CN109596689A - 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 - Google Patents
双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109596689A CN109596689A CN201811450982.9A CN201811450982A CN109596689A CN 109596689 A CN109596689 A CN 109596689A CN 201811450982 A CN201811450982 A CN 201811450982A CN 109596689 A CN109596689 A CN 109596689A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- dual signal
- mos
- electrochemical sensor
- electrode
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/32—Calomel electrodes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,包括步骤:在MoS2纳米层表面原位合成Au NPs,形成Au NPs@MoS2复合纳米材料;标记两种电活性物质的探针碱基互补配对,形成双信号串联体探针;“探针‑甲基化肿瘤抑制基因‑双信号串联体探针”超级三明治结构的形成;构建电化学传感器,分析肿瘤抑制基因的甲基化状态。本发明的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,利用复合纳米材料、双信号导出技术、超级三明治放大策略构建了灵敏高并且快速方便的电化学传感体系,不仅可以识别不同甲基化程度的肿瘤抑制基因,而且可应用于完全甲基化的肿瘤抑制基因的高灵敏检测,可以满足临床样品检测的灵敏性要求。
Description
技术领域
本发明涉及DNA电化学传感器,具体涉及双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法。
背景技术
真核细胞中的DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化条件下,CpG岛上的胞嘧啶分子5位碳原子上引入一个甲基的反应。作为一种最重要的表观遗传修饰,基因中CpG岛的异常甲基化状态是许多疾病的征兆,例如与癌症相关的DNA高甲基化通常会控制肿瘤抑制基因的活性表达,与肿瘤细胞的形成和生长有关。因此,DNA甲基化的有效检测对于癌症的早期诊断以及遗传信息控制的机理研究具有重要的意义。
作为一种有效的信号放大策略,超级三明治结构在生物传感器的构建领域逐渐受到重视。例如,Yang等发展了一种新型的超级三明治结构,并将其应用于DNA分析,当检测体系中有目标DNA存在时,即使有一个目标DNA,就可以作为“桥梁”,使带有大量信号物质的DNA串联体与组装在电极表面的捕获探针相连,从而增强了电化学信号。[Chem.Commun.Asimple and ultrasensitive electrochemical DNA biosensor based on DNAconcatamers.2011,47(44):12116-12118]。
由于仪器成本低、操作简单、灵敏性高、选择性好等优点,电化学方法被广泛用于基因组DNA甲基化的分析。目前,DNA甲基化的电化学检测均采用单信号输出,即一种目标物质对应输出单个电化学信号。单个信号响应的检测方法存在一定的局限性,容易受外界环境变化的干扰,例如pH、溶剂极性、温度、共反应剂等。同时,在复杂的生物基质中,一些假阳性或者假阴性的信号很难避免。所以,在DNA甲基化分析中,双信号输出电化学传感器的构建是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏高并且快速方便的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法。
为实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,包括步骤:
S1:在MoS2纳米层表面原位合成Au NPs,形成Au NPs@MoS2复合纳米材料;
S2:取Au NPs@MoS2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面,干燥后得Au NPs@MoS2纳米复合材料修饰的玻碳电极;
S3:将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针probe 1-Fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针probe 2-MB于水浴中反应,得到双信号串联体探针,其中,所述probe 1-Fc的序列为5′-Fc-CAATTTCCTTCCACTCGTCCGGAGGAAGGTGCCG-3′,所述probe 2-MB的序列为5′-CGAGTGGAAGGAAATTGCGGCACCTTCCTCCGGA-MB-3′;
S4:将步骤S2得到的电极浸泡在捕获探针capture DNA的溶液中,过夜,其中capture DNA的序列为5′-SH-TTTTCATCCAAATACTCCACACG-3′;
S5:将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中;
S6:将步骤S5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中,得双信号超级三明治电化学传感器;
S7:将步骤S6得到的双信号超级三明治电化学传感器的工作电极、饱和甘汞电极和铂电极构成三电极体系,置于磷酸盐缓冲溶液和氮气氛围中进行检测。
优选的,所述步骤S1具体包括:在聚乙烯吡咯烷酮环境中,将氯金酸缓慢注入MoS2纳米层悬浮液中,剧烈震荡几分钟,室温下反应得到酒红色Au NPs@MoS2纳米复合材料。
优选的,所述步骤S2具体包括:取10L Au NPs@MoS2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面并于室温下在空气中自然避光干燥,得到Au NPs@MoS2纳米复合材料修饰的玻碳电极。
优选的,所述步骤S3具体包括:将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针1probe 1-Fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针2probe 2-MB于37℃水浴中反应2h,得到双信号串联体探针,probe 1-Fc的序列为5′-Fc-CAATTTCCTTCCACTCGTCCGGAGGAAGGTGCCG-3′,probe 2-MB的序列为5′-CGAGTGGAAGGAAATTGCGGCACCTTCCTCCGGA-MB-3′。
优选的,所述步骤S4具体包括:将S2得到的电极浸泡在捕获探针capture DNA的溶液中,4℃过夜,capture DNA的序列为5′-SH-TTTTCATCCAAATACTCCACACG-3′。
优选的,所述步骤S5具体包括:将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中,37℃反应1h。
优选的,所述步骤S6具体包括:将步骤S5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中,37℃杂交反应2h。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,利用复合纳米材料、双信号导出技术、超级三明治放大策略构建了灵敏高并且快速方便的电化学传感体系,不仅可以识别不同甲基化程度的肿瘤抑制基因,而且可应用于完全甲基化的肿瘤抑制基因的高灵敏检测,可以满足临床样品检测的灵敏性要求。
附图说明
图1是双信号超级三明治电化学传感器的构建示意图;
图2是MoS2纳米层的扫描电镜图;
图3是Au NPs@MoS2纳米复合物的扫描电镜图;
图4是p53肿瘤抑制基因甲基化状态的电化学识别图,其中曲线a是预处理的没发生甲基化的p53肿瘤抑制基因;曲线b是完全甲基化的p53肿瘤抑制基因;曲线c是顶端单甲基化的p53肿瘤抑制基因;曲线d是中间单甲基化的p53肿瘤抑制基因;
图5是电化学响应的双信号与不同浓度的完全甲基化的p53肿瘤抑制基因的关系图,其中,浓度从a到g依次为:10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,500pM,1nM。
具体实施方式:
实施例
下面以p53肿瘤抑制基因为例对本发明做进一步的解释说明。
图1所示是双信号超级三明治电化学传感器的构建及其在完全甲基化的p53肿瘤抑制基因检测中的应用示意图。首先,Au NPs@MoS2纳米复合物滴涂在玻碳电极表面,然后通过Au-S键的作用将末端巯基修饰的capture DNA直接固定到Au NPs表面,capture DNA的序列为5′-SH-TTTTCATCCAAATACTCCACACG-3′(SEQ ID NO.1)。当目标物质存在时,3′端碱基片段(CGTGTGGAGTATTTGGATGA)将会和capture DNA杂交配对,目标物质被捕捉到电极表面。目标物质中未反应的剩余基因片段(CGAGTGGAAGGAAATTG)将会和双信号串联体探针中的probe 1反应,电活性物质(Fc和MB)组装到电极表面,从而实现双信号的电化学检测。
Au NPs@MoS2纳米复合材料的制备方法包括以下步骤:
取0.3g二硫化钼粉末溶解于n-丁基锂溶液中,氮气氛围中搅拌反应48h。通过离心去除多余或未反应的溶剂后,无氧去离子水加入Li插层的MoS2沉淀物中,超声1h完成剥离过程。然后,通过离心分离收集产物,用水和酒精将产物洗涤数次,得到MoS2纳米层。结果如图2所示,剥落的MoS2纳米层具有明显的褶皱层状纳米结构。为了合成Au NPs@MoS2纳米复合材料,将聚乙烯吡咯烷酮加入到MoS2纳米层悬浮液中,剧烈震荡几分钟。随后,10mM氯金酸慢慢注入上述混合物中,室温下搅拌反应得到酒红色的Au NPs@MoS2纳米复合材料。结果如图3所示,大量的粒径12nm左右的Au NPs均匀的原位生长在MoS2纳米层的表面。
p53肿瘤抑制基因甲基化状态的电化学识别:为了验证构建的双信号超级三明治电化学传感器可以用来分辨p53肿瘤抑制基因的甲基化程度,将固定在Au NPs@MoS2上的capture DNA与预处理的不同甲基化程度的p53肿瘤抑制基因发生杂交反应,然后将杂交之后的产物置于双信号probe 1-Fc&probe 2-MB串联体探针溶液中,结果如图4所示,probe1-Fc的序列为5′-FC-CAATTTCCTTCCACTCGTCCGGAGGAAGGTGCCG-3′(SEQ ID NO.2),probe 2-MB的序列为5′-CGAGTGGAAGGAAATTGCGGCACCTTCCTCCGGA-MB-3′(SEQ ID NO.3)。在-0.28V位置处出现的信号峰归属于MB的还原,0.18V位置处出现的信号峰归属于Fc的氧化。当capture DNA与预处理的发生全甲基化的p53肿瘤抑制基因杂交后(曲线b),Fc和MB的氧化峰电流均明显强于未发生甲基化的p53肿瘤抑制基因(曲线a)和发生半甲基化的p53肿瘤抑制基因(曲线c和曲线d)。值得一提的是,中间部位发生甲基化的p53肿瘤抑制基因构建的传感器的峰电流强于顶端部位发生甲基化的p53肿瘤抑制基因构建的传感器。表明我们构建的双信号超级三明治电化学传感器可有效应用于p53肿瘤抑制基因甲基化状态的识别。
完全甲基化p53肿瘤抑制基因的高灵敏检测:利用此传感器检测完全甲基化p53肿瘤抑制基因的浓度。从图5中可知,随着完全甲基化p53肿瘤抑制基因浓度的增加,Fc和MB的峰电流强度同时不断增加,且在10fM到1nM浓度范围内呈现良好的线性关系。检出限分别是450aM和700aM。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttcatcca aatactccac acg 23
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaatttcct tccactcgtc cggaggaagg tgccg 35
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagtggaag gaaattgcgg caccttcctc cgga 34
Claims (7)
1.双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,包括步骤:
S1:在MoS2纳米层表面原位合成Au NPs,形成Au NPs@MoS2复合纳米材料;
S2:取Au NPs@MoS2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面,干燥后得Au NPs@MoS2纳米复合材料修饰的玻碳电极;
S3:将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针probe 1-Fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针probe 2-MB于水浴中反应,得到双信号串联体探针,其中,所述probe 1-Fc的序列为5′-Fc-CAATTTCCTTCCACTCGTCCGGAGGAAGGTGCCG-3′,所述probe 2-MB的序列为5′-CGAGTGGAAGGAAATTGCGGCACCTTCCTCCGGA-MB-3′;
S4:将步骤S2得到的电极浸泡在捕获探针capture DNA的溶液中,过夜,其中captureDNA的序列为5′-SH-TTTTCATCCAAATACTCCACACG-3′;
S5:将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中;
S6:将步骤S5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中,得双信号超级三明治电化学传感器;
S7:将步骤S6得到的双信号超级三明治电化学传感器的工作电极、饱和甘汞电极和铂电极构成三电极体系,置于磷酸盐缓冲溶液和氮气氛围中进行检测。
2.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S1具体包括:在聚乙烯吡咯烷酮环境中,将氯金酸缓慢注入MoS2纳米层悬浮液中,剧烈震荡几分钟,室温下反应得到酒红色Au NPs@MoS2纳米复合材料。
3.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S2具体包括:取10μL Au NPs@MoS2纳米复合材料滴涂到玻碳电极表面并于室温下在空气中自然避光干燥,得到Au NPs@MoS2纳米复合材料修饰的玻碳电极。
4.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S3具体包括:将相同浓度的5′端修饰二茂铁的探针1probe 1-Fc和3′端修饰亚甲基蓝的探针2probe 2-MB于37℃水浴中反应2h,得到双信号串联体探针,probe 1-Fc的序列为5′-Fc-CAATTTCCTTCCACTCGTCCGGAGGAAGGTGCCG-3′,probe 2-MB的序列为5′-CGAGTGGAAGGAAATTGCGGCACCTTCCTCCGGA-MB-3′。
5.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S4具体包括:将S2得到的电极浸泡在捕获探针capture DNA的溶液中,4℃过夜,capture DNA的序列为5′-SH-TTTTCATCCAAATACTCCACACG-3′。
6.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S5具体包括:将电极浸入含有待测甲基化基因的缓冲溶液中,37℃反应1h。
7.根据权利要求1所述的双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法,其特征在于,所述步骤S6具体包括:将步骤S5中得到的电极浸入双信号串联体探针溶液中,37℃杂交反应2h。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811450982.9A CN109596689B (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811450982.9A CN109596689B (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109596689A true CN109596689A (zh) | 2019-04-09 |
CN109596689B CN109596689B (zh) | 2020-09-15 |
Family
ID=65960521
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811450982.9A Active CN109596689B (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109596689B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112098489A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-12-18 | 孙经纬 | 一种定量dna甲基化程度的电化学方法及系统 |
CN113552191A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-10-26 | 江苏师范大学 | 基于多层dna放大回路检测甲基化dna的比例型电化学传感器的构建方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105651999A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-08 | 江苏大学 | 一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用 |
CN106556630A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-04-05 | 中山大学 | 一种dna甲基化实时检测方法及其应用 |
CN107356642A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-17 | 西安交通大学 | 一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化dna电化学检测方法及试剂盒 |
-
2018
- 2018-11-30 CN CN201811450982.9A patent/CN109596689B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105651999A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-08 | 江苏大学 | 一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用 |
CN106556630A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-04-05 | 中山大学 | 一种dna甲基化实时检测方法及其应用 |
CN107356642A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-17 | 西安交通大学 | 一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化dna电化学检测方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
PINGDAN YAN 等: "Double signal enhancement strategy based on rolling circle amplification and photoinduced electron transfer for ultrasensitive fluorometric detection of methylated DNA", 《MICROCHIMICA ACTA》 * |
PO WANG 等: "Picomolar level profiling of the methylation status of the p53 tumor suppressor gene by a label-free electrochemical biosensor", 《CHEMCOMM》 * |
XIAN CHEN 等: "Enzyme-Free and Label-Free Ultrasensitive Electrochemical Detection of Human Immunodeficiency Virus DNA in Biological Samples Based on Long-Range Self-Assembled DNA Nanostructures", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112098489A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-12-18 | 孙经纬 | 一种定量dna甲基化程度的电化学方法及系统 |
CN113552191A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-10-26 | 江苏师范大学 | 基于多层dna放大回路检测甲基化dna的比例型电化学传感器的构建方法 |
CN113552191B (zh) * | 2021-07-28 | 2023-11-21 | 江苏师范大学 | 基于多层dna放大回路检测甲基化dna的比例型电化学传感器的构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109596689B (zh) | 2020-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yuan et al. | Simultaneously electrochemical detection of microRNAs based on multifunctional magnetic nanoparticles probe coupling with hybridization chain reaction | |
Rasheed et al. | Graphene-DNA electrochemical sensor for the sensitive detection of BRCA1 gene | |
Ahmad et al. | High performance cholesterol sensor based on ZnO nanotubes grown on Si/Ag electrodes | |
CN102899418B (zh) | 一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法 | |
WO2016062101A1 (zh) | 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用 | |
Xu et al. | An electrochemical biosensor based on nucleic acids enzyme and nanochannels for detecting copper (II) ion | |
Ren et al. | An efficient, label-free and sensitive electrochemical microRNA sensor based on target-initiated catalytic hairpin assembly of trivalent DNAzyme junctions | |
Pividori et al. | Graphite-epoxy composites as a new transducing material for electrochemical genosensing | |
Mansor et al. | Detection of breast cancer 1 (BRCA1) gene using an electrochemical DNA biosensor based on immobilized ZnO nanowires | |
Jiao et al. | Electrochemical detection of circRNAs based on the combination of back-splice junction and duplex-specific nuclease | |
CN103698375A (zh) | 一种检测miRNA的方法 | |
CN110106232A (zh) | 基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法 | |
CN106568820B (zh) | 基于dna信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
Li et al. | Amplified electrochemical detection of nucleic acid hybridization via selective preconcentration of unmodified gold nanoparticles | |
CN108169311A (zh) | 一种检测miRNA-122的电化学生物传感器 | |
CN111122679A (zh) | 一种dna生物传感器及其制备方法和应用 | |
CN109596689A (zh) | 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法 | |
Khodadoust et al. | A ratiometric electrochemical DNA-biosensor for detection of miR-141 | |
CN104152449A (zh) | miRNA捕获探针及其修饰电极与捕获探针互补链及其修饰碳纳米管-金磁纳米粒复合物 | |
CN109540995B (zh) | 检测转基因成分dna的方法及其使用的电化学传感器 | |
Cao et al. | An ultrasensitive biosensor for virulence ompA gene of Cronobacter sakazakii based on boron doped carbon quantum dots-AuNPs nanozyme and exonuclease III-assisted target-recycling strategy | |
CN105567808B (zh) | 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用 | |
Hou et al. | DNAzyme-guided polymerization of aniline for ultrasensitive electrochemical detection of nucleic acid with bio-bar codes-initiated rolling circle amplification | |
Qian et al. | Enzyme-free amplification for sensitive electrochemical detection of DNA via target-catalyzed hairpin assembly assisted current change | |
Wang et al. | Chemistry solutions to facilitate nanopore detection and analysis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |