CN113862400B - 检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒。检测新冠ORF1ab基因的引物对如SEQ ID NO：1~2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测新冠N基因的引物对如SEQ ID NO：4~5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测流感嗜血杆菌的引物对如SEQ ID NO：7~8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。检测肺炎链球菌的引物对如SEQ ID NO：10~11所示、探针如SEQ ID NO：12所示；检测肺炎支原体的引物对如SEQ ID NO：13~14所示、探针如SEQ ID NO：15所示；检测肺炎衣原体的引物对如SEQ ID NO：16~17所示、探针如SEQ ID NO：18所示。本发明提供的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性，将其应用于检测试剂盒，能够高效的对新冠病毒感染和社区获得性肺炎感染进行筛查和分诊。

Description

检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒（COVID-19）已被列为乙类传染病，按照甲类传染病管理。为指导各地疾控机构规范开展新型冠状病毒肺炎的流行病学调查工作，掌握病例发病情况、暴露史、接触史等流行病学相关信息，分析聚集性疫情的传播特征和传播链，做好密切接触者的追踪判定，防范新型冠状病毒肺炎疫情的蔓延和传播，按照法律要求，所有病例都应立即通过传染病信息系统进行报告。
新型冠状病毒肺炎患者主要临床表现为发热、咳嗽、肌肉疼痛或疲劳以及呼吸窘迫症状，少数患者会呈现咳痰、头痛、咯血和腹泻症状。CT影像显示几乎所有患者均呈现双肺浸润肺炎表现，同时部分患者会出现白细胞减少和淋巴细胞减少症。
社区获得性肺炎（CAP）患者同样有发热，咳嗽、脓痰、白细胞增多或减少；胸部X线片表现有片状、叶状、肺泡高密度浸润性病变等症状。
新冠病毒感染症状与社区获得性肺炎十分相似，无法从临床症状和体征区分，对分析聚集性疫情的传播特征和传播链，以密切接触者的追踪判定增加了难度。
社区获得性肺炎（CAP）的病原主要有细菌、支原体、衣原体和病毒4大类。临床较为常见的社区获得性肺炎的细菌病原是肺炎链球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、克雷伯杆氏菌和卡他莫拉菌等。社区获得性肺炎的病毒病原有甲、乙型流感病毒，副流感病毒1、2、3型，呼吸道合胞病毒和腺病毒等。其他微生物病原有肺炎支原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体等。目前国内多项成人社区获得性肺炎（CAP）流行病学调查结果显示：肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌以及流感嗜血杆菌是我国成人CAP的重要致病原。
在当前新冠病毒感染肆虐的社会环境下，密切接触人员筛查和全员普筛的过程中，筛查并区分新冠病毒感染和社区获得性肺炎十分必要。因此，需要一种产品，能准确、快速筛查出新冠病毒感染以及社区获得性肺炎，可用于临床疑似病例的确诊、疑似病例（有类似症状人员）的管理、高风险人群（如密切接触者、来自感染高风险国家和地区人群）的出入境检测等。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒。旨在解决现有技术中无法通过一次检测对新冠病毒感染和社区获得性肺炎进行分诊的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合，该引物探针组合包括：
检测新冠ORF1ab基因的引物对如SEQ ID NO：1~2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；
检测新冠N基因的引物对如SEQ ID NO：4~5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；
检测肺炎链球菌的引物对如SEQ ID NO：10~11所示、探针如SEQ ID NO：12所示；
检测肺炎支原体的引物对如SEQ ID NO：13~14所示、探针如SEQ ID NO：15所示；
检测肺炎衣原体的引物对如SEQ ID NO：16~17所示、探针如SEQ ID NO：18所示。
作为优选实施方案，所述引物探针组合还包括：
检测流感嗜血杆菌的引物对如SEQ ID NO：7~8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。
作为优选实施方案，引物探针组合还包括：
内源性内标引物对如SEQ ID NO：19~20所示、内标探针如SEQ ID NO：21所示。
SEQ ID NO：1～21的序列信息见表1。
表1
SEQ ID NO：1 ACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAG 新冠ORF1ab基因正向引物
SEQ ID NO：2 AGATGTCAAAAGCCCTGTATACG 新冠ORF1ab基因反向引物
SEQ ID NO：3 ACACCGTGCGGCACAGGCACTAG 新冠ORF1ab基因探针
SEQ ID NO：4 ACCAACAGAGCCTAAAAAGGAC 新冠N基因正向引物
SEQ ID NO：5 CCAAATCTGCAGCAGGAAGAAGAG 新冠N基因反向引物
SEQ ID NO：6 ACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAG 新冠N基因探针
SEQ ID NO：7 GCTGGATGAAAGGGGAAGCAG 流感嗜血杆菌正向引物
SEQ ID NO：8 CTTAGGACCAGCGCCTATTGC 流感嗜血杆菌反向引物
SEQ ID NO：9 ACCTGATAAAACTAGCAGAG 流感嗜血杆菌探针
SEQ ID NO：10 GTTCAGGCTATATGCTTGCAG 肺炎链球菌正向引物
SEQ ID NO：11 GCCATTTCGCCTGAGTTGTCG 肺炎链球菌反向引物
SEQ ID NO：12 CCGCTGGAGGAAGCACACAG 肺炎链球菌探针
SEQ ID NO：13 GAAGCGTACTTCGCCAACATTG 肺炎支原体正向引物
SEQ ID NO：14 GTGGGCCGACTTGGTAACATG 肺炎支原体反向引物
SEQ ID NO：15 CCTCACCTGGTTCGGGCAAGCG 肺炎支原体探针
SEQ ID NO：16 GAGTACAATGGTCTCGAGCAAC 肺炎衣原体正向引物
SEQ ID NO：17 GTAAAGAAGGGTTCCATGCAG 肺炎衣原体反向引物
SEQ ID NO：18 CGCATTGCTCAGCCAAAACTACC 肺炎衣原体探针
SEQ ID NO：19 GCTTCTGACACAACTGTGTTCAC 内源性内标正向引物
SEQ ID NO：20 CGGCAGACTTCTCCACAGGAGT 内源性内标反向引物
SEQ ID NO：21 ACCTCAAACAGACACCATGG 内源性内标探针
本发明还提供一种新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，该试剂盒包括所述的引物探针组合。
作为优选实施方案，所述特异性引物SEQ ID NO：1-2，SEQ ID NO：4-5，SEQ ID NO：7-8，SEQ ID NO：10-11，SEQ ID NO：13-14和SEQ ID NO：16-17在扩增反应液中的浓度分别为0.4-0.6μM，所述特异性探针SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18在扩增反应液中的浓度分别为0.25-0.35μM，所述内源性内标引物探针SEQ ID NO：19-21在扩增反应液中的浓度分别为0.15-0.25μM。
作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括：核酸扩增反应液A、核酸扩增反应液B、酶混合液；
所述核酸扩增反应液A包括SEQ ID NO：1~9的引物探针、SEQ ID NO：19~20所示的内源性内标引物探针和RT-PCR反应试剂；
所述核酸扩增反应液B包括SEQ ID NO：10~18的引物探针、SEQ ID NO：19~20所示的内源性内标引物探针和RT-PCR反应试剂；
所述酶混合液包括：逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、UDG酶和牛血清白蛋白，溶剂为无核酸酶水。
作为优选实施方案，所述RT-PCR反应试剂包括：Tris缓冲液、钾离子、硫酸铵、镁离子、dA/T/G/C/UTPs、四甲基氯化铵、海藻糖、二甲基亚砜，溶剂为无核酸酶水。
作为优选实施方案，所述试剂盒用于PCR反应时反应体系的各组分组成为：
特异性引物 0.4-0.6μM
特异性探针 0.25-0.35μM
内源性内标引物探针 0.15-0.25μM
Tris缓冲液 20-40mM
钾离子 40-60mM
硫酸铵 20-50mM
镁离子 3-7mM
dATP 400-800μM
dTTP 400-800μM
dGTP 400-800μM
dCTP 400-800μM
dUTP 400-800μM
四甲基氯化铵 25-40mM
海藻糖 0.5-1.5wt%
二甲基亚砜 体积百分比0.1%-2%
逆转录酶 0.3-0.5U/μL
DNA聚合酶 0.15-0.3U/μL
RNA酶抑制剂 0.25-0.4 U/μL
UDG酶 0.0015-0.003 U/μL
牛血清白蛋白 0.1-0.3wt%
溶剂为无核酸酶水，反应体系pH值为8.0~8.8。
作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和空白对照；
所述阳性对照为新冠病毒ORF1a基因假病毒、N基因假病毒、流感嗜血杆菌培养物、肺炎链球菌培养物、肺炎支原体培养物、肺炎衣原体培养物和人胚肾细胞293T的混合液；
所述阴性对照为人胚肾细胞293T培养液；
所述空白对照为无核酸酶水。
本发明还提供检测新冠病毒的引物探针组合，该引物探针组合包括：
检测新冠ORF1ab基因的引物对如SEQ ID NO：1~2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；
检测新冠N基因的引物对如SEQ ID NO：4~5所示、探针如SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供一种新冠病毒的检测试剂盒，该试剂盒包括所述检测新冠病毒的引物探针组合。
本发明还提供检测肺炎病原菌的引物探针组合，该引物探针组合包括：
检测肺炎链球菌的引物对如SEQ ID NO：10~11所示、探针如SEQ ID NO：12所示；
检测肺炎支原体的引物对如SEQ ID NO：13~14所示、探针如SEQ ID NO：15所示；
检测肺炎衣原体的引物对如SEQ ID NO：16~17所示、探针如SEQ ID NO：18所示。
本发明还提供一种肺炎病原菌的检测试剂盒，该试剂盒包括所述检测肺炎病原菌的引物探针组合。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明提供的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性，将其应用于检测试剂盒，能够高效的对新冠病毒感染和社区获得性肺炎感染进行筛查和分诊。
2，本发明的试剂盒能够实现对新型冠状病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌进行同时检测，并且满足较高的灵敏度。
附图说明
图1为实施例2中PCR反应液A管的扩增示意图；
图2为实施例2中PCR反应液B管的扩增示意图。
图3为实施例3中本发明试剂盒对新型冠状病毒ORF1ab基因检测灵敏度的示意图；
图4为实施例3中本发明试剂盒对新型冠状病毒N基因检测灵敏度的示意图；
图5为实施例3中本发明试剂盒对流感嗜血杆菌的检测灵敏度示意图；
图6为实施例3中本发明试剂盒对肺炎支原体的检测灵敏度示意图；
图7为实施例3中本发明试剂盒对肺炎衣原体的检测灵敏度示意图；
图8为实施例3中本发明试剂盒对肺炎链球菌的检测灵敏度示意图；
图9为实施例3中本发明试剂盒对新型冠状病毒检测准确性和特异性的示意图；
图10为实施例3中本发明试剂盒对流感嗜血杆菌检测准确性和特异性的示意图；
图11为实施例3中本发明试剂盒对肺炎支原体检测准确性和特异性的示意图；
图12为实施例3中本发明试剂盒对肺炎衣原体检测准确性和特异性的示意图；
图13为实施例3中本发明试剂盒对肺炎链球菌检测准确性和特异性的示意图。
图14为实施例5中本发明试剂盒对新冠病毒ORF1ab基因检测重复性的示意图。
图15为实施例5中本发明试剂盒对新冠病毒N基因检测重复性的示意图。
图16为实施例5中本发明试剂盒对流感嗜血杆菌检测重复性的示意图。
图17为实施例5中本发明试剂盒对肺炎支原体检测重复性的示意图。
图18为实施例5中本发明试剂盒对肺炎衣原体检测重复性的示意图。
图19为实施例5中本发明试剂盒对肺炎链球菌检测重复性的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1 新冠病毒和肺炎病原菌检测试剂盒的制备
按照下表2和表3配制核酸扩增反应液。
表2 ：核酸扩增反应液A组分及浓度
Figure 698515DEST_PATH_IMAGE001
表3 核酸扩增反应液B组分及浓度
Figure 453981DEST_PATH_IMAGE002
按照表4配制酶混合液。
表4
Figure 312216DEST_PATH_IMAGE003
按照表5配制阳性对照。
表5
Figure 127725DEST_PATH_IMAGE004
按照表6配制阴性对照和空白对照。
表6
名称 组份 浓度 装量（μL）
阴性对照 人胚肾细胞293T培养液 5×10<sup>4</sup>cell/mL 1000
空白对照 无核酸酶水 / 1000
实施例2 新冠病毒和肺炎病原菌检测试剂盒的使用方法
本发明检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）PCR反应液准备
从试剂盒中取出核酸扩增反应液A、核酸扩增反应液B和酶混合液，室温融化后振荡混匀，根据待扩增样本数N（含阳性对照、阴性对照和空白对照）按表7和表8分别配制PCR反应液A管和PCR反应液B管，充分混匀后进行短时离心并分装至PCR反应管（板）中，分装体积为12.5μL。
表7 PCR反应液A管配制
组分名称 体积（μL） 反应液配制
核酸扩增反应液A 11 11×N
酶混合液 1.5 1.5×N
总体积 12.5 12.5×N
表8 PCR反应液B管配制
组分名称 体积（μL） 反应液配制
核酸扩增反应液B 11 11×N
酶混合液 1.5 1.5×N
总体积 12.5 12.5×N
（2）样本处理及加样
按照推荐核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取好的待测样本、阳性对照、阴性对照和空白对照核酸溶液分别取12.5μL加入到上述配制好的PCR反应管（板）中反应液A管和B管中，盖紧管盖（或封膜），短时离心后转移至扩增检测区。PCR反应液分装如表9所示。
表9
Figure 71410DEST_PATH_IMAGE005
（3）PCR扩增检测
将PCR反应管（板）放入QuantStudio™ 5荧光PCR扩增仪进行扩增检测。扩增程序如表10所示。
表10
Figure 633497DEST_PATH_IMAGE006
步骤3中60℃时荧光检测，反应液A管中新型冠状病毒ORF1ab检测通道为FAM，新型冠状病毒N基因检测通道为ROX，流感嗜血杆菌检测通道为VIC；反应液B管中肺炎链球菌检测通道为FAM，肺炎支原体检测通道为ROX，肺炎衣原体检测通道为VIC，反应液A管和B管内标检测通道均为CY5；“Passive Reference”均选择“None”，扩增体积设置为25 μL。
按照上述扩增程序对待测样本进行检测，并统计扩增结果。参见图1和图2，其中图1为PCR反应液A管的扩增示意图；图2为PCR反应液B管的扩增示意图。
实施例3 本发明试剂盒用于检测的灵敏度
利用实施例1的试剂盒，检测国家标准品2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品(370099-202001)，验证检测灵敏度；灵敏度参考品S浓度(原液)为3×105copies/mL，使用数字PCR方法联合定值。S使用无RNA/DNA酶去离子水进行1:3倍比稀释(2份水+1份样本)后，将1:9、1:27、1:81、1:243、1:729、1:2187、1:6561、1:19683、1:59049、1:177147分别标记为S1～S10，按照试剂盒说明书要求进行核酸提取后进行检测。根据梯度稀释后的检测结果，本试剂盒对SARS-CoV-2的检测灵敏度是0.137 copies/μL（S6），如图3-图4所示，其中图3为新型冠状病毒ORF1ab基因检测灵敏度示意图；图4为新型冠状病毒N基因检测灵敏度示意图。
利用实施例1的试剂盒检测流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体企业参考品，验证灵敏度；将同等浓度的流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体培养液混合为灵敏度参考品S-L浓度(原液)为3×105CFU/mL，使用数字PCR方法联合定值。S-L使用无RNA/DNA酶去离子水进行1:3倍比稀释(2份水+1份样本)后，将1:9、1:27、1:81、1:243、1:729、1:2187、1:6561、1:19683、1:59049、1:177147分别标记为S1～S10，按照试剂盒说明书要求进行核酸提取后进行检测。根据梯度稀释后的检测结果，本试剂盒对流感嗜血杆菌的检测灵敏度是15.3CFU/mL（S-L8），如图5所示；本试剂盒对肺炎支原体的检测灵敏度是15.3 CFU/mL（S-L8），如图6所示；对肺炎衣原体的检测灵敏度是15.3 CFU/mL（S-L8），如图7所示；对肺炎链球菌检测灵敏度是15.3 CFU/mL（S-L8），如图8所示。
实施例4 本发明试剂盒用于检测的准确性及特异性
利用实施例1的试剂盒检测国家标准品2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品(370099-202001)中的阳性参考品P1-P2和阴性参考品N1-N22（包含：嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、腺病毒3型、副流感病毒2型、呼吸道合胞病毒A型、百日咳杆菌、其他冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、MERS冠状病毒、禽流感H7N9、H5N1、乙型流感Victoria系、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型流感H3N2、EB病毒以及人基因组核酸）；其中阳性参考品P1-P2检测为新冠病毒阳性，阴性参考品N3为肺炎链球菌阳性，阴性参考品N4为流感嗜血杆菌阳性，阴性参考品N6为肺炎支原体阳性，阴性参考品N8为肺炎衣原体阳性，阴性参考品N1-N2，N5，N7、N9-N22均为阴性，如图9-13所示，分别为本发明试剂盒对新型冠状病毒、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌检测的准确性和特异性示意图。即本试剂盒检测新型冠状病毒、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体均为阳性，且无交叉反应，并与其他呼吸道病原体如嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、腺病毒3型、副流感病毒2型、呼吸道合胞病毒A型、百日咳杆菌、其他冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、MERS冠状病毒、禽流感H7N9、H5N1、乙型流感Victoria系、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型流感H3N2、EB病毒以及人基因组核酸也无交叉反应。本试剂盒检测新型冠状病毒、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体的准确率为100%，阴性符合率为100%。
实施例5 本发明试剂盒用于检测的重复性
利用实施例1的试剂盒检测国家标准品2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品(370099-202001)中的精密度参考品R及100倍稀释液R-1，流感嗜血杆菌培养物及100倍稀释液，肺炎链球菌培养物及100倍稀释液，肺炎支原体培养物及100倍稀释液，肺炎衣原体培养物及100倍稀释液，以及人基因组核酸，每个样本重复20次。检测结果参见图14-19，分别为检测新冠病毒ORF1ab基因、N基因，流感嗜血杆菌，肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌重复性的示意图。结果表明：本试剂盒对新冠病毒ORF1ab基因、N基因，流感嗜血杆菌，肺炎支原体、肺炎衣原体以及肺炎链球菌检测结果CV%均小于5%。
实施例6 本发明试剂盒用于检测的抗干扰能力
利用实施例1的试剂盒进行抗干扰能力验证。选取2种采样干扰物质：正常人新鲜血液、粘蛋白，以及24种在呼吸道感染中常用的药物作为干扰物质：苯福林、羟甲唑啉、氯化钠、倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔、莫匹罗星、左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、美罗培南、妥布霉素，研究这些干扰物质的影响。以3×LoD模拟样本(假病毒+阴性样本)，按照10％医学水平的比例或浓度的采样干扰物质以及药物说明书中的用量的最高浓度作为干扰浓度加入到稀释样本中，以未加入干扰物质为对照，对结果进行阴阳性判断，评价各干扰物质加入前后对检测结果的影响。扩增反应液A干扰物质验证结果见表11，扩增反应液B干扰物质验证结果见表12。从表11和表12的检测结果可以看出：加入2种采样干扰物质和24种药物的样本与各对照相比，不影响检测结果阴阳性的判断。
表11
Figure 346239DEST_PATH_IMAGE007
表12
Figure 270332DEST_PATH_IMAGE008
实施例7 本发明试剂盒用于检测的稳定性
利用实施例1的试剂盒进行加速稳定性试验。将试剂盒置于37℃恒温箱中，依次于第0天、第6天、第8天、第9天，对阳性参考品P1-P5，阴性参考品N1-N6，检出限参考品LoD，新冠病毒精密度参考品R1以及肺炎病原体精密度参考品R2进行检测，统计检测结果。检测结果如表13所示，结果表明：该试剂盒的检测结果的准确性不会受到放置时间的影响。
表13
Figure 701314DEST_PATH_IMAGE009
实施例8 本发明与同类产品的对比
利用实施例1的试剂盒检测临床样本核酸，对比本发明与同类试剂的检测效果。
选用其他已上市的2种新冠病毒核酸检测产品（注册证号分别为：国械注准20213400609和国械注准20203400065）、2种肺炎支原体核酸检测产品（注册证号分别为：国械注准20183401705和国械注准20173400542）、2种肺炎衣原体核酸检测产品（注册证号分别为：国械注准20183401705和国械注准20163400700）；另外3套肺炎链球菌引物探针以及3套流感嗜血杆菌引物探针，序列信息见表14。
表14
Figure 798583DEST_PATH_IMAGE010
分别检测《2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品》的检测限参考S、阴性参考品N6（肺炎支原体MP）、N7（肺炎衣原体CP）、N3（肺炎链球菌SP）和N4（流感嗜血杆菌H-inFlu）。上述样品分别使用无RNA/DNA酶去离子水进行1:2倍比稀释（2份水+1份样本）后，将1:9、1:27、1:81、1:243、1:729、1:2187、1:6561、1:19683、1:59049、1:177147分别标记为S1-S10、MP1-MP10、CP1-CP10、SP1-SP10、H-inFlu1- H-inFlu10，按照试剂盒说明书要求进行核酸提取后进行检测，每个浓度重复3次；检测结果如表15-19所示。
表15：新冠病毒检测限参考品S1-S8核酸检测结果
Figure 896989DEST_PATH_IMAGE011
表16：肺炎支原体检测限参考品MP1-MP10核酸检测结果
Figure 788721DEST_PATH_IMAGE012
表17：肺炎衣原体检测限参考品CP1-CP10核酸检测结果
Figure 706999DEST_PATH_IMAGE013
表18：肺炎链球菌检测限参考品SP1-SP10核酸检测结果
Figure 607959DEST_PATH_IMAGE014
表19：流感嗜血杆菌检测限参考品H-inFlu -1- H-inFlu -10核酸检测结果
Figure 29713DEST_PATH_IMAGE015
表15-19的数据结果表明：本发明试剂盒检测新冠病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌以及流感嗜血杆菌均表现较好的灵敏度，检测效果优于同类试剂。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 上海思路迪医学检验所有限公司
<120> 检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合及检测试剂盒
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
acgggtttgc ggtgtaagtg cag 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
agatgtcaaa agccctgtat acg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 3
acaccgtgcg gcacaggcac tag 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
accaacagag cctaaaaagg ac 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
ccaaatctgc agcaggaaga agag 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 6
actcaagcct taccgcagag acag 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
gctggatgaa aggggaagca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
cttaggacca gcgcctattg c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 9
acctgataaa actagcagag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 10
gttcaggcta tatgcttgca g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 11
gccatttcgc ctgagttgtc g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 12
ccgctggagg aagcacacag 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 13
gaagcgtact tcgccaacat tg 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 14
gtgggccgac ttggtaacat g 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 15
cctcacctgg ttcgggcaag cg 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 16
gagtacaatg gtctcgagca ac 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 17
gtaaagaagg gttccatgca g 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 18
cgcattgctc agccaaaact acc 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 19
gcttctgaca caactgtgtt cac 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 20
cggcagactt ctccacagga gt 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 21
acctcaaaca gacaccatgg 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 22
cctctgtttt ctcgccttgc gg 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 23
cgtgcagatt tcggaaagtt g 21
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 24
caactcacct tcctgcggtt cagg 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 25
ccagttcagc ttgttcgtcc t 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 26
caaccgcact ttctgccgtg ttg 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 27
acgcaacagc acgacaaccg 20
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 28
acgcctacaa tttgtttcat catag 25
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 29
gcgttgtcgg ctcaaaatgg 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 30
tccgcatttg ccagtgcatc atc 23
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 31
gcctcaagtc ggcgtgcaac c 21
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 32
ccgcttcatt ctgtacgg 18
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 33
cacactcaac tgggaatccg 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 34
gcgtgcaacc atataggcaa g 21
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 35
tgtgcgagaa aaaaccta 18
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 36
cacgcacact caactgggaa tccg 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 37
cacacagacg gcaactggta c 21
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 38
agtaccactt atcagcg 17
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 39
ctcaggcgaa atggctacag g 21

Claims (9)

1.检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合，其特征在于，该引物探针组合包括：
检测新冠ORF1ab基因的引物对如SEQ ID NO：1~2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；
检测新冠N基因的引物对如SEQ ID NO：4~5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；
检测肺炎链球菌的引物对如SEQ ID NO：10~11所示、探针如SEQ ID NO：12所示；
检测肺炎支原体的引物对如SEQ ID NO：13~14所示、探针如SEQ ID NO：15所示；
检测肺炎衣原体的引物对如SEQ ID NO：16~17所示、探针如SEQ ID NO：18所示。
2.如权利要求1所述的检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括：
检测流感嗜血杆菌的引物对如SEQ ID NO：7~8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。
3.如权利要求1或2所述的检测新冠病毒和肺炎病原菌的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括：
内源性内标引物对如SEQ ID NO：19~20所示、内标探针如SEQ ID NO：21所示。
4.一种新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
5.如权利要求4所述的新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中的引物SEQ ID NO：1-2，SEQ ID NO：4-5，SEQ ID NO：7-8，SEQ ID NO：10-11，SEQ IDNO：13-14和SEQ ID NO：16-17在扩增反应液中的浓度分别为0.4-0.6μM；检测试剂盒中的探针SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18在扩增反应液中的浓度分别为0.25-0.35μM；检测试剂盒中的内源性内标引物探针SEQ IDNO：19-21在扩增反应液中的浓度分别为0.15-0.25μM。
6.如权利要求4或5所述的新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：核酸扩增反应液A、核酸扩增反应液B、酶混合液；
所述核酸扩增反应液A包括SEQ ID NO：1~9的引物探针、SEQ ID NO：19~21所示的内源性内标引物探针和RT-PCR反应试剂；
所述核酸扩增反应液B包括SEQ ID NO：10~18的引物探针、SEQ ID NO：19~21所示的内源性内标引物探针和RT-PCR反应试剂；
所述酶混合液包括：逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、UDG酶和牛血清白蛋白，溶剂为无核酸酶水。
7.如权利要求6所述的新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应试剂包括：Tris缓冲液、钾离子、硫酸铵、镁离子、dA/T/G/C/UTPs、四甲基氯化铵、海藻糖、二甲基亚砜，溶剂为无核酸酶水。
8.如权利要求6所述的新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于PCR反应时反应体系的各组分组成为：
特异性引物 0.4-0.6μM
特异性探针 0.25-0.35μM
内源性内标引物探针 0.15-0.25μM
Tris缓冲液 20-40mM
钾离子 40-60mM
硫酸铵 20-50mM
镁离子 3-7mM
dATP 400-800μM
dTTP 400-800μM
dGTP 400-800μM
dCTP 400-800μM
dUTP 400-800μM
四甲基氯化铵 25-40mM
海藻糖 0.5-1.5wt%
二甲基亚砜 体积百分比0.1%-2%
逆转录酶 0.3-0.5U/μL
DNA聚合酶 0.15-0.3U/μL
RNA酶抑制剂 0.25-0.4 U/μL
UDG酶 0.0015-0.003 U/μL
牛血清白蛋白 0.1-0.3wt%
溶剂为无核酸酶水，反应体系pH值为8.0~8.8。
9.如权利要求6所述的新冠病毒和肺炎病原菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和空白对照；
所述阳性对照为新冠病毒ORF1a基因假病毒、N基因假病毒、流感嗜血杆菌培养物、肺炎链球菌培养物、肺炎支原体培养物、肺炎衣原体培养物和人胚肾细胞293T的混合液；
所述阴性对照为人胚肾细胞293T培养液；
所述空白对照为无核酸酶水。
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