KR20150039894A

KR20150039894A - p62의 ZZ 영역에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20150039894A
Application number: KR20130117910A
Authority: KR
Inventors: 권용태; 장준민; 한동훈; 김보연; 차현주; 유지은
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2015-04-14
Also published as: WO2015050383A1; KR101594168B1

Abstract

본원은 세포를 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기와 상호작용하는 N-end rule 라이겐드와 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 조절 방법 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 p62를 이용한 N-end rule 경로를 통한 단백질 제거는 변성된 단백질의 비정상적인 축적으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

p62의 ZZ 영역에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도 {Method for modulating autophagy mediated by p62 through ZZ domain and its use}

본원은 자가포식 조절을 통한 변성된 단백질의 비정상적 축적으로 인한 질환 치료제 분야이다.

자가포식(Autophagy)은 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정(Levine and Klionsky, (2004) Dev Cell 6, 463-377)으로, 결함이 있는 거대 단백질 복합체 및 세포내 소기관을 제거하여, 세포 성장, 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다.

예를 들면 자가포식은 암세포에서 활성화 (Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther., 8(7), 2036-2045)되며, 자가포식 억제제가 항암 치료제로서 작용하기도 한다 (Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752).

아울러, 상기 언급한 대로 자가포식은 손상된 단백질 및 세포 소기관의 세포내 변동을 통한 세포 항상성의 유지를 위한 중요한데, 그 결과, 자가포식현상이 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생한다(Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884). 따라서, 세포의 자가포식을 향상시키는 물질은 신경변성 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로서 작용할 수 있다.

암 및 신경변성 질환에 추가하여 자가포식은 간 질환, 심장 질환, 근육 질환 및 췌장 질환과 연관된 것으로 알려져 있다 (Levine and Kroemer, (2008), Cell, 132, 27-42; Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)).

미국 공개특허공보 제2010-0233730호는 치료를 위한 자가포식 조절에 관한 것으로, 세포에 시험물질을 처리한 후 대사 스트레스를 가해 자가포식체(autophagosome)의 세포내 변화 관찰을 통해, 자가포식 조절제를 선별하는 방법에 관한 것이다.

유럽 공개특허 공보 제 2446886 호는 자가포식 조절제를 이용한 콜라겐 VI 결여성 근육 위축증 치료에 관한 것으로, Beclin-1, BH3 모방체 등을 이용한 조성물을 개시한다.

상기 언급한 바와 같이 자가포식 현상의 조절을 통해 광범위한 다양한 질환이 치료될 수 있으며, 따라서 자가포식에 관여하는 물질을 표적으로 하는 새로운 치료제 및 방법의 개발이 필요하다.

본원은 N-end rule 경로를 통한 자가포식에 관여하는 새로운 물질을 표적으로 하는 자가포식 조절 방법 및 용도를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 서열번호 1의 서열을 기준으로 128 내지 163 잔기와 상호작용하는 N-end rule 라이겐드와 세포를 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 조절 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법은 한 구현예에서 인비트로에서 수행될 수 있으며, 본원에 따른 기술적 특징을 이용하여 인비트로에서 세포의 자가포식을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본원의 방법에 사용되는 N-end rule 라이겐드는 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 가지며, 이러한 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나이다. 상기 서열 중 Tyr-Ile-Phe-Ser-Thr는 sndvis virus nsP4 RNA polymerase 유래의 불안정화 N-말단 서열이다.

본원에 따른 방법에서, 상기 ZZ 영역과 라이겐드의 상호작용은 p62의 올리고머화를 유도한다.

다른 양태에서 본원은 또한 p62 단백질의 ZZ 영역과 상호작용하는 N-end rule 라이겐드를 포함하는 신경 변성질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원의 조성물에 포함되는 N-end rule 라이겐드는 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 가지며, 이러한 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나이다.

본원에 따른 약학 조성물은 단백질변성과 관련된 질환 (proteinopahty) 신경 변성질환의 치료에 사용될 수 있으며, 예를 들면 부신성 백색질형성장애(Adrenal Leukodystrophy), 알콜중독, 알렉산더병(Alexander's disease), 알퍼병(Alper's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증, 모세관확장실조(ataxia telangiectasia), 배튼병(Batten disease), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 캐너번병(Canavan disease), 뇌성마비, 코케인 증후군(cockayne syndrome), 피질기저퇴화(corticobasal degeneration), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 치명성 가계 불면증 (familial fatal insomnia), 전두엽 측두엽 변성증(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅톤병

(Huntington's disease), HIV-관련 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe's disease), 레비소체 치매(Lewy body dementia), 신경보렐리아증(neuroborreliosis), 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성경화증(multiple sclerosis), 발작수면

(narcolepsy), 니이만-픽병(Niemann Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 픽병(Pick's disease), 원발가쪽경화증(primary lateral sclerosis), 프리온 질환(prion disease), 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 레프숨병(Refsum's disease), 잔트호프병(Sandhoff disease), 실더병(Schilder's disease), 유독성 빈혈 속발성의 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼 병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 스틸-리차드슨-올스제위스키 병(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독(Tabes dorsalis), 독성 뇌병증(toxic encephalopathy)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 단백질변성과 관련된 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비 소체 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 헌팅톤병, 척수소뇌성 실조증 또는 척수구근 근위축증(spinobulbar musclular atrophy)을 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 p62에 의해 매개되는 자가포식을 조절하는 자가포식 조절제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기의 폴리펩타이드를 포함하는 시료를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 시험물질과 상기 단백질 또는 펩타이드의 ZZ 영역에서의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 시험물질과 접촉되지 않는 대조군과 비교하여, 자가포식이 변동, 예를 들면 증가 또는 감소된 경우, 상기 시험물질을 자가 포식 조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 스크리닝에 사용될 수 있는 시험물질은 N-end rule 라이겐드 예를 들면 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 갖는 것으로, Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나인 펩타이드 서열을 가진다.

본원에 따른 스크리닝 방법에스 상기 시료는 세포의 형태, 예를 들면 포유류 유래의 세포인, 예를 들면 HEK21, 마우스배아섬유세포 (Mouse embryonic fibroblast), HeLa, Hep3B, 또는 PC3 세포의 형태로 제공되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법은 또한 상기 b) 단계 대신에 또는 상기 b) 단계에 추가하여 상기 ZZ 영역과 라이겐드의 상호작용은 p62의 올리고머화 여부로 검출되는 것인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기와 상호작용하는 N-end rule 라이겐드와 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 조절 방법, 자가포식 조절제 및 자가포식제 스크리닝 방법은 N-end rule 경로를 통한 단백질 제거 기전을 통해 변성된 단백질의 비정상적인 축적으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료 방법 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 p62 단백질이 1 및 2 형의 불안정화 N-말단 잔기에 결합하는 것을 보여주는 결과이다. 도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 각 X-펩타이드를 이용하여 풀다운한 단백질의 ITRAQ 분석 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 X-펩타이드에 의해 풀다운된 단백질을 실버 염색 및 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 1c는 X-펩타이드 풀다운 분석 후, 침강된 단백질 중 p62 단백질을 전기영동/실버 염색으로 확인한 결과이다.
도 1d는 인비트로에서 전사되고 번역된 p62의 R11 펩타이드, F11 펩타이드 및 V11-펩타이드에 대한 결합여부를 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 1e는 p62/sqstm1의 N-end rule N-말단과의 결합 특이성의 특징을 규명하기 위한 것으로 내인성 p62 및 D3로 명명된 PB1, ZZ 및 TB 영역을 포함하는 외인성 p62 결손 돌연변이를 이용한 풀다운 분석결과이다.
도 1f는 바이오틴 표지된 X-펩타이드를 스트렙타비딘 코팅된 칩에 고정한 후, p62-D3-GST 단백질을 고정된 펩타이드에 주입한 후 R11 펩타이드, F11 펩타이드 및 V11-펩타이드에 대한 결합여부를 확인한 결과이다.
도 2a는 p62/sqstm1에서 일련의 결실 돌연변이 D1 내지 D8를 도식적으로 나타낸 것이고, 각 돌연변이의 R11 및 W11에 대한 결합여부르 풀다운 및 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 2b는 p62의 ZZ 영역의 일차 서열을 ClustalW 프로그램을 사용하여 다양한 생물 유래의 UBR E3 라이게이즈의 UBR 영역의 서열과 비교한 결과이다.
도 2c는 보존된 ZZ-잔기의 기능적 중요성을 결정하기 위하여, 인간 p62(1-440)의 D129, D142_145, D147_149, D151_154, H160_163 및 E177가 알라닌으로 치환된 6개의 점 돌연변이체의 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단 잔기 결합여부를 X-풀다운 분석법으로 분석한 결과이다.
도 2d는 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단에 결합에 중요한 ZZ 영역내의 부위를 구체적으로 특정하기 위하여, D3 C-말단에 생성된 결실 돌연변이체 및 이의 N-end rule N-말단에의 결합여부에 대한 X-펩타이드 풀다운 분석 결과이다.
도 2e는 ZZ 영역의 전형적 징크 핑거 모티브의 구성체인 두 개의 히스티딘 히스티딘 잔기의 N-end rule N-말단에의 결합 중요성을 확인하기 위하여, 히스티딘이 결실된 돌연변이체를 구축하고 이를 타입-1 (R11, H-11, 및 K-11) 및 타입-2 (F-11, W-11, Y-11 및 L-11) N-end rule N-말단 잔기와의 인비트로 결합 분석으로 확인한 결과이다.
도 2f는 PB1의 결실이 p62의 W-11 (Type-2) 펩타이드에 부정적 영향을 미치는 것을 나타내는 풀다운 분석 결과이다.
도 3a는 p62의 GRP78 조절에서의 역할을 규명하기 위하여, RNA 간섭분석 (RNAi)을 이용하여 HEK293에서 ER 스트레스 유도제인 thapsigargin의 존재 또는 부재하에서 p62를 제거하였으며, p62 제거의 효과는 상기 각 조건에서의 GRP78의 농도를 비교분석한 결과이다.
도 3b는 p62가 GRP78의 안정화에 중요한지 여부를 결정하기 위하여, RNAi로 p62가 제거된 HEK293 세포 또는 p62 제거 MEF 세포를 이용하여 사이클로헥사미드 추적 분석을 수행하고, GRP78 순환을 p62 대조군 세포와 p62 결실 세포에서 비교한 결과이다.
도 3c는 도 3b와 동일한 실험으로 대조적으로 thapsigargin 자극으로 GRP78 순환이 빨라졌으며, MEF 및 HEK293 대조군 세포에서의 GRP78의 반감기는 각각 2시간 및 3시간 아래인 것을 나타내는 실험결과이다.
도 3d는 펄스 추적 분석결과로, p62의 결실로 인해 GRP78의 축적이 초래되었으며 thapsigargin에 대한 반응한 반감기도 증가한 것을 나타낸다.
도 4a는 GRP78의 알지닌화가 프로테오좀 억제제인 MG132의 존재 중에서 thapsigargin로 자극시 HeLa 세포에서 유도되었음을 나타내는 웨스턴블랏 결과이다.
도 4b는 thapsigargin 처리시간이 길어지면 알지닌화-GRP78 (R-GRP78)을 포함하는 0.2 - 2 micron 크기의 반점이 형성된 것을 나타내는 면역형광분석 결과이다.
도 4c는 p62가 실제로 R-GRP78에 결합할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, p62로 HEK293 세포 추출물 및 친화성 라이겐드로 X-펩타이드 R11 (일차 불안정화 잔기), E11 (2차 불안정화 잔기), 및 V11 (안정화 대조군)을 이용한 인비트로에서 펩타이드 풀다운 분석 결과이다.
도 4d는 NHK가 세포에서 p62와 R-GRP78와 상호작용하는지 여부를 면역형광분석법으로 조사한 결과로 NHK 과발현으로 HeLa 세포에서 p62 소(foci) 형성 및 GRP78이 알지닌화가 유도되었다.
도 5a는 R-GRP78 및 기타 다른 N-end rule 단백질의 p62에의 결합이 이러한 올리고머화를 유도하여 자가포식에 이를 수 있는지를 조사하기 위하여, 합성 라이겐드 및, 전장 p62를 과발현하며 RA, FA 또는 WA와 같은 다양한 N-end rule 펩타이드 또는 대조군 펩타이드 AA, R 또는 AR 의 존재/부재 중에서 배양된 HEK293 세포 추출물을 이용한 비환원 SDS-PAGE 분석 및 p62 항체를 이용한 웨스턴블랏 결과이다.
도 5b는 N-end rule 상호작용에 의한 p62 올리고머화가 N-end rule 경로의 알지닌화 경로에 특이적이며, RA의 p62 올리고머화에 대한 효과는 용량 및 시간 의존적 방식임을 웨스턴블랏 및 ELISA로 관찰한 결과이다.

본원은 N-end rule 경로를 통한 자가포식에 있어 p62가 관여한다는 발견에 기초한 것으로 p62를 표적으로 하는 자가포식 조절 방법을 제공하고자 한다.

이에 한 양태에서 본원은 세포를 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기와 상호작용하는 N-end rule 라이겐드와 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 조절 방법에 관한 것이다.

본원에서 자가포식 (autophagy 또는 autophagocytosis)이란 라이소좀을 이용하여 세포내 불필요하거나 변성된 단백질을 포함하는 다양한 세포구성성분을 제거하는 이화작용을 일컫는 것으로, 자가포식의 조절은 세포내 성분의 정상적인 합성, 분해 및 재활용에 있어 필수적이다. 이 과정에서 자가포식체 (autophagosome)가 형성되고 이는 리소좀과 융합되어, 세포구성성분이 분해되거나 재사용된다. 자가포식에는 메크로, 마이크로 및 세파론 매개된 자가포식이 있으며, 모두 본원에 포함될 수 있으며, 특히 메크로 매개된 자가포식이 포함된다.

본원에서 N-end rule (N-말단 법칙) 경로란 N-말단 (단백질 또는 폴리펩타이드에 존재하는 아미노말단을 일컫는 것임)에 특정 불안정화 잔기 즉 N-degron을 갖는 단백질을 분해하는 단백질 분해 경로를 일컫는 것이다. N-end rule 경로의 기질(substrate)은 UBR 박스라고 불리는 N-degron 결합영역을 갖는 N-recognin이라는 단백질에 의해 인식된다. 이러한 UBR 박스는 기질의 처음 두 개 잔기와의 상호작용을 통해 기질을 인식하는데 이를 N-end rule이라 한다.

본원에서 조절 (modulation)이란, 생물학적 기능의 활성화, 자극 또는 상향 조절, 또는 저하 또는 하향 조절, 또는 양쪽 모두를 포함하는 것이다. 한 구현예에서는 자가포식 기능의 활성화을 의미한다. 나아가 조절이란, 인비트로 상태에서의 조절, 인비보 상태에서의 조절, 엑스비보 상태에서의 조절을 모두 포함하는 것이다.

본원에 따른 p62 (sequestosome-1)는 세포질내 존재하는 다수 영역을 포함하는 스캐폴드 단백질로, PKC, p38, RIP1 및 TRAF6과 결합하는 것으로 알려져 있으며, PKC와 상호작용하는 N-말단의 PB1 영역, RIP1과 상호작용하는 ZZ-형의 징크 핑거 (ZZ) 영역, 및 TRAF6 영역을 포함한다 (Sanz L et al., (1999) EMNO J. 18, 3044-3053). p62 단백질 서열 NP_003891 (서열번호 1), 핵산 서열은 NM_003900.4로 공지되어 있다. 하지만 이의 N-end rule 경로에 있어서의 구체적 기전은 알려진 바 없다

본원에서는 p62가 N-end rule 경로에 관여하는 신규한 N-recognin임을 규명하였으며, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 p62는 ZZ 영역을 통해 기존에 알려진 N-recognin 보다 높은 결합력으로 N-degron과 결합한다. 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 상기와 같은 N-end rule에 따른 결합으로 인해, p62에 닫힌 구조에서 열린 구조 (closed to open)로 구조적 변화 (conformational change)가 야기되고, 이는 자가포식의 활성화로 이어져 변성된 단백질이 제거된다. 이러한 구조적 변화는 p62의 올리고머화를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. p62의 올리고머화는 4개 이상이다.

이러한 측면에서 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기를 발현하는 세포와 N-end rule 라이겐드의 접촉을 통해 자가포식을 활성화 할 수 있다.

본원에 따른 상술한 p62의 전부 또는 일부를 발현하는 세포는 포유동물의 조직으로부터 분리된 일차 세포 예를 들면, 이로 제한하는 것은 아니나 뇌, 간, 췌장, 근육 유래의 세포, 포유류 유래의 확립된 세포 주 예를 들면 HEK21, Mouse embryonic fibroblast, HeLa, Hep3B, 및 PC3를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 본원의 효과가 필요한 세포라면 어느 것이든 사용될 수 있다.

본원에서 라이겐드란 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 포함하는 천연 또는 합성의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그 유도체로 길이는 두 개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 두 개 또는 열한개 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 또는 그 유도체가 사용된다. 이들은 천연 또는 비천연의 아미노산 잔기 (예를 들면 D- 또는 L-아미노산), 또는 펩타이드모방체를 포함한다.

본원에서 타입 1 및 타입 2의 N-end rule 말단 또는 불안정화 말단은 각각 Arg, Lys, 및 His (타입 1), 또는 Phe, Leu, Trp, Tyr, 및 Ile (타입 2)를 들 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala (RA) 또는 Arg-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Arg-Thr-Tyr(RIFSTIEGRTY)를 들 수 있다.

상기 언급한 바와 같이 p62는 ZZ영역을 통해 N-end rule 라이겐드에 결합을 하고, 이는 p62의 올리고머화를 포함하는 구조적 변화를 야기하여 자가포식을 활성화 한다.

자기포식은 세포내 변성 단백질을 제거하는 과정으로, 자가포식에 이상이 있는 경우, 변성된 단백질의 축적으로 인해 다양한 질환 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 신경퇴행성질환을 포함하는 신경변성 질환, 간질환, 항암 치료에 사용될 수 있다 (Hara t et al Nature 2006, Mizushima n et al Genes & Dev. 2007, Takamura a et al Genes & Dev. 2011, Ratuo p et al J Hepatology 2010 등 참조)

일 구현예에서는 단백질변성과 관련된 질환 (proteinopathy)에 사용되며, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비 소체 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 헌팅톤병, 척수소뇌성 실조증 및 척수구근 근위축증(spinobulbar musclular atrophy)를 포함한다.

다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 신경변성 질환은 부신성 백색질형성장애(Adrenal Leukodystrophy), 알콜중독, 알렉산더병(Alexander's disease), 알퍼병(Alper's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증, 모세관확장실조(ataxia telangiectasia), 배튼병(Batten disease), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 캐너번병(Canavan disease), 뇌성마비, 코케인 증후군(cockayne syndrome), 피질기저퇴화(corticobasal degeneration), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 치명성 가계 불면증 (familial fatal insomnia), 전두엽 측두엽 변성증(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅톤병 (Huntington's disease), HIV-관련 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe's disease), 레비소체 치매(Lewy body dementia), 신경보렐리아증(neuroborreliosis), 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성경화증(multiple sclerosis), 발작수면(narcolepsy), 니이만-픽병(Niemann Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 픽병(Pick's disease), 원발가쪽경화증(primary lateral sclerosis), 프리온 질환(prion disease), 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 레프숨병(Refsum's disease), 잔트호프병(Sandhoff disease), 실더병(Schilder's disease), 유독성 빈혈 속발성의 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼 병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 스틸-리차드슨-올스제위스키 병(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독(Tabes dorsalis), 독성 뇌병증(toxic encephalopathy)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 p62 단백질의 ZZ 영역과 상호작용하는 N-end rule 라이겐드를 포함하는 자가포식 조절제 또는 자가포식 조절용 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 자가포식 조절제 또는 약학 조성물에 포함되는 라이겐드 및 그 용도는 앞서 언급한 바와 같으며, 예를 들면 신경변성질환 등의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 관련 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본원에 따른 조성물의 투여로 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 자가포식 이상으로 인한 변성 단백질제거에 효과가 있는 본원 조성물은 변성 단백질 축적으로 인한 질환의 초기 증상, 또는 증상이 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

이에 본원의 자가포식 조절제는 약학 조성물로 제조될 수 있다. 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 상기 질환 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수도 있다.

본원에 따른 치료제 또는 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 예로서 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본원의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60 kg)의 경우, 약 1 ng 내지 10 mg/일, 특히 약 1 μg 내지 1mg/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

다른 양태에서 본원은 p62에 의해 매개되는 자가포식을 조절하는 자가포식 조절제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법은 일 구현예에서 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기의 폴리펩타이드를 포함하는 시료를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 시험물질과 상기 단백질 또는 펩타이드의 ZZ 영역에서의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 시험물질과 접촉되지 않는 대조군과 비교하여, 자가포식이 증가되는 경우, 상기 시험물질을 자가 포식 조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원의 스크리닝 방법에는 ZZ 영역을 포함하는 p62 단백질은 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 N- 또는 C-말단 또는 그 사이에서 일부가 결실된 형태의 것이 모두 포함된다. 한 구현예에서 본 방법에 사용될 수 있는 ZZ를 포함하는 p62의 인간 서열을 기준으로 128 내지 163 잔기를 포함한다. 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다.

한 구현예에서는 p62 단백질의 유전자는 GenBank Accession No NM_003900, 및 이에 의해 코딩되는 단백질 서열은 NP_003891을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

상기 본원에 사용되는 p62 단백질 전장 또는 그 일부는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝에 사용되는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 pET28b(Novagen)과 같은 진핵발현용 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또는 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.

상기 정제된 단백질과 시험물질과의 접촉은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 시험물질의 부재 또는 존재하에서 결합여부를 확인할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 풀다운 분석, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.

한 구현예에서, 본원에 따른 상술한 p62 단백질의 전부 또는 일부는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면 p62 단백질의 전부 또는 일부를 발현 (Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, HEK21, Mouse embryonic fibroblast, HeLa, Hep3B, 및 PC3 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출하여, 예를 들면 공동면역침전법, 면역형광법을 통하여 p62와 라이겐드와의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, 자가포식을 억제하거나 또는 대안적으로 또는 이와 함께, p62의 올리고머화를 유도한 것을 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명에서 "시험물질"은 앞서 언급한 라이겐드를 포함하는 것으로, p62의 ZZ 영역과 결합을 포함하는 상호작용을 통하여, 자가포식을 활성화할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서는 저분자화합물이 시험물질로 사용될 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본원에 따른 다른 구현예에서, 상기 시험물질은 타입 1 또는 타입 2의 N-end rule 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

본원의 방법은 시험물질과 p62 단백질의 ZZ 영역에서의 상호작용을 검출하여, 이를 자가포식 활성화 여부와 연관시키는 단계를 포함하며, 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 시험물질과 접촉되지 않는 대조군과 비교하여, 자가포식이 증가되는 경우, 상기 시험물질을 자가 포식 조절 후보물질로 선별한다. 또안 대안적으로 또는 이에 추가하여 p62의 올리고머화로 검출되며, 이 경우 상기 a) 단계는 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기를 갖는 단백질의 형태로 제공될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 자가포식의 증가 또는 감소여부 또는 올리고머화는 공지된 방법으로 검출될 수 있다. 전자는 예를 들면 웨스턴블랏과 컨포컬 마이크로 스코피 방법을 사용한 자가포식 플럭스 분석법 (Autophagy flux assays)으로 검출될 수 있으며, 후자는 웨스턴블랏, 필터트렙 에세이 및/또는 질량분광분석법 등으로 검출될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 자가포식의 활성화를 유도하는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상, 또는 이 이상을 증가된 것을 후보물질로 선별할 수 있다.

본원에 따른 스크리닝 방법에 의해 선별된 후보물질은 후속 연구를 통해 신약으로 개발될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본원에 사용된 실험방법 및 재료는 다음과 같다.

실험방법 및 재료

포유류 세포에서 P62 결손 단백질의 과발현

내인성의 또는 p62 결손 돌연변이 단백질을 이용한 X-펩타이드 풀다운 분석을 위해, HEK293 세포주를 하기를 발현하는 플라스미드로 임시전달이입이하여 사용하였다. PCR로 증폭된 일련의 도메인 결손 돌연변이체인 p62/sqstm1을 EcoRI 및 XhoI 부위의 pcDNA.3.1/myc-his 플라스미드에 클로닝한 후, HEK293 세포주에 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 임시 전달이입하였다. 이어 24시간 후에, 세포를 수집하여 5X 부피의 저장성 완충액 (10mM KCl, 1.5mM MgCl₂,10mM HEPES pH=7.9)에 현탁한 후 30분간 둔 후, 동결 및 해동 반복을 5회 수행한 후, 2,000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하였다.

X-펩타이드 풀다운 분석

이를 위해 N-말단에 Arg, His, 또는 Lys (Type-1) 잔기; Phe, Trp, Tyr, 또는 Leu (Type-2); 또는 Val, Asp, 또는 Gly (안정화 대조군)을 포함하는 12-mer 펩타이드 (X-I-F-S-T-I-E-G-R-T-Y-K-biotin)를 C-말단의 바이오틴을 통해 스트렙타비딘 아가로스 레진(Thermo)에 가교하였다. 바이오티닐화 펩타이드 및 스트렙타비딘 아가로스의 비는 1ml의 침강 레진 당 0.5mg의 용해 펩타이드를 사용하였다. 혼합물을 5X 부피의 PBS에 희석한 후 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 이어 비드를 2000rpm에서 3분간 전기영동한 후 PBS로 3회 세척하였다. 150-200㎍의 총 단백질을 포함하는 30㎕의 추출물을 취하여, 300㎕의 결합 완충액 (0.05% Tween 20, 10% Glycerol, 0.2M KCl, 20mM HEPES pH=7.9)으로 희석한 후 X-peptide 비드 (50㎕ packed vol)와 혼합하였다. 이어 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 약하게 회전시키면서 반응하였다. 2000rpm에서 30초간 원심분리하여 비드를 침전시키고, 1m의 결합 완충액으로 5회 세척하거나 또는 4℃에서 20분씩 3회 세척하였다. 이어 20㎕ 2X SDS-PAGE에 재현탁한 후 100 ℃에서 5분간 가열한 후, 젤에 로딩한 후 전기영동 하였으며, 풀다운된 p62 단백질은 항-myc 항체로 검출하였다.

표면플라즈몬공명 (Biacore) 분석

한 개의 플로우 셀 중에 미리 고정된 스트렙타비딘을 구비한 Sensor chip SA (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 바이오티닐화된 biotinylated-R11 (RIFSTIEGRTY)/V11(VIFSTIEGRTY)/F11(FIFSTIEGRTY) 펩타이드로 포화시켰다.

140㎕의 바이오티닐화된 R11/V11/F11 펩타이드 (10 μM)를 플로우셀에 10㎕/min 의 속도로 10분간 주입하여 스트렙타비딘 칩이 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 R11/V11/F11-펩타이드로 포화되도록 하였다. 결합 카이네틱스를 분석하기 위하여, pGEX4T1에 도입된 p62-D3-GST를 분리정제한 후 E.coli에서 발현하였다.이어 다양한 농도로 p62-D3-GST를 HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, pH7.4 / 0.15M NaCl / 3mM EDTA / 0.005% 계면활성제 P20)에 희석하여, 센서칩에 30㎕/분의 속도로 150초 동안 주입하였다. 반응 유니트 (Response Unit, RU)을 수득하여, 결합속도 (association rate) 상수 (ka)를 결정하였다. 결합 후에, HBS-EP 완충액을 30㎕/분의 속도로 420 초 동안 주입하여 p62-D3를 고정된 R11/V11/F11 펩타이드로부터 분리하고, RU를 수집하여 해리속도 상수 (kd)를 결정하였다. 1% 용출 완충액 (20mM HEPES pH=7.0, 0.2M NaCl, 10% Glycerol, 2mM DTT)을 주입하여 수득한 RU를 매체 대조군으로 사용하였다. Biacore X-100 컨트롤 소프트웨어를 사용하여 RU의 변화를 측정하고 결합 커브를 작성하였다. SPR 실험을 이용하여 수득한 커브를 분석하였고, 고정된 바이오티닐화된 펩타이드에 대한 p62-D3-GST 해리평형상수 (KD)는 카이네틱 평가 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 해리평형상수 KD (M)는 KD = kd/ka 식으로부터 계산하였으며, 상기 식에서 kd 및 ka는 각각 해리 및 결합 속도 상수를 나타낸다.

올리고머화 분석

p62/sqstm1-myc/his를 발현하는 플라스미드를 lipofectamine 2000를 제조자의 방법에 따라 이용하여 HEK293 세포에 임시적으로 전달이입하였다. 24시간 후에, 세포를 융해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M KCl, 0.1 % Nonidet P-40, 10 % glycerol, protease inhibitor and phosphatase inhibitor)으로 융해하였다. 이어 냉동-해동 후, 세포 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 정치한 후 4℃, 13,000 x g에서 20분동안 원심분리하였다. 브래드포드 분석으로 단백질 농도를 결정하였다. 올리고머화 분석을 위해, 1μg의 단백질을 100μM 베스타틴의 존재 중, 실온에서 2시간 동안 최종농도 0.5 또는 1M 로 물에 용해된 다이펩타이드의 존재/부재 중에서 배양하였다. 시료를 4% 리티움 도데실 설페이트 (LDS)를 포함하는 비환원성 로딩 완충액에 혼합한 후 95에서 10분간 가열한 후 3% 스태킹 및 12% 분리 SDS PAGE에 로딩한 후 전기영동 하였다. p62의 모너머, 올리고머 및 응집체는 항-p62 및 항-myc항체 혼합물을 이용하여 검출하였다.

실시예 1 p62의 타입 1 및 2의 불안정화 N-말단 잔기에의 결합 확인

N-degron과 상호작용하는 단백질을 규명하기위하여, X-펩타이드 풀다운 분석 및 질량분광분석과 연계된 iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation)을 수행하였다. 구체적으로, N-end rule 상호작용 단백질로는 래트 정소 추출물을 사용하였으며 스트렙타빈 비드에 고정화된 바이오틴으로 표지된 X-펩타이드 (R11 (type 1), F11 (type 2), 및 V11 (안정화 대조군)을 사용하였다. X-펩타이드에 연결된 10mer 링커는 N-end rule의 기질인 신드비스 바이러스 폴리머라제 nsP4 에서 유래한 것이다. 각 X-펩타이드를 이용하여 풀다운한 단백질은 ITRAQ 표지 기법을 사용하여 상이한 색의 형광물질로 표지되었다 (도 1a). Mascot 스코어를 근거로 한 상기 단백질체 분석을 통해 약 200여개의 단백질을 규명하였으며, N-end rule 경로에 관여하는 공지의 포유류 UBR box E3 패밀리, UBR1, UBR2, UBR4 및 UBR5을 포함하였다. 상기 결과는 X-펩타이드 풀다운 분석으로 확인하였다. 그 결과 UBR1은 R11 및 F11 풀다운 분석 모두에서 나타났으며, UBR2는 F11 풀다운 분석에서만 나타났고, UBR4 및 UBR5는 R11 분석에서 나타났으며, 이는 실버 염색된 젤 및 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 1b). 안정화 대조군인 V11을 사용한 풀다운 분석에서는 UBR 단백질이 침강되지 않았으며, 이는 침강분석이 목적하는 대로 특이적으로 작용하였음을 나타내는 것이다.

UBR E3 라이게이즈에 추가하여, R11 침강 시료에서 질량분광분석으로 확인된 것이 시케스토좀(sequestosome) 1 (p62) 단백질이다. p62/sqstm1은 유비퀴틴화되지 않은 단백질을 자가포식체 (autophagosome)로 유도하여 분해되도록 하는 자가포식 기질이다. 단백질체성 (proteosomal) 분해를 위해 기질을 옮겨주는 중요한 유비퀴틴-표적 인자이다. 이러한 결과는 X-펩타이드 풀다운 분석 후, 침강된 단백질의 전기영동/실버 염색과 웨스턴블랏으로 확인하였다. 실버 염색된 젤에서 R11-풀다운 시료에서는 분자량 62kDa 부근에서 강한 밴드가 있었으나, 음성 대조군인 V11-풀다운 시료에서는 이러한 밴드가 관찰되지 않았다. 질량분광분석 결과 이 밴드는 p62인 것으로 나타났다 (도 1c). 웨스턴블랏 결과 인비트로에서 전사되고 번역된 p62가 R11 펩타이드에 특이적으로 강한 결합을 나타낸 반면, F11 펩타이드에는 약하게, 그리고 V11-펩타이드에는 결합하지 않았다 (도 1d). 실험에 사용한 양을 기준으로, R11 펩타이드는 40%를 초과하는 효율로 p62를 침강할 수 있는 반면 F11 펩타이드의 효율은 5% 이었다. 이러한 결과는 디펩타이드 경쟁 분석으로 확인하였으며, RA 펩타이드가 p62와의 결합에서 R11 펩타이드와 가장 효과적으로 경쟁하였으며, 또다른 타입 1 N-end rule 펩타이드인 HA가 그 다음으로 경쟁에 효과적이었다 (도 1D). 타입 2 펩타이드 중에서, WA는 효과가 적으며, FA는 효과가 없었다. N-end rule 펩타이드가 아닌, AR과의 경쟁 분석 결과 RA, HA 및 WA이 N-end rule 특이적인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 p62가 광범하게 타입 1 및 타입 2의 N-end rule 펩타이드에 결합할 수 있음을 나타내는 것이다.

나아가 p62/sqstm1의 N-end rule N-말단과의 결합 특이성의 특징을 규명하기 위하여, 내인성 p62 및 D3로 명명된 PB1, ZZ 및 TB 영역을 포함하는 외인성 p62 결손 돌연변이를 이용한 풀다운 분석을 수행하였다. 내인성 p62는 3 종류의 모든 타입-1 N-end rule N-말단 잔기인 R11, H11 및 K11와 결합할 수 있다 (도 1e). p62는 R11-펩타이드에 강하게 결합하며, K11에는 중간정도 및 H11에는 약하게 결합하였다. 내인성 p62는 또한 4 종류의 N-end rule N-말단 잔기 중 3 종류, 즉, F11, W11 및 Y11에 결합하였으나, L11에는 결합하지 않았다. Arg (R), His (H) 및 Lys (K)은 양하전된 측쇄기를 가지며, Phe (F), Typ (W) 및 Tyr (Y)은 방향족 측쇄를 가진다. p62와 결합하는 아미노산의 특징으로부터 p62가 양성으로 하전되거나 방향족 측쇄를 선호한다는 것을 알 수 있다. 반면, p62는 Val (V), Leu (L) 및 Gly (G)과 같은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산과 음하전된 측쇄를 갖는 Asp (D)과 같은 아미노산은 선호하지 않았다. 외인성의 p62 D3 돌연변이는 타입 1 및 타입 2의 불안정화 N-말단 잔기와 결합할 수 있었으며, 내인성 p62보다는 효과적이지 않았다 (도 1e). D3 돌연변이체는 안정적 유형의 펩타이드인 V11, D11 및 G11 에는 결합하지 않았는데, 이는 상호작용이 p62와 마찬가지로 N-end rule 특이적임을 나타낸다. 이러한 결과는 p62가 광범위한 타입 1 및 타입 2 N-end rule N-말단에 결합할 수 있음을 나타내며, 이는 p62가 N-end rule 경로의 새로운 구성인자임을 나타내는 것이다.

이어, p62-D3 및 다양한 N-말단 아미노산과의 결합 친화도 및 카이네틱스를 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(Biacore, USA)를 이용하여 조사하였다. X-펩타이드 풀다운 실험결과 p62가 R11 펩타이드에는 강하게 F11에는 약하게, V11에는 결합하지 않았다. p62의 불안정화 및 안정화 N-말단에의 결합 상수를 측정하게 위하여, p62-D3-GST를 E. coli에서 발현하여 50% 순도로 정제하였다. 바이오틴 표지된 X-펩타이드를 스트렙타비딘 코팅된 칩에 고정한 후, p62-D3-GST 단백질을 고정된 펩타이드에 주입하였다. 풀다운 결과와 마찬가지로, p62-D3-GST는 R11 펩타이드에는 강하게 F11에는 약하게, V11에는 결합하지 않았다 (도 1f). R11 및 F11의 KD 값은 각각 30 nM 및 300 nM인 것으로 나타났으며, 이는 종전에 알려진 N-recognin의 낮은 마이크로몰라 수준 결합력과 비교하여 매우 우수한 것이다. 이러한 결과는 p62와 불안정화 N-end rule N-말단의 상호작용을 나타내는 것이다.

실시예 2 p62 ZZ 영역의 N-end rule N-말단 결합 규명

p62에서 불안정화 N-end rule N-말단을 인식하는 영역을 규명하기 위하여, p62/sqstm1에서 일련의 결실 돌연변이 (D1 내지 D8)을 구축한 후 이들의 R11 및 W11에의 결합여부를 X-펩타이드 풀다운 분석으로 확인하였다. p62 결손 돌연변이를 포함하는 벡터를 HEK293 세포에서 발현시킨 후, 세포의 전 융해물(lysate)을 분석에 사용하였다. D1 내지 D4는 C-말단부위에서 연속적으로 결실된 돌연변이체이고, D5 내지 D8은 C-말단부위에서 연속적으로 결실된 돌연변이체이다 (도 2a). D8을 제외하고 HEK293 세포에서의 발현은 항-히스티딘 항체를 사용한 웨스턴블랏으로 검출하였다. 실시예 1의 결과와 마찬가지로 전장 p62는 R11 및 W11 펩타이드에 강하게 결합하였다. R11 및 W11에 대한 돌연변이체의 결합 양상도 유사하였다. 돌연변이체 중에서 ZZ type zinc finger (ZZ) 영역을 포함하는 D2, D3, D4 및 D5가 가장 강한 결합력을 나타냈다. TRAF 영역을 포함하는 D3 및 D4는 D2 및 D5와 비교하여, R11 및 W11 펩타이드에 더 강하게 결합하는 것으로 나타났는데, 이는 ZZ 영역을 둘러싼 TRAF 영역이 p62가 R11 및 W11 펩타이드의 최적 결합에 필요한 것임을 나타내는 것이다. ZZ 영역이 없는 D1, D6 및 D7는 R11 및 W11 펩타이드에 결합하지 않았다. 이러한 결과는 ZZ 영역이 타입 1 및 2의 N-end rule N-말단에 결합에 관여함을 나타내는 것이다.

UBR 박스는 UBR1 내지 UBR7로 명명된 잘 보존된 N-end rule E3 패밀리에 존재하는 70개 잔기의 기본적인 기질 인식 영역이다. p62의 ZZ 영역의 UBR 박스와의 유사성을 조사하기 위하여, p62의 ZZ 영역의 일차 서열을 ClustalW 프로그램을 사용하여 다양한 생물 유래의 UBR E3 라이게이즈의 UBR 영역의 서열과 비교하였다. 그 결과 UBR 박스의 전형적인 C2H2 zinc finger fold가 p62-ZZ에서도 잘 보존된 반면, 비정형적인 UBR 박스의 binucleate Zn-finger fold는 p62-ZZ에서 부분적으로만 발견되었다 (도 2B). UBR 영역은 매우 잘 보존된 3개의 아스파르트산 (D118, D150 및 D153)을 포함하며, 이는 기질의 N-말단의 불안정화 잔기에의 결합에 필수적이다. p62-ZZ 영역 또한 D129, D147 및 D149를 포함하는 3개의 아스파르트산 잔기를 포함하고 있었다. ZZ 영역의 D147만이 UBR 박스(D118)에서 보존이 되었지만, 음하전된 (산성) 위의 3개의 아스파르트산 잔기가 UBR 박스의 경우와 마찬가지로 N-말단의 불안정화 잔기에의 결합에 필수적인 것으로 보인다. 이러한 결과는 p62가 양하전된 (염기성) 측쇄와의 결합을 선호하는 풀다운 분석결과와 일치하는 것이다. C2H2 징크 핑거 구조 및 3 개의 아스파르트산 잔기에 추가하여, 모든 서열에서 ZZ 영영내에 3 개의 동일한 (적색) 잔기 (Y140, D147 및 L150)와 ZZ 영역바깥의 두 개의 동일한 잔기 (G173 및 W184) 및 하나의 보존된 (적색) 잔기 (E177)이 발견되었다.

서열비교 분석에서 규명된 동일하며 보존된 ZZ-잔기의 기능적 중요성을 결정하기 위하여, 인간 p62(1-440)의 D129, D142_145, D147_149, D151_154, H160_163 및 E177가 알라닌으로 치환된 6개의 점 돌연변이체를 구축하여, X-풀다운 분석법으로 분석하였다. 그 결과 ZZ 영역내의 돌연변이체는 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단 잔기에 모두 결합하지 못하였다 (도 2C). 이러한 결과는 ZZ 및 UBR이 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단 잔기에 유사한 결합 특성을 가지는 것을 나타내며, 여기에서 Cys 및 His 잔기가 구조적 요소로 작용하며, 아스파르트산이 N-데그론 인식에 중요한 역할을 하는 것임을 나타낸다. ZZ 영역 바깥에 존재하는 보존된 E177의 알라닌으로의 돌연변이에서는 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단 잔기에 결합에 영향이 없었다. 종합하면 이러한 결과는 p62의 ZZ 영역의 N-end rule N-말단에의 결합 특성이 UBR 박스와 유사하며, 이는 ZZ 영역과 UBR 박스가 구조적으로 유사함을 나타내는 것이다.

타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) N-end rule N-말단에 결합에 중요한 ZZ 영역내의 부위를 구체적으로 특정하기 위하여, D3 C-말단에 결실 돌연변이체를 만들고, 이의 N-end rule N-말단에의 결합여부를 X-펩타이드 풀다운 분석으로 확인하였다. 총 9개의 p62 결실 돌연변이체 (도 2d)를 구축하고, 이들의 HEK293 세포에서의 발현을 항-myc 항체를 사용하여 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 2d 윗 패널). CD1 내지 CD6는 타입 1 (R-11) 및 타입 2 (W-11) 펩타이드에 모두 결합하였다 (도 2d 중간 및 아래 패널). ZZ 영역의 전형적 징크 핑거 모티브의 구성체인 두 개의 히스티딘 잔기가 없는 CD7 부터의 돌연변이체는 결합하지 않았다. 상기 두 개의 히스티딘 잔기의 N-end rule N-말단에의 결합 중요성을 확인하기 위하여, 더 많은 타입 즉 타입-1 (R11, H-11, 및 K-11) 및 타입-2 (F-11, W-11, Y-11 및 L-11) N-end rule N-말단 잔기를 인비트로 결합 분석에 사용하였다 (도 2e). CD-5 변이체는 L-11을 제외한 모든 타입-1 및 타입-2 N-end rule N-말단 잔기에 내인성 p62와 유사한 정도로 결합하였다. CD-6는 K-11에 결합하지 않는 것을 제외하고는 CD-5 변이체와 마찬가지로 N-end rule N-말단 잔에 결합하였다. 이러한 결과는 N-end rule N-말단 잔기의 결합에 필수불가결한 C-말단의 최소 ZZ 영역이 H163까지임을 나타내는 것이다.

이어 N-말단의 최소 ZZ 영역을 X-펩타이드 풀다운 분석으로 결정하였다. 전장 p62의 PB1 영역부터 시작하여 ZZ 영역의 중간까지의 부위에서 6개의 N-말단 결실 돌연변이체를 만들었다. 모든 돌연변이체의 발현여부를 항-Myc 항체를 사용하여 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 2e 윗 패널). ND-1, ND-2, ND-3 및 ND-4은 R-11 (Type-1) 펩타이드에 결합하였으나, ND-5 및 ND-6는 결합하지 못하였다. ND-5는 UBR 박스에서 보존된 비정형적 binucleate Zn-finger의 요소인 시스테인 잔기 (C128) 및 아스파르트산 (D129)가 없다. 놀랍게도 PB1의 결실이 p62의 W-11 (Type-2) 펩타이드에 부정적 영향을 미치는 것으로 나타났는데, 이는 PB1 영역이 ZZ 영역의 구조 유지에 중요함을 나타내는 것이다 (도 2f 아래 패널). 아울러 PB1 영역이 p62의 N-end rule N-말단에 최적 결합에 필요한 것임을 나타낼 수 있다. 종합하면, ZZ 영역의 C128 및/또는 D129이 타입-1 및 타입-2 N-end rule N-말단에의 결합에 중요함을 나타내는 것이다.

실시예 3 p62에 의한 ER 세파론인 GRP78의 순환(turnover)

상기 결과로부터 p62가 N-end rule 경로의 새로운 인자로 밝혀졌으므로, p62의 기질을 조사하였다. 우선 공지된 또는 예상 가능한 N-end rule 기질을 평가하였다. 포유류에서 알려진 기질이 몇 개 없으며, 이들은 RGS 패밀리에 속하는 단백질인 RGS4, RGS5 및 RGS16와 BRCA1 및 CDC6을 들 수 있다. 가능한 N-end rule 기질은 GRP78 및 PDI, ER 세파론이다. GRP78이 p62와 마찬가지로 단백질의 질적 관리에 관여하므로, 이를 p62의 기질로서 먼저 조사하였다.

p62의 GRP78 조절에서의 역할을 규명하기 위하여, RNA 간섭분석 (RNAi)을 이용하여 HEK293에서 ER 스트레스 유도제인 thapsigargin의 존재 또는 부재하에서 p62를 제거하였으며, p62 제거의 효과는 상기 각 조건에서의 GRP78의 농도를 비교하여 평가하였다. 웨스턴블랏 분석결과 GRP78 농도는 p62의 제거로 인해 스트레스가 없는 RNAi 대조군과 비교하여 상향 조절되었다. 그 결과 thapsigargin는 대조군 siRNA 및 p62 siRNA에서 모두 GRP78의 발현을 유도하였으며, GRP78 농도는 RNAi 대조군과 비교하여 p62 제거 군에서 더 높았다 (도 3a 윗 패널). 이는 p62가 GRP78의 조절에 관여함을 나타내는 것이다. p62 제거는 GRP78 mRNA 발현을 유도하지 않으며, 이는 GRP78 상향조절에 미치는 p62 제거효과가 전사후 수준에서 작용하는 것임을 나타내는 것이다 (도 3a). 이러한 결과는 p62가 GRP78의 이행성 개시 또는 안정성에서 조절 역할을 하는 것을 나타낸다. p62가 GRP78의 안정화에 중요한지 여부를 결정하기 위하여, RNAi로 p62가 제거된 HEK293 세포 또는 p62 제거 MEF 세포를 이용하여 사이클로헥사미드 추적 분석을 수행하였으며, GRP78 순환을 p62 대조군 세포와 p62 결실 세포에서 비교하였다. 비-스트레스 조건에서, GRP78 순환은 반감기가 p62-WT MEF 세포의 경우 6시간, 대조군 HEK 293 세포의 경우 8 시간이 넘는 매우 느린 것으로 나타났다. 이어 p62 제거 HEK293 세포 및 p62 제거 MEF 세포 어느 것도 GRP78 순환에는 유의한 영향이 없었다 (도 3b). 대조적으로 thapsigargin 자극으로 GRP78 순환이 빨라졌으며, MEF 및 HEK293 대조군 세포에서의 GRP78의 반감기는 각각 2시간 및 3시간 아래였다 (도 3c). 반면 p62 제거된 세포의 경우 GRP78가 축적되었으며, 이의 반감기가 대조군과 비교하여 6시간보다 길어졌다. 펄스 추적 분석결과도 이와 일치하였으며, p62의 결실로 인해 GRP78의 축적이 초래되었으며 thapsigargin에 대한 반응한 반감기도 증가하였다 (도 3d). 이러한 결과는 p62가 thapsigargin 유도된 GRP78 순환에 관여하는 것을 나타내는 것이다.

실시예 4 GRP78의 알지닌화에 의한 p62에 의해 인식되는 N-degron 및 ERAD 기질 NHK의 p62-의존적 자가포식 분해

GRP78은 ATE1 의존적 방식으로 E19에서 알지닌화되어 GRP78 및 잘못접힌 ER 클라이언트를 포함하는 단백질 복합체를 자가포식으로 제거하는 것으로 나타났다 (Unpublished). GRP78은 잘못접힌 단백질에 대한 반응에서 중요한 역할을 하는 ER에 머무르는 세파론으로, ER 신호 서열이 ER로 전이된 후 잘려나가, N-말단 잔기인 보존된 pro-N-degron인 E19이 노출되고 ATE1에 의해 알지닌화된다 (도 3a). 웨스턴블랏 결과에 의하면 GRP78의 알지닌화는 프로테오좀 억제제인 MG132의 존재 중에서 thapsigargin로 자극시 HeLa 세포에서 유도되었으며 (도 4a), thapsigargin 처리시간이 길어지면 알지닌화-GRP78 (R-GRP78)을 포함하는 0.2 - 2 micron 크기의 반점이 형성되었다 (도 4b). 이러한 R-GRP78 반점은 thapsigargin에 의해 유도된 p62를 포함하는 반점의 위치와 같았다. 반점 형성은 LC3의 제거로 효과적으로 차단되었는데, 이는 LC3가 thapsigargin에 의해 유도된 R-GRP78 및 p62의 반점 형성에 중요함을 나타내는 것이다. p62 제거로 인해 R-GRP78의 반점 형성이 차단되었으며, 이는 p62가 R-GRP78의 반점 형성에 중요함을 나타내는 것이다 (도 4B). p62 및 LC3에 의한 반점 형성에서 R-GRP78의 의존성은 R-GRP78이 ER 스트레스에 대한 자가포식체와 관련되어 있음을 나타낸다. p62가 실제로 R-GRP78에 결합할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인비트로에서 펩타이드 풀다운 분석을 수행하였다. p62로 HEK293 세포 추출물 및 친화성 라이겐드로 X-펩타이드 R11 (일차 불안정화 잔기), E11 (2차 불안정화 잔기), 및 V11 (안정화 대조군)을 사용하였다. X-펩타이드 뒤의 10mer 링커는 E19에서 시작하는 GRP78 N-말단 잔기에서 유래되었다. 실험결과 p62는 R11 (GRP78) 펩타이드에 대한 강한 결합력을 나타냈으며, E11 (GRP78) 및 V11 (GRP78) 펩타이드는 결합하지 않았다 (도 4c). p62의 R-11 (GRP78) 펩타이드에 대한 친화성은 이의 R-11 (nsP4)에 대한 친화도와 비교하여 훨씬 낮았는데, 이는 N-말단 잔기 이외의 변수가 친화도를 결정하는 것을 나타낸다. ER 스트레스가 GRP78의 알지닌화를 유도하고, 알지닌화된 R-GRP78은 N-end rule 의존적 방식으로 p62와 상호작용을 하며, R-GRP78/p62 복합체가 자가포식체에 위치한다는 결과는 이러한 N-end rule 상호작용이 선별적 자가포식에 의해 잘못접힌/응집된 ER 클라이언트의 제거에 관여한다는 것을 나타낸다. 이를 증명하기 위하여, 알파 1-안티트립신의 변이체로 ER 공간에서 비정상적 접힘을 초래하는 돌연변이를 포함하는, NHK(null of Hong Kong)으로 불리는 ERAD 기질을 사용하였다. NHK가 세포에서 p62와 R-GRP78와 상호작용하는지 여부를 면역형광분석법으로 조사하였다. 그 결과 NHK 과발현으로 HeLa 세포에서 p62 소(foci) 형성 및 GRP78이 알지닌화가 유도되었다 (도 4d). 양 단백질을 포함하는 대부분의 세포에서, NHK와 p62 (윗 패널) 사이 및 NHK와 R-GRP78사이(아래 패널)에서 소(foci)가 상당히 같이 위치하는 것으로 나타났다. ER 스트레스 조건에서 NHK의 안정성에 있어 p62 및 GRP78의 역할을 규명하기 위하여, 대조군 siRNA 또는 siGRP78로 전달이입된 p62-WT 및 p62-KO MEF 및 HEK293 세포에서 NHK-GFP를 과발현한 후 thapsigargin의 존재 중에서 사이클로헥사마이드 추적 분석을 수행한 결과 p62 및 GRP78 제거로 인해 NHK가 안정화되는 것으로 나타났다 (도 4d 오른쪽). 이는 p62의 GRP78과의 N-end rule 상호작용으로 인해 선별적 자가포식에 의한 잘못접힌/응집된 단백질의 분해가 유도되었음을 나타내는 것이다.

실시예 5 N-end rule 펩타이드에 의한 p62의 알로스테리 조절을 통한 R-GRP78 효과 생성

자가포식을 위해 p62의 올리고머화가 필요한 것으로 알려져 있다. R-GRP78 및 기타 다른 N-end rule 단백질의 p62에의 결합이 이러한 올리고머화를 유도하여 자가포식에 이를 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 R-GRP78와 같은 효과를 유도할 수 있는 합성 라이겐드 및, 전장 p62를 과발현하며 RA, FA 또는 WA와 같은 다양한 N-end rule 펩타이드 또는 대조군 펩타이드 AA, R 또는 AR 의 존재/부재 중에서 배양된 HEK293 세포 추출물을 이용한 비환원 SDS-PAGE 분석을 수행하여 이들 N-end rule 펩타이드가 p62의 올리고머화를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. p62 항체를 이용한 웨스턴블랏 결과 RA는 효과적으로 p62의 올리고머화를 유도하였으며, 다른 N-end rule 펩타이드인 FA 및 WA와 대조군인 AA, R 및 AR은 효과가 없는 것으로 나타났다 (도 5a). 이러한 결과는 N-end rule 상호작용에 의한 p62 올리고머화가 N-end rule 경로의 알지닌화 경로에 특이적인 것을 나타낸다. RA의 p62 올리고머화에 대한 효과는 용량 및 시간 의존적 방식이었다 (도 5B). p62의 올리고머화가 자가포식체 형성 부위로의 전이가 선행되어야 하지만, LC3와의 상호작용으로 p62 응집체의 자가포식체의 이동이 원활하게 된다. 따라서 p62 전장 또는 LIR 및 UBA 영역이 결여된 p62-D3 코딩하는 플라스미드로 전달이입된 p62 KO MEF 세포를 사용한 ELISA 분석을 통해 RA 펩타이드가 LC3와 p62와의 상호작용을 향상시키는지 여부를 조사하였다. 세포 융해물이 상기 두 종류의 p62 단백질 발현여부를 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 5b). ELISA 분석은 세포 융해물을 글루타치온 코팅된 플레이트에 고정된 GST로 태깅된 LC3와 배양하여 수행하였다. p62에 대한 정제된 마우스 모노클론 항체를 이용하여 실험을 수행한 후 450nm에서의 흡광도 (OD)를 측정하였다. 실험결과 전장 p62는 LC3에 대하여 상당한 결합을 나타낸 반면, D3는 결합하지 않았는데, 이러한 ELISA 결과는 p62-LC3가 상호작용함을 나타내는 것이다. N-end rule 펩타이드가 p62와 LC3와의 상호작용을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, N-end rule 펩타이드 RA, FA 및 WA와 대조군 펩타이드 AR의 농도를 증가시키면서 전장 p62 및 LC3와 배양하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이, RA만이 10 mM 부근에서 p62와 LC3의 상호작용을 2배 증가시켰으며, 다른 펩타이드는 효과가 없었다. 이러한 결과는 RA (N-end rule 경로의 알지닌화 경로) 만이 효과가 있고, FA나 WA는 효과가 없는 p62의 올리고머화 실험에서 나타난 결과와 일치하는 것이다. 이러한 결과는 또한 p62 올리고머화가 LC3에의 결합 및 자가포식체 형성 부위로의 이동에 필요함을 나타내는 것이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Method for modulating autophagy mediated by p62 through ZZ domain and its use <130> DP201211013P <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> homo sapiens sequestosome-1 isoform 1 <220> <221> PROTEIN <222> (1)..(440) <223> sequestosome-1 isoform 1 <400> 1 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Glu Cys Arg Arg Asp His Arg Pro Pro 100 105 110 Cys Ala Gln Glu Ala Pro Arg Asn Met Val His Pro Asn Val Ile Cys 115 120 125 Asp Gly Cys Asn Gly Pro Val Val Gly Thr Arg Tyr Lys Cys Ser Val 130 135 140 Cys Pro Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Val Cys Glu Gly Lys Gly Leu His 145 150 155 160 Arg Gly His Thr Lys Leu Ala Phe Pro Ser Pro Phe Gly His Leu Ser 165 170 175 Glu Gly Phe Ser His Ser Arg Trp Leu Arg Lys Val Lys His Gly His 180 185 190 Phe Gly Trp Pro Gly Trp Glu Met Gly Pro Pro Gly Asn Trp Ser Pro 195 200 205 Arg Pro Pro Arg Ala Gly Glu Ala Arg Pro Gly Pro Thr Ala Glu Ser 210 215 220 Ala Ser Gly Pro Ser Glu Asp Pro Ser Val Asn Phe Leu Lys Asn Val 225 230 235 240 Gly Glu Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ile Glu Val Asp 245 250 255 Ile Asp Val Glu His Gly Gly Lys Arg Ser Arg Leu Thr Pro Val Ser 260 265 270 Pro Glu Ser Ser Ser Thr Glu Glu Lys Ser Ser Ser Gln Pro Ser Ser 275 280 285 Cys Cys Ser Asp Pro Ser Lys Pro Gly Gly Asn Val Glu Gly Ala Thr 290 295 300 Gln Ser Leu Ala Glu Gln Met Arg Lys Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gly 305 310 315 320 Arg Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp 325 330 335 Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly Glu 340 345 350 Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ser Leu Asp 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Glu Ala Ala Leu Tyr Pro 370 375 380 His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gln 385 390 395 400 Met Leu Ser Met Gly Phe Ser Asp Glu Gly Gly Trp Leu Thr Arg Leu 405 410 415 Leu Gln Thr Lys Asn Tyr Asp Ile Gly Ala Ala Leu Asp Thr Ile Gln 420 425 430 Tyr Ser Lys His Pro Pro Pro Leu 435 440

Claims

세포를 p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 서열번호 1의 서열을 기준으로 128 내지 163 잔기와 상호작용하는 N-end rule 라이겐드와 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 조절 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 N-end rule 라이겐드는 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 갖는 것인, 자가포식 조절 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나인, 자가포식 조절 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 ZZ 영역과 라이겐드의 상호작용은 p62의 올리고머화를 유도하는 것인, 자가포식 조절방법.
p62 단백질의 ZZ 영역과 상호작용하는 N-end rule 라이겐드를 포함하는 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 라이겐드는 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 갖는 것인, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나인, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 ZZ 영역과 상기 라이겐드의 상호작용은 p62의 올리고머화를 유도하는 것인, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 신경 변성질환은 부신성 백색질형성장애(Adrenal Leukodystrophy), 알콜중독, 알렉산더병(Alexander's disease), 알퍼병(Alper's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증, 모세관확장실조(ataxia telangiectasia), 배튼병(Batten disease), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 캐너번병(Canavan disease), 뇌성마비, 코케인 증후군(cockayne syndrome), 피질기저퇴화(corticobasal degeneration), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 치명성 가계 불면증 (familial fatal insomnia), 전두엽 측두엽 변성증(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅톤병
(Huntington's disease), HIV-관련 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe's disease), 레비소체 치매(Lewy body dementia), 신경보렐리아증(neuroborreliosis), 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성경화증(multiple sclerosis), 발작수면
(narcolepsy), 니이만-픽병(Niemann Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 픽병(Pick's disease), 원발가쪽경화증(primary lateral sclerosis), 프리온 질환(prion disease), 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 레프숨병(Refsum's disease), 잔트호프병(Sandhoff disease), 실더병(Schilder's disease), 유독성 빈혈 속발성의 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼 병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 스틸-리차드슨-올스제위스키 병(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독(Tabes dorsalis), 독성 뇌병증(toxic encephalopathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 신경변성 질환은 단백질변성과 관련된 질환 (proteinopahty)인, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 단백질변성과 관련된 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비 소체 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 헌팅톤병, 척수소뇌성 실조증 또는 척수구근 근위축증(spinobulbar musclular atrophy)인, 신경 변성질환 치료용 약학적 조성물.
p62에 의해 매개되는 자가포식을 조절하는 자가포식 조절제 스크리닝 방법으로, 상기 방법은
a) p62 단백질, 상기 p62 단백질의 ZZ 영역 또는 상기 ZZ 영역의 128 내지 163 잔기의 폴리펩타이드를 포함하는 시료를 시험물질과 접촉시키는 단계;
b) 상기 시험물질과 상기 단백질 또는 펩타이드의 ZZ 영역에서의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 시험물질과 접촉되지 않는 대조군과 비교하여, 자가포식이 증가 또는 감소된 경우, 상기 시험물질을 자가 포식 조절 후보물질로 선별하는 것인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 시험물질은 N-end rule 라이겐드인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 N-end rule 라이겐드는 타입-1 또는 타입-2의 N-end rule N-말단을 갖는 것인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 N-end rule 라이겐드는 Arg-Ala 또는 Xaa-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys 서열을 갖는 펩타이드로, 여기에서 X는 Arg, His, Lys, Phe, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 시료는 세포의 형태로 제공되는 것인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 유래의 세포인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 세포는 HEK21, 마우스배아섬유세포 (Mouse embryonic fibroblast), HeLa, Hep3B, 또는 PC3인 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 b) 단계 대신에 또는 상기 b) 단계에 추가하여 상기 ZZ 영역과 라이겐드의 상호작용은 p62의 올리고머화 여부로 검출되는 것인, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.