WO2001072835A1 - Famille de canaux humains a cation sodium et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une nouvelle famille de canaux humains à cation sodium sensibles à l'amiloride ou à l'un de ses analogues et leur utilisation pour le diagnostic, la prévention et le traitement de pathologies intestinales ou de pathologies induisant une hypertension chez l'humain ou l'animal.
Description
FAMILLE DE CANAUX HUMAINS A CATION SODIUM ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne une nouvelle classe de canaux humains à cation sodium. En particulier des canaux humains à cation sodium sensibles à l' amiloride ou à l'un de ses analogues appartenant à la famille des dégénérines, NaC/DEG. L'invention est basée sur la découverte d'un nouveau canal à cation sodium humain, canal à cation sodium intestinal humain sensible à l' amiloride, ci-après dénommé hINaC .
Les propriétés des canaux de la famille NaC/DEG ainsi que leur distribution tissulaire confèrent à ces canaux un rôle primordial dans le transport du sodium chez un grand nombre de types cellulaires.
Les canaux à cation sodium sont des protéines ubiguitaires dont la fonction est de réguler le passage des cations sodium entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule. Cette fonction en fait des candidats idéaux pour un grand nombre de processus biologiques dans lesquels est impliqué un transfert de cations sodium. Les canaux NaC/DEG de Mammifères déjà identifiés appartiennent à deux groupes principaux. Le premier groupe inclut le canal à ion sodium épithélial ci-après dénommé ENaC , associé au transport transépithélial du cation sodium et à son homéostase ainsi qu'à la perception du goût (Garty et al. Physiological
Review Vol. 77 pages 359-396, 1997, Barbry et al. American Journal of Physiology Vol. 273, G571-G585, 1997). Le deuxième groupe comprend les canaux sensibles aux acides ci-après dénommés ASICs (Waldmann, R. et al. Current opinion Neurobiology Vol. 8, pages 418-424, 1998 ; Waldmann R. et al. Nature Vol. 386, pages 173-177, 1997.).
Très récemment, un nouveau gène proche appelé BLINaC a été identifié chez le rat et la souris (Sakai et al. Journal of Physiology. vol. 519 pages 323-333, London, 1999). Il est principalement présent dans le foie, l'intestin et le cerveau ; la séquence du gène BLINaC présente une homologie de 30% avec les séquences des ASICs. Cependant, il n'est pas activé par une acidification extracellulaire, bien qu'il soit également capable de former un canal sélectif aux cations sodium et sensible à 1' amiloride comme révélé par l'introduction de mutations améliorant sa fonction.
La présente invention est fondée sur la découverte et le clonage d'un nouveau canal chez l'homme, désigné hINaC, membre de la famille des canaux NaC/DEG.
La mise en évidence de cette nouvelle classe de canal humain à cation sodium permet notamment de disposer de nouveaux moyens pour rechercher par criblage des drogues capables de moduler leur activité et donc de prévenir ou de traiter des maladies impliquant lesdits canaux, comme des pathologies intestinales telles qu'hypersécrétion intestinale ou des pathologies dont le traitement fait
intervenir l'utilisation d' amiloride ou un de ses analogues telles que des pathologies induisant une hypertension.
La présente invention a donc pour objet une protéine purifiée constituant un canal humain à cation sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues. Plus particulièrement, l'invention concerne une protéine purifiée constituant un canal sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe
SEQ ID. No : 2, ou un dérivé fonctionnel de cette protéine.
De tels dérivés fonctionnels sont ceux dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie pas les propriétés du canal hINaC . De tels variants peuvent être analysés par l'homme du métier selon les techniques décrites dans les exemples donnés ci-après qui ont permis de mettre en évidence les propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal hINaC .
Plus particulièrement, l'invention concerne une protéine purifiée, dérivé fonctionnel de la protéine constituant un canal sodium de l'invention, dont la séquence en acides est choisie parmi les séquences SEQ ID. No : 3, SEQ ID. No : 4 et SEQ ID. No : 5. Il a été possible d'obtenir une très grande activation du canal humain à cation sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues en mutant un résidu particulier situé juste avant le second domaine transmembranaire (Mil) . Les protéines dont la séquence est SEQ ID. No : 3, SEQ ID. No : 4 et SEQ
ID. No : 5 ont été obtenues en remplaçant 1 ' alanine 443 par des acides aminés ayant des chaînes latérales plus grandes, tels que la cystéine, la phénylalanine et la thréonine respectivement. Ces mutations ont entraîné une amélioration de la fonction des canaux associée à l'apparition d'importants courants constitutifs.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine constituant un canal ionique de 1 ' invention peuvent être préparés par les méthodes classiques décrites dans la littérature. Ces anticorps sont utiles pour rechercher la présence des canaux ioniques de l'invention dans différents tissus humains ou animaux, mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine thérapeutique pour inhiber ou activer in vivo, grâce à leur spécificité, un canal hINaC et/ou ses dérivés.
La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine constituant un canal humain à cation sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour la protéine constituant le canal hINaC dont la séquence en acides aminés est choisie parmi les séquences SEQ ID. No : 2, SEQ ID. No : 3, SEQ ID. No : 4 et SEQ ID. No : 5. Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine hINaC est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1.
L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique comprenant la séquence comprise entre les nucleotides 48 et 1562 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1. L ' invention concerne également sa séquence complémentaire et tous fragments oligonucléotidiques sens ou antisens issus de cette séquence. L'invention concerne également un dérivé de cette séquence présentant une mutation au niveau du codon correspondant à 1 ' alanine en position 443.
L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptées, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine constituant un canal ionique selon l'invention. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou 1 ' expression dans un hôte des canaux de 1 ' invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine constituant un canal cationique selon 1 ' invention consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique de 1 ' invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal à cation sodium,
à isoler, par tout moyen approprié les protéines constituant les canaux à cation sodium de 1 ' invention.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un canal ionique selon 1 ' invention consiste :
- à transférer une molécule d'acide nucléique de 1 ' invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression des canaux à cation sodium de l'invention.
L'hôte cellulaire mis en œuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d' insectes .
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide .
L'invention concerne aussi les hôtes cellulaires et plus particulièrement les cellules transformées exprimant des canaux à cation sodium présentant des propriétés et une structure du type de celles du canal hINaC obtenues conformément aux procédés précédents. Ces cellules sont utiles pour le criblage de substances capables de moduler les courants des canaux hINaC . Ce criblage est effectué en mettant en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules exprimant les canaux de l'invention, puis en
mesurant, par tout moyen approprié, les effets éventuels de ladite substance sur les courants sodium desdits canaux. Des techniques électrophysiologiques permettent également ces études et font aussi l'objet de la présente invention dès lors qu'elles mettent en œuvre les canaux hlnaC ou leurs variants. Ce procédé de criblage permet d'identifier des drogues capables de moduler l'activité des canaux sodium de 1 ' invention et donc susceptibles de prévenir ou de traiter des maladies impliquant ces canaux. Ces substances et leur utilisation comme médicament, isolés et détectés grâce aux procédés ci-dessus, font également partie de l'invention.
Plus particulièrement, l'invention concerne donc une substance chimique ou biologique capable de modifier les courants d'un canal sodium selon l'invention pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter des pathologies intestinales telles que l'hypersécrétion intestinale ou des pathologies dont le traitement fait intervenir l'utilisation d' amiloride ou un de ses analogues telles que des pathologies induisant une hypertension.
Une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine constituant un canal hINaC ou un dérivé de celui- ci, ou un vecteur comprenant cette molécule d'acide nucléique ou encore une cellule exprimant des canaux hINaC , sont aussi utiles pour la préparation d'animaux transgéniques. Il peut s'agir d'animaux sur-exprimant lesdits canaux, mais surtout d'animaux dit "knock out",
c'est à dire présentant une déficience en ces canaux; ces animaux transgéniques sont préparés par des méthodes connues de l'homme du métier, et permettent de disposer de modèles vivants pour 1 ' étude de pathologies animales associées aux canaux hINaC .
Ces animaux transgéniques de même que les hôtes cellulaires décrits précédemment sont utiles en tant que modèles pour 1 ' étude de pathologies associées à ces canaux sodium sensibles à l' amiloride ou à l'un de ses analogues soient parce qu'ils sur-expriment les canaux sodium du type canal hINaC, soit parce qu'ils présentent une déficience en ces canaux sodium.
L'invention concerne également le diagnostic in vi tro de pathologies chez l'homme et /ou chez l'animal susceptibles d'impliquer ledit canal sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues. Ce diagnostic in vi tro pourra être accompli par tout moyen mettant en œuvre un procédé de détection ou de localisation dans un échantillon biologique, dudit canal sodium ou du gène codant pour ledit canal sodium.
Ces procédés de détection peuvent utiliser soit des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre la protéine, contre un variant de celle-ci ou contre au moins un fragment de ceux-ci, constituant ledit canal ionique, soit une ou plusieurs sondes nucléotidiques sens ou antisens capables de s'hybrider avec le gène codant pour ledit canal sodium, ou avec un variant de celui-ci ou avec au moins un fragment de ceux-ci ou avec leurs ARNm.
Ces procédés de détection in vi tro peuvent être appliqués à la détection de toute pathologie impliquant les canaux sodium de l'invention, comme des pathologies intestinales telles que l'hypersécrétion intestinale ou encore des pathologies dont le traitement fait intervenir l'utilisation d' amiloride ou un de ses analogues telles que des pathologies induisant une hypertension chez un sujet humain ou animal .
Ainsi, l'invention concerne aussi l'utilisation des anticorps ou de leurs fragments, pour la détection de pathologies chez l'homme ou chez l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, ou la suppression ou l'addition d'au moins un acide aminé dans au moins une séquence proteique choisie parmi les séquences représentées en annexe sous les numéros SEQ ID . No : 2, SEQ ID. No : 3, SEQ ID. No : 4 ou SEQ ID. No : 5.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'au moins une séquence d'acides nucléiques choisie parmi des séquences nucléotidiques comprenant la séquence nucleotidique représentée en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou sa séquence complémentaire ou celles codant pour une séquence proteique choisie parmi les séquences représentées en annexe sous les numéros SEQ ID. No : 2, SEQ ID. No : 3, SEQ ID . No : 4 ou SEQ ID . No : 5 ou des oligonucléotides issus de celles-ci pour la détection de pathologies chez l'homme ou chez l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, ou la suppression ou l'addition d'un moins un nucléotide dans lesdites séquences nucléotidiques.
En outre, une protéine constituant un canal ionique hINaC peut être aussi utile pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant ces canaux. L'invention concerne donc aussi les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une de ces protéines éventuellement associée à un véhicule physiologiquement acceptable.
De même, les molécules d'acide nucléique de
1 ' invention ou les cellules transformées par ladite molécule sont donc susceptibles d'être utilisées dans des stratégies de thérapie génique afin de compenser une déficience des canaux hINaC au niveau de un ou plusieurs tissus intestinaux d'un patient. L'invention concerne donc aussi un médicament comprenant des molécules d'acide nucléique de 1 ' invention ou de cellules transformées par lesdites molécules pour le traitement de pathologies impliquant les canaux hINaC et leurs dérivés.
L'invention a donc pour objet une composition pharmaceutique comprenant un vecteur, ledit vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique choisie parmi les séquences représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros : SEQ ID No . : 2, SEQ ID No . : 3, SEQ ID No . : 4, ou SEQ ID No . : 5 , la séquence comprise entre les nucleotides 48 et 1562 de la séquence réprésentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. : 1 ou sa séquence complémentaire, avantageusement
associé à des séquences de contrôle, éventuellement associé à un véhicule physiologiquement acceptable.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent rapportant le travail de recherche ayant mené à l'identification et à la caractérisation de ces canaux à cation sodium sensibles à l' amiloride ou à l'un de ses analogues et où il sera fait référence aux séquences et dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1A représente la séquence nucleotidique hINaC et la séquence de la protéine prédite (505 acides aminés) . - La figure 1B représente l'analyse phylogenetique de plusieurs membres de la famille NaC/DEG isolés à partir de Drosophila , Caenorhabditis elegans
(incluant les dégénérines MEC-10, MEC-4, DEG-1, UNC-8, UNC-
105) , Hélix aspersa (FaNaC canal Na+ activé par le FMRFamide) et de mammifères (incluant le canal Na+ épithélial humain ENaC et les ASICs) . La séquence de la protéine hINaC présente une homologie de 79% avec la séquence de la protéine BLINaC de souris et de 29% avec la séquence des protéines ASICs.
- la figure 2A montre les images obtenues par analyse de Northern Blot. Elle représente la distribution tissulaire de hINaC .
- la figure 2B montre la localisation le long du tractus intestinal étudiée par RT-PCR en utilisant des
amorces spécifiques de hINaC . Un fort signal est détecté dans le duodénum et le jéjunum confirmant l'expression prédominante du hINaC dans l'intestin grêle. Contrairement aux études chez le rat et la souris, aucun signal n'est détecté dans le foie.
- la figure 2C montre une localisation plus sensible de l'ARNm du hINaC dans les tissus humains obtenue par RT-PCR. L'expression significative du hINaC dans l'intestin grêle a été confirmé et un faible signal a également été détecté dans les testicules alors qu'aucun signal n'a été détecté dans le cerveau et le foie. Le panel inférieur dans B et C correspond à un contrôle d'amplification de la GAPDH (coloration au bromure d'éthydium pour B et analyse en Southern blot pour C) .
- la figure 3A représente l'expression du hINaC dans les ovocytes de Xenopus . Des ARNc du hINaC type sauvage ou mutant A443 ont été injectés dans les ovocytes de Xenopus (10 ng par ovocyte) et le courant sensible à 1' amiloride (1 mM amiloride) a été enregistré au potentiel de -70 mV deux jours après en utilisant le voltage clamp à deux électrodes. L'expression du hINaC de type natif entraîne une apparition d'un courant de très basse amplitude qui est faiblement sensible à 10~3M d' amiloride et fait difficilement la différence entre Na+ et K+ . Le mutant A443S ne modifie pas l'amplitude du courant alors que les mutants A443C et plus particulièrement A443F et A443T sont associés à de très forts courants sensibles à l' amiloride avec des propriétés différentes. Le nombre d' ovocytes testés dans chaque condition est donné au-dessus
des histogrammes. Les ovocytes contrôles ont été injectés avec de l'eau. Une représentation schématique de la protéine hINaC incluant la position des mutations améliorant sa fonction est présentée sous les histogrammes. Les domaines extracellulaire et intracellulaire sont référencés comme « externe » (out) et « interne » (in) respectivement et les deux domaines transmembranaires putatifs comme MI et Mil.
- la figure 3B représente les courbes dose- réponse de l'inhibition du courant du mutant améliorant la fonction A443T enregistrées à -70mV en présence d' amiloride et de ses dérivés benzamil et EIPA. Chaque point correspond à la moyenne de 4 à 6 ovocytes . Les IC50 correspondant sont 0,5 μM, 0,8 μM et 18 μM pour l' amiloride, le benzamil et le EIPA, respectivement.
- la figure 3C représente la relation courant- voltage normale du courant sensible à l' amiloride (ImM) enregistrée à partir d'un ovocyte représentatif exprimant le mutant A443T dans un milieu riche en sodium (ND96, 96 mM de Na+ externe) ou riche en potassium (98mM de K+ externe) .
Le potentiel d'inversion du courant dans le milieu ND96 est de 35 mV.
- la figure 4A représente la cartographie FISH (Fluorescent in si tu hybridation) de la sonde hINaC sur le chromosome humain 4q31.3-q32. Elle illustre les métaphases observées avec un filtre Zeiss FITC à large bande. Les chromosomes sont colorés avec de l'iodure de propidium et le signal fluorescent FITC apparaît sous forme de points blancs.
- la figure 4B représente l'idéogramme des bandes G du chromosome 4 avec le site d'hybridation au 4q31.3-q32.
I - Identification, clonage du gène hINaC et structure primaire de la protéine correspondante déduite.
Une banque génomique humaine (2,5 x 106 clones) a été criblée avec la sonde cDNA de BLINaC de rat marquée au P32, sonde correspondant aux acides aminés 1-214 du hINaC humain. Un clone positif a été obtenu, il a été digéré avec Xhol et sous-cloné dans un vecteur pBluescript SK" . Il contient un insert ADN de 10 kb qui inclut deux exons correspondant aux acides aminés 115-195 et 196-236 du hINaC humain. Pour identifier le côté 3' de la séquence codant le hINaC , 1 ' ARN total de duodénum humain a été transcrit de façon réverse grâce à la reverse transcriptase Superscript II® en utilisant l'amorce SP6/KS-oligo-dT (5'- GATTTAGGTGACACTATAGAATCGAGGTCGACGGTATCCAGTCGAC (T) 18-3 ' ) (SEQ ID No : 6). L'échantillon RT a été amplifié par PCR
(94°C pendant 0,5 min, 60°C pendant 0,5 min, 72°C pendant 3 min ; 43 cycles) en utilisant soit l'amorce 5'-
GATTTAGGTGACACTATAGAA-3 ' (SEQ ID No : 7) soit l'amorce 5'-
TAGAATCGAGGTCGACGGTATC-3 ' (SEQ ID No : 8) qui sont identiques à des parties de l'amorce SP6/KS-oligo-dT et une amorce sens complémentaire à la séquence codant hINaC (position des bases 510-531 ; 5 ' -ACTGATTTTGCTGCAAGTCACC- 3' ; SEQ ID No : 9). Pour identifier le côté 5' de la séquence codant le hINaC, 1 'ARN de duodénum a été transcrit de façon réverse en utilisant l'amorce oligo- (dT) 15, la
queue poly G ayant été ajoutée au moyen de dGTP et de la transférase déoxynucléotidyl terminal, et utilisé pour la PCR. Les conditions d'amplification par PCR sont : 94°C pendant 1 min, 45°C pendant 1,5 min, 72°C pendant 2,5 min ; 10 cycles suivi de 94°C pendant 1 min, 55°C pendant 1,5 min, 72 °C pendant 2,5 min ; 41 cycles, deux amorces (5'- CACTTGGAATTCGCGGCGTCA(C)18-3 ' (SEQ ID No : 10) et 5'- CACTTGGAATTCGCGGCGTCA-3 ' ) (SEQ ID No : 11) complémentaires à la queue et une amorce antisens spécifique du hINaC (position des bases 531-510 : 5 ' -GGTGACTTGCAGCAAAATCAGT- 3' ; SEQ ID No : 12) ont été utilisés simultanément. Une PCR supplémentaire a été réalisée (94°C pendant 1 min, 55°C pendant 1,5 min, 72°C pendant 2,5 min ; 43 cycles) utilisant une des amorces de la queue (5'- CACTTGGAATTCGCGGCGTCA-3 ' ; SEQ ID No : 11) et une seconde amorce antisens hINaC (position des bases 287-265 5'- GATCTGCCATGTCACAAGTGAGA-3 ' ; SEQ ID No : 13). Les produits de PCR ont été sous-clonés dans le vecteur pBluescript SK"® et séquences. Ces procédures ont permis l'identification de l'amont du premier codon ATG et de l'aval du codon stop. La séquence complète codant le hINaC a été reconstruite à partir de deux fragments de PCR se chevauchant localisés entre une amorce sens positionnée juste avant le premier ATG (position des nucleotides 36-58 : 5'- ACGCTAGCCTGAAATCACAAATGGAGCAGAC-3' (SEQ ID No : 14) et une amorce antisens commençant au nucléotide 1582 dans la séquence ( 5 ' -GTGGATCCGGTATCATGAAAAGGAAACTATT-3 ' ; SEQ ID No : 15) . L'ADNc a été inséré dans le vecteur d'expression d'ovocyte de Xenopus pBSK-SP6-globin. Les mutants de hINaC A443 ont été préparés par PCR en utilisant une version
modifiée de la méthode d'epissage des gènes par extension chevauchante (Horton, R.M. et al., Gène, vol 77, pages 61- 68, 1989) .
Le criblage d'une banque génomique humaine avec une sonde correspondant à l'ADNc du canal à sodium BLINaC de rat a permis l'isolement d'un clone génomique partiel de 10 kb. La comparaison de séquence avec l'ADNc de BLINaC de rat a suggéré la présence de deux exons putatifs dans ce clone. La séquence de ces exons putatifs a été utilisée pour cloner un ADNc pleine longueur à partir de duodénum humain par RACE-PCR 3' et 5 ' . L'ADNc est long de 1692 pb et contient un cadre de lecture ouvert précédé d'un codon stop et qui code une protéine de 505 acides aminés (Fig. 1A) . La séquence de cette protéine présente une homologie de 79% avec celle du BLINaC de rat et de souris (Fig. 1B) . Une homologie comparable (79%) a été trouvée au niveau des nucleotides. La structure de la protéine humaine est similaire à la structure proposée des protéines de la famille NaC/DEG proches, la région N-terminale intracellulaire contient trois sites putatifs de phosphorylation par la protéine kinase C et un site potentiel de phosphorylation par la caséine kinase 2 (Fig. 1A) . La grande boucle extracellulaire contient 8 sites putatifs de N-glycosylation.
II - Cartographie tissulaire,
Des Northern blots d'ARN poly A+ provenant de différents tissus humains contenant 2 μg d'ARN poly A+ par piste ont été utilisés. Les blots ont été hybrides avec le
fragment PCR de 398 pb de hINaC marqué au P32 correspondant aux bases 390-758 pendant 16h à 65°C dans la solution d'hybridation ExpressHyb®, lavés dans 0,5 x SSC/ 0,1% SDS à 50°C et, par la suite, exposés à un film X-Omat AR® Kodak pendant 17 jours à -70°C.
Deux panels d'ADNc de différents tissus humains et un panel d'ADNc provenant des tissus du système digestif humain ont été utilisés. Deux amorces (positions 442-464 : 5' -GGCACATTGTATCCAAAGTCCTC-3 ' ; SEQ ID No : 16 et positions 708-730 : 5 ' -CCTCTTCCAGAGACACTCACTTT-3 ' ; SEQ ID No : 17) ont été utilisées dans un volume total de réaction de 20 μl . Trente-Huit cycles d'amplification (30 sec à 95°C, 1 min à 60°C et 1 min à 72°C) pour les panels d'ADNc de différents tissus humains ou 32 cycles d'amplification (30 sec à 95°C, 1 min à 55°C et 1 min à 72°C) pour le panel d'ADNc provenant des tissus du système digestif humain ont été réalisés en utilisant l'ADN polymérase Taq, excepté pour la GAPDH pour laquelle 24 cycles seulement ont été réalisés. 1/5 de chacune des réactions de PCR sont chargées sur un gel à 2% d'agarose puis transférées sur une membrane de nylon Hybond N+®. La membrane est hybridée avec la sonde d'ADNc de hINaC marquée au P32, lavée dans 0,2 x SSC/ 0,1% SDS à 60°C et ensuite exposée à un film X-Omat AR® Kodak à -70°C.
Une bande de 2,1 kb a été détectée par Northern Blot sur les ARN poly A+ d'intestin grêle humain (Fig. 2A) . Aucun signal n'a pu être détecté sur le cerveau ou le foie qui ont été montrés comme les principaux sites d'expression de BLINaC chez la souris. La distribution de l'ARNm de
hINaC le long du tractus digestif humain a confirmé son expression prédominante dans l'intestin grêle, plus précisément sur le duodénum et le jéjunum, un faible signal ayant été détecté dans l'estomac, l'iléon et le rectum (Fig. 2B) . Ce profil d'expression est proche de celui trouvé pour le BLINaC de souris et de rat excepté qu'une faible et variable expression a été trouvée dans le côlon. Une détection plus sensible de l'ARNm du hINaC par RT-PCR a montré, en plus du signal dans l'intestin grêle, un signal plus faible dans les testicules alors qu'aucun signal n'est détectable dans le cerveau et le foie même dans les conditions de PCR décrites pour permettre la détection de transcrits rares (Fig. 2C) .
III - Cartographie chromosomique.
Les étalements de métaphase ont été préparés à partir de lymphocytes humains stimulés par la phytohémagglutinine cultivés à 37°C pendant 72h. La 5- bromodéoxyuridine a été ajoutée à raison de 60 μg/ml de milieu lors des 7 dernières heures de culture pour assurer une cartographie chromosomique de bandes R de bonne qualité. Le plasmide contenant 1 ' insert Xhol-Xhol du hINaC génomique de 10 kb a été biotinylé par une transduction avec de la biotine-16-dUTP . L'hybridation avec les étalements chromosomiques a été réalisée selon un protocole connu de l'homme du métier. Pour chaque lame, 200 ng d'ADN biotinylé sont utilisés. Avant l'hybridation, la sonde marquée est incubée avec de l'ADN Cot-1 humain 150 fois en excès pendant 45 min à 37°C pour entrer en concurrence avec
les séquences répétitives non spécifiques. La sonde hybridee est détectée grâce à 1 ' avidine conjuguée à 1 ' isothiocyanate . Les chromosomes sont contrecolorés et les bandes R sont révélées avec du iodure de propidium (pH 11) comme décrit par Lemieux et al., Cytogenetic Cell Genetic, vol. 59, pages 311-312 (1992).
La localisation chromosomique du hINac a été étudiée par l'hybridation in si tu fluorescente (FISH) (Fig. 4) . Un total de 30 cellules en métaphase ont été analysées et 90% des cellules ont montré des points fluorescents spécifiques sur la région 4q31,3-q32 du génome humain (Fig. 4A,B). Les positions de plusieurs introns du gène hINaC ont été déduites à partir de la séquence du clone génomique partiel initialement isolé et à partir d'une séquence génomique humaine publiée par l'Institut Whitehead/ MIT Center for Génome Research (numéro d'accès : AC021433) . La séquence codante est incluse dans au moins 10 exons (Fig. 1A) .
IV - Propriétés fonctionnelles du hINaC .
L'isolement, le maintien et l'injection au stade V et VI d' ovocytes de Xenopus avec hINaC type sauvage ou mutant ont été réalisés selon Fink, M. et al., Embo Journal, vol 17, pages 3297-3308 (1998). L ' ARNc a été synthétisé à partir du vecteur pBSK-SP6-globine digéré par Notl . Les ovocytes de Xenopus ont été injectés avec 0,25-10 ng d'ARNc et des essais de voltage-clamp avec des microélectrodes ont été réalisés 1 à 3 jours après l'injection. La solution de bain ND96 contient 96 mM NaCl,
2 mM KC1, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4 ajusté avec du NaOH. Dans certaines expériences, le NaCl a été remplacé par du KC1.
Les propriétés fonctionnelles du hINaC ont été analysées après l'expression de son ARN complémentaire dans les ovocytes de Xenopus . Un courant de faible amplitude, de l'ordre de plusieurs dizaines de nA qui ne fait pas la distinction entre Na+ et K+ a été enregistré dans les ovocytes injectés avec hINaC . Ce courant est seulement partiellement inhibé par 1 mM d' amiloride. Un type de courant similaire a également été observé dans les ovocytes injectés avec BLINaC de rat. Le courant est soit lié au hINaC lui-même, soit à l'activation non-spécifique d'un canal ionique endogène. Il a été possible d'obtenir une très grande activation de hINaC en mutant un résidu particulier situé juste avant le second domaine transmembranaire (Mil) . Ces mutations ont consisté au remplacement de l' alanine 443 par des acides aminés ayant des chaînes latérales plus grandes, tels que la cystéine, la phénylalanine ou la thréonine . Elles ont entraîné une amélioration de la fonction des canaux associée à l'apparition d'importants courants constitutifs (Fig. 3A) . L'amplitude du courant n'a pas significativement changé pour la mutation A443S comparée au canal natif. Cependant, le courant augmente significativement pour le mutant A443C et atteint plusieurs μA pour les mutants A443F et A443T (Fig. 3A) . Les propriétés du mutant A443T ont été analysées de façon plus précise. La forte diminution de courant après le remplacement du Na+ externe par du K+ et le potentiel d'inversion du courant dans un milieu riche en Na+ (Fig.
3C) montrent que le canal dont la fonction est améliorée par la mutation est sélectif pour les ions sodium. Le courant est bloqué de façon réversible par le diurétique amiloride et par ses dérivés benzamil et N- ( 3-amino-6- chloro-5-ethylisopropylaminopyrazine-4-carbonyl) guanidine (EIPA) (Fig. 3B) .
Claims
REVENDICATIONS
1) Protéine purifiée constituant un canal sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe SEQ ID. : 2, ou un dérivé fonctionnel de cette protéine.
2) Protéine purifiée, dérivé fonctionnel de la protéine constituant un canal sodium selon la revendication
1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe SEQ ID. No : 3, SEQ ID. No : 4 et SEQ ID. No : 5.
3) Anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine constituant un canal ionique selon l'une des revendications 1 ou 2.
4) Molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 ou 2.
5) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 4 comprenant la séquence comprise entre les nucleotides 48 et 1562 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou sa séquence complémentaire.
6) Vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 5 avantageusement associé à des séquences de contrôle.
7) Procédé de production d'une protéine constituant un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce qu'il consiste :
- à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6 dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant ledit canal sodium, à isoler, par tout moyen approprié les protéines constituant lesdits canaux.
8) Procédé d'expression d'un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce qu'il consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6 dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production desdits canaux sodium.
9) Hôte cellulaire obtenu par un procédé selon la revendication 8.
10) Procédé de criblage de substances capables de moduler l'activité de canaux sodium sensibles à
1' amiloride ou l'un de ses analogues selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que l'on met en contact une substance à tester avec des cellules selon la revendication 9, puis l'on mesure, par tout moyen approprié, les effets éventuels de ladite substance sur les courants desdits canaux.
11) Procédé selon la revendication 10 appliqué au criblage de substances capables de prévenir ou traiter des pathologies intestinales chez un sujet humain ou animal.
12) Procédé selon la revendication 10 appliqué au criblage de substances capables de prévenir ou traiter des pathologies induisant une hypertension chez un sujet humain ou animal.
13) Procédé de diagnostic d'une maladie chez l'homme et/ou chez l'animal susceptible d'impliquer un canal sodium sensible à l 'amiloride ou à l'un de ses analogues caractérisé en ce que l'on recherche dans un échantillon biologique d'un patient la présence ou l'absence d'un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 , ou du gène codant celui-ci ou d'un variant de ceux-ci.
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon avec un anticorps ou un mélange d'anticorps selon la revendication 3.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on met en contact les acides nucléiques contenus dans ledit échantillon avec une ou plusieurs sondes nucléotidiques capables de s'hybrider avec une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou un variant de celles-ci.
16) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on recherche dans le génome des cellules présentes dans ledit échantillon la localisation du gène codant un canal sodium sensible à l' amiloride ou à l'un de ses analogues à l'aide de sondes nucléotidiques capables de s'hybrider avec une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou un variant de celles-ci.
17) Utilisation des anticorps ou de leurs fragments, selon la revendication 3 pour la détection de pathologies chez l'homme ou chez l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, ou la suppression ou l'addition d'au moins un acide aminé dans la séquence proteique selon l'une des revendications 1 ou 2.
18) Utilisation des séquences d'acides nucléiques selon les revendications 4 ou 5, ou des oligonucléotides issus de celles-ci pour la détection de pathologies chez l'homme ou chez l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, ou la suppression ou l'addition d'un moins un nucléotide dans lesdites séquences nucléotidiques
19) Utilisation selon l'une des revendications 17 ou 18 pour la détection de pathologies intestinales chez un sujet humain ou animal.
20) Utilisation selon l'une des revendications
17 ou 18 pour la détection de pathologies induisant une hypertension chez un sujet humain ou animal.
21) Utilisation d'une substance chimique ou biologique capable de modifier les courants d'un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter des pathologies intestinales, chez un sujet humain ou animal .
22) Utilisation d'une substance chimique ou biologique capable de modifier les courants d'un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter des pathologies induisant une hypertension chez un sujet humain ou animal .
23) Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une protéine constituant un canal sodium selon l'une des revendications 1 ou 2 ou un anticorps selon la revendication 3, ou une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6, éventuellement associé à un véhicule physiologiquement acceptable.
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Cited By (1)
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| WO2007042776A1 (fr) * | 2005-10-07 | 2007-04-19 | Imperial College Innovations Limited | Modulateurs de la voie de signalisation purinergique pour traiter l'homeostasie du sodium, l'hypertension et l'hyperaldosteronisme |
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2001
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Non-Patent Citations (3)
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| GB2446735A (en) * | 2005-10-07 | 2008-08-20 | Imp College Innovations Ltd | Modulators of the purinergic signalling pathway for treating sodium homeostatis hypertension and aldosteronism |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2806728A1 (fr) | 2001-09-28 |
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