CN111471804A

CN111471804A - 一种高灵敏高通量检测新型冠状病毒的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111471804A
Application number: CN202010502614.5A
Authority: CN
Inventors: 郭惠民; 李志凯; 高鹏钊
Original assignee: Zhejiang Dipu Diagnosis Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Dipu Diagnosis Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111471804B

Abstract

本发明公开了用于新一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其应用，包括扩增引物和单碱基延伸引物，其特征在于：包括根据新型冠状病毒基因ORF1ab、E、N设计的7对PCR扩增引物和13条延伸引物，其中正向扩增引物如SEQ ID NO.1～7所示，反向扩增引物如SEQ ID NO.8～14所示，延伸引物如SEQ ID NO.15～27所示。本发明的核酸质谱法整合了多重PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能，兼具“多、快、好、省”四大优势，为市场提供了一个具有显著成本优势，简易工作流程和高通量的全自动解决方案，并将起到降低无效医疗支出的作用，检出限可达到5copies/ul。

Description

一种高灵敏高通量检测新型冠状病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病原微生cop物基因检测技术领域，涉及一种基于核酸质谱法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的试剂盒，试剂盒包括新型冠状病毒ORF1ab、E和N共三个区域特异位点13个以及人GAPDH内参基因位点1个的检测试剂，设计每个位点的扩增引物和单碱基延伸引物，通过多重PCR和多重单碱基延伸反应，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定样品中是否含有新型冠状病毒基因，其检测特异性强、灵敏度高、可应用于科研、药物疗效研究和新型冠状病毒筛查等。

背景技术

新型冠状病毒(2019novel coronavirus,2019-nCoV)的基因结构与一般RNA 病毒结构差别较大。在应对引起本次肺炎疫情的新型冠状病毒检测上，广大的科研人员和检验专家们也全力以赴，制定了详尽的生物安全和防护措施，为疾病诊断提供了各类检测手段与技术。尤其是核酸检测发挥了应有的技术优势，是能最早确诊新型冠状病毒感染的方法，也是确诊病毒感染最重要的依据。

在保证核酸检测结果及时性的同时，降低核酸检测试剂盒的假阴性对当前疫情防控显得尤为重要，也是现阶段疫情防控的难题。鉴于此，急需一种特异性高和灵敏性强的的检测试剂盒更能满足当前新冠病毒检测的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于基质辅助激光飞行时间的核酸质谱技术可以检测新型冠状病毒的试剂盒和使用方法，以提高临床对新型冠状病毒的筛查诊断能力。为了实现本发明的上述目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括扩增引物和单碱基延伸引物，其特征在于：包括根据新型冠状病毒基因ORF1ab、E、N设计的7对扩增引物和13条单碱基延伸引物，其中正向扩增引物如SEQ ID NO.1～7所示，反向扩增引物如SEQ ID NO.8～14所示，单碱基延伸引物如SEQ ID NO.15～27所示。本发明创造性的针对新型冠状病毒ORF1ab、E和N共三个区域设计13个位点，大大提高检测灵敏度。

在本发明的一个优选实施方式中，所述包括根据人GAPDH基因保守区设计的1对扩增引物和1条单碱基延伸引物，其中正向扩增引物如SEQ ID NO.28所示，反向扩增引物如SEQ ID NO.29所示，单碱基延伸引物如SEQ ID NO.30所示。本发明通过以人GAPDH为内参对照，保证实验结果准确性。

SEQ ID NO.1	ACGTTGGATGATGAGAAGTGCTCTGCCTAT
		SEQ ID NO.2	ACGTTGGATGTAGTGGAGCAATGGATACA
SEQ ID NO.3	ACGTTGGATGACACCGCATACAGTCTTA
		SEQ ID NO.4	ACGTTGGATGTCGTGGTATTCTTGCTAGTT
SEQ ID NO.5	ACGTTGGATGCGGTGATGCTGCTCTTGCT
		SEQ ID NO.6	ACGTTGGATGACCCCAAAATCAGCGAAATG
SEQ ID NO.7	ACGTTGGATGGATTACAAACATTGGCCGC
		SEQ ID NO.8	ACGTTGGATGAATGCCCAGTGGTGTAAGT
SEQ ID NO.9	ACGTTGGATGAAACAGCTGAGGTGATAGAG
		SEQ ID NO.10	ACGTTGGATGAACATTATCGCTACCAAC
SEQ ID NO.11	ACGTTGGATGATTCAGATTTTTAACACGAG
		SEQ ID NO.12	ACGTTGGATGTACGTTTTTGCCGAGGCTTC
SEQ ID NO.13	ACGTTGGATGTGGTTACTGCCAGTTGAATC
		SEQ ID NO.14	ACGTTGGATGAATGCGCGACATTCCGAAG
SEQ ID NO.15	CAGTTGAACTCGGTACA
		SEQ ID NO.16	GTACAGAAGTAAATGAGTTC
SEQ ID NO.17	CTACAGAGAAGCTGCTTGT
		SEQ ID NO.18	GGCTCTCAATGACTTCAGT
SEQ ID NO.19	GTTGGGGCTTGTGTTCTT
		SEQ ID NO.20	GATGTGGTGCTTGCATA
SEQ ID NO.21	TTGTAAATGCTGTTAC
		SEQ ID NO.22	CAATATTGTTAACGTGAGTCTT
SEQ ID NO.23	CGTGAGTCTTGTAAAACCTT
		SEQ ID NO.24	ATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATG
SEQ ID NO.25	CACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCT
		SEQ ID NO.26	AGGGTCCACCAAACGTAATG
SEQ ID NO.27	ACAATTTGCCCCCAGCGCTT
		SEQ ID NO.28	ACGTTGGATGCAATGACCCCTTCATTGACC
SEQ ID NO.29	ACGTTGGATGGACAAGCTTCCCGTTCTCAG
		SEQ ID NO.30	ATGTTCCAATATGATTCCACCCATG

在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒是基于核酸质谱法检测新冠病毒的试剂盒。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：

本发明另一方面还涉及一种新型冠状病毒检测平台，其包括基于飞行时间的核酸质谱仪以及上述试剂盒。本发明针对RNA病毒易变异的特点，选择基于飞行时间的核酸质谱检测技术可进行多基因多位点检测，相对于目前市场上的荧光定量PCR的单基因单位点检测，可大大提高检出率。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的平台是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(DP-TOF)平台。通过采用该平台，全流程手动操作少于30分钟，每天可做3000个样本，不仅简化了工作流程，还极大的提高检测通量。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒的应用，其特征在于在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。

本发明另一方面还涉及上述检测新型冠状病毒的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

a)以待检测样本DNA/RNA(如样本为RNA，则需反转录)为模板，利用所述一共8对扩增引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物。反应条件为：30℃，10分钟；95℃，2分钟；95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟；进行45个循环扩增；72℃，4分钟。

b)将上一步PCR产物利用虾碱性磷酸酶进行纯化，去除多余的dNTP，得到消化产物；反应条件为：37℃，40分钟，85℃，5分钟；

c)利用所述一共14条延伸引物对上一步消化产物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；反应条件为：95℃，30秒，94℃，5秒，40个循环，52℃，5秒，80℃，5秒，5个循环，72℃，3分钟。

d)将上一步延伸产物经树脂脱盐和芯片点样，进行核酸质谱检测，通过软件解读检测结果即可。

本发明的优点包括但不限于以下：

本发明的核酸质谱法整合了多重PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能，兼具“多、快、好、省”四大优势，为市场提供了一个具有显著成本优势，简易工作流程和高通量的全自动解决方案，并将起到降低无效医疗支出的作用，检出限可达到5copies/ul。

本发明针对新型冠状病毒ORF1ab、E和N共三个区域设计13个位点，大大提高检测灵敏度；以人GAPDH为内参对照保证实验结果准确性。

本发明针对RNA病毒易变异的特点，选择基于飞行时间的核酸质谱检测技术可进行多基因多位点检测，相对于目前市场上的荧光定量PCR的单基因单位点检测，可大大提高检出率。

本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(DP-TOF)平台，全流程手动操作少于30分钟，每天可做3000个样本，不仅简化了工作流程，还极大的提高检测通量。

附图说明

图1和图2对应实施例1。图1代表核酸质谱检测空白对照时的质谱峰图，仅延伸引物UEP处有质谱峰图，N基因、ORF1ab基因和E基因对应位置不出峰；图2代表核酸质谱检测阳性质粒时的质谱峰图，N基因、ORF1ab基因和E基因对应位置均能正常出峰。

图3对应实施例3，表示质粒浓度为200copies/ul、50copies/ul和25copies/ul时的荧光定量PCR扩增曲线。当质粒浓度为200copies/ul和50copies/ul时荧光定量PCR的内参基因、ORF1ab基因和N基因正常起峰，可正常检测；当质粒浓度为25copies/ul时荧光定量PCR的内参基因、ORF1ab基因和N基因不起峰，无法正常检测。

具体实施方式

下面结合实施例做一详细说明，以使本领域和相关领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以顺利实施。在本发明中，如果未经特别说明，相关的试剂采用本领域公知的试剂，相关的步骤按照本领域公知的步骤进行。

实施例1：基于核酸质谱法检测新型冠状病毒质粒的方法。

新冠病毒的阳性质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，pUC57克隆质粒+插入序列，使用时稀释至一定浓度作为模板。插入序列覆盖新冠病毒的ORF、N、E三个区域，插入序列(5‘→3’)如SEQ ID NO.31所示，共1598bp。

检测试剂的8对扩增引物和14条单碱基延伸引物由上海百力格生物有限公司合成，扩增引物干粉合成后用超纯水溶解制备成100μM贮存液，混合使用时使每一条扩增引物的终浓度为0.5μM。延伸引物干粉用超纯水溶解制备成500μM的贮存液，混合配制后在质谱仪上调整至每一个引物峰高相对均一为止，即最低峰高大于最高峰高的二分之一。

检测试剂盒为飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂盒(浙江迪谱诊断技术有限公司，生产批号：20190517)。

仪器：Veriti型96孔定性PCR仪(Applied Biosystems)，DP-TOF飞行时间质谱仪(浙江迪谱诊断技术有限公司)。VORTEX-5旋涡混匀器，低速离心机。

a)以合成的质粒为阳性样本，利用5对特异引物进行扩增，具体步骤如下：

多重PCR扩增程序为：30℃，10分钟；95℃，2分钟；95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，

1分钟；进行45个循环扩增；72℃，4分钟。

b)SAP酶消化处理，利用虾碱性磷酸酶对PCR反应产物进行纯化，去除多余的dNTP，取5μL上述反应液用于SAP消化反应体系，SAP消化反应体系如下，总计7μL。

SAP消化反应程序为：37℃保温40min；85℃保温5min。

*注：SAP产物应立即进行下一步操作，不建议放置4℃过夜。

c)单碱基延伸反应：取上述7μL反应液加入延伸反应体系，延伸反应体系配置如下，总计9μL。

单碱基延伸反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循，最后72℃后延伸3min。

延伸反应结束后，往产物里加入16μL超纯水，离心混匀后准备上机。本次实验使用的是带有芯片准备模块的全自动384孔模块系统(CPM384)。将其转移到核酸质谱仪的芯片准备模块，将一块芯片也放入模块，设置好程序，机器自动进行产物脱盐、点样芯片，和产物飞行步骤。飞行结束后，在机器自带的Typer软件分析数据。

实施例2、基于核酸质谱法检测新型冠状假病毒的方法。

假病毒2019-nCov-RdRP Pseudovirus Standard Reference购于广州邦德盛生物科技有限公司，包含RdRP片段2995bp。

将假病毒标准品利用反转录试剂盒(TaKaRaPrimeScript^TM1st Strand cDNASynthesis Kit)进行反转录，体系如下：

反转录完成后，用Nanodrop测定其浓度，立即检测或-20℃保存备用。

利用实施例一中优化好的引物组进行多重PCR扩增，SAP消化，多重单碱基延伸，所用试剂盒为飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂盒(浙江迪谱诊断技术有限公司，生产批号：20190517)。反应条件同实施例一。

延伸结束，往产物里加入16μL超纯水，离心混匀后上机进行质谱飞行同实施例一。

实施例3、平行实验对比荧光定量PCR和核酸质谱的检测灵敏度。

将质粒稀释成200copies/ul、100copies/ul、50copies、25copies/ul、10copies/ul、5copies/ul、2copies/ul、1copies/ul八个梯度，然后分别进行核酸质谱检测和荧光定量检测。

QPCR反应体系：(n+1)×19ul(2019-nCoV RT-PCR buffer)与(n+1)×11ul(EnzymeMix)，20ul/管分装。n＝反应官数。提取物、阴阳性对照均5ul。

荧光定量检测仪器为Quantstudio 5荧光定量PCR仪，所用试剂盒为新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。反应条件如下：

核酸质谱反应体系与步骤同实施例1、2。

核酸质谱结果：

结果显示荧光定量PCR的检出限为50copies/ul，核酸质谱的检出限为5copies/ul。

实施例4：基于核酸质谱法检测新冠病毒变异株。

合成新冠病毒变异株A型、C型的假病毒(广州邦德盛生物科技有限公司)，序列覆盖新冠病毒的ORF、N、E三个区域。

将合成的假病毒利用反转录试剂盒(TaKaRaPrimeScript^TM1st Strand cDNASynthesis Kit)进行反转录，体系同实施例2。反转录完成后，用Nanodrop测定其浓度，立即检测或-20℃保存备用。

将提取的假病毒cDNA稀释至一定浓度分别进行核酸质谱检测和荧光定量检测。QPCR反应体系、条件同实施例3，核酸质谱反应体系与步骤同实施例1、2，均重复10次，分析结果。

检测结果：

结果显示两种检测平台均能检测出B型新冠病毒，对于变异株荧光定量技术只能检测出A型变异株新冠病毒的ORF基因，N基因检测不到；对于C型变异株ORF基因和N基因均检测不到。而核酸质谱检测平台由于其多位点的优势，A、C型变异株均可以检测到。

综上所述，本发明提供了一种高灵敏高通量检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒，该体系灵敏度高，准确性好，检测下限低至5copies/ul，灵敏度是荧光定量的10倍，针对RNA病毒易变异特点，可实现对新冠病毒不同变异株的检测，并实现多基因多位点1孔检测，准确性达100％；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果，结果文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；通量高，成本低廉，实用性非常突出，可立即应用于临床，尤其适合目前全球性的新型冠状病毒检测。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

序列表

<110> XXXX研究所

<120> 一种高灵敏高通量检测新型冠状病毒的试剂盒及其应用

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<213> 新型冠状病毒(2019-nCoV)

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acgttggatg atgagaagtg ctctgcctat 30

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acgttggatg tagtggagca atggataca 29

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acgttggatg acaccgcata cagtctta 28

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acgttggatg tcgtggtatt cttgctagtt 30

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acgttggatg cggtgatgct gctcttgct 29

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acgttggatg accccaaaat cagcgaaatg 30

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acgttggatg attcagattt ttaacacgag 30

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acgttggatg tacgtttttg ccgaggcttc 30

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acgttggatg tggttactgc cagttgaatc 30

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gtacagaagt aaatgagttc 20

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ctacagagaa gctgcttgt 19

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ggctctcaat gacttcagt 19

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gttggggctt gtgttctt 18

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gatgtggtgc ttgcata 17

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caatattgtt aacgtgagtc tt 22

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cgtgagtctt gtaaaacctt 20

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attgaaccag cttgagagca aaatg 25

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cactaagaaa tctgctgctg aggct 25

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agggtccacc aaacgtaatg 20

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acaatttgcc cccagcgctt 20

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acgttggatg caatgacccc ttcattgacc 30

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acgttggatg gacaagcttc ccgttctcag 30

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atgttccaat atgattccac ccatg 25

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tgataaagta cttaatgaga agtgctctgc ctatacagtt gaactcggta cagaagtaaa 60

tgagttcgcc tgtgttgtgg cagatgctgt cataaaaact ttgcaaccag tatctgaatt 120

acttacacca ctgggcattg atttagatga gtggagtatt agtggagcaa tggatacaac 180

tagctacaga gaagctgctt gttgtcatct cgcaaaggct ctcaatgact tcagtaactc 240

aggttctgat gttctttacc aaccaccaca aacctctatc acctcagctg ttttgcagag 300

tggttttaga aaaatggccc tgtgggtttt acacttaaaa acacagtctg taccgtctgc 360

ggtatgtgga aaggttatgg ctgtagttgt gatcaactcc gcgaacccat gcttcagtca 420

gctgatgcac aatcgttttt aaacgggttt gcggtgtaag tgcaacaccg catacagtct 480

tacaggctgt tggggcttgt gttctttgca attcacagac ttcattaaga tgtggtgctt 540

gcatacgtag accattctta tgttgtaaat gctgttacga ccatgtcata tcaacatcac 600

ataaattagt cttgtctgtt aatccgtatg tttgcaatgc tccaggttgt gatgtcacag 660

atgtgactca actttactta ggaggtatga gctattattg taaatcacat aaaccaccca 720

ttagttttcc attgtgtgct aatggacaag tttttggttt atataaaaat acatgtgttg 780

gtagcgataa tgttactgac tttaatgcaa ttgcaactcg tggtattctt gctagttaca 840

ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt 900

cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt 960

cctgatcttc tggtggggaa cttctcctgc tagaatggct ggcaatggcg gtgatgctgc 1020

tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag agcaaaatgt ctggtaaagg 1080

ccaacaacaa caaggccaaa ctgtcactaa gaaatctgct gctgaggctt ctaagaagcc 1140

tcggcaaaaa cgtactgcca ctaaagcata caatgtaaca caagcattta tgctttggtg 1200

taaagatggc catgtagaaa cattttaccc aaaattacaa tctagtcaag cgtggcaacc 1260

gggtgttgct atgcctaatc tttacaaaat gcaaagaatg ctattagaaa agtgtgacct 1320

tcaaaattat ggtgatagtg caacattacc taaaggcata atgatgaatg tcgcaaaata 1380

tactcaactg tgtcaatatt taaacacatt aacattagct gtaccctata atatgagagt 1440

tatacataaa gtggatattg ttgccatcaa tgaccccttc attgacctca actacatggt 1500

ttacatgttc caatatgatt ccacccatgg caaattccat ggcaccgtca aggctgagaa 1560

cgggaagctt gtcatcaatg gaaatcccat caccatc 1597

Claims

1.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括扩增引物和单碱基延伸引物，其特征在于：包括根据新型冠状病毒基因ORF1ab、E、N设计的7对PCR扩增引物和13条延伸引物，其中正向扩增引物如SEQ ID NO.1～7所示，反向扩增引物如SEQ ID NO.8～14所示，延伸引物如SEQ IDNO.15～27所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在所述试剂盒还包括根据人GAPDH基因保守区设计的1对PCR引物和1条延伸引物，其中正向扩增引物如SEQ ID NO.28所示，反向扩增引物如SEQ ID NO.29所示，延伸引物如SEQ ID NO.30所示。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，所述的试剂盒是基于核酸质谱法检测新冠病毒的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒还包括飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：

。

5.一种新型冠状病毒检测平台，其包括基于飞行时间的核酸质谱仪以及上述权利要求1～4任意一项所述的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的检测平台，其特征在于所述的平台是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(DP-TOF)平台。

7.权利要求1～4任意一项所述的试剂盒的应用，其特征在于在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。

8.权利要求5或6所述的平台在检测新型冠状病毒中的应用。