KR20210039975A - N-말단 아르기닌화된 단백질과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-말단 아르기닌화된 단백질과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 N-말단 아르기닌화된 단백질과의 결합력 및 특이도가 현저히 향상된 p62 ZZ 도메인 유래의 폴리펩타이드, 이의 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단 아르기닌에 높은 결합력을 보이며, 이의 점 돌연변이체는 N-말단 아르기닌에 대한 특이도가 매우 높아, N-말단 아르기닌 특이적이고 선택적인 표적물질 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

N-말단 아르기닌화된 단백질과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도{A polypeptide specifically binding to N-terminal arginylated protein and uses thereof}
본 발명은 N-말단 아르기닌화된 단백질과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 N-말단 아르기닌화된 단백질과의 결합력 및 특이도가 현저히 향상된 p62 ZZ 도메인 유래의 폴리펩타이드, 이의 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
단백질 아르기닌화는 번역 후 변형(post-translational modification)으로 아르기닌 전달효소 ATE1(arginyltransferase 1)에 의해 매개되며, 한 단백질의 새로 노출된 N-말단이 Glu, Asp, 또는 oxidized Cys인 경우 그 N-말단이 ATE1에 의해 아르기닌(Arg)이 부착되면서 일어난다.
ATE1은 심장발달, 혈관형성, 신경재생, 스트레스 대응, 세포 이동, 세포 생존 등 다양한 생물학적 기능을 조절하며, 이의 기능은 context dependent 하다. 세포 내에서 다양하고 복잡하게 일어나는 단백질 아르기닌화를 글로벌하게 검출하는 방법으로 N-말단 아르기닌을 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 면역침강 후 MS/MS을 통해 동정하는 방법이 이용되고 있다.
그러나, 항체를 이용하는 방법은 비용과 시간이 많이 들고 인식 시 N-말단 아르기닌을 따르는 펩타이드 서열에 제한을 받기 때문에 다양한 아르기닌화 된 단백질들을 포괄적으로 동정하지 못하는 단점이 있다.
이를 극복하기 위해 N-말단 아르기닌에 특이적이고 선택적으로 결합하면서 아르기닌 이후의 펩타이드 서열에 제한받지 않는 새로운 표적 물질의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 N-말단 아르기닌화된 단백질의 N-말단 아르기닌에 특이적으로 결합하면서도, 아르기닌 이후의 서열에 영향을 받지 않는 선택성을 지닌 표적 물질을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, p62 단백질의 ZZ 도메인 유래 폴리펩타이드가 N-말단 아르기닌과의 결합력이 매우 우수하며 이의 점돌연변이체가 놀라울 정도로 향성된 특이성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 (i) 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내며, 6번째 아미노산이 이소류신(I6), 7번째 아미노산이 시스테인(C7), 8번째 아미노산이 아스파르트산(D8), 10번째 아미노산이 시스테인(C10), 11번째 아미노산이 아스파라긴(N11), 18번째 아미노산이 아르기닌(R18), 21번째 아미노산이 시스테인(C21), 24번째 아미노산이 시스테인(C24), 26번째 아미노산이 아스파르트산(D26), 28번째 아미노산이 아스파르트산(D28) 30번째 아미노산이 시스테인(C30), 33번째 아미노산이 시스테인(C33), 39번째 아미노산이 히스티딘(H39) 및 42번째 아미노산이 히스티딘(H42)인 제1 펩타이드 단편, (ii) 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합되고, 임의의 아미노산 8개로 이루어진 제2 펩타이드 단편으로 이루어진 펩타이드로서, 상기 제1 펩타이드 단편의 C7, C10, C30 및 C33이 제1 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제1 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 펩타이드 단편의 C21, C24, H39 및 H42가 제2 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제2 아연 집게 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (i) 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내며, 6번째 아미노산이 이소류신(I6), 7번째 아미노산이 시스테인(C7), 8번째 아미노산이 아스파르트산(D8), 10번째 아미노산이 시스테인(C10), 11번째 아미노산이 아스파라긴(N11), 18번째 아미노산이 아르기닌(R18), 21번째 아미노산이 시스테인(C21), 24번째 아미노산이 시스테인(C24), 26번째 아미노산이 아스파르트산(D26), 28번째 아미노산이 아스파르트산(D28) 30번째 아미노산이 시스테인(C30), 33번째 아미노산이 시스테인(C33), 39번째 아미노산이 히스티딘(H39) 및 42번째 아미노산이 히스티딘(H42)인 제1 펩타이드 단편, (ii) 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합되고, 임의의 아미노산 8개로 이루어진 제2 펩타이드 단편으로 이루어진 펩타이드로서, 상기 제1 펩타이드 단편의 C7, C10, C30 및 C33이 제1 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제1 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 펩타이드 단편의 C21, C24, H39 및 H42가 제2 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제2 아연 집게 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌을 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 (i) 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내며, 6번째 아미노산이 이소류신(I6), 7번째 아미노산이 시스테인(C7), 8번째 아미노산이 아스파르트산(D8), 10번째 아미노산이 시스테인(C10), 11번째 아미노산이 아스파라긴(N11), 18번째 아미노산이 아르기닌(R18), 21번째 아미노산이 시스테인(C21), 24번째 아미노산이 시스테인(C24), 26번째 아미노산이 아스파르트산(D26), 28번째 아미노산이 아스파르트산(D28) 30번째 아미노산이 시스테인(C30), 33번째 아미노산이 시스테인(C33), 39번째 아미노산이 히스티딘(H39) 및 42번째 아미노산이 히스티딘(H42)인 제1 펩타이드 단편, (ii) 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합되고, 임의의 아미노산 8개로 이루어진 제2 펩타이드 단편으로 이루어진 펩타이드로서, 상기 제1 펩타이드 단편의 C7, C10, C30 및 C33이 제1 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제1 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 펩타이드 단편의 C21, C24, H39 및 H42가 제2 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제2 아연 집게 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
본 발명의 상기 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain, ZZ doamin)은 서열번호 3으로 표시되는 p62 단백질의 ZZ 도메인 단편으로서, 구체적으로는 서열번호 3으로 표시되는 ZZ 도메인의 아미노산 서열에서 122 내지 167번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 아미노산 서열로 이루어진 본 발명의 폴리펩타이드는 N-말단 아르기닌화된 단백질의 N-말단 아르기닌을 특이적으로 표적하는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명이 제공하는 상기 N-말단 아르기닌 특이적 폴리펩타이드는 in vitro 및 in vivo에서 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능하며, 임의의 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌화와 관련된 다양한 질환에 대한 정보를 제공하는데 활용될 수 있다.
이와 같은 본 폴리펩타이드의 효과는 본 명세서의 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명이 제공하는 상기 폴리펩타이드에서 (i) 제1 펩타이드 단편은 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인(ZZ domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내면서, p62 ZZ 도메인의 구조적 및 기능적 특성을 유지하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, p62 ZZ 도메인은 음으로 하전된 3개의 β-가닥(β-strand)과 1개의 α-나선(α-helix) 구조를 포함하며, 2개의 아연 원자와 배위하는 구조적 및 기능적 특성을 포함하고 있다. 본 발명이 제공하는 상기 폴리펩티드의 제1 펩타이드 단편도 이와 같은 p62 ZZ 도메인의 구조적 및 기능적 특성을 동일하게 포함하면서 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내며, 6번째 아미노산이 이소류신(I6), 7번째 아미노산이 시스테인(C7), 8번째 아미노산이 아스파르트산(D8), 10번째 아미노산이 시스테인(C10), 11번째 아미노산이 아스파라긴(N11), 18번째 아미노산이 아르기닌(R18), 21번째 아미노산이 시스테인(C21), 24번째 아미노산이 시스테인(C24), 26번째 아미노산이 아스파르트산(D26), 28번째 아미노산이 아스파르트산(D28) 30번째 아미노산이 시스테인(C30), 33번째 아미노산이 시스테인(C33), 39번째 아미노산이 히스티딘(H39) 및 42번째 아미노산이 히스티딘(H42)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 펩타이드 단편의 C7, C10, C30 및 C33이 제1 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제1 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 펩타이드 단편의 C21, C24, H39 및 H42가 제2 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제2 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 아연 이온과 결합하는 제1 아연 집게 구조는 상기 제2 아연 이온과 결합하는 제2 아연 집게 구조와 지그재그의 순서로 위치한다. 또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 p62 ZZ 도메인의 N-말단 U 자형 루프는 아연 원자와 배위하는 상기 C7 및 C10 잔기에 의해 유지된다.
본 발명의 다른 일 양태에서 상기 제1 펩타이드 단편의 I6, D8, N11, R18, D26 및 D28 잔기가 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 상호작용하여 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명이 제공하는 상기 폴리펩타이드의 상기 제1 펩타이드 단편은 전술한 p62 ZZ 도메인의 구조적 및 기능적 특징으로 유지하면서, 서열번호 1로 표시되는 서열과 70% 이상, 구체적으로는 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “퍼센트(%) 서열 상동성”은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 외, eds., 1987)]에 기재된 방법, 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
본 발명이 제공하는 상기 폴리펩타이드에서 상기 제2 펩타이드 단편은 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합되고 임의의 아미노산 8개로 이루어진 펩타이드이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 단편은 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 결합하지 못했으나, 상기 제2 펩타이드 단편이 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합한 폴리펩타이드는 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 매우 강한 결합력을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열과 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 더 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상의 서열상동성을 나타내는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에서 11번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파르트산(D)으로 치환(N11D)된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명이 제공하는 상기 폴리펩타이드는 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 높은 결합력을 나타내지만, N-말단 타이로신(Try) 잔기와도 약한 결합력을 나타내는 것으로 확인이 되었다. 하지만, 상기 서열번호 1에서 11번째 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된 제1 펩타이드를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와의 높은 결합력은 그대로 유지하면서 N-말단 타이로신과의 결합력은 상실하여, N-말단 아르기닌에 대한 특이도가 현저히 높아지는 것을 확인하였다.
본 발명의 폴리펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법(유전공학적 방법, 화학적 합성)을 이용하여 합성될 수 있다. 유전공학적 방법에 의한 작제는, 예를들어, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 5내지 8의 폴리뉴클레오티드)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 펩타이드(substally pure peptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sufation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 친화성 태그가 결합된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 친화성 태그는 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, His 태그, GST(Glutathione S-transferase) 태그, 비오틴(biotin) 태그, 비너스(venus) 태그, 로우-비트(low-bit) 태그, 스트랩 (strep) 태그, 트윈 스트랩 II (Twin strep II) 태그, Flag 태그, S 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CMP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag1), GAL4-DBD 태그, 소프태그 3(softag 3), 스트랩 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier pretein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 친화성 태그는 본 발명이 제공하는 상기 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 직접 연결될 수 있으며, 링커를 통해 연결될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 검출을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 검출용 조성물 또는 키트에 포함되는 펩타이드는 전술한 바와 같이 친화성 태그로 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 검출용 조성물 또는 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 N-말단 아르기닌화 펩타이드 또는 단백질과의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다.
또한 본 발명인 키트에 포함된 상기 폴리펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 시료를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 대상 시료에 포함된 N-말단 아르기닌화된 펩타이드 또는 단백질과 본 발명의 폴리펩타이드의 결합을 관찰함으로써 N-말단이 아르기닌화된 펩타이드 또는 단백질을 검출할 수 있다.
본 발명이 제공하는 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오타이드의 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건 (stringent conditions) 하에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6,pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지 (예를 들면, λgt4λB,λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinesehamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E.coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화 (glycosylation) 문제로 인해 온전한 (intact) Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 단백질의 N-말단 아르기닌을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 용어 '생물학적 시료'는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를들어, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 검출의 용이를 위해 친화성 태그로 표지될 수 있으며, 각각의 친화성 태그에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
본 발명의 상기 방법에서 상기 폴리펩타이드를 생물학적 시료에 처리한 이후에 미결합되거나 비특이적으로 결합한 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계가 추가로 수행될 수 있다.
본 발명이 제공하는 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단 아르기닌에 높은 결합력을 보이며, 이의 점 돌연변이체는 N-말단 아르기닌에 대한 특이도가 매우 높아, N-말단 아르기닌 특이적이고 선택적인 표적물질 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1c를 포함하는 도 1은 p62 ZZ 도메인이 N-말단 아르기닌(Nt-Arg)과 높은 결합 친화도를 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
도 2a 내지 2f를 포함하는 도 2는 절편화된 p62 ZZ122-175 단편이 Nt-Arg 및 Nt-Tyr에 결합한다는 것을 확인한 결과이다.
도 3a 내지 3e를 포함하는 도 3은 p62 ZZ122-175 단편의 N132D 돌연변이체가 야생형의 p62 ZZ122-175 단편과 비교해 더 향상된 Nt-Arg 특이도 및 결합 친화도를 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4e를 포함하는 도 4는 p62 ZZ122-175 단편의 N132D 돌연변이체가 세포 유래의 N-말단 아르기닌화 된 단백질과 결합한다는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 p62 ZZ122-175 단편, p62 ZZ122-175 단편의 N132D 돌연변이체 및 p62 ZZ126-172 단편의 Nt-Arg 결합 친화도를 웨스턴 블롯을 통해 비교하여 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 항체 및 시약
이 연구에 사용 된 항체는 다음과 같다:
마우스 단일클론 항-GST (Santa Cruz, sc-138, 1 : 2,000), 마우스 단일클론 항-p62 (Abcam, ab56416, 1 : 100,000), 토끼 다중클론 항-BiP (CST, 3177S, 1 : 2,000), 토끼 다중클론 항-R-BiP (Abfrontier, AR05MA0001, 1 : 2,000), 토끼 다중클론 항-R-CRT (Abfrontier, AR05-PA0002, 1 : 2,000), 마우스 단일클론 항-ATE1 (Santa Cruz, sc-271220, 1 : 1,000 ), 마우스 단일클론 항-플래그 (Sigma, F3165, 1 : 10,000), 마우스 단일 클론 항-β- 액틴 (Sigma, A1978, 1 : 5,000), 마우스 단일클론 항-Myc (Santa Cruz, sc-40, 1 : 5,000 ) 및 Ub- 접합 단백질에 특이적인 마우스 단일클론 항-FK2 (ENZO, BML-PW8810-0500, 1 : 5,000). 다음의 2차 항체가 사용되었다 : 항-마우스 IgG (CST, 7074, 1 : 5,000), 항-토끼 IgG (CST, 7076, 1 : 5,000).
포름산(Formic acid), 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate), 우레아(urea), 다이티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT), 요오도아세트아미드 (iodoacetamid, IAA), D-비오틴(biotin) (2031), PierceTM GST 아가로스 (20211), L- 글루타티온 환원제 (G4251), 탑시가르긴(thapsigargin), MG132 및 이소프로필-b-D- 티오- 갈락토 사이드 (11411446001)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. GSTrap 4B (28401747), HisTrap HP (17524851) 및 HiLoadTM 25/600 SuperdexTM 75 pg (28-9893) 컬럼은 GE Healthcare에서 구입했다. 스트랩-택틴 (Strep-Tactin) XP 아가로스는 IBA Lifesciences에서 구입했다. E. coli BL21 (DE3) RIL 컴피턴트 세포는 Novagen에서 구입했다. 시퀀싱 등급의 변형된 트립신은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입했다. 스트렙토아비딘 아가로스 비드(Streptavidin agarose bead) (20353), Ni-NTA 아가로스 (R90115) 및 인비트로솔 가용화제 (invitrosol solubilizer) (MS10007)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)에서 구입했다. HPLC 등급 아세토니트릴(acetonitrile)은 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA)에서 구입했다. Milli Q 시스템 (Millipore, Molsheim, France)을 사용하여 물을 정제했다. RA (4017629.1000) 및 AR (4005990.011) 디펩티드(di-peptide)는 BACHEM에서 구입했다. 실버 염색 키트 (EBP-1051)는 ELPISBIO (대한민국 대전)에서 구입했다.
2. 플라스미드 제조 및 돌연변이 유발
p62, NBR1, ZZEF1, MIB2, KCMF1, HERC2 및 p300의 ZZ 도메이 BamHI-EcoRI (NBRI-ZZ, ZZEF1-ZZ, KCMF1-ZZ 및 p300-ZZ) 사이트 또는 HindIII-EcoRI (MIB2-ZZ 및 HERC2-ZZ) 사이트를 사용하여 pcDNA3.1-GST에 서브클로닝되었다 (pcDNA3.1-GST를 생성하기 위해 GST 인코딩 DNA가 EcoRI 및 XhoI 사이트 사용하여 pcDNA3.1 (+) / myc / His A에 삽입됨). pGST-N3은 사전에 BamHIII / NotI 사이트를 사용하여 pEGFP-N3 벡터의 EGFP를 GST로 전환함으로써 제조되었다. p62-ZZ (83-175)의 N- 및 C- 말단 결실 구조를 생성하기 위해, HindIII / BamHI 부위를 사용하여 PCR 증폭 DNA를 pGST-N3 벡터 (Clone Tech.)에 삽입했다. 적절한 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하여 2 단계 PCR을 수행하여 ZZ (122-175)의 N132D 또는 N132Q와 같은 점 돌연변이를 도입했다. MX-RGS4 (X = Cys 또는 Val), Ub-X-BiP (X = Arg 또는 Val), Ub-X-PDI (X = Arg 또는 Val)는 EcoRI / XhoI 사이트를 사용하여 pcDNA3.1 (+) / myc / His A에 서브 클로닝되었다. 박테리아 발현 및 정제를 위해 ZZ122-175 N132D 증폭 DNA를 EcoRI / XhoI 사이트를 사용하여 pGEX6p-1 벡터에 서브 클로닝했다. R-catcher는 NdeI / XhoI 부위를 사용하여 Twin strepII-His6-ZZ122-175N132D를 포함하는 PCR 증폭물을 pETDuet-1 (Novagen) 벡터로 서브클로닝함으로써 제조되었다. 새로운 아르기닐화(arginylated)된 ER 단백질의 확인을 위해 PCR 증폭된 cDNA (FBLN1, FKBP10, SERPINH1, PRDX4, ENPL, CLUS 및 LG3BP)가 KpnI / XhoI (PRDX4, CLUS 및 LG3BP) 또는 EcoRI / NotI (SERPH1, FKB10, ENPL 및 FBLN1) 사이트를 사용하여 pcDNA3.1(+)/myc/His B에 삽입되었다. SERPINH1, PRDX4, CLUS, FBLN1의 P1 '사이트에서 점돌연변이는 적절한 변이가 포함된 primer를 이용하여 2 단계 PCR을 수행하여 도입되었다.
3. 세포 배양 및 면역 블롯팅
HEK293 및 HeLa (CCL2, ATCC) 세포, + / + 및 ATE1-/-MEF는 5% CO2 인큐베이터에서 10% FBS (Gibco)가 보충된 DMEM (Hyclone)에서 배양되었다. ATE 녹아웃 MEF는 면역 블롯팅 분석을 사용하여 확인되었다. 정기적으로 세포주에서 마이코플라스마 오염이 테스트되었다. 면역 블롯팅을 위해 세포를 2x SDS 샘플 버퍼에 직접 용해한 다음 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다.풀다운 분석을 위해, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche)와 함께 저장성 버퍼 (20mM HEPES pH 7.9, 10mM KCl, 1.5mM MgCl2)에서 용해시켰다.
4. GST-ZZ 재조합 단백질 및 R-catcher 정제
GST-p62-ZZ 재조합 단백질을 정제하기 위해 야생형 또는 D129A 돌연변이체 GST-ZZN132D를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 BL21 DE3 (Novagen)로 형질 전환했다.
세포를 루리아-버타니(Luria-Bertani) broth (LB broth), 37 ℃, 200rpm에서 1mM 아이소프로필-베타-D-갈락토사이드(isopropyl-β-D-thio-galactoside) (IPTG)를 O.D 600 0.6에 도달 할때까지 첨가시켜 밤새 성장시켰다. 대장균 배양액을 18 ℃ 인큐베이터로 옮기고 200rpm에서 16 시간 더 성장시켰다. 세포를 6,790 x g에서 20분 동안 원심 분리하여 수집하고 버퍼 A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 100?M PMSF, 10 % 글리세롤)에서 부드럽게 초음파 처리한 다음 26,000 x g에서 30 분 동안 원심 분리했다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 0.45 μM 기공 주사기 멤브레인 필터로 여과했다. 여과된 상층액을 1mL / min의 유속으로 AKTA FPLC (GE Healthcare)와 연결된 GSTrap 4B (GE Healthcare) 컬럼에 로드하고 실시간 크로마토 그램이 기본 수준에 도달했을 때 동일한 유속에서 10 CV (컬럼 부피)의 용해 버퍼 (50mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 μM PMSF, 10 % 글리세롤)로 세척했다. 결합된 단백질은 20mM 환원 글루타티온을 함유하는 용해 버퍼를 사용하여 용출되었다.
등온 적정 열량 측정 (ITC)의 경우, GST 융합 p62 (122-175) 야생형 및 돌연변이체 (N132Q 및 N132D)는 18 ℃에서 1mM 아이소프로필 베타-디-티오-갈락토사이드(Isopropyl-β-D-thio-galactosid)(IPTG)가 포함된 Luria-Bertani(LB)배지의 E. coli BL21 (DE3) RIL 컴피턴트 세포에서 발현되었다. 세포를 수집하고 3mM β머캅토에탄올 (β-ME)을 함유하는 B 버퍼 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 200mM NaCl)에서 초음파 처리했다. 세포 용해물을 18,000 x g에서 1 시간 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 이 상층액을 글루타치온 세파로즈(Glutathione SepharoseTM 4) Fast Flow 수지에 로드하고 B 버퍼로 세척했다. GST 융합 단백질은 용출 버퍼 (100mM Tris-HCl pH 7.5, 200mM NaCl 및 3mM β-ME)에서 20mM 글루타치온으로 용출되었다. 용출된 샘플은 TEV 프로테아제를 포함하거나 포함하지 않는 투석 버퍼 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 및 3mM β-ME)에서 투석되었다. 이 샘플을 음이온 교환 컬럼 (HiTrap Q HP, GE Healthcare)에 로드하고 제한되지 않은 샘플을 수집하여 0.2mM Tris(2- 카르복시 에틸포스핀((2-carboxyethyl)phosphine) (TCEP)를 포함하는 B 버퍼를 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피 (HiLoadTM 25/600 SuperdexTM 75pg 컬럼, GE Healthcare)에 로드했다.
R-catcher를 코딩하는 플라스미드 DNA (pETDuet1-twin strepII-His6-ZZ122-175 N132D)를 BL21 DE3로 형질 전환시켰다. 세포를 0.5mM 이소 프로필 -b-D- 티오-갈락토사이드 (IPTG)를 함유하는 1L LB 배지에서 18 °C에서 밤새 배양하고 6,790 x g에서 원심 분리하여 펠릿화(pelleted)했다. 세포 펠릿을 재현탁하고 용해 버퍼 (50mM Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 100nM PMSF, 10 % 글리세롤)에서 부드러운 초음파 처리로 용해했다. 세포 용해물을 30 분 동안 26,000 x g에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한 다음 0.45 ㎛ 기공 주사기 막을 사용하여 여과했다. 여과된 상층액을 AKTA FPLC (GE Healthcare)와 연결된 HisTrap HP (5ml) 컬럼에 1ml / min의 유속으로 로드했다. 결합된 단백질은 세척 후 농도 구배를 갖는 250 mM 이미다졸(imidazole)을 함유하는 용해 완충액을 사용하여 용출되었다.
5. X-peptide 및 R-catcher 풀다운 어세이
p62 ZZ-GST를 인코딩하는 플라스미드를 Xtreme Gene HP 형질 감염 프로토콜에 따라 일시적으로 HEK293 세포로 형질 감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 스크래핑하여 수확하였다. 세포 펠렛을 저장성 완충액(5 부피의 세포 펠렛)에 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 배양하고 5회 동결-해동 사이클을 거친 후 4 ℃에서 20분 동안 15,928 x g 원심분리를 실시했다. X-펩티드 풀다운 분석의 경우, 200μg 총 단백질 또는 1μg 정제된 GST-ZZ를 스트렙트아비딘 아가로스 레진에 컨주게이트 되어 있는, 비오틴화 된 X-nsP4 11-mer 펩티드 (X = Arg, His, Lys, Tyr, Trp, Phe, Leu, Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr 또는 Val)와 바인딩 버퍼(20 mM HEPES pH 7.9, 0.2 M KCl, 0.05 % Tween 20, 10 % 글리세롤) 내에서 배양하고, 4 ℃에서 3 시간 동안 부드럽게 회전시켰다.
6. 통계학적 분석
데이터는 세 개 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시했다. ANOVA를 사용하여 Prism 6 소프트웨어 (Graph Pad)로 통계 분석을 수행했다. P <0.05 인 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(*** P <0.001; n.s., 통계적으로 유의 한 차이 없음 (P ≥ 0.05)).
실험결과
1. p62 ZZ 도메인은 N-말단 아르기닌(Nt-Arg)에 대해 강한 결합력을 나타냄
본 발명자들은 이전 연구에서 p62의 aa 83-175까지의 ZZ 도메인 단편 (ZZ83-175)이 염기성 N-말단 잔기인 Arg, Lys 및 His (1형 N-degrons) 및 부피가 큰 방향족 잔기인 Tyr, Trp 및 Phe (2형 N-degrons)에 결합한다는 것을 확인한 바 있다(Nat Commun 8 (1):102.p62/SQSTM1/Sequestosome-1 is an N-recognin of the N-end rule pathway which modulates autophagosome biogenesis.). 이 중 p62는 Nt-Arg에 대해 가장 높은 친화력을 나타냈다. Pro 및 Gly와 같은 다른 Nt 잔기는 특정 상황에서 디그론으로 작용할 수 있기 때문에, in vitro 펩타이드 풀다운 분석을 사용하여 20 개의 Nt 아미노산 잔기 모두와 ZZ83-175의 결합을 분석하기로 결정했다. 이러한 분석에서 본 발명자는 모델 N-말단 규칙 기질인 ZZ83-175-GST 및 비오틴화 된 로타바이러스 비구조 단백질 4(nsP4) 펩티드를 발현하는 HEK293 세포 용해물을 사용했다.
예상대로 ZZ83-175는 Nt-Arg에 대해 높은 결합 친화도를 보였고 Nt-Lys, -His, -Tyr, -Phe 및 -Trp에 대해 중간 정도의 친화성을 나타냈다(도 1a). 그러나, ZZ83-175는 그 이외에 다른 어떤 잔기에도 결합하지 않았다. 이전 연구에서 전체 길이 p62 단백질이 보여준 바와 같이, ZZ83-175 내의 Asp129 (D129A)의 알라닌 치환은 모든 N-데그론에 결합하는 능력을 폐지했다(Nat Commun 8 (1):102.p62/SQSTM1/Sequestosome-1 is an N-recognin of the N-end rule pathway which modulates autophagosome biogenesis.).
인간 프로테옴의 다른 ZZ 도메인이 Nt-Arg에 결합할 수 있는지 확인하기 위해 UniProt 데이터베이스를 검색했다. 인간 프로테옴에서 약 18 개의 단백질이 p62 ZZ 도메인과 유사한 ZZ 유형 징크 핑거 도메인을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 도메인은 4~6 개의 Cys 잔기와 2 개의 아연 이온을 배위할 수 있는 추가 His 잔기를 보유한다. 18 개의 ZZ 도메인의 정렬은 아연 배위 잔기가 매우 보존되어 있음을 보여주었다(도 1b). p62 ZZ 도메인의 x-선 결정구조에 따르면 4 개의 Cys 잔기 (Cys128, C131, Cys151 및 Cys154)는 1개의 아연 이온, 2 개의 Cys 잔기 (Cys142 및 Cys145) 및 2 개의 His 잔기 (His160 및 His163)는 다른 1개의 아연 이온을 조정한다. 또한 Asp129, Asp147 및 Asp149로 구성된 음전하 패치는 많은 ZZ 도메인에서 보존된다. 특히, Asn132는 p62의 ZZ 도메인에만 존재하며(도 1b),이 잔기의 양극성 특성은 p62 ZZ 도메인과 type-1 및 type-2 N-데그론과의 상호 작용을 담당하는 것으로 밝혀진 바 있다.
본 발명자는 MIB2(mind bomb homolog 2), KCMF1(potassium channel modulatory factor 1), HERC2(HECT domain and RCC1-like domain containing protein 2)를 포함하는 RCC1 유사 도메인, ZZEF1(zinc finger ZZ-type and EF-hand domain containing protein1), p300(histone acetyltransferase p300) 및 NBR1(next to BRCA1 gene 1 protein)을 서브클로닝 하고, 이들의 Nt-Arg에 대한 결합능을 in vitro 펩타이드 풀다운 어세이를 통해 평가했다.
그 결과, p62 ZZ 도메인만이 Nt-Arg에 대해 높은 친화력을 나타냈고, 다른 ZZ 도메인은 Nt-Arg에 대한 결합이 없거나 최소한으로 나타났다(도 1c). 따라서, 본 발명자는 Nt-Arg 결합 도구로서 p62 ZZ 도메인을 사용하기로 결정했다.
2. p62 ZZ 122-175 는 Nt-Arg에 대해 매우 강한 결합력을 나타냄
Nt-Arg 결합 도구를 구성하기 위해, p62 ZZ83-175는 이미 확인된 ZZ 도메인 (잔기 #122-167)외부의 측면 영역을 포함하므로, p62 ZZ83-175를 최소화하기로 결정했다(도 2a). 이러한 측면 영역이 p62가 Nt-Arg에 최적으로 결합하는데 필요한지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자는 C-말단 GST로 태그가 된 ZZ83-175의 N-말단 및 C-말단 삭제 구조를 생성하고 in vitro 펩타이드 풀다운 분석실험을 통해 Nt-Arg에 결합하는 능력을 테스트했다.
도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 잔기 83 내지 122의 결실이 Nt-Arg 결합에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 그러나, 잔기 167 내지 175의 결실은 실질적으로 Nt-Arg 결합을 감소시켰다. 이와 같은 결과를 바탕으로 Nt-Arg에 대한 결합친 화성을 유지하는 최소 단위로 ZZ122-175를 선택했다.
ZZ122-175를 사용하여, 다음으로 비오틴화 된 펩티드와 ZZ122-175-GST 구조를 발현하는 HEK293 세포 용해물을 사용하여 모든 20개의 Nt 아미노산 잔기에 결합하는 능력을 테스트했다. 결과는 ZZ122-175가 Nt-Arg에 대한 높은 결합 친화도를 유지했지만 Nt-Tyr을 제외한 다른 모든 Nt 잔기에 결합하는 능력은 상실한 것으로 확인되었다(도 2d).
다음으로 글루타티온 수지를 사용하여 세균에서 발현된 GST-ZZ122-175를 정제하고, 이 단백질을 사용하여 펩타이드 풀다운 분석을 반복했고, 위와 유사한 결과를 확인할 수 있었다(도 2e). 마찬가지로, D129A 점 돌연변이는 모든 Nt 잔기와의 결합능을 상실하였다.
등온 적정 열량 측정법(ITC) 분석 결과, GST-ZZ122-175가 RIFS 테트라 펩타이드(Nt-Arg)와 KD 4.4μM, YIFS 테트라 펩타이드(Nt-Tyr)와 KD 16.15μM로 결합하는 것으로 확인되었다(도 2f).
3. ZZ 122-175 N132D 돌연변이체는 야생형 ZZ 122-175 와 비교해 현저히 향상된 Nt-Arg 결합 특이도를 나타냄
Nt-Arg에만 특이적으로 결합하는 도구를 생성하기 위해 ZZ122-175를 돌연변이시켜 Nt-Tyr에 대한 친화성을 줄였다. 이러한 목적을 달성하기 위해 양극성 특성이 p62 ZZ 도메인이 염기성 및 방향족 N-데그론에 결합하는데 중요하기 때문에 ZZ 잔기 Asn132 (N132)에 초점을 맞추었다. 본 발명자는 아스파라긴의 메틸렌기가 더 긴 버전인 글루타민(N132Q) 또는 아스파라긴의 극성 버전인 아스파르트 산 (N132D)으로 치환했다. 이들 돌연변이체 및 ZZ122-175의 야생형 버전을 HEK293 세포에서 발현했고, in vitro 펩타이드 풀다운 분석을 사용하여 Nt-Arg 또는 Nt-Tyr에 결합하는 능력을 테스트했다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 야생형에 비해 N132Q 돌연변이가 N-데그론에 대한 ZZ122-175의 친화성을 감소시킨 반면, N132D 돌연변이는 Nt-Arg에 대한 친화성을 증가시켰 을뿐만 아니라 Nt-Tyr에 대한 친화도를 현저히 낮추는 것으로 나타났다.
ITC 분석 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 N132D 돌연변이가 RIFS 테트라 펩티드에 대해 2.85μM의 결합 친화도를 나타냈는데, 이는 야생형(6.9μM)보다 2 배 이상 더 높은 것이다. 반대로, N132D 돌연변이체는 YIFS 테트라 펩타이드에 대해 107μM의 결합 친화도를 나타냈으며, 이는 야생형(20.7μM)보다 약 5 배 낮은 수치이다. 일관되게, 20 개의 서로 다른 Nt 잔기를 포함하는 비오틴화 된 X-펩티드를 사용한 in vitro 펩타이드 풀다운 분석 결과에서도, N132D 돌연변이를 포함하는 ZZ122-175 (ZZ122-175 N132D)가 Nt-Arg에만 결합하고 Nt-Tyr에 결합하는 능력을 상실했음을 확인할 수 있었다(도 3c).
4. ZZ 122-175 N132D 돌연변이체는 N-말단의 두 번째(2 nd ) 잔기의 종류와 무관하게 모든 단백질의 Nt-Arg에 결합함
Nt-아르기닌화 된 단백질의 두 번째 잔기는 UBR 상자에 대한 Nt-Arg의 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 이와 같은 현상이 p62 ZZ 도메인의 경우에도 해당되는지 확인하기 위해 친화성 정제 GST-ZZ122-175 및 GST-ZZ122-175 N132D 를 사용하여 아르기닌화를 허용하는 잔기 Asp, Glu 및 산화된 Cys (이들 잔기들은 ATE1 의존적으로 아르기닌화 되는 2nd 잔기들임)의 효과를 테스트했다.
그 결과 도 3d에 나타낸 바와 같이, 야생형과 N132D 돌연변이가 모든 ATE1 의존성 아르기닐화 된 단백질에 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Nt- 아르기닌화 된 단백질은 단백질 분해 절단을 통해 ATE1 독립적인 방식으로도 생성될 수 있기 때문에 가능한 모든 2차 잔기를 나타내는 비오틴화 된 펩티드를 사용하여 펩타이드드 풀다운 분석을 다시 수행했다.
그 결과 도 3e에 나타낸 바와 같이, ZZ122-175와 ZZ122-175 N132D가 두 번째 잔기에 관계없이 모든 Nt-아르기닐화 된 단백질에 결합할 수 있음을 확인했다.
5. R-catcher는 단백질 독성 스트레스 하에서 유도된 세포성 Nt-Arg 단백질에 결합할 수 있음
ZZ122-175 N132D가 생체 내에서 알려진 아르기닌화 단백질을 포획할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자는 ER 샤페론, BiP 및 CRT의 Nt-아르기닌화를 유도하는 것으로 밝혀진 프로테아좀 억제제 MG132와 ER 스트레스 유도제 thapsigargin(TG)으로 HeLa 세포를 자극했다(도 4a). 이러한 용해물과 글루타티온 수지에 고정된 정제 GST 태그 ZZ122-175 N132D를 사용하여 풀다운 분석을 수행했다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 ZZ122-175 N132D가 AR 디펩타이드의 존재에 관계없이 Nt-아르기닌화 된 BiP 및 CRT를 효율적으로 끌어 내릴 수있는 반면, 이러한 상호작용은 D129A 돌연변이 및 RA 디펩타이드 경쟁에 의해 억제되었음을 확인할 수 있었다.
질량 분석법(MS)과 관련된 기술적 문제로 인해, 이전에 사용된 GST 태그를 전환하여 Twin StrepII-His6 태그와 "R-catcher"라고하는 약 9kDa 단백질(Twin StrepII-His6-ZZ122-175 N132D)을 생성했다(도 4c). 이 새로운 태그가 R-catcher와 Nt-Arg의 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하기 위해 정제된 R-catcher를 사용하여 R-catcher가 다양한 2 번째 잔기를 포함하는 아르기닌화 된 단백질을 풀다운할 수 있음을 확인하였다(nsp4(2nd Ile), RGS4 (2nd oxidized Cys), BiP (2nd Glu) 및 PDI (2nd Asp), 도 4d).
또한, 도 4e에 나타낸 바와 같이 R-catcher가 내인성 아르기닌화 된 BiP 및 CRT를 풀다운 할 수 있음을 확인했으며, 이러한 상호 작용은 D129A 돌연변이 및 RA 디펩티드 경쟁에 의해 상실되었다(도 4e).
6. ZZ 126-172 와의 결합능 비교
정제된 1ug의 GST tag가 달린 (ZZ122-175, ZZ122-175 N132D, ZZ126-172) 단백질과 Streptavidine beads에 부착시킨 X-BiP (X-EEDKKEDVG-biotin) 펩타이드를 3시간 incubation하고, wash 후 2x SDS sample buffer로 결합하여 풀다운 된 단백질을 elute 한 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 1ug의 시료 조건에서는 ZZ122-175, ZZ122-175 N132D만 R-BiP 펩타이드에 결합하는 것으로 확인되었다.
본 발명이 제공하는 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단 아르기닌에 높은 결합력을 보이며, 이의 점 돌연변이체는 N-말단 아르기닌에 대한 특이도가 매우 높아, N-말단 아르기닌 특이적이고 선택적인 표적물질 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
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Claims (13)

  1. (i) 서열번호 1로 표시되는 p62 아연 집게 도메인 (Zinc finger domain)과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내며, 6번째 아미노산이 이소류신(I6), 7번째 아미노산이 시스테인(C7), 8번째 아미노산이 아스파르트산(D8), 10번째 아미노산이 시스테인(C10), 11번째 아미노산이 아스파라긴(N11), 18번째 아미노산이 아르기닌(R18), 21번째 아미노산이 시스테인(C21), 24번째 아미노산이 시스테인(C24), 26번째 아미노산이 아스파르트산(D26), 28번째 아미노산이 아스파르트산(D28) 30번째 아미노산이 시스테인(C30), 33번째 아미노산이 시스테인(C33), 39번째 아미노산이 히스티딘(H39) 및 42번째 아미노산이 히스티딘(H42)인 제1 펩타이드 단편, (ii) 상기 제1 펩타이드 단편의 C-말단에 결합되고, 임의의 아미노산 8개로 이루어진 제2 펩타이드 단편으로 이루어진 펩타이드로서, 상기 제1 펩타이드 단편의 C7, C10, C30 및 C33이 제1 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제1 아연 집게 구조를 형성하며, 상기 제1 펩타이드 단편의 C21, C24, H39 및 H42가 제2 아연 이온(Zn2+)과 결합하여 제2 아연 집게 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 임의의 아미노산 8개는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드의 I6, D8, N11, R18, D26 및 D28 잔기가 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1에서 11번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파르트산(D)으로 치환된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드와 비교해 임의의 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 잔기와의 결합력이 향상된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌 검출용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 친화성 태그가 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 친화성 태그는 His 태그, GST(Glutathione S-transferase) 태그, 비오틴(biotin) 태그, 비너스(venus) 태그, 로우-비트(low-bit) 태그, 스트랩 (strep) 태그, 트윈 스트랩 II (Twin strep II) 태그, Flag 태그, S 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CMP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, GAL4-DBD 태그, 소프태그 1 (softag1), 소프태그 3(softag 3), 스트랩 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier pretein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 아르기닌을 검출하는 방법.
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