CN100587489C - 荧光标记dna单壁碳纳米管示踪剂及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光标记DNA单壁碳纳米管示踪剂及制备方法和应用。由单壁碳纳米管(SWNTs)、DNA片断和荧光素(FAM等)三部分组成；先用单壁碳纳米管与官能团修饰的DNA片段通过偶合剂共价连接，再与有荧光标记的互补DNA片段杂交，得到带有荧光标记DNA功能化的单壁碳纳米管(SWNTs-dsDNA-FAM)。SWNTs-dsDNA-FAM能进入不同类型的肿瘤细胞，免疫调节细胞以及其他细胞如单核细胞系小鼠巨噬细胞(Raw264.7)，并能显示其进入这些细胞的程度。此示踪剂有良好的稳定性，标记物不易降解，能评价细胞组织器官吸收SWNTs的能力。此示踪剂利用FAM等荧光材料作为显示剂，检测方便，各种荧光显微镜，流式细胞仪都可进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及单壁碳纳米管(SWNTs)的标记，特别是一种荧光标记DNA单壁碳纳米管示踪剂及制备方法和应用，具体说就是用荧光材料连接单股DNA片断，然后通过与已经连接到SWNTs上的互补序列的单股DNA进行杂交，从而制备荧光标记DNA功能化的SWNTs(SWNTs-dsDNA-FAM)。荧光标记的SWNTs可用于检测其进入不同种类细胞的能力，可被用于检测功能化的SWNTs在体内的生物分布，这对研究碳纳米管的生物用途，如作为载体靶向特殊细胞等纳米在生物应用领域具有重要意义。
背景技术
SWNTs直径约为1.0～2.0nm，长度在几十纳米到几百微米之间，具有很好的导电性，导热性和机械性能，并可进行化学修饰，它的应用已经渐渐的扩展到生物学领域。碳纳米管可被蛋白质，核酸，糖基等一些生物大分子功能化，从而增加其水溶性。这些功能化的碳纳米管毒性低，水溶性强，能够穿透哺乳类动物的细胞。这些特点赋予碳纳米管在生物医药领域具有广泛的潜在应用，尤其是能够用作化学药物和生物药物的载体，还可以用于包括疫苗传递在内的一些治疗。但是研究也发现，碳纳米管进入不同类型细胞的能力是不同的，这就需要用一种方法来标记碳纳米管，检测这些碳纳米管在不同细胞的穿透能力。几个国外实验室已通过应用荧光材料标记的方法评价了碳纳米管进入细胞的能力。如Dai Hongjie等人(J.Am.Chem.Soc.2005，127，6021-6026.PNAS，2005，102，11600-11605.J.Am.Chem.Soc.2005，127，12492-12493.)利用一种带有氨基的聚乙烯醇2000磷脂分子先对SWNTs进行包裹，得到分散性能很好的SWNTs，再用一种双官能团偶合剂连接带有荧光标记的DNA或短的双链RNA，研究了它们在细胞内的分布。我们发展了一种独特的荧光标记DNA功能化的单壁碳纳米管，这种标记的碳纳米管可作为示踪剂显示碳纳米管进入组织细胞的能力。这对研究碳纳米管的生物分布和生物用途具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光标记DNA单壁碳纳米管示踪剂及制备方法和应用。用荧光基团标记单壁碳纳米管来制备单壁碳纳米管示踪剂，并且检测其进入不同细胞的能力，这为确定单壁碳纳米管的生物分布奠定了基础。此示踪剂利用荧光素(FAM)等荧光材料作为显示剂，检测方便，各种荧光显微镜，流式细胞仪都可进行检测。
本发明首先在单股DNA上修饰氨基(NH2-)，通过与氧化的SWNTs上的羧基(COOH-)形成酰胺键，将单股DNA以共价键连接到SWNTs，再与有荧光标记的补偿DNA杂交，从而制备出水溶性很好的带有荧光标记的DNA功能化的SWNTs示踪剂。用此示踪剂与不同类型的肿瘤细胞(如鼠肺癌细胞，鼠宫颈癌细胞，鼠卵巢癌细胞)相互作用。显示了不同肿瘤细胞吸收SWNTs的能力。直接肿瘤组织内注射SWNTs-dsDNA-FAM，肿瘤组织也能对其吸收。该示踪剂与免疫调节细胞成熟树突细胞，未成熟树突细胞孵育，显示碳纳米管能进入这些细胞。动物注射荧光标记的碳纳米管，不同组织与细胞也显示了不同程度的吸收。鼠脾免疫调节Gr-1+CD11b+细胞趋向吸收尾静脉注射的SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂。
本发明提供的荧光标记DNA单壁碳纳米管示踪剂是由单壁碳纳米管(SWNTs)、双链DNA片断(dsDNA)和荧光基团构成。例如可表示为：SWNTs-dsDNA-FAM(荧光素)。
所述的单壁碳纳米管是管径为1.0～2.0nm，长度为10nm～100μm的单壁碳纳米管。
所述的双链DNA片断是带有六个或七个亚甲基氨基修饰的2个-1000个碱基中的至少一种的DNA片断。例如：5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH23’或
5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)7-NH23’。
所述的荧光基团是补偿DNA片断中的荧光基团：FAM、TET、HEX、TAMRA、Rox、Dabcyl、Cy5或Cy3荧光素中的至少一种，且可接到3’端或5’端。
本发明碳单壁纳米管示踪剂的制备方法包括如下步骤：荧光标记的DNA功能化的单壁碳纳米管的制备：
1)将SWNTs(采用电弧法制备)在硝酸或盐酸溶液中超声分散1-2h，并回流24-48h，离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去Triton X-100。
2)纯化后的SWNTs在混酸(浓硝酸∶浓硫酸＝1∶3)中超声3-5h，水洗去酸液。
3)将切割氧化后SWNTs在含有偶合剂的0.2％Triton X-100中，调节pH＝6.0值，超声2h，再室漏搅拌一夜，将反应液用碱液调pH＝8.5，将氨基修饰的DNA片断加入，水浴超声3h或不超声，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物双链DNA-SWNTs；
所述的双链DNA片断是带有六个或七个亚甲基氨基修饰的2个-1000个碱基中的至少一种的DNA片断。
所述的SWNTs与偶联剂的重量比是1∶200；所述的SWNTs与双链DNA片断重量比为3∶1。
4)将DNA功能化的双链DNA-SWNTs与带有荧光标记的互补DNA片断的荧光基团同时加入沸水中杂交反应，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次，得到带有荧光标记DNA功能化的碳纳米管。或
杂交反应在恒温30℃至50℃之间于0.05M磷酸缓冲溶液，pH＝7.0，0.025M NaCl中进行反应2h，然后用Mili-Q水洗两次。
所述的互补DNA片断中的荧光基团：FAM、TET、HEX、TAMRA、Rox、Dabcyl、Cy5或Cy3荧光素中的至少一种，且可接到3’端或5’端。
所述的偶合剂为1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亚酰胺(1-ethyl-3(3-dimethyamino-propyl)carbodiimide(EDC))及其盐酸盐，1，3-二环己基碳二亚酰胺(1，3-dicyclohexylcarbodi-imide(DCC))及其盐酸盐，1，3-二异丙基碳二亚酰胺(1，3-diisopropylcarbodi-imide(DIC))及其盐酸盐，1，3-二己基碳二亚酰胺(1，3-dihexylcarbodi-imide(DHC))及其盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide(NHS))及其钠盐，N-羟基磺酸琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS))及其钠盐，1-羟基苯并三唑一水物(1-hydroxybenzotriazole hydrate(HOBt))中的一种或多种。
所述的单壁碳纳米管示踪剂的制备方法得到的DNA功能化的SWNTs：Cp5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH-OC-SWNTs。
本发明所述的单壁碳纳米管示踪剂的应用，它应用于评价组织器官的单壁碳纳米管分布的示踪剂。它应用于单壁碳纳米管进入癌细胞程度检测的示踪剂。
本发明提供了一种用来证明修饰的SWNTs可以不同程度的进入不同细胞的有力工具，该方法按如下步骤进行：荧光标记DNA功能化的SWNTs(SWNTs-dsDNA-FAM)评估.透射电镜，荧光光谱，原子力显微镜用于证实荧光基团(FAM)标记的DNA功能化的单壁碳纳米管。
荧光标记的DNA功能化的SWNTs(SWNTs-dsDNA-FAM)用于评价其进入不同细胞的能力：
1)SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与培养于24孔板的鼠肺癌细胞，鼠宫颈癌细胞，鼠卵巢癌细胞共同孵育。4小时后通过荧光显微镜与流式细胞仪检测该荧光复合物进入的程度。这些细胞被培养在含有10％小牛血清与1％青/链霉素的RPMI1640培养基中。
2)SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，6小时后取出肿瘤组织的肿瘤细胞，进行荧光显微镜和流式细胞仪分析。
3)SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，4小时后通过荧光显微镜与流式细胞仪检测FAM复合物进入的程度。这些树突细胞培养在含有1000单位粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和1000单位白介素-4(IL-4)的RPMI1640全培养基中。
4)直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，6小时后，取脾细胞，用荧光显微镜与流式细胞仪分析免疫调节细胞CD11b+对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。
5)直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到植入卵巢癌细胞的小鼠体腹腔内，取脾细胞，用荧光显微镜与流式细胞仪分析脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。2×107卵巢癌细胞被注入小鼠腹腔，2个月后，随着肿瘤细胞的生长，小鼠脾脏也逐渐增大，脾细胞群分析显示了大多数小鼠脾细胞为Gr1+CD11b+的免疫调节细胞。这些植入卵巢肿瘤的大鼠脾被注入SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)，6小时后分析SWNTs-dsDNA-FAM在Gr1+CD11b+细胞内的分布。
本发明具有如下特点：
此荧光标记的DNA功能化的SWNTs示踪剂稳定，分散性能好，具有荧光标记，可进入细胞用来评价单壁碳纳米管进入不同细胞的能力。作为单壁碳纳米管进入不同细胞的示踪剂为开发以SWNTs做为药物或基因载体的临床治疗方法提供了研究工具。此示踪剂有良好的分散性和稳定性，标记物不易降解，不仅能评价体外培养细胞吸收SWNTs的能力，更重要的是能够用于体内评价SWNTs在不同组织器官的分布。此示踪剂利用FAM等荧光材料作为显示剂，检测方便，各种荧光显微镜，流式细胞仪都可进行检测。
附图说明：
图1FAM标记的DNA与单壁碳纳米管的连接。
图2鼠肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂的吸收。
图3当SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂被注射入肿瘤组织内，肿瘤细胞对它的吸收。
图4免疫调节细胞趋向吸收SWNTs-dsDNA-FAM。
图5尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM到植入卵巢癌细胞的小鼠体内，小鼠脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞的吸收。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明的特征，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，本发明并不局限于下述实例。本发明技术的公开，对于本领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
本发明使用的透射电镜配备电子能谱(FEI，TECNAI-20)，分光光度计(Eppendorf，AGbiophotometer)，原子力显微镜(Veeco，Nanoscope IV)，流式细胞仪(BD FACScalibur)。
各种试剂的纯度：均为分析纯。SWNTs的氧化使用的混酸是浓酸。
实施例1：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在70mL 2.6M硝酸中超声分散1h，再回流24h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去TritonX-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(浓硝酸∶浓硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声3h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM EDC，100mM sulfo-NHS，100mM 2-吗啉乙磺酸单酯(2-Morpholinoethanesulfomic acidMonohydrate(MES))(pH＝6.0)的0.2％Triton X-100中超声2h，再室温搅拌一夜，将反应液用8M氢氧化钠(NaOH)调到pH＝85，将5μM DNA加入，水浴超声3h，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物，Cp5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH23’-SWNTs复合物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光素(FAM)标记的补偿DNA(FAM-DNA)的杂交：
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH2 3’-SWNTs与带有FAM的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM同时加入沸水中，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，FAM-DNA的杂交通过荧光光谱证实(图1)。图1FAM标记的DNA与单壁碳纳米管的连接。
A：DNA(5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH2 3’)功能化的SWNTs的透射电镜照片。
B：DNA功能化的SWNTs分别与FAM标记的DNA(c-DNA：5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM)和互补DNA(n-DNA：5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATI-CA-3’-FAM)杂交后的荧光光谱，在467nm激发，516nm为FAM的特征峰。
C：DNA功能化的SWNTs的原子力显微镜照片，箭头指示了SWNTs与DNA的连接。
5)检测SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力(图2)。图2鼠肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。
A：鼠肺癌肿瘤细胞(LCC)与SWNTs-dsDNA-FAM孵育4h后，通过荧光显微镜分析。
A1：光镜下的鼠肺癌肿瘤细胞(LCC)。
A2：转染对照，鼠肺癌肿瘤细胞(LCC)与无FAM标记的dsDNA连接的SWNTs孵育或与仅FAM标记的dsDNA孵育。
A3：SWNTs-dsDNA-FAM转染鼠肺癌肿瘤细胞(LCC)的荧光显微镜分析。
A4：SWNTs-dsDNA-FAM转染鼠肺癌肿瘤细胞(LCC)的流式细胞分析。
a：未经转染的细胞；b：SWNTs-dsDNA-FAMDNA转染的细胞。
B：宫颈癌细胞(TC-1)与SWNTs-dsDNA-FAM孵育4h后，通过荧光显微镜分析。
B1：光镜下的宫颈癌细胞(TC-1)。
B2：转染对照，宫颈癌细胞(TC-1)与无FAM标记的dsDNA连接的SWNTs孵育或仅FAM标记的dsDNA。
B3：SWNTs-dsDNA-FAM转染宫颈癌细胞(TC-1)的荧光显微镜分析。
B4：SWNTs-dsDNA-FAM转染宫颈癌细胞(TC-1)的流式细胞分析。a：未经转染的细胞；b：FAM标记的DNA功能化的SWNTs转染的细胞。
C：卵巢癌细胞(1H8)与SWNTs-dsDNA FAM孵育4h后，通过荧光显微镜分析。
C1：光镜下的卵巢癌细胞(1H8)。
C2：转染对照，卵巢癌细胞(1H8)与无FAM标记的dsDNA连接的SWNTs孵育或仅FAM标记的dsDNA。
C3：SWNTs-dsDNA-FAM转染鼠卵巢癌细胞(1H8)的荧光显微镜分析。
C4：SWNTs-dsDNA-FAM转染鼠卵巢癌细胞(1H8)的流式细胞分析。a：未经转染的细胞；b：SWNTs-dsDNA-FAM转染的细胞。
B.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(图3)。图3SWNTs-dsDNA-FAM注入肿瘤组织，肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM吸收。
A1，A2和A3注射dsDNA功能化的SWNTs或FAM标记的DNA肿瘤组织的肿瘤细胞。
B1，B2和B3注射SWNTs-dsDNA-FAM的肿瘤组织的肿瘤细胞。
A1和B1：光镜下肿瘤细胞。
A2和B2：荧光显微镜下鼠肺癌细胞，B2显示了肺癌细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。
A3和B3是相应的流式细胞仪分析：
A3：a：未注射任何试剂的肿瘤组织的肿瘤细胞对照。b：仅注射dsDNA功能化的SWNTs或FAM标记的DNA肿瘤组织的肿瘤细胞。
B3：a：未注射任何试剂的肿瘤组织的肿瘤细胞对照。b：注射SWNTs-dsDNA-FAM肿瘤组织的肿瘤细胞。
C.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力(图4)。
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力(图4)。图4免疫调节细胞趋向吸收SWNTs-dsDNA-FAM。
A：未成熟树突细胞(imBMDC)对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。
A1：光镜下未成熟的树突细胞。
A2：未成熟的树突细胞与dsDNA功能化的SWNTs或FAM标记的DNA。
A3：荧光显微镜下SWNTs-dsDNA-FAM转染的未成熟的树突细胞。
A4：SWNTs-dsDNA-FAM转染的未成熟树突细胞流式细胞仪分析。
a：未经处理的细胞；
b：SWNTs-dsDNA-FAM转染的未成熟树突细胞。
B：成熟树突细胞(mBMDC)对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。
B1：光镜下成熟的树突细胞。
B2：成熟的树突细胞与dsDNA功能化的SWNTs或FAM标记的DNA。
B3：荧光显微镜下SWNTs-dsDNA-FAM转染的成熟的树突细胞。
B4：SWNTs-dsDNA-FAM转染的成熟的树突细胞的流式细胞仪分析。
a：未经处理的细胞；
b：SWNTs-dsDNA-FAM转染的未成熟与成熟的树突细胞。
C：FAM标记的DNA功能化的SWNTs尾静脉注射后不同群细胞的吸收。
C1：R1区(大细胞群：免疫调节细胞)分析(C1.1)；R2(小细胞群：T或B淋巴细胞)分析(C1.2)。
C2：FAM标记的DNA功能化的SWNTs尾静脉注射后6h大细胞群免疫调节细胞的吸收。
C2.1：光镜下的群细胞。C2.2：荧光显微镜分析。
D：SWNTs-dsDNA-FAM尾静脉注射后6h CD11b+细胞的吸收。FL1:FAM的荧光强度。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(图5)。图5尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM到植入卵巢癌细胞的小鼠体内，小鼠脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞的吸收。
A1：对照组，仅注射SWNTs或FAM标记的DNA。
A2：实验组，注射SWNTs-dsDNA-FAM细胞。
B：尾静脉注射dsDNA功能化的SWNTs对照或FAM标记的DNA功能化的SWNTs鼠脾细胞分析。FL1:FAM的荧光强度。
实施例2：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在150mL 36.5％盐酸中超声分散2h，再回流48h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去Triton X-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(浓硝酸∶浓硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声5h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM EDC，100mMsulfo-NHS，100mM MES(pH＝6.0)的0.2％Triton X-100中超声2h，再室温搅拌一夜，将反应液用8M NaOH调到pH＝8.5，将5μM DNA加入，水浴超声3h，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光素(FAM)标记的补偿DNA(FAM-DNA)的杂交：
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH23，-SWNTs与带有荧光基团Cy5的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM同时加入沸水中，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，与FAM-DNA的杂交通过荧光光谱证实。(类似于实例一中的图一，只是电镜照片中的SWNTs稍短)
5)检测SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力。(类似于实例一中的图二)。
B.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。(类似于实例一中的图三)。
C.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力。(类似于实例一中的图四)
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力。(类似于实例一中的图四)。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收。(类似于实例一中的图五)
实施例3：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在70mL 2.6M硝酸中超声分散1h，再回流24h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去TritonX-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(浓硝酸∶浓硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声3h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM HOBt，100mM MES(pH＝6.0)的0.2％Triton X-100中超声2h，再室温搅拌一夜，将反应液用8M NaOH调到pH＝8.5，将5μM DNA加入，水浴超声3h，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光素(FAM)标记的补偿DNA(FAM-DNA)的杂交：
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH2 3’-SWNTs与带有FAM的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM同时加入沸水中，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，与FAM-DNA的杂交通过荧光光谱证实(类似于实例一中的图一)。
5)检测SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力(类似于实例一中的图二)。
B.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图三)。
C.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力(类似于实例一中的图四)。
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力(类似于实例一中的图四)。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图五)。
实施例4：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在70mL 2.6M硝酸中超声分散1h，再回流24h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去Triton X-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声5h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM EDC，100mMsulfo-NHS，100mM MES(pH＝6.0)的0.2％Triton X-100中超声1h，再室温搅拌一夜，将反应液用8M NaOH调到pH＝8.5，将5μM DNA加入，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用Mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光素(FAM)标记的补偿DNA(FAM-DNA)的杂交：
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH2 3’-SWNTs与带有FAM的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM同时加入沸水中，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，与FAM-DNA的杂交通过荧光光谱证实(类似于实例一中的图一，只是电镜照片中的SWNTs稍短)。
5)检测SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力(类似于实例一中的图二)。
B.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图三)。
C.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力(类似于实例一中的图四)。
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力(类似于实例一中的图四)。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图五)。
实施例5：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在70mL 2.6M硝酸中超声分散1h，再回流24h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去Triton X-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声5h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM EDC，100mMsulfo-NHS，100mM 2-Morpholinoethanesulfomic acid Monohydrate(MES)(pH＝6.0)的0.2％Titon X-100中超声1h，再室温搅拌-夜，将反应液用8M NaOH调到pH＝8.5，将5μM DNA加入，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用Mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光基团(Cy5)标记的补偿DNA(Cy5-DNA)的杂交：
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH23’-SWNTs与带有FAM的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-Cy5同时加入沸水中，再冷至4℃，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，与Cy5-DNA的杂交通过荧光光谱证实。(类似于实例一中的图一，只是电镜照片中的SWNTs稍短，荧光光谱是667nm激发，690nm左右为特征峰)。
5)检测SWNTs-dsDNA-Cy5示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-Cy5(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力(类似于实例一中的图二)。
B.SWNTs-dsDNA-Cy5(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图三)。
C.SWNTs-dsDNA-Cy5(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力(类似于实例一中的图四)。
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-Cy5(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力(类似于实例一中的图四)。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-Cy5的吸收(类似于实例一中的图五)。
实施例6：
1)SWNTs的纯化、切割和氧化：
0.5g SWNTs(采用电弧法制备)在70mL 2.6M硝酸HNO3中超声分散1h，再回流24h，然后离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的Triton X-100洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去Triton X-100。纯化的SWNTs进一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg纯化的SWNTs在400mL混酸中超声5h，然后用蒸馏水洗去酸液。
2)SWNTs用氨基修饰的单股DNA功能化：将0.5mg氧化的SWNTs在5mL含有100mM EDC，100mM sulfo-NHS，100mM MES(pH＝6.0)的0.2％Triton X-100中超声1h，再室温搅拌一夜，将反应液用8M NaOH调到pH＝8.5，将5μM DNA加入，再室温搅拌一夜，产品在14000r下离心1h，弃去下层固体，上层溶液再在14000r下离心5h，下层固体用Mili-Q离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物。
3)氨基修饰的单股DNA功能化的SWNTs与用荧光素(FAM)标记的补偿DNA(FAM-DNA)的杂交；
将DNA功能化的SWNTs Cp 5’-TAA-ATA-CCA-TTA-AAA-ATG-CA-(CH2)6-NH23’-SWNTs与带有FAM的DNA片断5’-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’-FAM同时加入37℃杂交底液(0.05M磷酸缓冲溶液，pH＝7.0，0.025M氯化钠)中杂交2h，然后用Mili-Q水洗两次。
4)DNA功能化的SWNTs通过透射电镜和原子力显微镜证实，与FAM-DNA的杂交通过荧光光谱证实(类似于实例一中的图一，只是电镜照片中的SWNTs稍短)。
5)检测SWNTs-dsDNA-FAM示踪剂进入不同细胞的能力：
A.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)与不同类型肿瘤细胞孵育，显示其进入这些不同肿瘤细胞的能力(类似于实例一中的图二)。
B.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)直接注入鼠肺癌组织，显示肿瘤细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图三)。
C.SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为2nM)分别与成熟树突细胞，未成熟树突细胞共同孵育，显示其进入这些免疫调节细胞的能力(类似于实例一中的图四)。
D.直接尾经脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到健康小鼠体内，显示鼠脾免疫调节细胞吸收示踪剂的能力(类似于实例一中的图四)。
E.直接尾静脉注射SWNTs-dsDNA-FAM(100μl，DNA终浓度为10nM)到患有卵巢癌肿瘤的小鼠体内，显示脾Gr1+CD11b+免疫调节细胞对SWNTs-dsDNA-FAM的吸收(类似于实例一中的图五)。
Claims (3)
1、一种荧光标记DNA单壁碳纳米管示踪剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将电弧法制备的单壁碳纳米管在硝酸或盐酸溶液中超声分散1-2小时，并回流24-48小时，离心洗去酸液，再分别用1.1％和0.2％的表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚洗涤，过膜收集固体，最后用蒸馏水洗去聚乙二醇辛基苯基醚；
2)纯化后的单壁碳纳米管在浓硝酸与浓硫酸为1∶3的混酸中超声3-5小时，水洗去酸液；
3)将切割氧化后单壁碳纳米管在含有偶合剂的0.2％聚乙二醇辛基苯基醚中，调节pH＝6.0，超声2小时，再室温搅拌一夜，将反应液用碱液调pH＝8.5，将氨基修饰的DNA片断加入，水浴超声3小时或不超声，再室温搅拌一夜，产品在14000转/分钟下离心1小时，弃去下层固体，上层溶液再在14000转/分钟下离心5小时，下层固体用超纯水离心洗涤四次，离心得到固体功能化产物双链DNA和单壁碳纳米管的共价键复合物；
所述的双链DNA片断是带有六个或七个亚甲基氨基修饰的2个-1000个碱基中的至少一种的DNA片断；
所述的单壁碳纳米管与偶合剂的重量比是1∶200；所述的单壁碳纳米管与双链DNA片断重量比是3∶1；
4)将DNA功能化的单壁碳纳米管与带有荧光标记的互补DNA片断同时加入沸水中进行杂交反应，再冷至4℃，然后用超纯水洗两次，得到带有荧光标记DNA功能化的单壁碳纳米管；或
杂交反应在恒温30℃至50℃之间于0.05摩尔/升磷酸缓冲溶液，pH＝7.0，0.025摩尔/升氯化钠中进行反应2小时，然后用超纯水洗两次；
所述的偶合剂为1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亚酰胺及其盐酸盐，1，3-二环己基碳二亚酰胺及其盐酸盐，1，3-二异丙基碳二亚酰胺及其盐酸盐，1，3-二己基碳二亚酰胺及其盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺及其钠盐，N-羟基磺酸琥珀酰亚胺及其钠盐，1-羟基苯并三唑一水物中的一种或多种。
2.权利要求1所述方法制备的单壁碳纳米管示踪剂，应用于评价组织器官的单壁碳纳米管分布的示踪剂。
3.权利要求1所述方法制备的单壁碳纳米管示踪剂，应用于评价单壁碳纳米管进入癌细胞的程度的示踪剂。
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