CN108546730A - Dna四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用 - Google Patents

Dna四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用方法。其中，DNA四面体由四条DNA单链自组装合成。DNA四面体促进小鼠神经干细胞迁移的作用是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来发挥作用，而RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RHOA/ROCK2信号通路上的RhoA、Rock2和Vinculin蛋白表达量来实现的，而且小鼠神经干细胞迁移过程中所用DNA四面体浓度为100～300nM。DNA四面体具有良好的生物利用度和生物相容性，同时能够对小鼠神经干细胞的迁移起到促进作用，可效解决了神经干细胞迁移效果差的问题。

Description

DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用
技术领域
本发明属于DNA四面体应用术领域，具体涉及一种DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用。
背景技术
DNA四面体纳米材料(TDNs)是一种新型的DNA纳米材料，目前在生物医学领域有着十分广泛的研究和巨大的潜在运用前景。TDNs是由四条ss DNA单链在特定的条件下自组装形成的具有三维结构的DNA纳米材料，而四条ss DNA(S1、S2、S3、S4)的碱基序列是严格遵循了“碱基互补配对原则”，进而精确、巧妙地设计出来的。TDNs合成方法简便、产率较高，对特异性或非特异性核酸酶的耐受性均较普通的线性DNA好，且具有良好的生物相容性、生物安全性和生物可降解性。
小鼠神经干细胞(NE-4C)，该细胞来源于ATCC细胞库，是一种较好的体外研究神经系统的模型之一。NE-4C细胞在一定的环境下可以维持干细胞的特点，但是在特定诱导处理后，可分化为成熟的神经元或者神经胶质细胞。目前，在关于神经干细胞的研究中，主要方向是研究药物或者材料对神经干细胞增殖、迁移以及分化的影响。神经干细胞的迁移在神经发生过程中起着重要的作用，促进神经干细胞的迁移，有助于神经组织的修复和再生。因此促进神经干细胞的迁移，有助于神经系统的再生或修复。
目前的研究中发现，增殖分化研究过程中所使用的药物或者材料可能对细胞一定的毒性作用，即具有生物相容性、生物安全性、生物可降解性较差等特点。此外，在体内实验的研究中发现，神经干细胞出现了存活率低、增殖缓慢、迁移效果差以及分化成熟慢等问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用方法，以解决在进行体内实验时神经干细胞迁移效果差的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用方法，该四面体由四条DNA单链组装合成，四条单链序列如SEQ ID NO：1～4所示。DNA四面体促进小鼠神经干细胞迁移的作用是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来发挥作用。
进一步地，RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RHOA/ROCK2信号通路上的蛋白表达量来实现的。
进一步地，RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RhoA蛋白的表达量来实现的。
进一步地，RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导Rock2蛋白的表达量来实现的。
进一步地，RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导Vinculin蛋白的表达量来实现的。
进一步地，RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RhoA、Rock2和Vinculin蛋白的表达量来实现的。
进一步地，小鼠神经干细胞迁移过程中所用DNA四面体浓度为100～300nM。
进一步地，小鼠神经干细胞迁移过程中所用DNA四面体浓度为250nM。
本发明的有益效果是：本发明中所用到的DNA四面体，具有特定的结构和氨基酸序列，其能够显著诱导RHOA/ROCK2信号通路上蛋白质的表达量，如RhoA、Rock2、Vinculin等；RhoA、Rock2、Vinculin量越多，小鼠神经干细胞的迁移也就越快。因此，本发明中，DNA四面体有效地促进了小鼠神经干细胞的迁移。
本发明所用的DNA四面体具有良好的生物利用度和生物相容性，同时能够对小鼠神经干细胞的迁移起到促进作用，有效解决了神经干细胞迁移效果差的问题。
附图说明
图1为DNA四面体纳米材料TDNs合成过程示意图；
图2为TDNs电泳图；
图3为TDNs透射电镜图；
图4粒径分布图，其中a为ssDNA的粒径分布图，b为TDNs的粒径分布图；
图5为小鼠神经干细胞荧光示综结果图；
图6为小鼠神经干细胞对TDNs摄取情况流式细胞术处理后的结果图；
图7为小鼠神经干细胞划痕实验结果图；
图8为小鼠神经干细胞Transwell实验结果图；
图9为半定量PCR和荧光定量PCR实验结果图；
图10为蛋白质印迹实验结果图；
图11为免疫荧光实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明中，公开了一种DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用方法，该迁移促进剂为DNA四面体纳米材料(TDNs)，TDNs合成示意图如图1所示。如图2所示，其大小约为210bp，并由四条ss DNA单链S1、S2、S3和S4按照碱基互补配对原则字组装成四面体结构，四条单链的大小分别约为60bp、50bp、50bp、50bp，它们的序列如下：
S1：atttatcacccgccatagtagacgtatcaccaggcagttgagacgaacattcctaagtctgaa；
S2：acatgcgagggtccaataccgacgattacagcttgctacacgattcagacttaggaatgttcg；
S3：actactatggcgggtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatcc；
S4：acggtattggaccctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccg。
本发明中TDNs的获得包括合成、筛选以及鉴定几个步骤，具体方法如下：
(1)TDNs的合成
将四种ss DNA单链(S1、S2、S3、S4)以相同浓度加入TM buffer溶液中，其中，TMbuffer溶液的溶质为Tris-HCl和MgCl2，它们的浓度分别为10mM和50mM，并调节溶液的pH值为8.0。然后将混合物经过涡旋、混匀、离心后置于PCR仪内，将温度迅速升高到95℃稳定10～15min，再冷却至4℃稳定20min，合成浓度约为1000nM的TDNs初品。合成过程示意图如图1所示。
(2)TDNs的筛选
a、制备聚丙烯酰胺凝胶：将40wt％的丙烯酰胺溶液、10×TAE、10wt％的硫酸铵溶液、蒸馏水、四甲基乙二胺按照1～2:1:1:1:1的体积比混合，制成聚丙烯酰氨凝胶。
b、加样及电泳：将1ul 6×loading buffer分别与5ul的样品和marker混合均匀，然后分别加入对应的电泳槽中。在冰浴、恒压100V的条件下，电泳处理1小时。
c、GelRed染色及曝光：将聚丙烯酰氨凝胶放置于GelRed和蒸馏水按照1:50的比例混合的混合液液中，避光，摇床15～25分钟。曝光。
结果：如图2所示，泳道1～8分别为Marker，1-S1，2-S2，3-S3，4-S4，5-S1+S2，6-S1+S2+S3，7-S1+S2+S3+S4(7-TDNs)。从图中可以看出，ss DNA单链S1、S2、S3、S4的大小分别约为60bp、50bp、50bp、50bp，则本发明制备出的TDNs的大小约为210bp。
(3)TDNs的鉴定
①透射电镜
a、取适量样本液于金属片上，红外下照射5～10分钟使其干燥，上机检测。
b、结果：如图3所示，TDNs的形状在透射电镜下呈近似三角形形状，粒径大小在10～15nM范围内。
②动态光散射
a、取适量ssDNA和TDNs溶液，放置于动态光散射检测仪中，进行检测。
b、结果：如图4-a，ssDNA的粒径约为48.255nm。如图4-b，TDNs的粒径约为16.801nm。
TDNs筛选及鉴定完成后，利用荧光示综技术或流式细胞技术验证TDNs能够被小鼠神经干细胞摄取，验证的具体方法为：
(1)荧光示踪技术：
a、在共聚焦小皿中接种小鼠神经干细胞悬液，先在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、对照组加入浓度为250nM的Cy5修饰的S1，实验组加入浓度为250nM的Cy5修饰的TDNs，于孵箱培养12小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
c、吸去培养基，用PBS清洗三次，每次5分钟；然后用4wt％的多聚甲醛固定25分钟，吸去多聚甲醛，用PBS清洗三次，每次5分钟；再用鬼笔环肽处理，避光10～30分钟，吸去鬼笔环肽，用PBS清洗三次，每次5分钟；然后用DAPI处理，避光10分钟，吸去DAPI，用PBS清洗三次，每次5分钟；再用10wt％的甘油封样，避光，4℃保存，并上机检测。
d、结果：如图5-a和5-b，ssDNA被神经干细胞摄取的较少；神经干细胞对TDNs摄取的较多，且进入细胞的TDNs大部分聚集在细胞的胞浆内，进入细胞核的较少。
(2)流式细胞术：
a、在6孔板接种细胞悬液，先在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、阴性对照组不做任何处理，阳性对照组加入浓度为250nM的Cy5修饰的S1，实验组加入浓度为250nM的Cy5修饰的TDNs，于孵箱培养12小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
c、将细胞收集起来，1000r/min下离心5min，PBS重悬，重复三次，上机检测。
d、结果：如图6-a和6-b，神经干细胞对TNDs的摄取明显多于对ssDNA的摄取。
通过上述实验验证，TNDs能够很好的被小鼠神经干细胞摄取。在此基础上，继续验证本发明中所制备出的TNDs能够对小鼠神经干细胞的迁移具有促进作用。验证采用划痕实验和Transwell实验进行。具体方法如下：
TDNs促进小鼠神经干细胞的迁移
①划痕实验
a、在6孔板中接种小鼠神经干细胞悬液，先将培养板在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后使用无菌枪尖在培养板中，将单层细胞沿着直线做划痕，并用PBS洗三次。
b、对照组不加入TDNs，实验组加入对应浓度的TDNs，于孵箱培养(37℃，5％(v/v)CO2)。分别于0、12、24小时后于光镜下拍照，记录划痕变化。
c、结果：如图7，与对照组相比，TDNs明显促进小鼠神经干细胞的横线迁移。
②Transwell实验
a、将Transwell(孔径为0.8μm)小室放置于6孔板中，在小室中接种小鼠神经干细胞悬液，先将培养板在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)C O2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、对照组不加入TDNs，实验组加入浓度为250nM的TDNs，于孵箱培养12小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
c、吸去培养基，用PBS清洗三次，每次5分钟；然后用4wt％的多聚甲醛固定25分钟后，吸去多聚甲醛，用PBS清洗三次，每次5分钟；再用DAPI处理，避光10分钟，吸去DAPI，用PBS清洗三次，每次5分钟；避光，4℃保存，并上机检测。
d、结果：如图8，与对照组相比，实验组中穿过Transwell小室的细胞明显增加，即TDNs促进了神经干细胞的垂直向迁移。
利用划痕实验和Transwell实验，证明了本发明的TDNs对小鼠神经干细胞的横向和纵向迁移确实具有良好的促进作用，而且通过下述实验，对TDNs对小鼠神经干细胞迁移的促进机制进行了研究。
迁移机制
①半定量PCR和荧光定量PCR(Q-PCR)
a、在6孔板中接种小鼠神经干细胞悬液，先将培养板在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、对照组不加入TDNs，实验组加入浓度为250nM的TDNs，于孵箱培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；使用基因提取试剂盒，提取基因；通过高纯总RNA快速提取试剂盒及逆转录试剂盒获得稳定cDNA。
c、半定量PCR：每个扩增体系为25ul(1ul cDNA、9.5ul ddH2O、12.5ul MasterMix、1ul引物Forward、1ul引物Reserve)，上机扩增，配胶(1.2g琼脂糖、60ml1*TAE、2ulgolden view)电泳，结果分析。
d、Q-PCR：每孔20ul的反应体系(2ul cDNA、10ul SYBR、0.8ul引物Forward、0.8ul引物Reserve、6.4ul ddH2O)，上机检测，数据处理。
e、结果：如图9a～9c、图10a～10c、图11a～11c所示，在半定量PCR及定量PCR中，与对照组相比，实验组中迁移相关RHOA/ROCK2信号通路上的三个蛋白，分别是RhoA、Rock2、Vinculin，其对应的基因的表达量增加。说明TDNs促进神经干细胞的迁移，是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来实现的。
②蛋白质印迹法(Western Blot)
a、在6孔板中接种小鼠神经干细胞悬液，先将培养板在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、对照组不加入TDNs，实验组加入浓度为250nM的TDNs，于孵箱培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；使用全蛋白提取试剂盒，提取蛋白。
c、SDS－PAGE电泳：灌胶→上样→电泳→转膜→封闭液摇动封闭1小时→一抗4℃过夜→回收一抗，TBST洗涤三次，每次5～10分钟→二抗，1小时→弃二抗，TBST洗涤三次，每次5～10分钟→曝光，数据处理。
d、结果：如图9d～9e、图10d～10e、图11d～11e所示，与对照组相比，实验组中迁移相关RHOA/ROCK2信号通路上的三个蛋白，分别是RhoA、Rock2、Vinculin，其对应的蛋白的表达量增加。说明TDNs促进神经干细胞的迁移，是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来实现的。
③免疫荧光技术
a、在共聚焦小皿中接种细胞悬液，先将培养板在孵箱预培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)；然后将培养基中的血清浓度由10％降到6％，于孵箱继续培养6小时(37℃，5％(v/v)CO2)；再将培养基中的血清浓度由6％降到0，于孵箱继续培养1小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
b、对照组不加入TDNs，实验组加入浓度为250nM TDNs，于孵箱培养24小时(37℃，5％(v/v)CO2)。
c、吸去培养基，PBS清洗三次，每次5分钟；用4wt％的多聚甲醛固定25分钟后，吸去多聚甲醛，PBS清洗三次，每次5分钟；再用0.5％Triton-100处理20～25分钟，吸去Triton-100，PBS清洗三次，每次5分钟；然后用羊血清处理1小时，吸去羊血清，PBS清洗三次，每次5分钟。一抗RhoA、Rock2、Vinculin抗体处理，4℃，过夜。第二天，37℃复温0.5小时，回收一抗，PBS洗3次，每次5分钟。携带荧光的二抗处理，避光，37℃，1小时，吸去二抗，PBS洗3次，每次5分钟。DAPI处理，避光，10分钟，吸去DAPI，PBS洗3次，每次5分钟。10％甘油封样，避光，4℃保存，并上机检测。
d、结果：如图9f～9g、图10f～10g、图11f～11g所示，与对照组相比，实验组中蛋白的荧光的强度(RhoA、Rock2、Vinculin)较高，进一步说明了TDNs促进神经干细胞的迁移，是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来实现的。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63

Claims (9)

1.DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，该四面体由四条DNA单链自组装合成，所述四条单链序列如SEQ ID NO：1～4所示。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：所述DNA四面体促进小鼠神经干细胞的迁移是通过激活RHOA/ROCK2信号通路来发挥作用。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RHOA/ROCK2信号通路上的蛋白表达量来实现的。
4.根据权利要求3所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RhoA蛋白的表达量来实现的。
5.根据权利要求3所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导Rock2蛋白的表达量来实现的。
6.根据权利要求3所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导Vinculin蛋白的表达量来实现的。
7.根据权利要求3所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：RHOA/ROCK2信号通路的激活是通过诱导RhoA、Rock2和Vinculin蛋白的表达量来实现的。
8.根据权利要求1所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：小鼠神经干细胞迁移过程中所用DNA四面体浓度为100～300nM。
9.根据权利要求8所述的DNA四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用，其特征在于：小鼠神经干细胞迁移过程中所用DNA四面体浓度为250nM。
CN201810351727.2A 2017-11-22 2018-04-19 Dna四面体在促进小鼠神经干细胞迁移中的应用 Pending CN108546730A (zh)

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