CN117230189A - 一种树状dna探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子检测技术领域，公开了一种树状DNA探针及其制备方法和应用。所述树状DNA探针由三层DNA分子自组装形成；所述三层DNA分子为Y0、Y1、U2；所述Y0和Y1分别由三条DNA单链通过互补的序列形成Y型DNA结构；所述U2由含互补序列的DNA单链通过退火过程形成环形发夹状DNA结构。该树状DNA探针对APE1检测的灵敏度高、特异性强，且反应检测耗时较短，效率较高；树状DNA探针可对活细胞内APE1进行实时追踪检测分析；利用该树状DNA探针检测APE1的条件简单，只需简单的将二者混合，37℃孵育后，利用荧光分析就可检测；树状DNA探针具有良好的生物相容性、低生物毒性与高细胞摄入效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种树状DNA探针及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤作为威胁人类生命健康的重要疾病之一，其发病率及死亡率在我国均呈逐年上升趋势。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)是一种很典型的肿瘤标志物，人血液和组织细胞中APE1浓度的异常变化与各种疾病密切相关，APE1典型过表达在多种人类癌症细胞中，如乳腺癌细胞、肝癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌等。
此外，与正常细胞相比，APE1细胞水平的浓度波动通常发生在易患癌症的患者细胞中、接受化疗药物治疗的患者细胞中以及癌症复发的患者细胞中。因此，对APE1的特异性检测具有重要价值。但是，针对肿瘤标志物APE1常见的各种检测方法很难将高灵敏度和特异性的方法结合，且检测步骤都较为复杂，检测手段的生物相容性和环境友好性不高、受外界环境的影响较大。
因此有必要开发一种树状DNA探针及其制备方法和应用，提高DNA探针对肿瘤标志物APE1的灵敏度、特异性和稳定性，从而实现对肿瘤标志物的胞内实时追踪监测。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种树状DNA探针及其制备方法和应用，提高DNA探针对肿瘤标志物APE1的灵敏度、特异性和稳定性，从而实现对肿瘤标志物的胞内实时追踪监测。
本发明的第一方面提供一种树状DNA探针。
具体的，所述树状DNA探针由三层DNA分子自组装形成；所述三层DNA分子为Y0、Y1、U2；所述Y0和Y1分别由三条DNA单链通过互补的序列形成Y型DNA结构；所述U2由含互补序列的DNA单链通过退火过程形成环形发夹状DNA结构。
优选的，所述Y0由Y0a、Y0b和Y0c组成；所述Y0a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Y0b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Y0c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述Y0a、Y0b和Y0c的5’端被磷酸修饰。
优选的，所述Y1由Y1a、Y1b和Y1c组成；所述Y1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Y1b的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述Y1c的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述Y1a和Y1b的5’端连接荧光基团以及与荧光基团相邻18-22bp的位置具有一个AP位点。
进一步优选的，所述荧光基团为Cy3荧光基团。
进一步优选的，所述荧光基团相邻19-21bp的位置具有一个AP位点。
更进一步优选的，所述荧光基团相邻20bp的位置具有一个AP位点。
优选的，所述Y1b和Y1c的3’端连接淬灭基团；所述Y1c的5’端被磷酸修饰。
进一步优选的，所述淬灭基团为BHQ2淬灭基团。
优选的，所述U2由U20组成；所述U20的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述U20的3’端连接淬灭基团；所述U20的5’端连接荧光基团以及与荧光基团相邻18-22bp的位置具有一个AP位点。
进一步优选的，所述三层DNA分子中，Y1c的3’端以及Y1b的5’端与1个U2连接，同时Y1b的3’端以及Y1a的5’端与1个U2连接，其中Y0的5’端均与Y1a的3’
端连接，Y0的3’端均与Y1c的5’端连接。
本发明的第二方面提供一种树状DNA探针的制备方法。
具体的，包括以下步骤：
将Y0a、Y0b、Y0c与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得Y0；将Y1a、Y1b、Y1c与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得Y1；将U20与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得U2；将Y1与U2混合、离心、加热反应，制得外层DNA分子结构G2；将Y0与外层DNA分子结构G2混合、离心、加热反应，制得树状DNA探针。
优选的，所述Tris缓冲液为Tris-HCL。
进一步优选的，所述Tris-HCL的pH为7.5。
优选的，所述盐溶液为氯化钠溶液。
优选的，所述加热反应为加热至90-100℃反应5min。
优选的，所述冷却的时间为2-10h，冷却至20-30℃。
优选的，所述Y1与U2的摩尔比例为1：1-5。
进一步优选的，所述Y1与U2的摩尔比例为1：1-3。
更进一步优选的，所述Y1与U2的摩尔比例为1：2。
优选的，所述加热反应的温度为45-55℃。
优选的，所述Y0与外层DNA分子结构G2的摩尔比为1：2～6。
进一步优选的，所述Y0与外层DNA分子结构G2的摩尔比为1：2～4。
更进一步优选的，所述Y0与外层DNA分子结构G2的摩尔比为1：3。
优选的，所述加热反应的温度为40-50℃。
本发明的第三方面提供一种树状DNA探针在检测肿瘤标志物APE1中的应用。
具体的，将树状DNA探针与被测样本反应，若被测样本为APE1或者含有APE1的癌细胞(体内或体外)，APE1可以识别树状DNA探针中的特异性结合位点即AP位点，使AP位点处的磷酸二酯键裂解为含3’-羟基和5’-脱氧核糖磷酸盐(dRP)末端的核苷酸缺口。则树状DNA探针结构中含有荧光基团Cy3一侧的DNA短链从树状DNA探针中释放出来，此时Cy3与淬灭基团BHQ2分开，重新显示出高荧光强度。且随着APE1浓度增大，荧光信号进一步增强，直至到探针的最大检测值，即检测出现荧光时，被测样本含有肿瘤标志物APE1。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)树状DNA探针对APE1检测的灵敏度高、特异性强，且反应检测耗时较短，效率较高；
(2)树状DNA探针可对活细胞内APE1进行实时追踪检测分析；
(3)利用该树状DNA探针检测APE1的条件简单，只需简单的将二者混合，37℃孵育后，利用荧光分析就可检测；
(4)树状DNA探针具有良好的生物相容性、低生物毒性与高细胞摄入效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中Y0的制备示意图；
图2为本发明实施例1中Y1的制备示意图；
图3为本发明实施例1中U2的制备示意图；
图4为本发明实施例1中合成外层G2结构的示意图；
图5为本发明实施例1中P-DNA的合成过程示意图；
图6为本发明实施例1中P-DNA合成的聚丙烯酰胺凝胶表征图；
图7为本发明实施例1中APE1与P-DNA孵化后的聚丙烯酰胺凝胶表征图；
图8为本发明实施例1中P-DNA的形貌图；
图9为本发明实施例1中P-DNA与APE1孵化后的形貌图；
图10为本发明实施例1中P-DNA及P-DNA与APE1混合孵育后的荧光光谱图；
图11为本发明实施例1中P-DNA与APE1作用的时间依赖性检测结果图；
图12为本发明实施例1中P-DNA与APE1作用的浓度依赖性检测结果图；
图13为本发明MCF-7细胞的共聚焦显微镜成像结果图；
图14为本发明CKK-8法检测探针的细胞毒性结果分析图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种树状DNA探针。
树状DNA探针由三层DNA分子自组装形成，分别是Y0、Y1、U2。其中Y0和Y1是由三条DNA单链通过互补的序列形成的Y型DNA结构，U2是由含互补序列的单链DNA通过退火过程形成的环形发夹状结构。Y0由Y0a、Y0b和Y0c组成；Y1由Y1a、Y1b和Y1c组成；U2由U20组成；具体的各DNA单链的核苷酸序列及修饰如表1所示。
表1各DNA单链的核苷酸序列及修饰
注：P’表示5’端磷酸修饰；(AP)表示此处含有AP位点；y表示5’端连接有荧光基团Cy3；B表示3’端连接有淬灭基团BHQ2。
该树状DNA探针的制备方法为：
(1)首先通过DNA退火过程合成了三层的制备单元：Y0、Y1、U2。
Y0的制备过程为：
分别取3μL浓度为10μM寡核苷酸单链Y0a、Y0b、Y0c，与6μL 100mM Tris-HCl(pH为7.5)以及3μL 500mM NaCl的混合溶液混合，再加入12μL的H2O，使其总体积为30μL。将混合溶液在恒温金属浴中95℃保温培养5分钟，随后经过3h的缓慢降温冷却到25℃，就可以得到浓度为1μM的Y0，Y0的制备示意图如图1所示。
Y1的制备过程为：
分别取3μL浓度为10μM寡核苷酸单链Y1a、Y1b、Y1c，与6μL 100mM Tris-HCl(pH为7.5)以及3μL 500mM NaCl的混合溶液混合，再加入12μL的H2O，使其总体积为30μL。在恒温金属浴中95℃保温培养5分钟，随后经过3h的缓慢降温冷却到25℃，就可以得到浓度为1μM的Y1，Y1的制备示意图如图2所示。
U2的制备过程为：
取6μL浓度为10μM寡核苷酸单链U20，与12μL100 mM Tris-HCl(pH为7.5)以及6μL500mM NaCl的混合溶液混合，再加入36μL的H2O，使其总体积为60μL。在恒温金属浴中95℃保温培养5分钟，随后经过3h的缓慢降温冷却到25℃，就可以得到浓度为1μM的U2，U2的制备示意图如图3所示。
(2)接着合成外层G2结构(Y1+U2)，合成过程如下：
取5μL浓度为1μM的Y1溶液，再加入10μL浓度为1μM的U2溶液于同一离心管中，使得Y1和U2的摩尔比为1：2。将混合溶液搅拌20s，再离心20s，然后在50℃保温10min，再缓慢降温至室温，整个反应时长3h，得到外层DNA分子结构G2，得到的G2溶液浓度为0.333μM。合成外层G2结构(Y1+U2)的示意图如图4所示。
(3)最后，将Y0与G2室温下自组装得到最终的树状DNA探针(即P-DNA)：
取1μL浓度为1μM的Y0溶液，再加入9μL浓度为0.333μM的G2溶液于同一离心管中，使得Y0和G2的摩尔比为1：3，体积比为1：9。将混合溶液搅拌20s，再离心20s，然后在45℃保温10min，再缓慢冷却至室温，反应总计时长3h，得到P-DNA。得到的P-DNA溶液浓度为0.1μM，摩尔质量为10-3nmol。其中P-DNA的浓度和摩尔浓度可以根据Y0和G2的加入量进行调节。P-DNA的合成过程示意图如图5所示。
结果：
1.利用聚丙烯酰胺凝胶进行P-DNA的合成表征。
方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的表征手段。它以聚丙烯酰胺作为支持介质，具有机械强度大，弹性大，透明，化学性质稳定等特点。其基本原理是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)作用下形成聚丙烯酰胺凝胶。DNA在电泳缓冲液中由于电场的存在，因其磷酸骨架带负电荷，会向电泳正极移动，同时由于凝胶网状结构孔隙大小会对不同分子大小的DNA阻碍作用不同，导致DNA分子在凝胶中的迁移速率不同，最终实现分子量或结构具有差异的DNA分子的分离。本实验中采用了8％的非变形聚丙烯酰胺凝胶。具体来说，称量23.2g丙烯酰胺和0.8g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于烧杯中，加入1×TBE缓冲液(89mmol/L Tris-boric，2mmol/L EDTA，pH 8.2-8.4)定容至300mL制成8％丙烯酰胺溶液备用。向100ml烧杯中加入60ml的8％丙烯酰胺溶液，再加入40μl的TEMED，400μl的10％过硫酸铵。向组装好的玻璃模具中缓慢灌入正在反应的溶液以避免气泡的产生，待溶液充满整个模具后插上梳子后静待1小时凝胶成型。之后向JY600E电泳仪中加入形成的凝胶玻璃板，注入1×TBE缓冲液，随后将样品与6×DNA上样缓冲液(10mmol/L TrisHCl,60mmol/L EDTA，60％Glycerol,pH 7.6,0.05％Bromophenol Blue)混合加入到凝胶孔中。以不超过150V/cm的电压进行电泳2小时。在溴化乙锭溶液中染色20min后在G:BOX iChemi凝胶电泳成像仪上在365nm的波长下拍照成像。
结果如图6所示，由凝胶图可知，P-DNA的合成产率达60％以上。
2.P-DNA与APE1共同孵化后的凝胶表征。
方法：本实验中依旧采用8％的非变形聚丙烯酰胺凝胶。具体来说，称量23.2g丙烯酰胺和0.8g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于烧杯中，加入1×TBE缓冲液(89mmol/L Tris-boric，2mmol/L EDTA，pH 8.2-8.4)定容至300mL制成8％丙烯酰胺溶液备用。向100ml烧杯中加入60ml的8％丙烯酰胺溶液，再加入40μl的TEMED，400μl的10％过硫酸铵。向组装好的玻璃模具中缓慢灌入正在反应的溶液以避免气泡的产生，待溶液充满整个模具后插上梳子后静待1小时凝胶成型。之后向JY600E电泳仪中加入形成的凝胶玻璃板，注入1×TBE缓冲液，随后将样品与6×DNA上样缓冲液(10mmol/L TrisHCl,60mmol/L EDTA,60％Glycerol,pH 7.6,0.05％Bromophenol Blue)混合加入到凝胶孔中。以不超过200V/cm的电压进行电泳2小时。在溴化乙锭溶液中染色20min后在G:BOX iChemi凝胶电泳成像仪上在365nm的波长下拍照成像。
结果如图7所示，由对比的凝胶表征图可以发现，APE1与P-DNA孵化之后，并没有出现条带，证明P-DNA被裂解完全，说明实施例1中P-DNA对APE1有较好的响应性和检测的灵敏度。
3.P-DNA的形貌探测。
利用原子力显微镜(AFM)进行P-DNA的形貌探测，如图8所示，图8的(a)为P-DNA的2D形貌图；(b)为P-DNA的3D形貌图；(c)为P-DNA的颗粒粒径分析图。进一步确认了探针的结构。由原子力显微镜表征得到的形貌图像分析可知，P-DNA形貌较为规则、均一，且树状DNA探针的直径大多集中在27nm左右。该实验数据表明，通过无酶法自组装形成的树状DNA探针可以被简单快速地有效合成。
4.P-DNA与APE1孵化后的形貌探测。
由原子力显微镜表征得到的形貌图像分析可知，如图9所示，图9的(a)为P-DNA被AE1裂解后树状DNA探针粒子的2D形貌图；(b)为P-DNA被AE1裂解后树状DNA探针粒子的3D形貌图；(c)为P-DNA被AE1裂解后树状DNA探针粒子的粒径分析图。P-DNA与APE1共同孵化后，树状DNA探针被APE1裂解，得到的树状DNA探针粒子直径在4.5nm左右。进一步说明实施例1的树状DNA探针可以有效、高效的被APE1识别，即P-DNA可灵敏、高效的检测APE1并与其作用，使树状DNA探针被裂解。
5.P-DNA以及P-DNA与APE1混合孵育后的荧光光谱图对比。
为了证实树状DNA探针在无细胞体系中的预期APE1响应功能，进行了P-DNA与APE1之间的反应，实验中树状DNA探针所用浓度为0.02nM，APE1的用量为0.6U，在37℃反应2h，随后进行荧光光谱分析，结果如图10所示。与单独的P-DNA相比，P-DNA和APE1的反应混合物的荧光强度显著增强，证明实施例1的树状DNA探针的强有效性。原因是P-DNA在未含有APE1的系统中，P-DNA本身结构的特殊性，其中的荧光基团Cy3被相邻碱基处的淬灭基团BHQ2淬灭，因此单独的P-DNA系统中产生荧光信号很小；而含P-DNA的系统中一旦存在APE1，APE1可以特异性识别P-DNA探针中的AP位点，从而产生强荧光信号。
6.P-DNA与APE1作用的时间依赖性检测。
首先进行无细胞体系中P-DNA纳米探针检测APE1的时间条件探索，P-DNA的浓度与APE1的浓度固定，时间梯度设置在0-150分钟范围内。从图11可知，探针与APE1酶作用后产生的荧光强度随作用时间增大而增大，呈线对数型增长。在所研究的时间区间内，在0-80min这一作用时间范围内可认为两者呈线性关系，120min开始，荧光强度达到峰值。因此从实验数据可以确定，探针与APE1酶在无细胞系统中作用的最佳时间是120min。同时，为了排除荧光基团自身在溶液中随时间信号减弱的影响，增加无酶对照组，探针一旦与APE1酶接触，就会产生较强的荧光信号，并随时间的增加，荧光信号强度进一步增大，这说明P-DNA对APE1酶的检测具有较高的灵敏性。
7.P-DNA与APE1作用的浓度依赖性检测。
如图12所示，反应体系的荧光强度随APE1浓度增大而逐渐增大并且在接近理论酶量时荧光强度几乎保持不变，除此之外还可以发现，一旦DNA纳米探针与APE1接触，就会产生区分于纳米探针本身的荧光强度。结合这两点分析表明，实施例1所制备的P-DNA对APE1的检测具有高度灵敏性，可以实现准确的APE1定性研究。
8.共聚焦显微镜下进行细胞成像观察。
MCF-7细胞是人乳腺癌细胞，APE1作为一种肿瘤标志物，在MCF-7细胞中过度表达。利用树状DNA探针(P-DNA，浓度为0.05μM)与MCF-7细胞共同孵育不同的时间(0H，1H，2H，5H，10H)后，在共聚焦显微镜下进行细胞成像观察。Cy3是仅开启Cy3荧光染料波长通道后的显微图像，DIC为微分干涉相称观察到的明场像。Merge为所有图像整合一起后的图片。图13中可以很明显的观察到，大量的荧光出现在细胞周围，且随着孵育时间的增加，荧光强度也进一步加强。说明进入细胞内检测APE1的探针浓度逐渐增加。说明本发明的探针与细胞孵育后，可以较容易地进入细胞，具有高细胞摄入效率。而且随着检测时间的增加，细胞也一直保持着良好的形态。这说明一方面本发明的探针成功进入MCF-7癌细胞且不会对细胞活性造成影响，另一方面我们的探针被癌细胞中过表达的APE1识别捕获。因此，本发明的探针可以追踪人类活细胞内APE1，并对其显示出高灵敏度探测。
9.CKK-8法检测探针的细胞毒性。
由图14可知，不同浓度的探针与MCF-7细胞孵育10H后，细胞的存活率都较高，均接近100％，几乎没有受到影响。
这说明本发明的探针具有低细胞毒性和良好的生物相容性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验所作的任何修改、等同替换、改进等得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种树状DNA探针，其特征在于，所述树状DNA探针由三层DNA分子自组装形成；所述三层DNA分子为Y0、Y1、U2；所述Y0和Y1分别由三条DNA单链通过互补的序列形成Y型DNA结构；所述U2由含互补序列的DNA单链通过退火过程形成环形发夹状DNA结构。
2.根据权利要求1所述的树状DNA探针，其特征在于，所述Y0由Y0a、Y0b和Y0c组成；所述Y0a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Y0b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Y0c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的树状DNA探针，其特征在于，所述Y0a、Y0b和Y0c的5’端被磷酸修饰。
4.根据权利要求1所述的树状DNA探针，其特征在于，所述Y1由Y1a、Y1b和Y1c组成；所述Y1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Y1b的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述Y1c的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求4所述的树状DNA探针，其特征在于，所述Y1a和Y1b的5’端连接荧光基团以及与荧光基团相邻18-22bp的位置具有一个AP位点。
6.根据权利要求4所述的树状DNA探针，其特征在于，所述Y1b和Y1c的3’端连接淬灭基团；所述Y1c的5’端被磷酸修饰。
7.根据权利要求1所述的树状DNA探针，其特征在于，所述U2由U20组成；所述U20的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述U20的3’端连接淬灭基团；所述U20的5’端连接荧光基团以及与荧光基团相邻18-22bp的位置具有一个AP位点。
8.权利要求1至7中任一项所述树状DNA探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Y0a、Y0b、Y0c与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得Y0；将Y1a、Y1b、Y1c与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得Y1；将U20与Tris缓冲液以及盐溶液混合，加热反应，冷却后制得U2；将Y1与U2混合、离心、加热反应，制得外层DNA分子结构G2；将Y0与外层DNA分子结构G2混合、离心、加热反应，制得树状DNA探针。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Y0与外层DNA分子结构G2的摩尔比为1：2～6。
10.权利要求1至7中任一项所述的树状DNA探针在检测肿瘤标志物APE1中的应用。
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