물을 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Shim, J.H. et al ., Mitochondrion 11, 707-715(2011)). 세포를 단백질 분해효소 저해제 혼합물 및 10 mM NEM로 보충된 10 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 부유하였고, 게이지 바늘을 통해 20회 통과시켰다. 차가운 1.5 M 수크로스 용액 40 ㎕를 첨가한 후, 600 × g 에서 10분 동안 원심분리 후에, 상기 상층액을 14,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하였고, 동일 부피의 2x 젤 시료 완충액과 함께 혼합하였다. 상기 미토콘드리아 분획물을 포함하는 펠렛을 50 ㎕ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5으로 2회 세척하였고, 30 ㎕ 2x 젤 시료 완충액에서 용해하였다. 젤 시료 완충액 안의 동일 부피의 상기 상층액 및 젤 시료 완충액 혼합물 및 미토콘드리아 분획물을 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.
그 결과, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R NT-UCH-L1 둘 다 세포질 또는 미토콘드리아 분획물에서 각각 6 시간 이내에 사라졌으나, UCH-L1의 수준은 변하지 않았다(도 3b). CCCP는 프로테아좀(proteasome)에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3c). 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R NT-UCH-L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 3d).
< 실시예 8> 모노유비퀴틴화된 형태( Monoubiquitinated form )가 용해성 NT -UCH-L1의 저장소인 것을 확인
Ub-NT-UCH-L1의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 45℃에서 30 분 동안 열 충격을 수행하였고, 37℃에서 회복하였다.
그 결과, 열 충격은 회복 동안에 사라지는 불용성 NT-UCH-L1을 유도하였다(도 3e). 단백질 합성 저해제 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에, 상기 불용성 NT-UCH-L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다(도 3f). 용해성 NT-UCH-L1이 감소할 때에, Ub-NT-UCH-L1이 이를 보충한다. NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고, 그 후에 Ub-NT-UCH-L1은 NT-UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서, Ub-NT-UCH-L1이 NT-UCH-L1가 감소될 때, NT-UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다.
< 실시예 9> NT - UCH - L1 의 전환 정도 확인
NT-UCH-L1를 일시적으로 발현하거나, 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서 NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다. NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽게 분해되는지 확인하였다. CHX로 단백질 합성을 저해한 후에, UCH-L1 유전자의 메틸레이션(methylation)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc의 분해 속도를 비교하였다.
그 결과, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다(도 4a). 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH-L1-myc은 Ub-NT-UCH-L1보다 더 쉽게 사라졌다. 또한, 내생의 UCH-L1를 상당히 발현하는 NCI-H157 세포에서 이러한 분해 패턴을 보였다(도 4b). NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자, MG132(프로테아좀 분해(proteasomal degradation)의 저해제), NH4Cl(리소좀 분해(lysosomal degradation)의 저해제) 및 3-메틸아데닌(3-methyladenine)(3MA, 자식작용의(autophagy)의 저해제)를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다. MG132 처리만이 NCI-H157(도 4c) 뿐만 아니라 HeLa 세포(도 4d)에서 NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다. 따라서, 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해된다.
< 실시예 10> NT - UCH - L1 응집 정도 확인
<10-1> 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조
세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Ardley, H.C. et al ., Mol Biol Cell 14, 4541-4556(2003)). 요약하면, 100 mm 세포 배양 플레이트의 세포를 500 ㎕ RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 1%(v/v) NP-40, 0.5%(wt/vol) 소듐데옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 0.1%(wt/vol) SDS, 단백질 분해 효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)(sigma), 10 mM NEM)에 26.5-게이지(gauge) 바늘을 통해 10회 통과함으로써 용해하였다. 12,000 × g에서 20 분 동안 원심분리 후에, 펠렛(pellet)을 200 ㎕ 젤 시료 완충액에서 재부유하였다. 상기 상층액을 2x 젤 시료 완충액의 동일 부피와 함께 혼합하였고, 10% SDS-PAGE에서 각 분획물의 20 ㎕을 분석하였다. MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때, HeLa 세포를 MG132로 처리하였고, 세제로 용해성(soluble, S) 및 불용성(insoluble, I) 분획물로 분리하였다.
그 결과, NT-UCH-L1 및 그것의 K15/157R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고, 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다(도 4e). MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-L1은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다(도 4e 중간 패널). 이것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화-결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다(도 4e 아래 패널). 또한, 이것은 NCI-H157 세포에서 보였다(도 4f). 또한, 공초점 현미경을 이용하여 Hela 세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1의 응집은 MG132 처리 후에 증가하였다(도 4g). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 응집되고, UCH-L1보다 프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가 응집을 저해하는 것을 나타낸다.
신경세포에서 NT-UCH-L1의 응집 현상을 설명하기 위해서, MG132없이, UCH-L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1이 일시적으로 발현하는 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다(도 4h). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다(도 4i). 이것은 불용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고, 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아울러, 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 응집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-L1(S-S NT)을 포함하였다(도 4i).
<10-2> 재조합 단백질의 제조, 그들의 분리 및 FPLC
다양한 UCH-L1-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드(plasmid)를 BL21(DE3)에 형질전환하였고, OD가 600 nm에서 0.6 ~ 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 생장시켰다. 단백질의 도입을 위해, 세포를 IPTG와 함께 25℃에서 2시간 동안 배양하였고, 수확하였으며, 용해 완충액(0.16 mg/ml 리소자임(lysozyme)이 있는 PBS, 0.1% Triton X-100, 2 ㎍/ml 아프로티닌(aprotinin), 1 mM PMSF, 10 mM 이미다졸(imidazole))에서 30분 동안 얼음에서 용해하였다. 상기 세포 용해물을 65,000 rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였고, 상층액을 Ni-NTA-agarose beads column(Qiagen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 Superdex 200, HR 10/30(GE Healthcare)에서 분리하였고, 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
그 결과, FPLC에서, NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면, 재조합 UCH-L1은 주로 단량체(약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다(도 4j). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 응집체를 나타낸다.
< 실시예 11> 산화적 및 미토콘드리아 스트레스의 NT - UCH - L1 내의 이황화 가교결합 유도 확인
세포가 스트레스를 받을 때, NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 시험하기 위해, HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)를 1 시간 동안 처리하였고, 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다(도 4k). UCH-L1은 응집체를 형성하지 않았으나, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 H2O2 를 0.5 mM 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다. 또한, 이러한 응집이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 야기되는 것을 확인하였다. CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3b 및 도 3c). NT-UCH-L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고, 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였을 때, CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다(도 4l 아래 패널 레인4). 하지만, 비환원 상태에서, NT-UCH-L1은 유지하였으나, 이의 원래 위치가 아니지만(위 패널 화살표), 대신에 더 높은 분자량 범위에 분산되었으며, 이는 프로테아좀 분석 전에 이황화 가교결합된 다량체를 형성하는 것을 제시한다. 종합하면, 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다.
< 실시예 12> Cys90 및 Cys132 에서 Ser 으로 돌연변이가 NT - UCH - L1 의 용해성에 주는 영향 확인
Cys90 및 Cys132에서 Ser으로 돌연변이는 NT-UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고, NT-UCH-L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를 포함하는 6 시스테인(cysteine) 잔기를 가지며, 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다(도 5a 레인1). 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 병행하여 적용하여, NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나, Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다(표 1 및 도 5b). Cys132는 이를 포함하는 모든 5 개의 시스테인과 이황화 결합을 형성하였다(도 5c). Cys132 및 Cys152은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기이다. NT-UCH-L1(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며, 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 응집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다(도 5a). 돌연변이 C90S는 적은 폴리머(polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다(도 5a 화살표). 이러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다(도 5d).
Figure pat00001
< 실시예 13> NT - UCH - L1 C90 /132S 변종의 분포 위치 및 안정성 확인
NT-UCH-L1 C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다. 일시적으로 NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역염색하였고, 공초점 현미경으로 가시화하였다(도 5e). 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때, UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며, NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cys132이 미토콘드리아 분포에 중요한 것인지를 확인하고자, 모든 6 개 시스테인(cysteines)이 세린(serines)으로 돌연변이 되어 있는 변종(C0 NT-UCH-L1)의 분포를 조사하였고, 응집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다(도 5f). 상기 C90/132S NT-UCH-L1의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다(도 1m). 이것은 NT-UCH-L1의 전체적인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인(cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다.
그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고, 그들의 반감기를 측정하였다. 도 5g와 같이, NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며, 이는 C90/132S NT-UCH-L1의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다.
< 실시예 14> NT - UCH - L1 가 세포내 ROS 수준에 주는 영향 확인
NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이것이 산화환원반응에 민감한 단백질인 것을 제시한다. 세포내 ROS의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH-L1의 분포는 ROS의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한 잠재력있는 역할을 제시한다.
NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준에 영향을 주는지 확인하고자, 세포내 ROS를 CM-H2DCFDA(Invitrogen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다. 요약하면, 트립신을 처리한 세포를 세척하였고 0.5 ml HBSS에서 재부유 하였다. 3 ㎕ 0.5 mM CM-H2DCFDA를 첨가하였고 37℃에서 15분 동안 배양하였다. HBSS로 간단히 세척한 후에, 세포를 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)로 분석하였다.
그 결과, NT-UCH-L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH-L1 발현에 비해, 세포내 ROS 수준을 감소시켰다(도 6a 위의 패널). NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock 또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 ROS 수준을 보였으며, 이는 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키는 것을 제시한다.
< 실시예 15> CCCP 로 유도된 손상으로부터 NT - UCH - L1 의 세포 보호 효과 확인
CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여, 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때, NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하고자, 5,000 개의 HeLa 세포를 실시간 세포 분석기인 xCELLigence(Roche Applied Science)를 위해 96-웰 E-플레이트(E-plate)에 두었다. 24시간 후에, 세포를 0, 10 및 25 μM의 CCCP로 처리하였고, 세포 생장을 전기적 전압과 전류의 비(impedance)로 매 30분 마다 실시간 세포 분석기인 xCELLigence로 측정함으로써 관측하였다. 시료는 3회 반복하였다.
그 결과, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포 사멸을 벗어났으므로, NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제시한다(도 6b). 다른 미토콘드리아 손상 시약(복합체 저해제)인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다(도 6d).
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A pharmaceutical composition containing N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as a active ingredient for the prevention and treatment of parkinson's disease <130> 11p-12-27 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 639 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctgaaca aagtgctgtc ccggctgggg gtcgccggcc agtggcgctt cgtggacgtg 60 ctggggctgg aagaggagtc tctgggctcg gtgccagcgc ctgcctgcgc gctgctgctg 120 ctgtttcccc tcacggccca gcatgagaac ttcaggaaaa agcagattga agagctgaag 180 ggacaagaag ttagtcctaa agtgtacttc atgaagcaga ccattgggaa ttcctgctta 240 ttcacgcagt ggccaataat caagacaaac tgggatttga ggatggatca gttctgaaac 300 agtttctttc tgaaacagag aaaatgtccc ctgaagacag agcaaaatgc tttgaaaaga 360 atgaggccat acaggcagcc catgatgccg tggcacagga aggccaatgt cgggtagatg 420 acaaggtgaa tttccatttt attctgttta acaacgtgga tggccacctc tatgaacttg 480 atggacgaat gccttttccg gtgaaccatg gcgccagttc agaggacacc ctgctgaagg 540 acgctgccaa ggtgtgcaga gaattcaccg agcgtgagca aggagaagtc cgcttctctg 600 ccgtggctct ctgcaaggca gcctaatgct ctgtgggag 639

Claims (9)

  1. N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항의 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 NT-UCH-L1 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
    3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
  8. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  9. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
KR1020120067410A 2012-06-22 2012-06-22 Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물 KR101384642B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120067410A KR101384642B1 (ko) 2012-06-22 2012-06-22 Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물
PCT/KR2013/005509 WO2013191509A1 (ko) 2012-06-22 2013-06-21 N-말단이 제거된 유비퀴틴 c-말단 가수분해효소-l1(nt-uch-l1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120067410A KR101384642B1 (ko) 2012-06-22 2012-06-22 Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140000733A true KR20140000733A (ko) 2014-01-06
KR101384642B1 KR101384642B1 (ko) 2014-04-22

Family

ID=49769037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120067410A KR101384642B1 (ko) 2012-06-22 2012-06-22 Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101384642B1 (ko)
WO (1) WO2013191509A1 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10398710B2 (en) 2015-05-22 2019-09-03 Intelligent Synthetic Biology Center Method for screening regulator of mitochondrial fission
US10908821B2 (en) 2019-02-28 2021-02-02 Micron Technology, Inc. Use of outstanding command queues for separate read-only cache and write-read cache in a memory sub-system
US10970222B2 (en) 2019-02-28 2021-04-06 Micron Technology, Inc. Eviction of a cache line based on a modification of a sector of the cache line
US11106609B2 (en) 2019-02-28 2021-08-31 Micron Technology, Inc. Priority scheduling in queues to access cache data in a memory sub-system
WO2021246627A1 (ko) * 2020-06-03 2021-12-09 옙바이오 주식회사 2-(4-(1-하이드록시프로판-2-일)페닐)이소인돌린-1-온 화합물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US11288199B2 (en) 2019-02-28 2022-03-29 Micron Technology, Inc. Separate read-only cache and write-read cache in a memory sub-system

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2310057B1 (es) 2004-07-19 2009-11-17 Oryzon Genomics, S.A. Metodo de analisis molecular y tratamiento en demencia de cuerpos de lewy.
KR100732298B1 (ko) * 2005-11-24 2007-06-25 이화여자대학교 산학협력단 유비키틴 ｃ-말단 가수분해제-ｌ1을 이용한 암전이 진단용조성물

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10398710B2 (en) 2015-05-22 2019-09-03 Intelligent Synthetic Biology Center Method for screening regulator of mitochondrial fission
US10908821B2 (en) 2019-02-28 2021-02-02 Micron Technology, Inc. Use of outstanding command queues for separate read-only cache and write-read cache in a memory sub-system
US10970222B2 (en) 2019-02-28 2021-04-06 Micron Technology, Inc. Eviction of a cache line based on a modification of a sector of the cache line
US11106609B2 (en) 2019-02-28 2021-08-31 Micron Technology, Inc. Priority scheduling in queues to access cache data in a memory sub-system
US11288199B2 (en) 2019-02-28 2022-03-29 Micron Technology, Inc. Separate read-only cache and write-read cache in a memory sub-system
US11675705B2 (en) 2019-02-28 2023-06-13 Micron Technology, Inc. Eviction of a cache line based on a modification of a sector of the cache line
US12007917B2 (en) 2019-02-28 2024-06-11 Micron Technology, Inc. Priority scheduling in queues to access cache data in a memory sub-system
WO2021246627A1 (ko) * 2020-06-03 2021-12-09 옙바이오 주식회사 2-(4-(1-하이드록시프로판-2-일)페닐)이소인돌린-1-온 화합물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013191509A1 (ko) 2013-12-27
KR101384642B1 (ko) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thompson et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome
KR101384642B1 (ko) Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 ｃ―말단 가수분해효소―ｌ１（ｎｔ―ｕｃｈ―ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물
Capanni et al. Altered pre-lamin A processing is a common mechanism leading to lipodystrophy
Słomnicki et al. S100A6 binds p53 and affects its activity
Helmlinger et al. Ataxin-7 is a subunit of GCN5 histone acetyltransferase-containing complexes
Zhang et al. Two chromogranin a-derived peptides induce calcium entry in human neutrophils by calmodulin-regulated calcium independent phospholipase A2
Gerlitz et al. Novel functional features of the Lis-H domain: role in protein dimerization, half-life and cellular localization
Piwnica et al. Cathepsin D processes human prolactin into multiple 16K-like N-terminal fragments: study of their antiangiogenic properties and physiological relevance
Ezaki et al. Characterization of Cln3p, the gene product responsible for juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis, as a lysosomal integral membrane glycoprotein
US20080213250A1 (en) Use of Eph Receptor Inhibitors for the Treatment of Neurodegenerative Diseases
AU2018215245B2 (en) Interaction between C-peptides and elastin receptor, a model for understanding vascular disease
Ferrándiz‐Huertas et al. Rab4 interacts with the human P‐glycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562 cells
Banerjee et al. Investigation of the reciprocal relationship between the expression of two gap junction connexin proteins, connexin46 and connexin43
JP2009516155A (ja) チアゾリジンジオン反応性バイオマーカーを用いる治療物質の同定法
Kirov et al. AHNAK2 participates in the stress‐induced nonclassical FGF1 secretion pathway
KR20150039894A (ko) p62의 ZZ 영역에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도
JP2005527235A (ja) デフェンシン：抗ウイルス剤の使用
US20190099502A1 (en) Targeting the neuronal calcium sensor 1 for treating wolfram syndrome
Zhang et al. Chromogranin B: intra‐and extra‐cellular mechanisms to regulate catecholamine storage and release, in catecholaminergic cells and organisms
Blazejczyk et al. Biochemical characterization and expression analysis of a novel EF-hand Ca2+ binding protein calmyrin2 (Cib2) in brain indicates its function in NMDA receptor mediated Ca2+ signaling
KR20210041035A (ko) 알츠하이머병의 판정약 및 판정 방법
Kadam et al. Novel nucleolar localization of clusterin and its associated functions in human oral cancers: An in vitro and in silico analysis
US20040186274A1 (en) Methylation of histone h4 at arginine 3
Brodeur et al. Calnuc binds to LRP9 and affects its endosomal sorting
Park et al. Leucine-rich glioma inactivated 3 associates with syntaxin 1

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171011

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180614

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190403

Year of fee payment: 6