CN112345513A - 基于熵驱动转录因子电化学发光生物传感器构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供探针组，所述探针组为探针组，其特征在于，所述探针组包括；第一探针，由3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.5所示；第二探针，由2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示；第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该探针组可以用于构建电化学发光生物传感器，得到的电化学发光生物传感器能够特异性好、灵敏度高的检测NF‑κB。

Description

基于熵驱动转录因子电化学发光生物传感器构建及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于熵驱动转录因子电化学发光生物传感器构建及应用。
背景技术
检测转录因子的传统方法包括电泳迁移率迁移测定(EMSA)，DNA足迹，蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。其中EMSA，DNA足迹和Western blot仅能分析转录的表达半定量因素，并且存在诸如耗时且繁琐的操作之类的问题。尽管ELISA可以实现高通量定量检测，但是为了鉴定具有双链DNA结合能力的转录因子，经常需要昂贵的特异性抗体，成本高并且分析灵敏度低。
近年来，转录因子的检测策略主要包括荧光法，电化学法和比色法。在所有这些方法中，电化学发光(ECL)由于其高灵敏度而引起了越来越多的关注。ECL作为一种新型的生命分析方法，由于其在时间和空间上的可控性，操作简便、成本低、灵敏度高和背景低等优点，引起临床诊断越来越受到重视。在各种ECL发光系统中，三(2,2'-联吡啶)钌(II)(Ru(bpy)3 2+)具有可再现性等优点，并且其衍生物通常用于ECL发光体。但是，由于Ru(bpy)3 2+的ECL系统在均相溶液中消耗的发光物质更多，因此检测成本增加，测定系统不稳定，并且ECL效率也受到限制。
如今，随着纳米技术的发展，研究人员致力于结合Ru(bpy)3 2+和纳米技术的新型ECL发光体的研究。通常，存在于纳米材料中的Ru(bpy)3 2+衍生物主要分为两类。一类是Ru(bpy)3 2+衍生物作为吸附分子，通过静电吸附、配位相互作用、交联和物理掺杂等方式掺杂到纳米材料中，其基本载体为脂质体，二氧化硅，量子点，贵金属纳米材料和3D金属有机框架(MOF)。然后将Ru(bpy)3 2+衍生物和其他载体纳米材料的复合材料用作ECL发光体，以制造ECL生物传感器，并为生物分析和临床诊断提供基础。虽然，材料修饰过程麻烦、繁琐，但是该过程为发光体提供了巨大的表面积，并极大地提高了发光分子发射强度。另外一类是Ru(bpy)3 2+衍生物作为前体分子，用于合成各种形态的纳米材料。例如，Chen等人制备的聚乙烯亚胺-钌(PEI-Ru)复合物是制备空心多孔聚合物纳米球(Ru-HPNSs)前体材料，该纳米球还可用作ECL发光体，用于制备粘蛋白1分析的超灵敏适体传感器。通过溶剂蒸发诱导的自组装过程，以Ru(bpy)3(PF6)2为原料合成了具有极高ECL强度的Ru(bpy)3 2+纳米线。这些中空的多孔或低维纳米结构具有更高的特异性，可以减少无效物质的吸附。通常，与不与其他纳米载体复合的传统方法相比，以Ru(bpy)3 2+衍生物为反应组分合成的纳米复合材料可以增加Ru(bpy)3 2+衍生物固定量并有效防止发光体泄漏。因此，期望的是，ECL纳米复合材料具有优异的稳定性，宽的比表面积以及较强的稳定性。
DNA纳米机器是指一类类似于机器功能的生物分子组件。1982年，Seeman首次开创了DNA纳米机器技术的研究领域。Rothemund的团队在2006年构建了DNA折纸技术，并组装了“笑脸”，“五角星”和其他形状。Zhou等人构造了一种新型的光响应纳米机器，该纳米机器的靶DNA底物链具有两个“臂”结构。这种新构建的纳米机器还可以在体内用于通过反义策略调节基因表达，或者在体外用于切换纳米机器人的机械运动。由于核酶(DNAzyme)的高特异性，并且不需要额外的蛋白酶来裂解，因此可以广泛用于核酸检测。Wang等提出了一种独特而强大的DNA纳米机，它将串联链置换反应与DNA分子机相结合，实现了DNA的检测。添加目标DNA会触发链置换反应并生成大量DNAzyme，被称为DNA Walker。当DNAzyme在金电极上行走时，许多底物DNA被切割，电化学信号发生变化。
DNA纳米机器也有许多重要的优势。例如，通过化学方法获得的DNA寡核苷酸作为其组成成分，可以通过简单的技术方法进行修饰，这使得DNA纳米机器易于构建和表征。另外，DNA序列可以自由设计，因此，可以成功实现基于特定碱基配对的各种DNA纳米结构的组装，因此可以根据检测需要设计纳米机。
发明内容
本发明提供一种检测转录因子电化学发光生物传感器的制备方法及其应用，应用该传感器检测转录因子的方法不需要严格的温度控制过程，并且具有易于操作和表面标记的特点，因此可以用于转录因子的高通量检测和相关药物的分析。不仅实现了转录因子的超灵敏检测，而且为解决与转录因子相关疾病通路提供了思路。
探针组，所述探针组包括：
第一探针，由3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子核苷酸序列如SEQID NO.3-SEQ ID NO.5所示；
第二探针，由2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选地，各条探针单独包装。
一种检测转录因子的试剂或试剂盒，包括上述的探针组。
试剂或试剂盒还包括核酸外切酶III。
一种生物传感器，包括上述的第一探针。
一种检测转录因子的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)Ru(dcbpy)3 2+和金纳米颗粒修饰聚乙烯亚胺(PEI)改性氧化石墨烯(GO)，制备得到发光体；
2)将发光体吸附到玻碳电极上，得到吸附发光体的玻碳电极；
3)吸附发光体的玻碳电极上的金纳米颗粒与第一探针连接，得到生物传感器；所述第一探针由DNA3、DNA4和DNA5互补杂交得到；DNA3为SEQ ID NO.3的单链DNA分子，DNA4为SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子，DNA5为SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子。
可选地，Ru(dcbpy)3 2+为三(4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶)钌(II)二氯化物，
三(4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶)钌(II)二氯化物、GO-PEI和金纳米颗粒的质量比为1:1:0.1。
可选地，在上述步骤2)中，发光体通过静电作用吸附到玻碳电极。
可选地，在上述步骤3)中，吸附发光体的玻碳电极上的金纳米颗粒通过与第一探针上修饰的巯基形成Au-S键连接；可选地，DNA3为SEQ ID NO.3的5’端修饰巯基得到的单链DNA分子。
可选地，第一探针的制备方法包括如下步骤：
1)将浓度相同的DNA3、DNA4和DNA5溶液与含有氯化镁和三(2-羧乙基)膦(TCEP)的缓冲液混匀，孵育，形成DNA混合物溶液；氯化镁的浓度为5.0μM，TCEP的浓度为0.1mM；
2)将步骤1)中得到的DNA混合物溶液加热至90-95℃，冷却至室温，形成第一探针。
每次修饰后，用缓冲溶液冲洗玻碳电极，以去除未被特异性吸附的物质；
可选地，修饰有发光体的玻碳电极与第一探针连接后，还包括将得到的生物传感器加入含巯基己醇溶液的步骤，以阻止非特异性吸附。
具体为杂交的DNA/GO-Au-Ru/GCE浸入含巯基己醇的缓冲溶液，发生封闭反应，并使第一探针垂直指向GCE表面。
上述的探针组、上述的试剂或试剂盒、上述的生物传感器或上述生物传感器的制备方法得到的生物传感器在检测转录因子中应用。
一种检测转录因子的方法，包括利用上述的探针组、上述的试剂或试剂盒、上述的生物传感器、上述方法制备得到的生物传感器检测转录因子。
可选地，包括如下步骤：
1)将第二探针溶液与待测样品混合，在室温下孵育30-60分钟；
2)将1)孵育后的溶液中加入外切酶III对DNA2进行消化，于25-37℃反应5分钟，后停止外切酶III消化；
3)将权利要求4或5中制备得到的生物传感器加入2)的溶液中，25-37℃孵育15-40分钟；
4)将修饰有淬灭基团的第三探针加入3)中的溶液中，室温孵育2小时；得到处理后的生物传感器；
5)将处理后的生物传感器进行ECL测试；根据测试结果确定待测样品中转录因子的浓度。
可选地，所述修饰有淬灭基团的第三探针为银纳米簇修饰第三探针；所述第三探针为SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子。
可选地，上述检测方法中，加入50微升浓度为10μM第二探针溶液，50微升浓度为2UL-1的Exo III，60μL浓度为30μM/mL的修饰有银纳米簇的第三探针；第二探针溶液、待测样品、核酸外切酶III和修饰有银纳米簇的第三探针形成180微升反应体系。
所述转录因子为NF-κB，可选地，为NF-κB p50。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供探针组，探针组，所述探针组包括：第一探针，由3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所示；第二探针，由2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2所示；第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该探针组可以用于构建电化学发光生物传感器，得到的电化学发光生物传感器能够特异性好、灵敏度高的检测NF-κB。
2、本发明的检测转录因子的方法，不需要严格的温度控制过程，并且具有易于操作和表面标记的特点，因此可以用于转录因子NF-κB的高通量检测和相关药物的分析。不仅实现了转录因子的NF-κB超灵敏检测，而且为解决与转录因子相关疾病通路提供了思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是电化学生物传感器的构建示意图；
图2循环伏安法(CV)表征电化学生物传感器的构建；横坐标为电位(V)，纵坐标为电流(μA)；a-f分别代表a裸电极(GCE)，b发光体修饰后GOAu-Ru/GCE，c杂交DNA探针修饰后hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，d MCH修饰后MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，e DNA1修饰后DNA1/MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE后，f DNA6修饰银纳米簇加上去后形成的DNA6-AgNCs/DNA1/MCH/hybrid DNA/GO-Au-Ru/GCE；
图3电化学阻抗图谱(EIS)表征电化学生物传感器的构建；横坐标实部阻抗(Ω)，纵坐标虚部阻抗(Ω)；a-f分别代表a裸电极(GCE)，b发光体修饰后GOAu-Ru/GCE，c杂交DNA探针修饰后hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，d MCH修饰后MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，e DNA1修饰后DNA1/MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE后，f DNA6修饰银纳米簇加上去后形成的DNA6-AgNCs/DNA1/MCH/hybrid DNA/GO-Au-Ru/GCE；
图4电化学发光表征电化学生物传感器的构建；横坐标电势(V)，纵坐标ECL强度(a.u.)；a-f分别代表a裸电极(GCE)，b发光体修饰后GOAu-Ru/GCE，c杂交DNA探针修饰后hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，d MCH修饰后MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，e DNA1修饰后DNA1/MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE后，f DNA6修饰银纳米簇加上去后形成的DNA6-AgNCs/DNA1/MCH/hybrid DNA/GO-Au-Ru/GCE；
图5基于熵驱动反应的电化学发光生物传感器用于NF-κB p50超灵敏检测示意图；
图6ECL强度随着靶标物之浓度的变化关系；
图7ECL强度与靶标浓度的线性关系；
图8不同蛋白质下的该生物传感器的淬灭效率；
图9连续扫描8个循环下的ECL强度；
图10GOAu-Ru的透射电子显微镜(1400PLUS，日本电子)表征；
图11GO-PEI与GOAu-Ru的红外谱(Thermo Fisher Nicolet iS5)图；
图12GOAu-Ru的X射线光电子能谱(Thermo Fisher K-Alpha)测试结果；横坐标是电子结合能，纵坐标为光电子的检测能量；
Au4f为85.1eV，C1s为284.8eV,，N1s为399.8eV，Ru3p为482.1eV，O1s为531.1eV；
图13Ru(dcbpy)3 2+、金纳颗粒(Au NPs)、PEI修饰的氧化石墨烯(GO-PEI)和GOAu-Ru的紫外-可见(Spectra Max M5e，分子设备有限公司)光谱；横坐标为波长，纵坐标为吸光度(单位是a.u.)；曲线a在304nm和475nm处有峰；曲线b在519nm处有峰；曲线c在239nm处有峰；d在239nm、304nm、475nm和519nm处有峰。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
蛋白质结合缓冲液为：10mM Tris HCl、100mM KCl、2mM MgCl2、0.25mM DTT、10％(体积百分含量)甘油和0.1mM EDTA，pH 8.0；
DNA杂交缓冲液：50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0。
GO-PEI购自先丰纳米，货号为102427，外切酶III购自生工生物，货号为B300061-0004；
合成发光体(GO-Au-Ru)：
1)配置5mL(2mg mL-1)的三(4,4’-二羧酸-2,2’-联吡啶)钌(II)二氯化物(Ru(dcbpy)3 2+)溶液，将5mL EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合溶液(该混合溶液中EDC浓度为2mg mL-1，NHS的浓度为1mg mL-1)添加到上述Ru(dcbpy)3 2+溶液中活化，并且持续搅拌2小时；
2)10mL的GO-PEI(1mg mL-1)溶液添加到步骤1)已经活化的Ru(dcbpy)3 2+溶液中持续搅拌2小时；
3)10mL直径为15nm金纳米颗粒溶液(0.1mg mL-1)添加到上述溶液中，通过这种方式可以形成Au-N键。通过离心洗涤，移除多余的试剂；
4)GOAu-Ru复合物重新分散在4mL的纯水中。
DNA6-银纳米簇合成过程:
首先，10μL(24mM)硝酸银溶液和1mL浓度为30μM第三探针(DNA6，序列为CCC AGTCGT CAT CAG ATA TCC CTC CTT TCC ACC ATT TCC CTT AAT CCC C)溶液混合(溶液为含有5mM镁离子pH＝7.4的0.1M的PBS缓冲溶液),银离子和DNA6的摩尔比为8：1。然后，震荡混合溶液两分钟，在0℃下加入提前制备好的硼氢化钠溶液(15μL,25mM)。最后，剧烈振荡1.5h，将反应溶液放入4℃冰箱反应12小时，合成出DNA6-银纳米簇(银纳米簇修饰DNA6)，即修饰有淬灭基团的第三探针。
循环伏安(CV)法以及交流阻抗(EIS)所测试用电解质是含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M S2O8 2-的0.1M PBS磷酸盐溶液(pH 7.4)。
实施例1传感器的构建
传感器构建方法，包括如下步骤：
1.首先，将直径为4mm的玻碳电极(GCE)用0.05微米直径的氧化铝连续研磨，在去离子水中交替进行超声处理，得到无污点的镜面。然后将8μL的GO-Au-Ru悬浮液放在已经清洗过的玻碳电极(简称GO-Au-Ru/GCE)上，在氮气气氛下干燥。然后将GO-Au-Ru/GCE浸入含有DNA杂交探针(第一探针)的PBS缓冲液过夜，通过DNA末端巯基与金颗粒反应形成Au-S键，将DNA杂交探针连接到GO-Au-Ru/GCE上(简称杂交DNA/GO-Au-Ru/GCE)。
2.DNA杂交探针溶液配制如下。首先，将终浓度相同(1μM)的DNA3(序列为5’端巯基标记,5’-3’方向TTT TTT GAA ATG GTG GAA AGG AGG GAT ATC TGA TGA CGA CTG GGA AAGTCC CCT C)、DNA4(序列为5’-3’方向，GAC TTT CCC AGT CGT CAT CAG ATA TCC CT)和DNA5(序列为5’-3’方向，CCT TTC CAC CAT TTC)放入含有氯化镁(5.0μM)和TCEP(0.1mM)的PBS缓冲液(pH为7.4)中，25℃孵育1.5小时，形成DNA混合物溶液。然后将该DNA混合物溶液加热至90-95℃，为了使得单链DNA(ssDNA)内的氢键断裂，迅速冷却至室温，形成杂交DNA探针，并保存于4℃，以备进一步使用。
3.将杂交的DNA/GO-Au-Ru/GCE浸入含100μM巯基己醇(MCH)的60μL PBS溶液(0.1M,pH为7.4)中，是为了封闭DNA/GO-Au-Ru/GCE上未连接DNA杂交探针的金纳米颗粒，使杂交DNA探针垂直指向GCE表面。另外，每次修饰后，都用20μL的PBS溶液冲洗玻碳电极，以去除未被特异性吸附的物质。从而实现了ECL生物传感器(MCH/hybrid DNA/GO-Au-Ru/GCE)的构建，其详细过程参照图1。
实施例2、基于熵驱动转录因子传感器检测方案
熵驱动检测原理：
本实施例设计的新的转录因子检测策略主要包括核酸外切酶III辅助的切口酶反应和基于电化学发光的熵驱动DNA Walker传感器，如图5所示。当系统中存在转录因子时，双链DNA(dsDNA，DNA1/DNA2双链体)上的结合位点可以与转录因子结合，并且所形成的复合结构会阻碍双链DNA的裂解。用该反应体系处理电极后，无法触发电极表面的反应，因此可以检测到较高的ECL信号。然而，当系统中没有转录因子时，Exo III可以从3’的平末端和凹端消化双链DNA中单链DNA，由于DNA3的3’端设计了5个突出碱基，因此可以防止DNA1被核酸外切酶III消化。在DNA1/DNA2双链体中它可以从3’末端至5’末端特异性切割DNA2(序列为5’-3’方向，GAT GAC GAC TGG GAA AGT CCC CTC)，在消化DNA2后，游离DNA1将与电极上修饰的DNA3/DNA4/DNA5复合物进行熵降低反应：首先，DNA1与DNA3的裸露单链部分结合，并进一步与DNA3杂交形成双链DNA1/DNA3，最终导致DNA4被替换。其次，在形成的DNA1/DNA5/DNA3中，DNA3的中间部分具有部分碱基序列，可以与银纳米簇修饰的DNA6杂交并配对，DNA1和DNA5被替换下来，进一步形成DNA3/DNA6双链DNA。替换的DNA1可以进一步触发其余的熵驱动的DNA Walker反应。最后，由于在DNA6末端修饰的银纳米簇可以淬灭电极表面的ECL信号，将得到较低的ECL信号。通过信号增加的程度来实现对转录因子浓度的分析。
检测具体实施方法：
首先，将DNA1和DNA2溶解于DNA杂交缓冲液中混合形成10μM DNA双链探针(第二探针)溶液。然后将混合物加热至90-95℃，然后立即冷却至4℃，形成纯度高、结构刚性强的dsDNA。之后，50微升浓度为10μM DNA双链探针溶液加入20微升溶于蛋白质结合缓冲液的不同浓度的NF-κB p50，在25℃孵化45分钟，构造复杂dsDNA和NF-κB p50的结合物。
对于外切酶III的消化过程，将孵育后的体系中加入50微升(2U L-1)Exo III于37℃反应15分钟，形成120微升反应体系，然后将混合物慢慢加热至75℃，静置10分钟，停止消化过程。然后将实施例1制备好的ECL生物传感器浸在120μL上述的反应溶液中，25℃孵育15分钟，立即将60μL上述步骤制备的DNA6-银纳米簇加入到反应溶液中，25℃孵育2小时。最后，在共反应物三乙胺(20mM)存在的情况下，用PBS溶液(0.1M,pH 7.4)对处理后的ECL生物传感器进行ECL测试(电化学发光分析仪ECL-6B捕获的ECL信号)。为保证发光体ECL测试的出峰位置，电压设置范围为0.5-1.3V，工作电极为玻碳电极(GCE)，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极(Pt)。
传感器构建成功的验证：
为了验证该电化学发光生物传感器的成功合成，本实施例使用循环伏安法(CV)表征逐步修饰的玻碳电极(GCE)，见图2。修饰前的GCE(曲线a)呈现氧化还原峰，而GOAu-Ru修饰后(GOAu-Ru/GCE，曲线b)，CV信号峰明显地下降。将杂交DNA探针(曲线c)、巯基己醇(MCH，曲线d)、序列为5’-3’方向，GAG GGG ACT TTC CCA GTC GTC ATC AGA TA的DNA1(曲线e)依次修饰到GOAu-Ru/GCE后，依次得到hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE、MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE、DNA1/MCH/hybrid DNA/GOAu-Ru/GCE，氧化还原峰连续下降，这主要是由于电荷转移的阻抗增加所致。但是，银纳米簇修的DNA6加上去后形成的DNA6-Ag NCs/DNA1/MCH/hybridDNA/GO-Au-Ru/GCE(曲线f)，氧化还原峰明显升高，因为Ag NCs提高了电子转移的效率。
接下来，进一步采用电化学阻抗谱(EIS)来描述逐步修饰后的表面阻抗，见图3。图示的经典模型电路，由实数Z'和虚数Z”组成的总阻抗以电路图的形式被电路元件反映，这主要与电化学系统的电阻和电容有关。实际的Z'主要包括电解质的欧姆电阻(Rs)，电荷转移阻抗(Rct)和Warburg扩散阻抗(W)。在此三电极系统中，Rs反映了GCE与Ag/AgCl参比电极之间的电阻，Rct对应于奈奎斯特图中高频区域的半圆所体现的电极的界面阻抗，而W是由离子浓度引起的与液相中离子传导速率有关的极化。虚构的Z”主要通过恒定相元素(CPE)表达，其直接表现出膜界面的不均匀性。随着GCE的不断修饰，界面阻抗发生了显著变化，因此，通过评估Rct的变化趋势，可以获得GCE的实际表面状况。如图3所示的EIS图像，GCE(曲线a)的Rct较低。但是，随着GOAu-Ru(曲线b)、杂交DNA探针(曲线c)、MCH(曲线d)和DNA1(曲线e)逐渐修饰到GCE，Rct依次增加。当Ag NCs修饰的DNA6(曲线f)固定在DNA3上时，Rct明显下降。
此外，还讨论了每个组装过程的ECL信号，如图4所示。GOAu-Ru在电极上呈现出强烈的ECL(曲线b)信号，但当固定了杂交DNA探针(曲线c)、MCH(曲线d)和DNA1(曲线e)等不发光物质，该信号有所减弱。然而，淬灭剂(Ag NCs修饰的DNA6，曲线f)与DNA3杂交，ECL信号明显下降。每个修饰过程的所有CV、EIS和ECL响应都共同证明了生物传感器的成功制备和理想的熵驱动生物反应的发生。各中间产物的表征见图10-13。
实施例3生物传感器的检测性能评估
按照实施例2的检测方法，用实施例1制备的生物传感器对不同浓度0pM、10pM、20pM、50pM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.5nM和1nM NF-κB p50进行了检测，结果如如图6所示。可以看出ECL强度随着浓度增大而逐渐上升。图7显示了ΔECL强度与浓度之间的函数关系，在0到500pM的范围内，ΔECL强度与NF-κB p50浓度之间的关系，线性方程为Y＝1.64+3.22X(R2＝0.998)，其中Y表示特定浓度样品与空白样品之间的ECL值差，X代表靶蛋白(NF-κBp50)的浓度。通过计算3倍标准差与标准曲线斜率的比值(3σ/斜率)，得到检测限(LOD)为9.1pM，具有巨大的应用价值。
实施例4生物传感器检测特异性的评估
按照实施例2的方法，用实施例1制备的ECL生物传感器对非特异性蛋白和靶标蛋白进行了验证，这些非特异性蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、唾液酸结合免疫球蛋白(Ig)样凝集素5(Siglec-5)、癌胚抗原(CEA)和干扰素-γ(IFN-γ)，浓度为靶标蛋白(NF-κB p50)浓度的10倍，即NF-κB p50为100pM，非特异性蛋白浓度为1nM。如图8所示，当存在BSA，Siglec-5，CEA，IFN-γ时，淬灭效率要低得多，这与空白样品的淬灭效果相似，而在存在NF-κB p50的情况下，淬灭效率要高得多。该检验揭示了设计良好的生物传感器对转录因子具有出色的选择性。此外，通过评估连续的8个周期的电位下的ECL信号来探究该体系的稳定性。图9显示了三个不同浓度NF-κB p50下于0.1M PBS的ECL响应(8个循环)，相应的相对标准偏差(RSD)在可接受的范围内(5％)，表明该传感方法具有出色的重现性和极高的应用价值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 基于熵驱动转录因子电化学发光生物传感器构建及应用
<130> SHA202000533
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gaggggactt tcccagtcgt catcagata 29
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gatgacgact gggaaagtcc cctc 24
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttttttgaaa tggtggaaag gagggatatc tgatgacgac tgggaaagtc ccctc 55
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gactttccca gtcgtcatca gatatccct 29
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctttccacc atttc 15
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccagtcgtc atcagatatc cctcctttcc accatttccc ttaatcccc 49

Claims (10)

1.探针组，其特征在于，所述探针组包括：
第一探针，由3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.5所示；
第二探针，由2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示；
第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种检测转录因子的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的探针组。
3.一种生物传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的第一探针。
4.一种检测转录因子的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)Ru(dcbpy)3 2+和金纳米颗粒修饰聚乙烯亚胺改性氧化石墨烯，制备得到发光体；
2)将发光体吸附到玻碳电极上，得到吸附发光体的玻碳电极；
3)吸附发光体的玻碳电极上的金纳米颗粒与第一探针连接，得到生物传感器；所述第一探针由DNA3、DNA4和DNA5互补杂交得到；DNA3为SEQ ID NO.3的单链DNA分子，DNA4为SEQID NO.4所示的单链DNA分子，DNA5为SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子。
5.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，吸附发光体的玻碳电极上的金纳米颗粒与第一探针上的巯基形成Au-S键连接；可选的，在所述步骤3)中，还包括将得到的生物传感器加入含巯基己醇溶液的步骤。
6.权利要求1所述的探针组、权利要求2所述的试剂或试剂盒、权利要求3所述的生物传感器或权利要求4或5所述生物传感器的制备方法得到的生物传感器在检测转录因子中应用。
7.一种检测转录因子的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的探针组、权利要求2所述的试剂或试剂盒、权利要求3所述的生物传感器、权利要求4或5所述检测转录因子的生物传感器的制备方法制备得到的生物传感器检测转录因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将第二探针溶液与待测样品混合，在室温下孵育30-60分钟；
2)将1)孵育后的溶液中加入核酸外切酶III进行消化，于25-37℃反应5分钟，后停止核酸外切酶III消化；
3)将权利要求4或5制备得到的生物传感器加入2)的溶液中，25-37℃孵育15-40分钟；
4)将修饰有淬灭基团的第三探针加入3)中的溶液中，室温孵育2小时；得到处理后的生物传感器；
5)将处理后的生物传感器进行电化学发光ECL测试；根据测试结果确定待测样品中转录因子的浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述修饰有淬灭基团的第三探针为银纳米簇修饰第三探针；所述第三探针为SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子。
10.根据权利要求6所述的应用，权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述转录因子为NF-κB，优选为NF-κB p50。
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