CN114113260A - 一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器及其制备方法与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器及其制备方法与应用方法。微电极传感器为三电极体系传感器，其对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，工作电极为壳聚糖、邻苯二酚以及金黄色葡萄球菌适配体修饰过的银微电极。本发明的微电极传感器是基于表面带有微纳米结构的微电极、双介质(Fc‑Ru3+)、壳聚糖和邻苯二酚构建而成。微电极传感器的工作电极能够特异性捕获金黄色葡萄球菌。微电极传感器在CV测试过程中，细菌体内的CI‑会在局部高场强的作用下泄漏至工作电极表面，当CI‑离子存在时，工作电极在0至‑0.1V之间的阴极还原峰会特异性增强，从而建立细菌浓度增大和电流信号增强之间的线性关系，达到特异性检测细菌的目的。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器及其制备方法与应 用方法
技术领域
本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器及其制备方法与应用方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌由Dr.Alexander Ogston于1880年首次发现并命名。典型的金黄色葡萄球菌呈球形，葡萄簇状，直径约0.8μm，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，通常定植于人类皮肤和粘膜表面，尤其是前鼻孔(约占一般人群的30％)。当宿主的免疫力降低或皮肤和粘膜屏障被破坏时，它可以进入任何器官或进入血液，轻度则引起皮肤和软组织感染(脓疱病、毛囊炎和烫伤皮肤综合征)，重度则导致严重的系统性疾病，如菌血症、心内膜炎、骨髓炎、溶血性肺炎和中毒性休克综合征。虽然轻度的皮肤和粘膜感染通常具有自限性，但严重的全身感染通常伴随着高死亡率(20％-50％)、高复发率(5-10％)和持续性损伤(超过三分之一的幸存者)。金黄色葡萄球菌是引起医院获得性感染的主要病原体。由于免疫系统受损和频繁的侵入性手术，高达2％的住院患者感染了金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌的毒性越来越强，对抗生素的耐药性也越来越强。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)于1961年首次被描述，从发现之后就一直对全球公共卫生造成严重的威胁。在美国、欧洲和日本等发达国家，约有40％至60％的院内感染金黄色葡萄球菌是MRSA。发展中国家的MRSA感染率更高(>70％)，可能是由于发展中国家的抗生素的广泛使用、不当使用以及耐药细菌的传播有关。
快速、有效、准确地诊断金黄色葡萄球菌对于快速治疗感染患者、防止感染传播和减少耐药菌株的形成具有重要意义。检测金黄色葡萄球菌的金标准仍然是培养方法，但它非常耗时，通常需要1-2天才能获得单个菌落，然后需要1-2天才能获得化学鉴定及药敏结果。近年来，发展了一些快速、自动化的检测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术和质谱，虽然只需1-5小时即可得到结果，但是这些方法需要昂贵的仪器、复杂的样品制备以及较高的专业要求，不太适合偏远贫穷地区，也不适合床旁检测。因此，急需寻找一种快速、简便、特异、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法，能缩短诊断时间，为临床提供准确的诊断，并能应用于床旁检测(POCT)系统。
发明内容
本发明的目的是针对以上背景技术中的技术问题，提供一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器及其制备方法与应用方法。
本发明提供的方案如下：
一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器，所述微电极传感器为三电极体系传感器，其对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，工作电极为壳聚糖、邻苯二酚以及金黄色葡萄球菌适配体修饰过的银微电极。
作为上述技术方案的优选，所述工作电极以银微电极为基体，壳聚糖包覆于银微电极表面，邻苯二酚和金黄色葡萄球菌适配体分别接枝到壳聚糖上。
作为上述技术方案的优选，所述银微电极的表面分布着微纳米级突起和间隙。
基于同一技术构思，本发明还提供一种制备上述检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器的制备方法，包含以下步骤：
(1)以银微电极为工作电极，铂丝为辅助电极构建双电极系统在银微电极表面电化学沉积壳聚糖，得到Chi-Ag电极；
(2)将步骤(1)得到的Chi-Ag电极作为工作电极，并以Ag/AgCl为参比电极，以铂丝为对电极构建三电极体系，在Chi-Ag电极表面电化学接枝邻苯二酚，得到Cat-Chi-Ag电极；
(3)将Cat-Chi-Ag电极浸泡在适配体溶液中，通过适配体上醛基和壳聚糖上氨基之间的反应将适配体修饰到Cat-Chi-Ag电极表面，得到的适配体修饰电极。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)的银微电极是采用局部电沉积法一步制备得到的银微电极；
所述电化学沉积法是将银微电极置于壳聚糖溶液中进行电化学沉积200-500秒，而后取出电极用超纯水冲洗并在室温下干燥。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中接枝邻苯二酚选用的邻苯二酚溶液的pH＝7.0-7.6，浓度为4-5mM；在制备前往邻苯二酚溶液中注入氮气去除空气，制备过程中持续注入氮气。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)的适配体溶液为适配体溶于PBS缓冲液，修饰时间为8-24小时，温度为0-25℃。
基于同一技术构思，本发明还提供一种基于上述的检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器的检测应用方法，包含以下步骤：
1)在室温下使用循环伏安法得出各浓度金黄色葡萄球菌标准溶液所对应的适配体修饰电极特异性响应信号的峰值电流，根据金黄色葡萄球菌浓度与峰值电流之间的相互关系建立标准曲线方程；
2)取用或制备待测样品溶液；
3)对步骤2)中的待测样品溶液采用循环伏安法检测特征峰的峰值电流；
4)将步骤3)得到的峰值电流代入步骤1)的标准曲线方程计算得出待测样品溶液中金黄色葡萄球菌的浓度含量。
作为上述技术方案的优选，所述步骤1)中标准曲线方程是在微电极传感器的Fc-Ru3+双电子介质溶液中加入金黄色葡萄球菌系列浓度标准溶液后得到，所述的标准曲线方程为两段式；
当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为1≤C≤10CFU mL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.3115C(cfu/mL)+0.3024(R2＝0.9939)；
当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为101＜C≤105CFU mL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.7318logC(cfu/mL)+3.4108(R2＝0.9927)。
作为上述技术方案的优选，所述Fc-Ru3+双电子介质溶液中含有50μM Fc、50μM Ru3 +和PBS缓冲液；循环伏安法测试前，在加入金黄色葡萄球菌溶液后的Fc-Ru3+双电子介质溶液中用氮气脱气，在测试过程中继续通入氮气。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
银微电极在施加电压时，能产生局部高电场将银微电极附近的细菌击破。本发明利用这一特性，构建了以修饰后的银微电极为工作电极的三电极体系微电极传感器。微电极传感器的工作电极能够特异性捕获金黄色葡萄球菌。微电极传感器在CV测试过程中，细菌体内的CI-会在局部高场强的作用下泄漏至工作电极表面，当CI-离子存在时，工作电极在0至-0.1V之间的阴极还原峰会特异性增强，从而建立细菌浓度增大和电流信号增强之间的线性关系，达到特异性检测细菌的目的。
银微电极的表面分布着微纳米级突起和间隙，一方面增加了微电极传感器的电子交换能力；另一方面在CV测试时电极表面突起尖端可产生强电场中心。当细菌被适配体捕获时，电极表面的高场强中心会导致细胞内物质泄漏，从而引起银电极氧化物还原峰显着增加。该传感器具有较宽的线性范围(1-105CFU mL-1)、低检测限(1CFU mL-1)和高特异性，在快速超灵敏检测金黄色葡萄球菌方面显示出巨大潜力。
在制备微电极传感器时，采取先对银微电极进行电化学沉积壳聚糖，而后接枝邻苯二酚与适配体的步骤，使得制备得到的微电极传感器的工作电极能够到达特异性捕获金黄色葡萄球菌，同时又不至于电极修饰膜过厚而影响产生高电场来击破细菌。此外，在对壳聚糖的沉积过程中控制沉积时间，可以有效的控制壳聚糖膜的厚度；在接枝邻苯二酚时控制溶液环境与浓度，可以使得接枝后的邻苯二酚达到最佳氧化还原的作用。
附图说明
图1为本发明的银微电极的扫描电镜图；
图2为本发明的检测信号放大机理图；
图3为本发明的模拟细菌裂解液中的电化学信号检测对比图；其中：a、不同溶液中的循环伏安图；b、循环伏安法峰值电流与NaCI浓度的线性关系；c、循环伏安法峰值电流与KCI浓度的线性关系；d、循环伏安法峰值电流与NaCl和KCI混合溶液浓度的关系。
图4为本发明的工作电极电流密度检测对比图；其中，a、微电极(直径＝0.03毫米)；b、表面光滑的圆柱形微电极(直径＝0.03毫米)；c、银柱电极(直径＝1毫米)；c、平面银电极(直径＝2毫米)。
图5为本发明的微电极传感器特异性检测结果对比图；其中：a、空白；b、大肠杆菌；c、克雷白氏菌；d、鲍曼不动杆菌；e、嗜麦芽寡养单孢菌；f、酿脓链球菌；g、奇异变形杆菌；h、洋葱伯克霍尔德氏菌；i、金黄色葡萄球菌。
图6为本发明的电极上金黄色葡萄球菌的SEM图像；
图7为本发明的电极修饰过程示意图；
图8为本发明的微电极传感器对金黄色葡萄球菌的检测结果图。其中：a、不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液中的循环伏安图；b、循环伏安法峰值电流与金黄色葡萄球菌浓度的线性关系图；c金黄色葡萄球菌浓度C的取值为1≤C≤10CFU mL-1时的峰值电流与浓度的线性关系图；d、金黄色葡萄球菌浓度C的取值为101＜C≤105CFU mL-1时的峰值电流与浓度的线性关系图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器，所述微电极传感器为三电极体系传感器，其对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，工作电极为壳聚糖、邻苯二酚以及金黄色葡萄球菌适配体修饰过的银微电极。
在本实施例中，所述工作电极以银微电极为基体，壳聚糖包覆于银微电极表面，邻苯二酚和金黄色葡萄球菌适配体分别接枝到壳聚糖上。
本实施例基于微电容原理，在电极表面制备修饰层以放大检测信号；构建了一种用于金黄色葡萄球菌检测的超灵敏微电极传感器。电极修饰过程是壳聚糖的沉积、接枝邻苯二酚和固定适体。银微电极采用LECD法制作。如图1所示，电极的表面分布着许多微纳米级的突起和间隙。微电极上微结构大大增加了微电极的比表面积，增加了微电极的表面电流密度，从而进一步放大检测信号。检测信号的放大机理如图2所示。在工作电极上聚合并接枝到壳聚糖上的邻苯二酚具有两种化学状态，即氧化态(醌)和还原态(儿茶酚)。两种介质(Fc、Ru3+/2+)分别被电极氧化和还原。然后用邻苯二酚还原Fc+，并立即用醌氧化Ru2+。与平面电极相比，纳米结构电极进一步提高了电荷转移率，增强了微电极的信号放大能力。适配体通过末端醛基与壳聚糖上的氨基反应固定在电极上。在金黄色葡萄球菌存在时，金黄色葡萄球菌被适体特异性捕获并固定在电极上。在CV测试过程中，银微电极表面的微纳结构会产生局部高电场，当银微电极表面适配体捕获葡萄球菌后，细菌体内的CI-会在局部高场强的作用下泄漏至电极表面，当CI-离子存在时，银微电极在0至-0.1V之间的阴极还原峰会特异性增强，从而建立细菌浓度增大和电流信号增强之间的线性关系，达到特异性检测细菌的目的。
现有技术中记载细菌中的主要离子成分是Na+、K+和CI-。为了找出本发明的微电极传感器在含有Na+、K+和CI-的电解液中可能的信号响应，本申请还进行了验证实验；分别在NaCl、KCl、K2CO3和Na2CO3溶液中记录了循环伏安法信号。实验结果如图3所示，NaCl和KCI的CV曲线与金黄色葡萄球菌溶液中的CV信号特别相似，如图3a所示。与空白组相比，在-0.5V∽0V的电位范围内观察到明显的对应于NaCl或KCl的还原峰。同时，在0V∽0.5V的电位范围内观察到K2CO3或Na2CO3的还原峰。这表明在NaCl或KCl溶液中-0.5V∽0V电位范围的还原峰很可能是由于存在CI-造成而不是K+或Na+。这进一步证实了细胞内CI-的泄漏是检测金黄色葡萄球菌时出现新峰的原因。
本发明还用与修饰微电极相同的条件参数修饰大电极，并进行CV测试，对比微电极和大电极的电流密度，如图4所示。可见相同条件下，本发明的银微电极的电流密度明显大于其它大电极的电流密度。
本发明的微电极传感器还做了特异性检测。通过用微电极传感器在多种细菌溶液中进行CV检测，分析微电极传感的特异性，其结果如图5所示，微电极传感器仅对葡萄球菌有较强的电流信号响应，说明该传感特异性好，可准确识别葡萄球菌。将检测完细菌的银微电极用缓冲液冲洗表面，然后室温干燥，喷金，进行SEM测试。得出如图6所示的银微电极上金黄色葡萄球菌的SEM图像。
实施例2
一种制备实施例1中检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器的制备方法，如图3所示，包含以下步骤：
(1)以银微电极为工作电极，铂丝为辅助电极构建双电极系统在工作电极表面电化学沉积壳聚糖，得到Chi-Ag电极；
(2)将步骤(1)得到的Chi-Ag电极作工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，在Chi-Ag电极表面电化学接枝邻苯二酚；工作电极通过CHI660e电化学工作站施加0.6V电压500s，将邻苯二酚接枝到壳聚糖上；得到Cat-Chi-Ag电极。Cat-Chi-Ag电极用超纯水洗涤并用氮气流干燥；
(3)将Cat-Chi-Ag电极浸泡在适配体溶液中，通过适配体上醛基和壳聚糖上氨基之间的反应将适配体修饰到Cat-Chi-Ag电极表面，形成适配体修饰电极(Apt-Cat-Chi-Ag)。
在本实施例中，所述步骤(1)的银微电极是采用局部电沉积法一步制备得到的银微电极。所述步骤(1)的电化学沉积法是将银微电极与铂丝置于壳聚糖溶液中进行电化学沉积200秒；而后取出电极用超纯水冲洗并在室温下干燥。银微电极在进行沉积前分别用去离子水和乙醇清洗5分钟，然后用氮气干燥电极。
在本实施例中，所述步骤(2)中邻苯二酚溶液的pH＝7.0，浓度为5mM；在制备前往邻苯二酚溶液中注入氮气30分钟去除空气，制备过程中持续注入氮气。在本实施例中，所述步骤(3)的适配体溶液用PBS缓冲液配制(0.1MKH2PO4:0.1MK2HPO4＝1:4，v/v)；孵育时间是12小时，温度为0℃。孵育后，将制备的Apt-Cat-Chi-Ag电极用PBS溶液洗涤以去除未接枝的适配体。电极修饰过程如图7所示。
实施例3
一种基于实施例1中检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器的检测方法，包含以下步骤：
1)在微电极传感器的Fc-Ru3+/2+双电子介质溶液中加入金黄色葡萄球菌系列浓度标准溶液，在室温下使用循环伏安法得出各浓度标准溶液的所对应的银电极特异性响应信号的峰值电流，根据金黄色葡萄球菌浓度与峰值电流之间的相互关系建立标准曲线方程；
2)取用或制备待测样品溶液；
3)对步骤2)中的待测样品溶液采用循环伏安法检测待测特征峰的峰值电流；
4)将步骤3)得到的峰值电流带入步骤1)的标准曲线方程计算得出待测样品溶液中金黄色葡萄球菌的浓度含量。
在本实施例中，所述步骤1)中标准曲线方程是在微电极传感器的Fc-Ru3+双电子介质溶液中加入金黄色葡萄球菌系列浓度标准溶液后得到，所述的标准曲线方程为两段式；当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为1≤C≤10CFU mL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.3115C(cfu/mL)+0.3024(R2＝0.9939)；当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为101＜C≤105CFUmL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.7318logC(cfu/mL)+3.4108(R2＝0.9927)。
在本实施例中，Fc-Ru3+/2+双介质溶液中含有50μMFc、50μMRu3+和PBS缓冲液；循环伏安法测试前，加入金黄色葡萄球菌溶液后的Fc-Ru3+/2+双电子介质溶液用氮气脱气30分钟，消除氧还原的干扰。在测试过程中继续用氮气填充溶液；一方面为测试系统提供了惰性环境，另一方面为测试溶液提供了微动力，增加了细菌被捕获的概率。CV的扫描电压从-0.5V到+0.5V。记录CV曲线直到信号稳定。
如图8所示，本发明的微电极传感器的线性范围为1-105CFUmL-1、检测限为1CFUmL-1。
上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器，所述微电极传感器为三电极体系传感器，其对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，其特征在于，工作电极为壳聚糖、邻苯二酚以及金黄色葡萄球菌适配体修饰过的银微电极。
2.根据权利要求1所述的微电极传感器，其特征在于，所述工作电极以银微电极为基体，壳聚糖包覆于银微电极表面，邻苯二酚和金黄色葡萄球菌适配体分别接枝到壳聚糖上。
3.根据权利要求1或2所述的微电极传感器，其特征在于，所述银微电极的表面分布着微纳米级突起和间隙。
4.一种权利要求1-3任一项所述微电极传感器的制备方法，其特征在于，电极修饰包含以下步骤：
(1)以银微电极为工作电极，铂丝为辅助电极构建双电极系统在银微电极表面电化学沉积壳聚糖，得到Chi-Ag电极；
(2)将步骤(1)得到的Chi-Ag电极作为工作电极，并以Ag/AgCl为参比电极，以铂丝为对电极构建三电极体系，在Chi-Ag电极表面电化学接枝邻苯二酚，得到Cat-Chi-Ag电极；
(3)将Cat-Chi-Ag电极浸泡在适配体溶液中，通过适配体上醛基和壳聚糖上氨基之间的反应将适配体修饰到Cat-Chi-Ag电极表面，得到的适配体修饰电极。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的银微电极是采用局部电沉积法一步制备得到的银微电极；
所述电化学沉积法是将银微电极置于壳聚糖溶液中进行电化学沉积200-500秒，而后取出电极用超纯水冲洗并在室温下干燥。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中接枝邻苯二酚选用的邻苯二酚溶液的pH＝7.0-7.6，浓度为4-5mM；在制备前往邻苯二酚溶液中注入氮气去除空气，制备过程中持续注入氮气。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的适配体溶液为适配体溶于PBS缓冲液，修饰时间为8-24小时，温度为0-25℃。
8.一种基于权利要求1-3任一项所述的检测金黄色葡萄球菌的微电极传感器的检测应用方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)在室温下使用循环伏安法得出各浓度金黄色葡萄球菌标准溶液所对应的适配体修饰电极特异性响应信号的峰值电流，根据金黄色葡萄球菌浓度与峰值电流之间的相互关系建立标准曲线方程；
2)取用或制备待测样品溶液；
3)对步骤2)中的待测样品溶液采用循环伏安法检测特征峰的峰值电流；
4)将步骤3)得到的峰值电流代入步骤1)的标准曲线方程计算得出待测样品溶液中金黄色葡萄球菌的浓度含量。
9.根据权利要求8所述的检测应用方法，其特征在于，所述步骤1)中标准曲线方程是在微电极传感器的Fc-Ru3+双电子介质溶液中加入金黄色葡萄球菌系列浓度标准溶液后得到，所述的标准曲线方程为两段式；
当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为1≤C≤10CFU mL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.3115C(cfu/mL)+0.3024(R2＝0.9939)；
当金黄色葡萄球菌浓度C的取值为101＜C≤105CFU mL-1时，所述标准曲线方程为：P(μA)＝0.7318logC(cfu/mL)+3.4108(R2＝0.9927)。
10.根据权利要求9所述的检测应用方法，其特征在于，所述Fc-Ru3+双电子介质溶液中含有50μM Fc、50μM Ru3+和PBS缓冲液；循环伏安法测试前，在加入金黄色葡萄球菌溶液后的Fc-Ru3+双电子介质溶液中用氮气脱气，在测试过程中继续通入氮气。
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