CN103620403A - 使用纳米管监测单分子的系统和方法 - Google Patents

使用纳米管监测单分子的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种单分子检测方法，并使用一个附有探针实体的碳纳米管定义了碳纳米管的第一状态。将所述碳纳米管引入目标实体中以定义碳纳米管的第二状态。比较碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导以检测生物分子实体的存在。本发明也提供了一个包含碳纳米管的单分子检测系统。

Description

使用纳米管监测单分子的系统和方法
有关申请的相互参考
本专利具有向第61/431,795号（于2011年1月11日提出）美国临时专利申请和第61/453,344号（于2011年3月16日提出）美国临时专利申请的优先权，所公开的全部专利内容都明确以援用的方式出现在本文中。
关于联邦科研赞助项目的声明
本发明是由美国国家科学基金会授权、政府ENG-0707748号和CHE-0641523号文件拨款资助进行的。政府对该发明拥有某些权利。
背景技术
本应用涉及单分子检测以及单分子动力学和热力学的测量和与分析。
单分子层面的研究揭示了多个生物分子系统中的分子内动力学和构象变化。对核酸分子内的分子链扩散，包括发夹结构的配置都通过光学技术（如荧光相关光普学（FCS））进行了研究。在某些研究中，对DNA发夹结构进行标记，并且在亚微秒的时间范围内监控少量分子的开合速度。但是，荧光相关光普学（FCS）的一个潜在缺点在于在整个观测过程中观测时间被限制在分子的扩散时间内。单分子荧光能量共振转移（smFRET）也用于研究生物分子中的构象变化，但是只能提供几十毫秒时间范围内的动力研究。生物分子检测的免标记技术包括纳米线、微腔、机械悬臂、光波导和光镊，但是没有任何一项包含足够高的敏感度以用于高时间分辨率的免标记检测，这是监控微秒时间范围内生物分子过程动力学所必需的。
基于单个分子的合成测序（SBS）系统已逐渐走向商业用途，因为它们无需扩容即可运行，简化了样品制备。因为它们使用了荧光，所以某些系统设计在染料和染料化学反应、激光激发系统、光学和过滤以及检测器特性的设计中包含了复杂的权衡方法。这些问题是由于在检测电子需要电信号时，最终将光子用作检测媒介物所造成的。
发明内容
此处公开的内容是单分子检测中已改进的新系统和新技术。
在一个实施例中，本公开主题给出了基于碳纳米管电导调制的单分子检测。碳纳米管的电导可以与碳纳米管的初始状态和引入目标实体后碳纳米管的第二状态进行比较。
在本公开主题的一个实施例中，单分子检测方法使用了一个碳纳米管，上面带有探针实体以定义碳纳米管的第一状态。将碳纳米管引入一个目标实体来定义其第二状态。比较第一状态和第二状态下的碳纳米管电导以检测生物分子实体的存在。
在一些实施例中，将点缺陷施加于碳纳米管上并将探针实体附着在碳纳米管的点缺陷处，从而将探针实体附在碳纳米管上。一个点缺陷可以是单个羧基缺陷。探针实体可以通过偶合反应附着在碳纳米管上。探针实体可以是一个包含ssDNA的DNA探针。目标实体可以是一个互补的目标DNA。
在一些实施例中，将碳纳米管引入缓冲合成物内的目标实体中，该缓冲合成物包含了目标实体。
在一些实施例中，将碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导与预定的电导数据项加以比较以确定目标实体的特性。预定的电导数据可以是一个校准曲线。
在一些实施例中，碳纳米管可以是一个单壁的碳纳米管。碳纳米管可以是一个场效应晶体管，能提供一个电子信号来测量碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导。
在一些实施例中，单分子检测方法采用免标记技术。
在一些实施例中，单分子检测方法用于提供单个分子、生物分子的合成测序（SBS）。该生物分子可以是DNA。
在另一个实施例中，单分子检测系统包括一个附着有探针实体的碳纳米管、与碳纳米管进行电子通讯的场效应晶体管和提供一个目标实体。
附图是此公开文件的组成部分，用于阐明公开的主题并解释其原理。
附图说明
本公开主题的更多特征、性质和许多优点将可从以下的实施例的详细说明中和附图变得更为明显。其中：
图1是依据本公开主题某些实施例的碳纳米管示意图；
图2是依据本公开主题某些实施例的、将一个目标实体引入碳纳米管后的示意图；
图3a是依据本公开主题某些实施例的、显示纳米管电导控制氧化的曲线图；
图3b是依据本公开主题某些实施例的、显示电导作为电势功能的曲线图；
图3c和图3d是依据本公开主题某些实施例的、半导体纳米管的拓扑图/扫描脉冲
显微镜（SGM）图片；
图3e是依据本公开主题某些实施例的、显示纳米管器件的原理图；
图4a是依据本公开主题某些实施例的、在引入到目标实体之前的电导记录的一系列曲线图；
图4b是基于图4a的一系列电导记录的直方图；
图4c是依据公开主题某些实施例的、在引入目标实体之后电导记录的一系列曲线图；
图4d是基于图4c的一系列电导记录的直方图；
图5a、5b和5c是依据公开主题某些实施例的融解曲线；
图6a是依据本公开主题某些实施例的、碳纳米管器件的电导曲线图；
图6b是依据本公开主题某些实施例的、碳纳米管器件的保压时间直方图；
图6c是依据本公开主题某些实施例的、碳纳米管器件的电导曲线图；
图6d、6e和6f是依据本公开主题某些实施例的阿雷尼厄斯图(ArrheniusPlots)；
图7a和7b是依据本公开主题某些实施例的、碳纳米管在引入一个目标实体之后的示意图；
图8a、8b和8c是依据本公开主题某些实施例的、碳纳米管器件的电导直方图；
图8d是依据本公开主题某些实施例的、电阻波幅对目标长度的曲线图；
图8e是依据本公开主题某些实施例的、电导波动波幅作为德拜(Debye)长度功能的曲线图；
图8f是依据本公开主题某些实施例的、碱基对掺入作为缓冲掺入功能时的预期灵敏度曲线图；
图9是依据本公开主题某些实施例的、微流体输送系统的照片和原理图；
图10是依据本公开主题某些实施例的合成测序（SBS）程序示意图；
图11a是依据本公开主题某些实施例的测量电子设备的原理图；
图11b是依据本公开主题某些实施例的纳米管器件噪声谱曲线图；
遍览所有图面，除另有说明外，均采用相同的附图数字和字符来表示所阐述的实施例的特征、元件、组成或比例。此外，虽然参照附图对现有公开主题有详细描述，但要结合说明性实施例来实现。
具体实施方式
利用碳纳米管，在单分子检测中采用了改进的新技术。在一些实施例中，新系统和方法是免标记的，以避免使用标记时的缺点并提供了改进的带宽。
一维（1D）导体如单壁碳纳米管（SWCNTs或CNTs）可用作高增益场效应传感器，其电导会随着局部电荷密度发生强烈改变。根据本公开主题的一个方面，在可控方式下通过电气化法可使这样的碳纳米管产生单个点缺陷；如下文详细说明，单个点缺陷可用于散射位置处生物分子的共价结合。这样将使碳纳米管晶体管（碳纳米管器件）显示出对单个分子结合的敏感性（例如活性碳化二亚胺在结合时超过100毫微秒的电导变化），这是由于分子和一维通道中调节散射的缺陷之间的库伦互相动作引起的。由于缺陷生成时的实时监控，准备这些器件时会有较高成品率，如下文所述。碳纳米管中的缺陷电导可用于检测生物分子实体的存在，得到足够高的信噪比（SNR）和带宽来测量单分子DNA杂交动力学和热力学。这样，可采用一个免标记的场效应方法进行检测。
为了说明但不限于此，图1是依据公开主题的一个碳纳米管示意图。碳纳米管101上附有一个探针实体102，如DNA。可采用一个点缺陷103（如一个羧基缺陷）将探针实体附于碳纳米管上。图1所示的碳纳米管101定义了碳纳米管的第一状态。
碳纳米管101被引入一个目标实体以说明其第二状态。为了说明不受限制，图2显示了碳纳米管101在引入目标实体104后，点缺陷103处附有一个探针DNA102的状态。根据公开主题，比较了碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导以检测生物分子实体的存在，详细描述如下。
根据公开主题，可采用标准制造技术制作碳纳米管晶体管。举例但不限于此，直径小于2nm的碳纳米管可通过化学气相沉淀法生成，在带有300nm热生成二氧化硅的掺杂硅片上，用光学制版接触多个钛电极即可。氧等离子体离子蚀刻可用于第二光刻过程中的一个选择性暴露区域上，来电动隔离邻近器件，在一对电极之间只留下一个纳米管。制造完成后，将该器件放在电化电池里并连接准备好的焊线。焊线用环氧基树脂包裹并密封在一个小玻璃管里。铂对电极可用在伪参考配置中来控制氧化和随后水实验中的液面电位差。
纳米管的点功能化可通过工艺中已知的某种电气化学法实现。举例但不限于此，一个略微大于氧化阈值（-0.9和-1V之间）的氧化电势可完全用在硫酸（例如去离子水中1M的H2SO4）中的铂电极上，直到看见纳米管电导的急剧下降为止。例如，在导电能级降低90%或99%时终止氧化。如果在导电能级降低90%时终止氧化，大约有88%的器件保留了传导性，此外大约19%单分子器件具有功能性。如果在导电能级降低90%时终止氧化，大约有88%的器件仍有导电性，此外大约19%形成功能性单分子器件。在导电能级降低超过99%时，导电器件的比例降低到大约18%，此外大约28%形成功能性单分子器件。不受理论约束，这个最终程序中的低产出是由许多因素引起的，包括生成惰性CO和C=O缺陷的可能性，多种活性缺陷和形成绝缘器件的过氧化反应。
为了说明但不限于此，图3显示了一个典型的电导控制氧化过程（1摩尔H2SO4（水）和30mV偏置）。器件电导降低后，氧化电势降低。将器件浸没在6.5mM的KMnO4中，目的是在新产生的缺陷上创造一个羧基官能团。如果是和探针DNA一起在互补目标存在时作用，产生的单分子功能块具有下述二级电导波动的特性。
使用纳米管在氧化前和氧化后的扫描栅极显微镜（SGM）研究此过程中产生的局部缺陷。在监控电导时，将一个通过原子力显微镜（AFM）悬臂的局部脉冲应用在纳米管的较小区域上，就可以在空间上画出电导对局部脉冲的敏感性。为了说明但不限于此，图3c和3d分别显示了氧化前和氧化后拓扑覆盖的扫描栅极显微镜（SGM）图形。基准尺是500nm。在覆盖的扫描栅极显微镜（SGM）图像中，较暗区域对应100mV固定偏置电压时的较低电流。该器件是一个半导体纳米管。图3c显示了控制器件栅敏感性的触点处的萧特基势垒。但是，氧化后敏感性被局限在纳米管的缺陷位置处，且不再依赖于图3d显示的原始带结构。金属纳米管和半导体纳米管都可以使用，而且通常会显示氧化后较大的栅依赖性。图3b显示了器件在原始状态及氧化后的代表性电流-电压（I-V）特性。图3b显示了该过程中不同阶段的电导：氧化前、氧化后、整夜与探针DNA偶合后以及在100mV源漏偏置下暴露于目标DNA的情况。该电导是作为PT电极上的电势相对于纳米管源漏电势的功效而言的。
在一些实施例中，参照本公开主题的点功能化器件可以用于研究两种不同的10mer双螺旋DNA杂交动力学和热力学，是通过说明用途的图3e中显示的实验器件进行的。图3e显示了用于控制温度的外部循环加热器/冷却器。以氨基和5’端的一个三碳链接器结尾的探针DNA，通过一个标准偶合反应（采用N-羟基硫代琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）共价附着在纳米管的羧基缺陷上。使用去离子水彻底冲洗器件后，随后的测量是在磷酸盐缓冲生理盐水溶液（1X PBS,pH=7.4）中进行的。将探针DAN附着在纳米管里的点缺陷以后，温度由一个热水浴槽（±0.1°C）控制。达到热平衡后（大约10分钟），持续监控器件电导30秒。未出现目标DNA时，器件电导中不会有特殊显示。该电导是由图4a中给出的闪烁（1/f）噪声控制的。器件的内部带宽超过10kHz，但是使外部测量过滤器按照此处测量方法能将带宽降低到4kHz。这将产生一个完整的输入参考噪音级，在100mV源漏偏置时为～1nArms。
无论如何，将器件浸于包含互补目标DNA的缓冲液中时，会出现图4c显示的大幅度两级波动；为了进行说明，大约有一个60-100nS的电导率差且有一个周期为30秒优于1/f噪音背景3级的信噪比（SNR），可通过缩短时间间隔进行改善。代表性器件（器件1）的实时电导数据是由探针DNANH2-5’-GGAAAAAAGG-3’（探针A6）和1μM互补目标DNA显示的。两种电导状态具有很强的温度依赖性：低温时器件主要处于低电导状态，在高温和添加目标DNA之前处于高电导状态。温度在解链温度左右时，两种状态同时存在。由于这种明显的温度关联，可提出一个电导由探针-目标杂交进行调节的模型。和其他观察结果一致，与DNA探针共价结合的目标DNA降低了纳米管电导，这是由目标附属器件缺陷处增加的散射和电荷转移引起的。低电导状态表示器件中有双螺旋DNA，高电导状态表示器件中有自由探针DNA。原则上，较长的DNA链应当进一步增加散射并引起较大的波幅变动，但预计这种效果会被溶解液抗衡粒子的德拜屏蔽效应部分抵消掉。上述模型是由下文的观察报告进一步支持的。观察报告显示：对于不包含电气化学修饰的原始控制器件，无论在添加目标DNA之前还是之后都没有观察到两极波动；而且连接探针DNA的控制器件带有非互补目标。值得注意的是，在加入DNA目标后电导有一个基线下降，这是由于非特异性吸附造成的。
电导调制与缺陷处通过率的变化有关，用兰道尔-Büttiker磁电阻效应公式表示为：
R total = R c + h 4 e 2 ( 1 + 1 - T T ) - - - ( 1 )
其中Rc是氧化前器件的电阻，T是缺陷处的通过率。对于该特定器件，,Rc=53kΩ，在加入DNA目标之前和之后，通过率大约会在0.0055到0.0018之间变化。也就是说，加入目标DNA后，通过率是由三个因数的其中之一调节的。无论原子力显微镜（AFM）还是扫描栅极显微镜（SGM）技术都没有足够的空间分辨率来确定器件里的变化是否发生于单个羧酸盐或者是否只是单个DNA分子共价附着在纳米管上。将多个DNA探针附着在纳米管上将引起多级波动。但是由于强烈的两级波动，可以断定只有单个DNA交互作用控制着电导调制并且这种波动适合两级波动模式。
通过带入图4d中高斯拟合得出的低电导和高电导状态曲线中的面积比，可以得出图5a显示的融解曲线。假设在两级模式下，DNA链是单链或者双链形式，溶液里的平衡常数K可由K=2α/(1-α)2得出。其中，α是DNA链双链形式下浓度C的分数。对于基于表面的杂交，溶液里的平衡常数K可写成朗缪尔等温线公式K=2α/(1-α)C。对于基于表面和基于溶液的杂交，温度都通过热力学关系式-RTln(K)=ΔH0-TΔS0与双链形式的DNA片段有关。通过纳米管（Tm=27.5°C）测得的DNA双链（其中α=0.5）的解链温度稍低一些，而且其转变比自由DNA（Tm=32.3°C）更剧烈。
为了进行说明，图5b和5c显示了对于不同探针低聚核苷酸NH2-5’-GTGAGTTGTT-3’（探针A1）提取的融解曲线。所示结果为1μM互补目标浓度下（图5b）的纳米管器件（器件2）和另一个1μM和100nM互补目标浓度下（图5c）的器件（器件3）。较低的目标浓度降低了融解温度，这与本体溶液中观测的结果相同。总结和对比两种DNA链的热力学特性，得出了表1中显示的标准UV-Vis分析结果。
Figure BDA00003384360200101
表1
为了研究DNA杂交动力学并通过单分子系统（为了进行说明，如图6所示）的时间平均值进一步了解观测到的热力学，使用一个隐马尔科夫模型通过理想化的转换在闪烁噪音存在时提取较高(τhigh)和较低(τlow)状态下的保压时间。这被用在smFRET实验中来研究生物分子的构象变化。各个状态下提取的寿命与保压时间直方图呈指数拟合。
从这种寿命分析可以确定，保压时间直方图与含有时间常数的双指数函数
Figure BDA00003384360200102
和
Figure BDA00003384360200103
相符合，如图6b所示。双指数原点可以是两个杂交对比轨迹的结果。使用类似模型来描述DNA杂交动力学（其中硅片或玻璃上带有固定探针）以及蛋白质怎样在DNA链上找到特定的目标位置。这种模式中，目标DNA通过3D扩散或者非特异性吸附，随后通过表面扩散到达探针。如图4c所示，纳米管电导在两种不同的动力模式间转换，这两种模式的时间常数不同。时间常数与基于溶液和基于表面动力学的联系是通过检查相关保压时间的浓度依赖性确定的。根据化学动力学，预计溶液杂交率(khybridization)与DNA目标浓度（DNA双分子链过程）是成比例的，并且溶液融解速率（kmelting）是独立于浓度的（单分子过程）。图6显示了器件3在100nM和1μM互补目标浓度下的阿雷尼厄斯图。浓度为1μM时使用公式和
Figure BDA00003384360200112
浓度为100nM时使用公式和
Figure BDA00003384360200114
这样杂交和整合速率将与溶液整体实验及上述中预期的一致。普遍认为，在khybridization（kmelting）从由确定到由确定的这个时间段上的目标浓度取决于一维和三维扩散速度以及基于表面的杂交和融解速率对浓度的依赖性。
为了进行说明，图6e和图6f分表给出了器件1（探针A6）和器件2（探针A1）在khybridization和kmelting为μM1时的阿雷尼厄斯图。器件2的图片（图6f）与研究DNA发夹结构中DNA双链动力学的阿雷尼厄斯图非常相似。融解速率（Kmelting）遵循类似的性质且非常依赖温度，而杂交率（Khybridizing）具有与阿雷尼厄斯相反的性质且对温度只有轻微依赖。这种反阿雷尼厄斯性质会产生一种负活化能，意味着反应速率随着温度的升高而降低且活化自由能从熵的大量损耗中增加。同时也观察到阿雷尼厄斯图中的轻微弯曲以及DNA发夹结构杂交和蛋白质折叠，这是由于温度作用引起反应中杂交率限定部分的改变引起的，因为活化熵或活化焓热含量中具有极大的温度依赖性。
器件1的阿雷尼厄斯图（图6e）显示了一个截然不同的Kmelting性质，在融解温度周围活化能有一个急剧变化。当温度低于融解温度时，能从阿雷尼厄斯图上的浅坡处看到Kmelting有一个较小的活化能（44kJ/mol）。原因在于DNA双链的呼吸作用（探针A6用于器件1）。这个DNA双链包含六个腺嘌呤与胸腺嘧啶（AT）碱基对，它们是由鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）碱基包裹的。这与A1双链（用于器件2和3）不同，它最多只有两个相邻腺嘌呤与胸腺嘧啶（AT）碱基。不受理论约束，器件1在熔点下的波动可能是由于腺嘌呤与胸腺嘧啶（AT）区域的气泡动力引起的。
除了溶液模式和表面模式，在波动停止后偶尔能观察到若干秒的非各态时间间隔，这在保压时间直方图上显示为长长的尾部。这种特性可能是由于DNA合成物附着在纳米管表面的可逆状态引起的，其构成影响了结合动力。根据保压时间直方图，预计非各态时间间隔占整个监控时间的10%左右。
如上文所述，所公开主题的一个实施例为单分子生物分析系统，能够在微秒时间范围内检测分子并探索分子动力学。该方法可应用于所有适用领域，包括但不限于：快时间分辨率的单分子研究（如免标记单核苷酸多态性（SNP）检测和合成测序（SBS)），蛋白质折叠和蛋白质构象变化的单分子研究，和/或蛋白质或生物分子旋转范围和酶活性。其它应用还包括生物分子过程研究、超速化学反应动力学和化学动力学研究。这些器件可以整合到带有综合测量电子的活性基片上，以降低寄生阻抗和测量噪音并探测更高速度和信噪比（SNR）条件下的动力学，如下文所述。
根据公开主题的一个实施例，在合成测序法(SBS)应用中可以观察到新核苷酸整合到探针范围再并入碳纳米管（CNT）时的电导，如图7a所示。挑战在于核苷酸整合时额外电荷的德拜屏蔽长度。碳纳米管（CNT）电导是由电荷固定过程中产生的缺陷控制的。如上文所述，使用兰道尔-Büttiker磁电阻效应公式时电导调制与缺陷处通过率的变化有关。典型的是，T值小于0.01时Rc接近上万千欧；但是，如图7a所示Rc由该点缺陷处德拜长度内的电荷强力调节。
为了了解单个核苷酸整合时有关电荷形成的信号级（表现为碳纳米管（CNT）内的电阻变化），使用一个10mer探针、将5’端共价附着在纳米管上并与不同长度目标杂交来进行测量，其中目标3’端到纳米管的距离是变化的。这些探针长度与ssDNA持续长度类似，如图7a所示。图8显示了这些测量的结果。图8a-c是温度为17℃（低于融解温度）时，不同长度目标结合和融解产生的两极电导波动直方图。不同目标体长度产生的电阻振幅已标示在图8d中，依据的是将目标体3’端连接到纳米管固定缓冲液（1X磷酸盐缓冲液（PBS））的距离。结果是由简单的德拜屏蔽长度
Figure BDA00003384360200131
得出的，其中λd是德拜长度。图8e显示了依据8mer目标体的德拜长度测得的电导波动幅度；德拜长度随着缓冲液浓度的变化而改变。这些测量结果与图8e所示的模拟预测值相同。
基于这些德拜长度模拟，图8显示了多种缓冲液浓度的检测范围。在0.01X磷酸盐缓冲液（PBS中，预计从碳纳米管（CNT）检测出18碱基（～6nm）。在合成测序法（SBS）应用中，需要检测更长示踪分子核苷酸的整合。由于ssDNA（～3nm或9碱基）的相对持续时间较短，所以这样的检测是可行的。由于序列较长，纳米管附近盘绕的DNA看起来更像图7b所显示的那样。这样也可以将更多核苷酸的额外电荷置于碳纳米管（CNT）内的阻力调节缺陷德拜长度内。
通过调整电解液和纳米管之间偏置的数量来调节碳纳米管（CNT）传感器增益，这会改变点缺陷的迁移率T。通过向伪参考配置中穿入铂丝或者使用伪参考配置/稳压器中的一个银/氯化银电极作为偏置（在反馈系统中应同时使用铂和银/氯化银电极）。电极的选择不影响结果。铂电极的优势在于能够承受严酷的电化学环境且便于清理。
用可分解荧光核苷可逆终止子（NRT）进行合成测序（SBS）是众所周知的。此外，3’-氧修饰核苷可逆终止子(NRT)解决了传统焦磷酸测序中已知的均聚物排序问题。
根据本公开主题的一方面，图9显示了合成测序（SBS）所需的微流体输送系统。该系统通过聚二甲硅氧烷（PDMS）里的离子通道与碳纳米管（CNT）传感器相连。此系统允许输送到芯片的控制量低至20μL，且管道内的气隙可用于分离样品量。整个系统是由电脑控制的。
3’-氧修饰核苷可逆终止子，如3’-氧叠氮甲基-脱氧核糖核苷三磷酸（3’-O-N3-dNTPs）可用于点功能碳纳米管（CNT）上单分子的合成测序（SBS）。通过微流体输送系统，每次向模板和聚合酶的引物部分添加四个核苷可逆终止子（NRT）的其中一个，类似于进行焦磷酸测序。只有成对的核苷可逆终止子（NRT）被整合到生成的DNA链中，然后产生一个独特的电子符号来确定整合的核苷可逆终止子（NRT）。检测后，用已确定的配对分解3’-氧叠氮甲基团，然后通过三羧基乙基膦（TECP）溶液继续测序。
为了说明但不限于此，图10显示了一个示范排序组合。首先，环形DNA片段在点缺陷处与碳纳米管（CNT）共价结合。然后添加一个带有碱基C的核苷可逆终止子（NRT），该碱基C与模板中的碱基G互补。进行电子检测以确定单分子整合结果。随着3’-OH保护基的脱离排序继续进行。如图10所示检测纳米管电阻（或电导）内的整合步骤。依据时间高通过滤该信号（如图10所示）可以进一步降低闪烁噪音的影响并如下所述那样改进核苷可逆终止子（NRT）。使用相对较低的核苷可逆终止子（NRT）输送浓度可以使碳纳米管（CNT）有时间与NRT整合之前的水环境相平衡。
依赖传感用的大像素成像芯片可以方便地将荧光标记技术按比例放大到其它通道。在免标记传感中，按比例放大时需要集成电子以便于对各个传感器进行处理和测量。除了样品制备和测量仪器简单外，直流电传感与荧光标记法相比的潜在优势之一还在于噪音限制的带宽之一。图11a显示了同样带有晶片外电子器件的纳米管的小信号模式。器件带宽受到与传感器本身相关的寄生参数的剧烈影响。公式
Figure BDA00003384360200141
给出了主导极点。电流值为Rp～5kΩ、Cp～2.1nF、C～500pF、RCNT～20MΩ，给出f1～10kHz。通过降低这种寄生参数可以很容易地改进器件带宽。使用一个绝缘基片可以降低C，钝化电极（和氧化物或抗蚀剂一起）或减小电极尺寸可以降低Cp，使用不同的触点金属来降低串联电阻Rp。经过这些改进可以轻易地将带宽提高到1MHz或更高。如图11b所示，预计1/f噪音可以控制1MHz以外的噪声性能。但是，即使不采取任何措施来降低现有等级以下的噪音，输入的参考干扰电流仍会小于1nA rms。
广泛的定制集成电路可以用于测量CMOS技术中的随机共振噪音，它可以方便地为本公开主题提供测量能力。可以将纳米管转移到这些光刻基片上或者采用众所周知的介电泳工艺。图9中的微流体组件可以按比例扩大到能够支持多个流体输送通道为止。芯片可进行放大和数据转换，通过数字形式显示实时结果。
这一额外带宽使得电子碳纳米管（CNT）整合检测可以以窄带方式进行。预计核苷可逆终止子（NRT）本身的整合速度非常快（接近纳秒），这能够实现从碳纳米管（CNT）到接近测量带宽的电导的高通过滤，滤除大部分的1/f噪音并提高信噪比（SNR）性能。这样就可以测量核苷可逆终止子（NRT）的整合时间，碱基不同则时间不同，这也提供了一种实时合成测序（SBS）途径。
实例
碳纳米管器件的制作
生成碳纳米管的催化剂溶液是由对甲基乙酸乙酯乙酸基杯[6]芳烃（MC6,日本德山公司）和三乙酰丙酮铁（Fe(Acac)3,奥德里奇）融入一氯苯中形成的。将1.0Wt%浓度的MC6和0.1Wt%浓度的Fe(Acac)3溶液刷在洁净的二氧化硅基片（300nm SiO2）一边，然后在空气中经预热炉（500℃）10分钟以清除抗蚀膜。同样温度下用氩气处理十分钟，这时温度升到750℃，接入氩气和氢气还原气一小时进行还原（分别为642sccm和115sccm）以激活纳米级零价铁。用乙醇作为碳源，通过化学气相沉淀（CVD）过程，一小时中在880℃的铁纳米离子中生成碳纳米管。此时的氩流量为138sccm，氢气流量为18sccm。通常生成的碳纳米管有几十毫米长相互间隔大约50μm。
在器件制作中，纳米管是在退化的掺杂硅基片（ρ=0.01Ωcm）上生成的，带有一个300nm的热生长层。用双层（120nm LOR1A/1.3μm希普利S1813）抗蚀剂中的光学刻版法定义通向纳米管的电极，随后对一个75nm的钛膜进行电子束蒸发并将其在PG去除剂中去除。使用扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）来定位纳米管相对于校准标记和基片上电子的位置以测量其直径（只选用直径小于2nm的纳米管）。然后，使用另一个刻版程序覆盖所选的纳米管，随后使用氧等离子体蚀刻（工艺系列800反应离子刻蚀（RIE）设备，50W射频电源，氧气250m托，10秒）清除其它纳米管。这个蚀刻程序确保只有一个纳米管桥接电极，而相邻电极是电隔离的。制作完成后，将基片放在400℃的合成气体（氢气和氩气的混合物）中至少煅烧两小时以彻底清除残留阻抗。
测量仪器和碳纳米管器件氧化
将芯片键合在44-针J型芯片载体上（切尔西技术），焊线使用标准环氧树脂（阻塞和填充用EPO-TEK120和EPO-TEK302-3M）实现电绝缘和机械绝缘。环氧树脂顶部固定了一个小玻璃管形成一个3ml的腔体进行水实验。使用伪参考配置中的铂丝调整液体电势，此时背栅处保持在0电势。也可以使用伪参考配置中的银/氯化银电极（在反馈系统中同时使用铂和银/氯化银电极）进行实验且电极的选择不影响实验结果。使用铂电极的优势在于能够承受严酷的电化学环境，并且在实验之间便于清理（用细纱布磨掉外层然后用去离子水清洗即可）。
作为栅电压功能的电导，借助100mV源漏偏置检测双探针配置中的电导时，会使用安捷伦（Agilent）4155C半导体参数分析仪来清理电解质。栅漏（<1nA）相对于源漏电流通常可以忽略不计。这很好地表明钛电极氧化层充分减少了电化学泄漏电流。通过一个虚拟仪器程序对实验进行实时监控。使用互阻抗电流放大器（斯坦福研究处SR570）（用数据采集卡设定在10kHz或15kHz）监控选定器件的电导时，使用一个电源电压设定电解液电压。互阻抗放大器也可以将源漏电压设定在100mV，此时带宽为4kHz（200nA/V敏感度，10kHz/12dB低通过滤器）。将经过硫酸溶液（1M H2SO4(aq)）氧化的器件连接到第二个电源电压上，该电源电压通常比铂丝电势高出0.4V以防止进一步氧化或偶尔的氧化不足。允许一次对多个器件进行氧化。然后用去离子水（保持电势固定）冲洗玻璃室并将器件浸泡在6.5mM的高锰酸钾溶液(KMnO4(aq))中持续45秒。
使用碳纳米管实现DNA功能化
氧化过程中碳纳米管产生的羧酸盐缺陷可分为两步连接到DNA上。首先，使用MES缓冲盐水溶液（pH=4.7,Pierce生物技术）将羧酸基激活30分钟，该溶液包含1mM乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）盐酸盐和2mMN-羟基硫代琥珀酰亚胺（可以从Pierce生物技术公司购买）。然后，用干净缓冲液冲洗器件，再用1X磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）冲洗。这些器件培养了2μM单链探针DNA，带有一个氨基的5’端浸在含有1mM乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）和2mMN-羟基硫代琥珀酰亚胺的缓冲液中(pH=7.4)一整夜（14小时）。再用去离子水冲洗器件并浸泡在1X的磷酸盐缓冲液中（PBS）做进一步鉴定。
碳纳米管扫描栅极显微镜
借助Park系统公司的XE-100原子力显微镜(AFM)，使用一个镉/金吸头在室温下可以完成扫描栅极显微镜（SGM）。扫描栅极显微镜（SGM）和电子力显微镜（EFM）可以同时进行，将吸头提高到纳米管上方30nm处。对于扫描栅极显微镜（SGM）使用一个锁定放大器（斯坦福研究处SR830）将一个50mV的较小偏置穿过纳米管，此时吸头偏置为-2V。该器件略为P型且这个负偏置增加了穿过局部吸头的电导。拓扑图像和扫描栅极显微镜（SGM）图像均已平齐，但不需要进一步的处理。当吸头位于肖特基势垒上时，原始器件的电导大约增加8%；而吸头位于缺陷上时，点功能化电导增加超过22%。
此处所述的公开主题参照了某些典型的实施例。所属领域技术人员应意识到，在不偏离本应用范围的前提下，可对本应用进行改动和改进。因此意味着在现有应用中，包括改动和变更都在附加的权利要求及同等内容的范围内。此外，虽然这里可以讨论应用中某个实施例的个体特征或者将此特征显示在某个实施例而非另一个实施例的图纸中，但显然某个实施例的个体特征可以包含在其它实施例的一个或多个特征中或者大多数实施例的特征中。
除了下面权利要求中的特定实施例，本公开主题也涵盖那些可能具有下述或上述独立特征组合的其它实施例。这样，从属权利要求和上述公开内容中出现的具体特征可以在本应用的范围内以其他方式相互合并，以便于识别本应用并使本应用涵盖上述具有其他可能组合的实施例。因此，为了进行说明和描述，对本应用中的特定实施例进行了以上说明。但这并不意味着它们足够详尽或者必须将本应用限制在本文公开的实施例中。

Claims (20)

1.一种单分子检测方法，包括：
提供一个带有探针实体的碳纳米管以定义碳纳米管的第一状态；
将碳纳米管引入一个目标实体中以定义碳纳米管的第二状态；
比较碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导以检测生物分子实体的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所提供的条件进一步包括：将一种点缺陷施加于碳纳米管上并将探针实体附着在碳纳米管的点缺陷处，从而把探针实体附着在碳纳米管上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，点缺陷包括一个单独的羧基缺陷。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所提供的条件进一步包括：通过一个偶合反应将探针实体附着在碳纳米管上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，探针实体包括一个探针DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，探针DNA包括单链DAN（ssDNA）。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，目标实体包括一个互补目标DNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引入进一步包括将碳纳米管引入到缓冲合成物内的目标实体中，该合成物包含了目标实体。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的比较进一步包括将碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导与预定的电导数据加以比较以确定目标实体的特性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，预定的电导数据包含一个校准曲线。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碳纳米管包含一个单壁碳纳米管。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碳纳米管包含一个场效应晶体管，该晶体管能提供一个电子信号来测量碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为免标记法。
14.使用如权利要求1所述的方法提供单分子，及生物分子的合成测序（SBS）。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的方法为免标记法。
16.一个单分子检测系统，其特征在于，包括：
一个带有探针实体的碳纳米管，用于定义碳纳米管的第一状态；
与碳纳米管进行电子通讯的场效应晶体管；和
提供有一个目标实体，该目标实体被引入碳纳米管时用于定义碳纳米管的第二状态，以便于比较碳纳米管在第一状态和第二状态下的电导以检测生物分子实体的存在。
17.根据权利要求16所述的单分子检测系统，其特征在于，进一步包含一个缓冲合成物来将目标DNA引入碳纳米管中。
18.根据权利要求16所述的单分子检测系统，其特征在于，探针实体附着在碳纳米管的点缺陷处。
19.根据权利要求16所述的单分子检测系统，其特征在于，探针实体包括一个探针DNA。
20.根据权利要求19所述的单分子检测系统，其特征在于，目标实体是一个互补目标DNA。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107423554A (zh) * 2017-06-09 2017-12-01 东南大学 一种用可逆单分子反应实现马尔科夫链的设计方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013154750A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of Columbia Unversity In The City Of New York Systems and methods for biological ion channel interfaces
CN103620403B (zh) 2011-01-11 2016-08-10 纽约市哥伦比亚大学理事会 使用纳米管监测单分子的系统和方法
WO2012116161A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for single-molecule detection using nanopores
US9164053B2 (en) 2011-09-26 2015-10-20 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics
WO2013158280A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for single-molecule nucleic-acid assay platforms
WO2014182630A1 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Pacific Biosciences Of California , Inc. Real-time electronic sequencing
CN103903970A (zh) * 2014-03-10 2014-07-02 中国科学院物理研究所 一种具有纳米间隙的异质电极对的制作方法
RU2721965C2 (ru) * 2014-12-18 2020-05-25 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Обнаружение изменений конформации полимеразы нуклеиновых кислот с помощью нанотрубки
WO2017024049A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single-molecule nanofet sequencing systems and methods
JP7085471B2 (ja) * 2015-10-05 2022-06-16 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ－オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション 心臓バイオマーカーのインピーダンス測定による検出のための垂直配向のプラチナワイヤ・アプタセンサアレイの作成およびパラメータ評価

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006024023A2 (en) * 2004-08-24 2006-03-02 Nanomix, Inc. Nanotube sensor devices for dna detection
CN101126735A (zh) * 2007-09-30 2008-02-20 董益阳 一种生物传感器及其制备方法和采用该传感器的检测装置
CN101194162A (zh) * 2005-06-28 2008-06-04 韩国化学研究院 一种以适配体作为分子识别元件的碳纳米管晶体管生物传感器及其用于检测靶材料的方法
CN101346472A (zh) * 2005-12-21 2009-01-14 霍夫曼—拉罗奇有限公司 用可逆2’-修饰的核苷酸进行的序列测定和基因分型
US20090181381A1 (en) * 2007-06-29 2009-07-16 Oldham Mark F Systems and methods for electronic detection with nanofets

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5304950A (en) 1992-07-30 1994-04-19 Hughes Aircraft Company Low power, low noise preamplifier with offset voltage cancellation
US5599668A (en) 1994-09-22 1997-02-04 Abbott Laboratories Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events
JP3785517B2 (ja) 1997-06-05 2006-06-14 東ソー株式会社 核酸融解温度測定法
EP1125120A1 (en) 1998-10-27 2001-08-22 President And Fellows of Harvard College Biological ion channels in nanofabricated detectors
DE19916921A1 (de) 1999-04-14 2000-10-19 Fraunhofer Ges Forschung Elektrisches Sensorarray
US6682649B1 (en) 1999-10-01 2004-01-27 Sophion Bioscience A/S Substrate and a method for determining and/or monitoring electrophysiological properties of ion channels
JP3871846B2 (ja) 2000-03-10 2007-01-24 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 ハイブリダイゼーション反応検出方法及び検出装置
GB0016473D0 (en) 2000-07-05 2000-08-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Sequencing method
NL1016779C2 (nl) 2000-12-02 2002-06-04 Cornelis Johannes Maria V Rijn Matrijs, werkwijze voor het vervaardigen van precisieproducten met behulp van een matrijs, alsmede precisieproducten, in het bijzonder microzeven en membraanfilters, vervaardigd met een dergelijke matrijs.
US6706402B2 (en) 2001-07-25 2004-03-16 Nantero, Inc. Nanotube films and articles
EP1423505A2 (en) 2001-08-06 2004-06-02 Vanderbilt University Device and methods for monitoring the status of at least one cell
EP1423687A1 (en) 2001-08-08 2004-06-02 The Arizona Board of Regents Nucleic acid field effect transistor
US20030087292A1 (en) 2001-10-04 2003-05-08 Shiping Chen Methods and systems for promoting interactions between probes and target molecules in fluid in microarrays
AU2003225839A1 (en) 2002-03-15 2003-09-29 Nanomix. Inc. Modification of selectivity for sensing for nanostructure device arrays
ATE544867T1 (de) 2002-12-11 2012-02-15 Centre Nat Rech Scient Methode zur elektronischen detektion wenigstens einer spezifischen interaktion zwischen einem proben- und einem zielmolekül
US7501279B2 (en) 2003-04-03 2009-03-10 University Of Washington Microwell arrays with nanoholes
US20050145496A1 (en) 2003-04-03 2005-07-07 Federico Goodsaid Thermal reaction device and method for using the same
US20050181383A1 (en) 2004-02-18 2005-08-18 Xing Su Isolating, positioning, and sequencing single molecules
WO2006041535A2 (en) 2004-05-05 2006-04-20 California Institute Of Technology Capillary lithography of nanofiber arrays
GB2431013B (en) 2004-07-23 2008-05-21 Electronic Bio Sciences Llc Method and apparatus for sensing a time varying current passing through an ion channel
US7786591B2 (en) 2004-09-29 2010-08-31 Broadcom Corporation Die down ball grid array package
US20060194263A1 (en) * 2004-09-30 2006-08-31 Salah Boussaad Small molecule mediated, heterogeneous, carbon nanotube biosensing
WO2007001402A2 (en) * 2004-09-30 2007-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Redox potential mediated, heterogeneous, carbon nanotube biosensing
US20130071837A1 (en) 2004-10-06 2013-03-21 Stephen N. Winters-Hilt Method and System for Characterizing or Identifying Molecules and Molecular Mixtures
WO2006095252A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 National Research Council Of Canada Electrostatically regulated atomic scale electroconductivity device
US20060202266A1 (en) 2005-03-14 2006-09-14 Marko Radosavljevic Field effect transistor with metal source/drain regions
WO2008097261A2 (en) 2006-07-13 2008-08-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Single walled carbon nanotubes with functionally adsorbed biopolymers for use as chemical sensors
US7977054B2 (en) 2005-03-29 2011-07-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Single walled carbon nanotubes functionally adsorbed to biopolymers for use as chemical sensors
EP2348300A3 (en) * 2005-04-06 2011-10-12 The President and Fellows of Harvard College Molecular characterization with carbon nanotube control
US20060228402A1 (en) 2005-04-08 2006-10-12 Charite-Universitatsmedizin Berlin Techniques for forming a lipid bilayer membrane
TWI287041B (en) 2005-04-27 2007-09-21 Jung-Tang Huang An ultra-rapid DNA sequencing method with nano-transistors array based devices
DE102005038121B3 (de) 2005-08-11 2007-04-12 Siemens Ag Verfahren zur Integration funktioneller Nanostrukturen in mikro- und nanoelektrische Schaltkreise
US20070292855A1 (en) 2005-08-19 2007-12-20 Intel Corporation Method and CMOS-based device to analyze molecules and nanomaterials based on the electrical readout of specific binding events on functionalized electrodes
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US9233846B2 (en) 2005-10-14 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Formation and encapsulation of molecular bilayer and monolayer membranes
US8536324B2 (en) 2005-10-21 2013-09-17 University Of South Florida Method of drug delivery by carbon nanotube-chitosan nanocomplexes
EP2570490B1 (en) * 2006-03-17 2017-06-28 The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services Apparatus for microarray binding sensors having biological probe materials using carbon nanotube transistors
KR100773550B1 (ko) 2006-04-03 2007-11-07 삼성전자주식회사 생분자의 고정 없이 전계 효과 트랜지스터를 이용하여생분자를 검출하는 방법
US7832647B2 (en) 2006-06-30 2010-11-16 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Semiconductor device
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
CA2672315A1 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
GB0700157D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Univ Warwick Ruthenium purple
US7956345B2 (en) 2007-01-24 2011-06-07 Stmicroelectronics Asia Pacific Pte. Ltd. CNT devices, low-temperature fabrication of CNT and CNT photo-resists
US9034637B2 (en) 2007-04-25 2015-05-19 Nxp, B.V. Apparatus and method for molecule detection using nanopores
KR101478540B1 (ko) 2007-09-17 2015-01-02 삼성전자 주식회사 트랜지스터의 채널로 나노 물질을 이용하는 바이오 센서 및그 제조 방법
US8609333B2 (en) 2007-10-01 2013-12-17 University Of Southern California Detection of methylated DNA and DNA mutations
US20090325211A1 (en) 2007-10-06 2009-12-31 Ye Fang System and method for dual-detection of a cellular response
US8124191B2 (en) 2007-11-30 2012-02-28 Electronic Bio Sciences, Llc Method and apparatus for single side bilayer formation
US7767400B2 (en) 2008-02-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Paired-end reads in sequencing by synthesis
US7790391B2 (en) 2008-03-28 2010-09-07 Helicos Biosciences Corporation Methods of equalizing representation levels of nucleic acid targets
WO2010026488A2 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Quantumdx Group Limited Methods and kits for nucleic acid sequencing
KR101026468B1 (ko) 2008-09-10 2011-04-01 한국전자통신연구원 생분자 검출 장치 및 검출 방법
WO2013154750A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of Columbia Unversity In The City Of New York Systems and methods for biological ion channel interfaces
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100148126A1 (en) 2008-11-26 2010-06-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Genomic sequencing using modified protein pores and ionic liquids
WO2010117470A2 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
US8864969B2 (en) 2009-06-25 2014-10-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Electro-diffusion enhanced bio-molecule charge detection using electrostatic interaction
AU2010307229B2 (en) 2009-09-18 2016-02-25 President And Fellows Of Harvard College Bare single-layer graphene membrane having a nanopore enabling high-sensitivity molecular detection and analysis
US8736425B2 (en) 2009-10-30 2014-05-27 General Electric Company Method and system for performance enhancement of resonant sensors
KR101711205B1 (ko) 2009-12-21 2017-03-02 삼성전자주식회사 전계효과 트랜지스터 및 이에 기반한 센서
US8481903B2 (en) 2010-03-06 2013-07-09 Alexander Triener Systems, methods, and apparatuses including a moveable optical component for detecting optical signals from a sample
WO2011123525A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 The Regents Of The University Of California Forming an artificial cell with controlled membrane composition, asymmetry and contents
US8444835B2 (en) 2010-09-09 2013-05-21 Intel Corporation Electronic and fluidic interface
WO2012044857A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 California Institute Of Technology Devices and methods for sequencing nucleic acids
CN103370617B (zh) 2010-10-01 2015-11-25 牛津纳米孔技术有限公司 生物化学分析设备和旋转阀
CN103620403B (zh) 2011-01-11 2016-08-10 纽约市哥伦比亚大学理事会 使用纳米管监测单分子的系统和方法
WO2012116161A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for single-molecule detection using nanopores
US9194801B2 (en) 2011-08-26 2015-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for a DNA-based thermometer
US9164053B2 (en) * 2011-09-26 2015-10-20 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics
WO2013158280A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for single-molecule nucleic-acid assay platforms

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006024023A2 (en) * 2004-08-24 2006-03-02 Nanomix, Inc. Nanotube sensor devices for dna detection
CN101194162A (zh) * 2005-06-28 2008-06-04 韩国化学研究院 一种以适配体作为分子识别元件的碳纳米管晶体管生物传感器及其用于检测靶材料的方法
CN101346472A (zh) * 2005-12-21 2009-01-14 霍夫曼—拉罗奇有限公司 用可逆2’-修饰的核苷酸进行的序列测定和基因分型
US20090181381A1 (en) * 2007-06-29 2009-07-16 Oldham Mark F Systems and methods for electronic detection with nanofets
CN101126735A (zh) * 2007-09-30 2008-02-20 董益阳 一种生物传感器及其制备方法和采用该传感器的检测装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107423554A (zh) * 2017-06-09 2017-12-01 东南大学 一种用可逆单分子反应实现马尔科夫链的设计方法
CN107423554B (zh) * 2017-06-09 2020-02-18 东南大学 一种用可逆单分子反应实现马尔科夫链的设计方法

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