JP2018536406A - 目的分子を電気化学検出するためのシステム - Google Patents

目的分子を電気化学検出するためのシステム Download PDF

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Abstract

本発明は、目的分子を「シグナルオン」電気化学検出のためのシステム、及び前記システムを実施する方法に関する。

Description

本発明は、目的分子を電気化学検出するためのシステム、並びに前記システムを実施するための方法に関する。
サンプル中の生体分子（特に、ＤＮＡ分子又は病原性タンパク質分子）を測定することは、診断、環境、又は農業−食品産業などの様々な分析分野において非常に有用であり必要である。この検出は、現在、技術環境及び大きなツールを必要とする分析システム（例えば、ＰＣＲ）によって実施されている。
臨床分析の分野で検出システムを使用するためには、検出システムは、感度を高くしなければならず、更に、この検出システムによって、非常に低い濃度（例えば、フェムトモル（１０−１５ｍｏｌ／ｌ）のオーダ）でも、偽陽性の可能性が非常に低い状態で、分析すべきサンプル中における病原体の存在を定量化することを可能にしなければならない。
電気化学デバイスは、この課題を満たしている。目的ＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡプローブと電気化学シグナルを生成するレドックスプローブとを使用して、バイオセンサーが目的分子（特に、ＤＮＡ分子）の存在を示すことは、従来技術から知られている。
先行技術の電気化学検出デバイスの中で、２種類のバイオセンサー（すなわち、「シグナルオフ」バイオセンサー、及び「シグナルオン」バイオセンサー）を識別することができる。
「シグナルオフバイオセンサー」は、ＤＮＡプローブと目的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーション後に、電気化学シグナルを減少させる。実際、二本鎖ＤＮＡの形成によって、レドックスプローブが電極の表面から遠ざかり、これによってレドックスプローブと電極との間における電子の移動が減少する。
例えば、Ｆａｒｊａｍｉら（Anal. Chem., 2011, 83 (5), pp 1594-1602）は、バイオセンサーを含む電気化学的な方法を用いてＤＮＡを検出することを記載しており、これは、以下を含む：
−金の電極上における、３’末端に固定化されたヘアピンＤＮＡプローブ、及び
−ＤＮＡプローブのヘアピン構造を介して、前記電極に近接して位置する前記ＤＮＡプローブの５’末端に連結されたレドックスプローブ。
この種のバイオセンサーの欠点は、レドックスプローブの性能が低下することに起因し得るか又はレドックスプローブが古くなることに起因し得るシグナル低下についての原因が不確かであることである。
ＤＮＡプローブが目的ＤＮＡ分子とハイブリダイズした瞬間から、「シグナルオン」バイオセンサーは電気化学シグナルの増加を誘発する。これらのバイオセンサーは、以下を必要とする：
− レドックスプローブを電極表面から離すことを可能にするための、又はそれをマスクすることを可能にするためのＤＮＡプローブに特異的な予備構造化（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ）、及び
−各目的ＤＮＡ分子に対するＤＮＡプローブの構造適合化（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）。
バイオセンサーが標的ＤＮＡ分子に接触した場合には、ＤＮＡプローブとバイオセンサーとの間の相互作用によってレドックスプローブが解放し、次いで、このレドックスプローブが電極に近づき、電気化学シグナルを生成することができる。
この種のバイオセンサーに実施されるＤＮＡプローブは、二本鎖、又は三本鎖構造の形態であってもよく、場合により、ヘアピンの形態で構成することができる。
Ｘｉａｏら（J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 11896-11897）は、レドックスプローブで標識された一本鎖ＤＮＡプローブを含んでいる電気化学ＤＮＡバイオセンサーを記載している。このＤＮＡプローブは、レドックスプローブを電極表面から離すことを可能にする三本鎖構造を形成する。ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション中において、レドックスプローブが導電性表面と接触し、電流が増加する。電気化学バイオセンサーは、５ｎＭに制限された感度閾値を有する。
周知である「シグナルオン」型バイオセンサーについての主な欠点は、検出すべき各目的ＤＮＡ分子の最適化を必要とするＤＮＡプローブについての必要かつ複雑な構造化である。さらに、これらのＤＮＡ電気化学バイオセンサーは、検出感度閾値が不十分である。
したがって、特に臨床及び食品分析の分野において、ＤＮＡプローブの予備的な構造化又は最適化を必要とせず、非常に低い濃度で目的分子を検出することを可能にする電気化学バイオセンサーを開発する必要性が依然として存在する。
本発明の主題は、「シグナルオン」バイオセンサー型の電気化学検出システム（この電気化学検出システムの感度は非常に高く、そしてこの電気化学検出システムのＤＮＡプローブの適合性は必要でない）を利用可能にすることである。
本発明による目的分子を電気化学検出するためのシステムは、
−導電性材料、
−前記導電性材料に共有結合される、正の官能基を有する少なくとも１つのナノ材料、
−少なくとも１つのレドックス分子、及び
−目的分子を標的とする少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ
を含み；
前記レドックス分子が、前記ナノ材料に共有結合しており；
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ナノ材料又は前記レドックス分子に共有結合しており；
前記ナノ材料の正の官能基の数が、オリゴヌクレオチドプローブの数よりも多い。
本発明は、下記の相互作用がレドックス分子からの導電性材料への電子の移動を遮断するように、オリゴヌクレオチドプローブのリン酸基の負電荷とナノ材料の正電荷との間の相互作用が三次元の構造化を可能にするという驚くべき事実に基づいている。
検出すべき目的分子が存在しない場合には、負に荷電したリン酸基は、ナノ材料の表面に存在する正の官能基と相互作用する。イオン型のこうした相互作用は、レドックス分子からナノ材料の表面への電子の移動を防止した結果として、ナノ材料上にオリゴヌクレオチドプローブを折り畳むことを伴う。
検出すべき目的分子が分析されるサンプル中に存在する瞬間から、目的分子とオリゴヌクレオチドプローブとの間の反応が、オリゴヌクレオチドプローブの配置（例えば、検出すべき目的ＤＮＡ分子とオリゴヌクレオチドプローブとの間に形成される二本鎖ＤＮＡ）を変化させ、後者とナノ材料との間の相互作用を妨害し、これによって、レドックス分子のマスクを解除することが可能となり、そしてレドックス分子からのナノ材料の表面への電子の移動を可能にする。
この移動又は電子は、電気分析法によって検出することができるファラデー電流を生成する。
本発明の範囲内において、この電流のアンペア数は、オリゴヌクレオチドプローブと相互作用する目的分子の数に比例する。
その結果、電流を測定することにより、分析されるサンプル中における目的分子の濃度を示すことが可能になる。
本発明のシステムの利点の１つは、目的分子に対する感度の増加である。本発明のシステムは、非常に低い濃度（特に、フェムトモル濃度（１０−１５ｍｏｌ／Ｌ））で、目的分子を定量化することができる。
本発明のシステムの別の利点は、オリゴヌクレオチドプローブのリン酸基の負の電荷とナノ材料の正の電荷との間の相互作用が、電子の移動が妨げられるように三次元構造を可能にするので、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、異なる目的分子に関する特異的な予備構造化又は最適化のいずれも必要としない。
さらに、公知の電気化学検出システムとは異なり、本発明による検出システムは、オリゴヌクレオチドプローブの高い特異性、及び電子の移動の強力な阻止によって、偽陽性が表れることをかなり制限する。
本発明によれば、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、目的分子に特異的な１０〜５０ヌクレオチド（特に、１０〜２５ヌクレオチド）の一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、その５’又は３’末端の官能化によって、前記プローブと前記レドックス分子との間で共有結合が可能となる。
例えば、前記オリゴヌクレオチドは、アミン又は酸によって官能化することができる。アミン又は酸は、１〜１０個の炭素原子を含む炭化水素リンカーによってオリゴヌクレオチドの末端から分離することができる。
前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子であることがあり、場合によりアプタマーを形成することができる。
本発明の電気化学検出システムによって検出することが可能な「目的分子」として、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、毒素、又は化学分子を挙げることができる。
目的ＤＮＡ分子は、単離された天然ゲノムＤＮＡ分子、ウイルスＤＮＡ分子、合成されたｃＤＮＡ分子、又はＰＣＲｓ産物であり得る。
目的ＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｓｎＲＮＡ分子、又はｓａｔｅｌｌｉｔｅＲＮＡ分子であり得る。
目的分子がＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である場合には、その分子を標的とするオリゴヌクレオチドプローブは、相補的な配列を有するＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。サンプル中における前記目的分子の存在は、ナノ材料の表面に対して垂直に配置された二本鎖構造の形成をもたらす。
目的分子がタンパク質又は毒素である場合には、前記分子を標的とするオリゴヌクレオチドプローブは、前記の目的分子がリガンドとして固定され得るアプタマーを形成する。そのようなオリゴヌクレオチドプローブの配列は、当業者の知識によって決定するか、又は従来の方法、例えば、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技術によって選択することができる。
本発明によれば、「レドックス分子」とは、酸化還元反応に能動的（ａｃｔｉｖｅ）であり、そして前記レドックス分子と前記導電性材料との間の電子の移動に関連する電気分析法を使用して測定可能な電気化学的なシグナルを生成することができる分子を意味する。この電気化学的なシグナルは、オリゴヌクレオチドプローブに相補的な目的分子の存在を示すことを可能にする。
本発明の一実施形態によれば、前記レドックス分子は、前記ナノ材料とオリゴヌクレオチドプローブの両方に共有結合しており、レドックス分子からの導電性材料への電子の移動を阻止するために、前記ナノ材料の正の官能基の数はかなり高く、そして特に、前記ナノ材料の正の官能基の数は、オリゴヌクレオチドプローブの数よりも多い。
本発明によるこの種の検出システムによって、いくつかの目的分子の同時検出を可能にする。
本発明の特定の実施形態は、電気化学検出システムに関し、
この電気化学検出システムは、
−酸化還元電位が異なる少なくとも２種類のレドックス分子、及び
−少なくとも２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（各プローブは、異なる目的分子を標的とする）
を含み、
同種類のオリゴヌクレオチドプローブは、同種類のレドックス分子に結合している。
少なくとも２種類のレドックス分子（各分子は、前記電気化学検出システムにおいて、１種類のオリゴヌクレオチドプローブに結合する）を使用することによって、サンプル中の少なくとも２種類の異なる目的分子を同時に検出することができる。各々目的分子の存在は、異なる電気化学的シグナルによってそれぞれ示される。
前記システムは、サンプル中のＳＮＰ（一塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出するのに特に有用である。
有利な実施形態では、本発明は、電気化学検出システムに関し、
この電気化学検出システムは、
−酸化還元電位が異なる２種類のレドックス分子、及び
−２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（各プローブは、異なる目的分子を標的とする）
を含み、
同種類のオリゴヌクレオチドプローブは、同種類のレドックス分子に結合している。
別の有利な実施形態では、本発明は、電気化学検出システムに関し、
この電気化学検出システムは、
−酸化還元電位が異なる３種類のレドックス分子、及び
−３種類の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（各プローブが、異なる目的分子を標的とする）、
を含み、同種類のオリゴヌクレオチドプローブが、同種類のレドックス分子に結合している。
本発明の別の実施形態によれば、本発明による目的分子（１個又は複数）を電気化学検出するためのシステムは、前記ナノ材料に共有結合する前記オリゴヌクレオチドプローブ及びレドックス分子を含み、レドックス分子からの導電性材料への電子の移動を遮断するために、前記ナノ材料の正の官能基の数はかなり高く、そして、特に、前記ナノ材料の正の官能基の数は、オリゴヌクレオチドプローブの数よりも多い。
この種の検出システムは、レドックス分子が１個の官能基を有するので、合成が長くなく迅速であるという利点を有する。
本発明の電気化学検出システムに使用されるレドックス分子は、当業者に知られているレドックス分子であってもよく、より詳細には、フェロセン、キノン、メチレンブルー、メタロポルフィリン、及びビオロゲンを含む群から選択される。
一実施形態では、前記レドックス分子は、ナノ材料に共有結合するために、従来の方法に従って予め官能化されていてもよい。
例えば、−ＣＯＯＨ基を導入するためにレドックス分子を酸によって官能化することができる。このように修飾されたレドックス分子は、場合によりカップリング剤の助けを借りて、ナノ材料の表面に位置するアミンと反応することができる。より詳細には、レドックス分子は、オリゴヌクレオチドプローブと反応すると伴に、ナノ材料に共有結合的に反応することができるように、官能化することができる。
オリゴヌクレオチドプローブがナノ材料に共有結合している実施形態において、前記プローブは、前記ナノ材料にも共有結合している前記レドックス分子と反応することなく前記ナノ材料と反応することができるように官能化されている。
実施例として、オリゴヌクレオチドプローブは、ナノ材料のアミン官能基と共有結合するようにＣＯＯＨ基によって修飾することができる。
有利には、予め行われる官能化は、「クリックケミストリー」によって行われる。
本発明の枠組みにおいて、用語「レドックス分子」及び「レドックスプローブ」は、相互に置き換えることができる。
「前記ナノ材料の正の官能基の数がかなり高い」とは、正の官能基の数が、前記正の官能基に対するオリゴヌクレオチドプローブの効果的な折り畳みを可能にするほど十分に大きいことを意味する。
「ナノ材料の正の官能基の数が、オリゴヌクレオチドプローブの数より大きい」とは、前記ナノ材料が有する正の官能基の数が、レドックス分子を介してナノ材料に共有結合したオリゴヌクレオチドプローブの数よりも多いことを意味し、これによって、オリゴヌクレオチドプローブのリン酸基の負電荷と正の官能基を有するナノ材料の正電荷との間の電子の移動を効率的に遮断することが保証される。
ナノ材料が有する正の官能基の数及びオリゴヌクレオチドプローブの数は、それぞれ、先行技術における公知の方法に従って決定することができる。
本発明によれば、前記電気化学検出システムの正の官能基を有するナノ材料は、以下の群から選択される：
−デンドリマー、好ましくはポリ（アミドアミン）型のデンドリマー、特に第２世代、第４世代、又は第６世代（それぞれ、Ｇ２、Ｇ４又はＧ６）のデンドリマー、
−金属粒子（例えば、金ナノ粒子）、
−磁性ナノ粒子（例えば、酸化鉄）、
−キトサンを主成分とするハイブリッドナノ材料、及び
−導電性ポリマー（場合により、正の官能基（例えば、ポリピロール、ポリアニリン、又はポリパラフェニレン）によって修飾された導電性ポリマー）。
有利な実施形態では、本発明による電気化学検出システムにおいて使用されるナノ材料は、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）型のデンドリマーであり、その構造は球状及びその直径であり、並びに前記デンドリマーの表面に存在する第１級アミン基の数は、また、世代数に応じて増加する：
−Ｇ２ ＰＡＭＡＭは、約２．９ｎｍの直径を有し、１６個の第１級アミン基を有し、
−Ｇ４ ＰＡＭＡＭは、約４．５ｎｍの直径を有し、６４個の第１級アミン基を有し、
−Ｇ６ ＰＡＭＡＭは、約６．７ｎｍの直径を有し、２５６個の第１級アミン基を有する。
高密度のアミン基を有するＰＡＭＡＭを使用することによって、異なる物質（例えば、異なるレドックス分子）による官能化を容易にするだけでなく、前記検出システムの感度の閾値を高めることが可能となる。
より有利な実施形態では、本発明による電気化学検出システムに使用されるナノ材料は、Ｇ４ ＰＡＭＡＭである。
別の有利な実施形態では、本発明による電気化学検出システムに使用されるナノ材料は官能化された金ナノ粒子である。金ナノ粒子は、電気化学センサの構築に有用な三次元構造の材料を得ることを可能にする良好な表面積／体積比を有する。
実施例として、金ナノ粒子は、正の官能基を有するナノ材料にするために、シスタミンによって官能化することができる。シスタミンは、金ナノ粒子の表面に結合し、遊離アミン基を残すことができる２個の硫黄原子を含む。後者は、その後、官能化することができる。
別の有利な実施形態では、本発明の検出システムで使用されるナノ材料は、場合により、Ｇ４ＰＡＭＡＭと結合した官能化された金ナノ粒子である。金ナノ粒子は、導電性を改善し、電気化学シグナルをさらに増加させる。金ナノ粒子とＰＡＭＡＭとの結合は、本発明の検出システムのダイナミックレンジを拡大することを可能にする。
ナノ材料は、共有結合によって導電性材料に結合される。当業者は、導電性材料上にナノ材料を堆積させるために、ナノ材料の性質に適した方法を選択する方法を知っているであろう。
例えば、ＰＡＭＡＭは、電着によって炭素電極の表面上に堆積させることができる。ＰＡＭＡＭのアミン基の酸化は、炭素表面上のＣ＝Ｃ基と相互作用するカチオンラジカル−ＮＨ・＋を生じ、これによって、共有結合でのグラフトを行う。
シスタミンによって官能化された金粒子は、前記電極を官能化するために、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を予め用いて、アミン基を介して炭素電極の表面に堆積させることができる。
本発明の電気化学検出システムでは、前記導電性材料は電極として作用し、ナノ材料を堆積させるための規則的な表面を提供する。前記材料は、カーボン、特に、カーボンナノチューブ、グラッシーカーボン、グラファイト、グラフェン、又は金属から形成することができる。
特定の実施形態において、前記導電性材料は、溶液中に分散することのできるマイクロ電極又はナノ電極である。
本発明の別の特定の実施形態によれば、導電性材料は、正の官能基を有する前記ナノ材料が導電性である場合には、前記検出システムには存在しない。
例えば、金ナノ粒子、金属ナノ粒子（例えば、白金、銀）、金属酸化物、量子ドット、グラファイト、又はグラフェンは、正の官能基を有するナノ材料及び導電性材料の両方であり得る。
本発明による電気化学検出システムは、以下において使用することができる：
−疾患のインビトロ又はインビボ診断を可能にする、生物学的サンプル中における病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、又はバイオマーカー（例えば、腫瘍学的バイオマーカー、アルツハイマー病バイオマーカー、パーキンソン病バイオマーカー））を検出すること、
−医薬品に対する少なくとも１つの病原体の耐性を同定すること、
−農業食品、薬学的サンプル、又は流出液における病原体又は毒素（例えば、サルモネラ属、ブドウ球菌属、アエロモナス属、大腸菌属、リステリア属、クロストリジウム属などの細菌毒素）を検出すること、及び
−特に、慢性及び／又は集中治療（例えば、化学療法又は抗凝固剤の服用）の枠組みの中で、体液中の少なくとも１つの医薬品の存在又は非存在をモニタリングすること。
この目的で、本発明による電気化学検出システムは、以下の工程に従って使用される：
ｉ．前記電気化学検出システムと前記サンプルとを接触させる工程、及び
ｉｉ．少なくとも１つの病原体、少なくとも１つの毒素、又は少なくとも１つの目的医薬品を検出する工程。
実施例として、本発明による前記電気化学検出システムは、オクラトキシンＡを検出するために使用することができる。
前記電気化学検出システムは、ＳＮＰ部位を検出又は識別するためにも使用することができる。
特定の実施形態によれば、本発明の前記電気化学検出システムは、配列番号４で表される配列のオリゴヌクレオチドプローブを含む。前記システムは、結核菌ゲノム内のＳＮＰ（ＴＣＧ／ＴＴＧ）部位を識別することによってリファンピシンに対して耐性のある結核菌を検出するために使用することができる。
本発明の主題は、また、サンプル中の目的分子を電気化学検出するための方法を提案することである。
前記方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）本発明による検出システムを、目的分子を含有することができるサンプルと接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記目的分子に特異的な酸化還元シグナルの電気化学測定を行う工程。
「電気化学測定」とは、レドックス分子の酸化還元電位の変化についての測定、又は所定の電位において観測される酸化電流の変化による電流測定型の変化についての測定、又は 所与の電位におけるインピーダンスの変化についての測定を意味する。これらの変化は、当業者にとって周知の方法に従って測定される。
目的分子がサンプル中に存在する場合には、オリゴヌクレオチドプローブとの相互作用は、レドックス分子をマスクしてファラデー電流を生成するために、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記の正の官能基を有するナノ材料との間の相互作用を妨げることを可能にする。
電気化学測定によってこの電流を検出することを可能にし、これは、酸化還元シグナルによって表される。結果として、このシグナルは、前記目的分子に特異的である。
本発明を実施するための電気化学測定は、電位差測定、インピーダンス測定、電量測定、又は電流測定とすることができる。
有利な実施形態では、電気化学的測定は、電流測定によって実施される。
電流の測定は、既知の電流測定技術（好ましくは、直線状、周期状、パルス状である走査型ボルタンメトリー）の手段によって、又は、電位変化型（例えば、クロノアンペロメトリー）の手段によって行うことができる。
本発明によれば、サンプルは、前記検出システムの範囲内でおいて、オリゴヌクレオチドプローブが負に荷電し、ナノ材料が正電荷を有するようなｐＨとするべきである。
特に、サンプルのｐＨは６〜７とするべきである。
本発明によれば、前記サンプルは生物学的サンプルとすることができる。
有利には、このサンプルは、診断上の理由から患者から採取されたものであってもよい。サンプルは、例えば、尿、血液、血清、血漿、細胞抽出物、又は体液とすることができる。
本発明によれば、電気化学検出法は、工程（ｉ）及び（ｉｉ）に加えて、工程（ｉｉ）の後に、前記目的分子の定量分析を含むことができる。目的分子の定量化は、当業者に公知の方法の１つに従って、予め確立された検量線を使用して行われる。
特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも２種類の目的分子を複数の電気化学検出するための方法に関する。
前記方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）前記のような少なくとも２種類のレドックス分子と少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプローブとを含む検出システムを、前記目的分子を含むことができるサンプルと接触させる工程；
（ｉｉ）前記目的分子に特異的な酸化還元シグナルを測定する工程。
前記方法は、少なくとも２種類の目的分子を同時に検出することを可能にする。
本発明は、また、検出システムを製造するための修飾された支持体に関する。
前記支持体は、
−導電性材料、
−正の官能基を有するナノ材料、及び
−少なくとも１つのレドックス分子、
を含み、
前記ナノ材料は、前記導電性材料と前記レドックス分子との間に位置し、後者の２つに共有結合している。
前記支持体によって、ユーザの要求に応じて、オリゴヌクレオチドプローブによって機能化するためのプラットフォームを提供することを可能にする。
前記支持体は、官能化されたレドックス分子を介して、５’末端も修飾されたオリゴヌクレオチドに結合することができる。
該支持体は、以下の方法に従って製造することができる：
−正の官能基を有するナノ材料で導電性材料を覆い、前記導電性材料と前記ナノ材料との間に共有結合を形成する工程；
−官能化もされている少なくとも１つのレドックス分子を用いて、正の官能基を有する前記ナノ材料を官能化する工程。
本発明は、また、前記電気化学検出システムを製造するための方法を提供し、
この方法は、
（ｉ）上記の修飾された支持体を、目的分子を標的とする少なくとも１つの官能化されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｉｉ）前記修飾された支持体と前記官能化されたオリゴヌクレオチドとの間に共有結合を形成する工程；
を含む。
工程（ｉｉ）において、前記修飾された支持体と前記官能化されたオリゴヌクレオチドとの間での共有結合の形成は、前記官能化されたオリゴヌクレオチドと前記ナノ材料との間において、又は前記官能化されたオリゴヌクレオチドと前記レドックス分子との間において行うことができる。
本発明による前記電気化学検出システムを製造する方法は、オリゴヌクレオチドプローブの３’又は５’末端における事前の官能化及びレドックス分子の事前の官能化を必要とする。それらが接触した場合には、前記官能化されたオリゴヌクレオチドとレドックス分子は、これらの官能基を介して、共有結合を形成する。
「官能化オリゴヌクレオチド」とは、５’又は３’末端が活性官能基（例えば、アミン、酸、アジド、アルキン、チオール）によって修飾され、そして、別の適合可能な活性官能基を含む化合物と「クリックケミストリー」型の迅速な化学反応とを実施することができるオリゴヌクレオチドを意味する。
有利には、本発明は、また、早期の診断又は通院の診断に使用することができる目的分子のための超高感度の検出キットを提案する。
前記キットは、以下を含む：
（ｉ）上記のような修飾された支持体、及び
（ｉｉ）目的の目的分子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。
前記キットによって、本発明による電気化学検出システムをユーザ自身の都合に合わせて製造することを可能にし、偽陰性を与えることのできるオリゴヌクレオチドプローブの性能低下又は古くなることを回避することを可能にする。前記修飾された支持体に含まれるレドックス分子に結合するために、前記オリゴヌクレオチドは、アミン基を付加することによってその５’末端が修飾される。
本発明の一実施形態によれば、本発明による前記電気化学検出システムを製造するためのキットは、
−酸化還元電位が異なる少なくとも２種類のレドックス分子、及び
−少なくとも２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ、
を含むことができ、
各種類のオリゴヌクレオチドプローブは、その酸化還元電位が相互に異なるレドックス分子に結合されている。
図１〜１０及び以下の実施例は、本発明を例示する。
図１は、目的分子（特に、ＤＮＡ分子）の非存在下及び存在下における、本発明による検出システムを示す。
図２は、目的分子（特に、アプタマー）の非存在下及び存在下における、本発明による検出システムを示す。
図３ａ及び３ｂは、使用されるナノ材料がＧ４ ＰＡＭＡＭである場合における、本発明による検出システムの特異性を示す。図３ｃは、前記システムによって検出することのできる濃度の範囲を示す。
図４ａ及び４ｂは、使用されるナノ材料が修飾された金ナノ粒子である場合における、本発明による検出システムの特異性を示す。図４ｃは、前記システムによって検出することのできる濃度の範囲を示す。
図５ａ及び５ｂは、使用されるナノ材料が、修飾された金ナノ粒子で結合されたＧ４ＰＡＭＡＭである場合における、本発明による検出システムの特異性を示す。図５ｃは、前記システムによって検出することのできる濃度の範囲を示す。
図６は、オリゴヌクレオチドプローブが合成ＤＮＡ分子である場合における、特にＣ型肝炎ウイルスの検出での、本発明による検出システムの特異性を示す。
図７ａ及び７ｂは、オリゴヌクレオチドプローブがオクラトキシンＡに特異的なアプタマーである場合における、本発明による検出システムの特異性を示す。特に、図７ｂは、オクラトキシンＡ対オクラトキシンＢに関する前記検出システムの選択性を示す。
図８は、本発明によるオクラトキシンＡを検出するためのシステムの特異性を示す。このシステムにおいて、使用されるナノ材料は、レドックスプローブとしてのナフトキノンで修飾されたＧ２ ＰＡＭＡＭであり、そして、オクラトキシンＡに特異的なアプタマーである。
図９は、キトサンで被覆され、オクラトキシンＡを検出するためのナフトキノンレドックスプローブで修飾された磁性酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子を含有する、本発明による検出システムの特異性を示す。
図１０は、キトサンのミクロスフェアを含み、オクラトキシンＡを検出するためのナフトキノンレドックスプローブで修飾される、本発明による検出システムの特異性を示す。
材料及び方法
−生成物
フェロセンＦｃ（ＮＨＰ）２は、当業者にとって公知の方法に従って合成される。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ＝７．４の溶液は、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、及び１３７ｍＭのＮａＣｌを含有する。ＰＢＳを再蒸留水で製造し、そして０．２２μｍの膜で濾過し、次いでそれを使用するまで４℃で保存する。
Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーは、使用する前に、０．２２μＭの濾過膜によって精製される。
０．１ｍＭ ＰＢＳ溶液中の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られたものであり、５ｎｍの直径を有する。
本発明によるシステムのダイナミックレンジを研究するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｓｓＤＮＡプローブ」と称する）は、ＮＨ２Ｃ６−基によって５’末端が修飾された配列番号１（５’ＧＡＴ−ＡＣＴ−ＴＣＴ−ＡＴＣ−ＡＣＣ３’）のオリゴヌクレオチドを含む。
前記プローブは、配列番号２で表される配列（５’ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＡＧＡ−ＡＧＴ−ＡＴＣ３’）の目的合成オリゴヌクレオチド（以下、目的合成ＤＮＡ分子と称する）を標的とする。前記オリゴヌクレオチドプローブと非相補的な、配列番号３で表される配列（５’ＣＡＴ−ＴＣＣ−ＣＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧ３’）のオリゴヌクレオチドは、対照として使用される。
耐性結核菌を検出するための実験の状況下で、４１１塩基のＰＣＲ産物が、耐性結核菌のｒｐｏＢ遺伝子から得られる。
ｃＰＣＲは、リファンピシンに対する耐性の原因であるｒｐｏＢ遺伝子の突然変異ＴＣＧ／ＴＴＧを含む結核菌の５株から得られたＰＣＲ産物である。これらの５株は、２−０９，７−０９，８−０９，１０−０９，及び１１−０９である。
ｎｃＰＣＲは、結核菌の野生株由来の非変異ｒｐｏＢ遺伝子から得られたＰＣＲ産物である。
ｃＰＣＲを標的とするオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ＰＣＲプローブ」と称する）は、配列番号４で表される配列（５’ＣＣＧ−ＡＣＴ−ＧＴＴ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＧＧ３’）のオリゴヌクレオチドを含み、その５’末端は、フェロセンとの共有結合を実現するためのＮＨ２Ｃ６−基によって修飾されている。
Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための実験の状況下で、ウイルスを標的とするオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号５で表される配列（５’ＴＣＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＧＧＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＴＡ Ｇ３’）のオリゴヌクレオチドを含み、その５’末端は、フェロセンとの共有結合を実現するためのＮＨ２Ｃ６−基によって修飾されている。
オクラトキシン（ＯＴＡ）を検出するための実験の状況下で、毒素を標的とするプローブは、配列番号６で表される配列（５’ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＣＧ ＴＡＡ ＡＧＧ ＧＡＧ ＣＡＴ ＣＧＧ ＡＣＡ３’）のアプタマー型のプローブであり、その５’末端は、フェロセンとの共有結合を実現するためのＮＨ２Ｃ６−基によって修飾されている。
−測定技術
サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）
分析は、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度で、−０．２〜０．５Ｖの電位の範囲内で、５ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／５ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−のペアを用いて、０．１ＭのＫＣｌ中で行う。
インピーダンス分光法（ＥＩＳ）
分析は、５ｍＭ の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／５ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−のペアを用いて、０．１ＭのＫＣｌ中で行う。全てのインピーダンスは、１００ＫＨｚ〜０．１Ｈｚまでの周波数の範囲内で、１０Ｖの直流電位で、０．２Ｖに対するＡｇ／ＡｇＣｌで得られる。
矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）
分析は、０．２２μｍの膜で濾過された（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、及び１３７ｍＭのＮａＣｌを含有する）ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中において行い、そして、使用するまで４℃で保存する。ＳＷＶ分析は、調整時間１８０秒、周波数２５Ｈｚ、及び変調振幅２０ｍＶによって、−０．３〜０．４の電位の範囲内で行う。
微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）
分析は、０．２２μｍの膜で濾過された（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、及び１３７ｍＭのＮａＣｌを含有する）ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中において行い、そして、使用するまで４℃で保存する。ＤＰＶ分析は、４５ｍＶのパルス高及び０．０５ｓのパルス長によって、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度で、０．３〜０．４Ｖの電位の範囲内で行われる。
実施例１：Ｇ４ ＰＡＭＡＭを含む検出システム
−Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーによるガラス状炭素電極の表面修飾
ガラス状炭素電極上のＧ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーの共有結合は、０．５ＭのＬｉＣｌＯ４を含有する水中において、０．０〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．（参照電極としての）Ａｇ／ＡｇＣｌ）をスキャンすることによるＣＶ法によって、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度でのサイクル中に生成される。反応中、作用電極及び対極は、２００μｌのＧ４ ＰＡＭＡＭ（５０μＭ溶液）を含む低容量のセル（ＢＡＳｉ）中で分けられている。分子を表面に固定し、再蒸留水で電極を注意深く洗浄した後に、ＣＶ及びＥＩＳ分析が行われる。
フェロセンレドックス分子と配列番号１で表される配列の修飾されたオリゴヌクレオチドとの結合
２個のフタルイミジルＦｃ（ＮＨＰ）２基によって修飾されたフェロセンは、デンドリマーと結合し、その表面は修飾されている。この反応は、アセトニトリル中のフェロセンの１ｍＭ溶液中において、周囲温度で、１時間、電極を浸漬することによって行われる。非結合残基をアセトニトリル及び二重蒸留水で洗浄する。次いで、（ＰＢＳ中で製造された）配列番号１の修飾されたｓｓＤＮＡ−Ｃ６ＮＨ２プローブの１０μＭ溶液中において、室温で、１時間、電極を浸漬する。次いで、電極を蒸留水及びＰＢＳ中ですすぎ、そしてフェロセンフタルイミドエステルを飽和させるために、周囲温度で、３０分間、ＰＢＳ溶液中のエタノールアミンの１ｍＭ溶液に浸漬する。次いで、検出システムを蒸留水及びＰＢＳで洗浄し、使用するまで４℃でＰＢＳに保存する。ＤＮＡ検出システムの構築の各工程の後に、表面修飾はＳＷＶ法によって試験される。
−配列番号２の相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション。
表面に結合した配列番号１のｓｓＤＮＡプローブに相補的な１５塩基のハイブリダイゼーションは、４０℃、１時間、合成ＤＮＡ溶液（配列番号２）中において、電極を浸漬することによって行われる。ハイブリダイゼーションに使用される異なる濃度は、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、及び１００ｎＭである。各インキュベーション後に、蒸留水及びＰＢＳで電極を注意深く洗浄し、ＳＷＶ法で電極を分析する。対照試験は、目的合成ＤＮＡ分子（配列番号２）と同じ条件下（４０℃、１時間）で、ＰＢＳ中の非相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号３）の１μＭへの電極の浸漬が行われ、そしてインキュベートされる。ＰＣＲに由来するサンプルの検出に同じ条件を適用し、ＰＣＲ後に得られる二本鎖ＤＮＡの脱ハイブリダイゼーションのために、９０℃、５分間、サンプルを予め処理する。
結果
ａ）配列番号２で表される配列の目的合成ＤＮＡ分子の検出
配列番号２の配列の目的の合成ＤＮＡ分子の検出は、ＳＷＶ法によって行われる。検出システムは、ＤＮＡ濃度（１００ｆＭと１ｎＭとの間で変化させる）を含む溶液中において、連続的にインキュベートされる。各濃度について、ＳＷＶによる分析を行う。図３ｃは、目的ＤＮＡの各濃度と伴に、０．１１Ｖにおけるフェロセンに相当する電流の増加を示す。この電流の変化は、目的合成ＤＮＡ分子の濃度に比例する。
目的ＤＮＡ分子の検出中における第１の正シグナルは、目的ＤＮＡの１ｐＭ溶液中における検出システムのインキュベーション後に得られ、そして、１０％の電流変動をもたらす。そして、検出システムの飽和は、９７％の電流変動と伴に１００ｐＭにおいて観察され、これは、フェロセンの酸化還元シグナルの変化に相当する。
目的ＤＮＡ分子の検出中における電流の増加は、相補的な目的合成ＤＮＡ分子（配列番号２）とオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１）とのハイブリダイゼーションによるレドックス分子のアンマスキングによって、及びＧ４ ＰＡＭＡＭの使用によって、説明される。プローブｓｓＤＮＡ／相補的な目的合成ＤＮＡ分子、複合体、又はＰＣＲサンプルからの由来に基づいているこの変化は、フェロセンとＧ４ ＰＡＭＡＭとの間における電子移動の増加を引き起こす（図３ａ及び３ｃ）。
ｂ）ＰＣＲに由来する目的ＤＮＡ分子の検出
Ｇ４ ＰＡＭＡＭ及び配列番号４で表される配列のオリゴヌクレオチドプローブを含む検出システムは、ＰＣＲ（ｃＰＣＲ）に由来する４１１塩基からなる目的ＤＮＡ分子を検出するための上記の方法に従って製造される。
インキュベーション後に、フェロセンに相当する電流変動が計算される。独立した５回の実験によって得られた変動の値は、８６％である。サンプルが生成物ｎｃＰＣＲ（この配列は、１個のヌクレオチド酸によってｃＰＣＲの配列と異なる）を含有しない場合には、電流変動は７％以下である（図３ａ及び図３ｂ）。前記システムが、結核菌のＤＮＡ分子のような目的ＤＮＡ分子を効率的かつ特異的に検出し、リファンピシンに対して耐性を示す株を区別することができることを、これらの結果は示す。それは、臨床分野で使用することができる。
実施例２：金ナノ粒子を含む検出システム
−金ナノ粒子の修飾、及びその表面での結合
２ｇ（０．００８モル）のシスタミンジクロロ水和物を、２０ｍｌの５Ｍ ＮａＯＨ（０．１Ｍ）に溶解し、１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を１０ｍｌの蒸留水ですすぎ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮する。再蒸留水に溶解したシスタミンを、最終濃度が５０μＭとなるように、１ｍｌの金ナノ粒子（ＯＤ＝０．４）の溶液に添加する。この溶液を、使用するまで４℃でインキュベートする。シスタミン濃度並びにインキュベーション時間は、紫外−可視分光分析及び動的光散乱による分析のための、修飾された非凝集金ナノ粒子のウェルを得ることを可能にするように、最適化された。
この反応後に、シスタミン残基を除去するために、シスタミンで修飾された金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ−ＮＨ２）のサンプルを１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。次いで、ペレットを１ｍｌの再蒸留水で２回すすぎ、過剰のシスタミンが除去されるまで遠心分離する。最後に、ＡｕＮＰｓ−ＮＨ２のサンプルを、３００μｌの水に溶解する。
ガラス状炭素電極に結合するために、１００μｌのＡｕＮＰｓ−ＮＨ２を、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍＭ／１０ｍＭを水に溶解）の１００μｌ溶液と混合する。次に、カルボン酸−ＣＯＯＨ基で修飾した電極をこの混合物に浸漬し、周囲温度で２時間インキュベートする。異なるインキュベーション時間が試験され、２時間が、検出システムの良好な性能のための最適な時間である。電極を注意深く再蒸留水ですすぎ、次いでＥＩＳ測定によって分析する。
シスタミンによるＡｕＮＰの修飾は最適化され、そして紫外可視分光法によってモニタリングされる。直径５ｎｍのＡｕＮＰは、５２０ｎｍの可視紫外線を吸収し、更に修飾されたＡｕＮＰの吸収値が増加するので、したがって、反応の有効性が確認される。
−β−アラニン及びエタノールアミンの電着
ガラス状炭素電極上のβ−アラニンの共有結合は、０．５ＭのＬｉＣｌＯ４を含有する水中において、０．２〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．（参照電極としての）Ａｇ／ＡｇＣｌ）を５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度で飽和するまでの１０サイクルで、スキャンすることによって、生成される。その反応の間において、作用電極及び対極は、β−アラニン１０ｍＭ溶液の２００μｌを含む低容量のセル（ＢＡＳｉ）中で分けられている。次いで電極を再蒸留水で慎重にすすぐ。エタノールアミンによる表面の飽和は、０．２〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）を３サイクルスキャンすることによって、同じ条件下で行われる。この反応に使用されるエタノールアミンの濃度は、０．５ＭのＬｉＣｌＯ ４を含有する水中で製造された１ｍＭである。分子を表面に固定し更に再蒸留水で電極を注意深くすすいだ後に、ＥＩＳ分析を行う。
−検出システムの構築
２個のフタルイミジルＦｃ（ＮＨＰ）２基によって修飾されたフェロセンは、修飾されたＡｕＮＰｓ−ＮＨ２表面上に結合している。反応は、アセトニトリル中のフェロセンの１ｍＭ溶液中において、周囲温度で、１時間、電極を浸漬することによって行われる。非結合残基をアセトニトリル及び再蒸留水で洗浄する。次いで、（ＰＢＳ中で製造された）修飾されたＤＮＡ配列番号１の１０μＭ溶液において、室温で、１時間、電極を浸漬する。電極を蒸留水及びＰＢＳですすいだ後に、電極は、フェロセンフタルイミドエステルを飽和させるために、ＰＢＳ中のエタノールアミンの１ｍＭ溶液において、周囲温度で、３０分間、浸漬される。次いで、検出システムを蒸留水及びＰＢＳで洗浄し、そして、使用するまで４℃でＰＢＳにおいて保存する。ＤＮＡプローブを構築する各工程の後に、表面修飾は、ＥＩＳ法によってモニタリングされる。
−相補的な目的合成ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーション
相補的な目的合成ＤＮＡ分子のその表面に結合したｓｓＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、配列番号２の目的合成ＤＮＡ分子の溶液中において、４０℃、１時間、電極を浸漬することによって行われる。ハイブリダイゼーションに使用される様々な濃度は、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭである。各インキュベーションの後に、蒸留水及びＰＢＳで注意深く電極を洗浄し、次いで電極をＤＰＶ法により分析する。
ＰＣＲ産物は、４１１塩基を含み、上記と同じ方法に従って、溶液中に配列番号４のＰＣＲプローブを含む検出システムによって検出される。
対照試験は、相補的な目的合成ＤＮＡ分子と同じ条件下（４０℃、１時間）で、ＰＢＳ中の非相補的な標的の１μＭの電極の浸漬によって行われ、そして、インキュベートされる。同じ条件が、ＰＣＲに由来するサンプルを検出するために適用される。
結果
ａ）配列番号２で表される配列の目的合成ＤＮＡ分子の検出
目的ＤＮＡ分子の検出は、ＳＷＶ法によって行われる。検出システムは、１００ｆＭと１ｎＭとの間で変化するＤＮＡ濃度を含む溶液中において連続してインキュベートされ、各濃度についてＳＷＶによる分析が行われる。図４ｃは、相補的な目的ＤＮＡの各濃度での、０．１１Ｖにおけるフェロセンに相当する電流の増加を示す。この電流の変化は、目的合成ＤＮＡ分子（配列番号２）の濃度に比例する。
目的合成ＤＮＡ分子の検出中における第１の正シグナルは、１００ｆＭの目的合成ＤＮＡ分子を含む溶液中での検出システムのインキュベーション後に得られ、１０％の電流変動をもたらす。
そして、検出システムの飽和は、１００ｐＭにおいて９７％の電流変化と伴に観察され、これは、フェロセンの変化に相当する。それにもかかわらず、１００ｐＭから１ｎＭまでの濃度での分析を、使用される検出システムを用いて行うことができる（図４ｃ）。
ｂ）結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の変異ｒｐｏＢ遺伝子（ｃＰＣＲ）に相当するＰＣＲ産物を含むサンプルを検出するために、配列番号４のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、実施例２ａ）で述べた検出システムと同じ検出システムを構築する。
前記検出システムは、ｃＰＣＲ産物がサンプル中に存在する場合において特異的な電気シグナルを生成することができる（図４ａ及び図４ｂ）。前記システムは、リファンピシンに耐性のある結核菌の株を特異的に検出することを可能にする。
実施例３：金ナノ粒子及びＧ４ ＰＡＭＡＭを含む検出システム（Ｇ４−ＡｕＮＰ）
−Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーによるガラス状炭素電極の表面の修飾
ガラス状炭素電極上のＧ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーの共有結合は、０．５ＭのＬｉＣｌＯ４を含有する水中において、０．０〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．（参照電極としての）Ａｇ／ＡｇＣｌ）をスキャンすることによるＣＶ法によって、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度でのサイクル中に生成される。反応中において、作用電極及び対極は、Ｇ４ ＰＡＭＡＭの５０μＭ溶液を２００μｌを含む低容量のセル（ＢＡＳｉ）中で分離されている。分子を表面に固定し、再蒸留水で電極を注意深く洗浄した後に、ＣＶ及びＥＩＳ分析を行う。
−Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマー及びＡｕＮＰを用いたガラス状炭素電極の表面の修飾
検出システムの構築の第一段階は、ガラス状炭素電極の表面上へのＧ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーの電着である。電着は、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度でのスキャン中において、０．０〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．（参照電極としての）Ａｇ／ＡｇＣｌ）をスキャンすることによるＣＶ法によって、生成される。酸化反応中に、デンドリマーのアミン基は、炭素含有表面のＣ＝Ｃ芳香族基と相互作用する−ＮＨ・＋カチオンラジカルを形成する。
−金ナノ粒子の修飾、及びその表面での結合
シスタミン二塩酸塩２ｇ（０．０１３モル）を２０ｍｌの５Ｍ ＮａＯＨ（０．１Ｍ）に溶解し、１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機層を１０ｍｌの蒸留水ですすぎ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮する。再蒸留水に溶解したシスタミンを、最終濃度が５０μＭとなるように、１ｍｌの金ナノ粒子溶液（ＯＤ＝０．４）に添加する。この溶液を、使用するまで４℃でインキュベートする。
この反応後に、シスタミンで修飾された金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ−ＮＨ２）のサンプルは、シスタミン残基を除去するために、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離される。次いで、ペレットを２ｍｌの再蒸留水で２回すすぎ、過剰のシスタミンが除去されるまで遠心分離する。最後に、ＡｕＮＰｓ−ＮＨ２のサンプルを３００μｌの水に溶解する。
−ＡｕＮＰ及びＧ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーの結合
Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーによって修飾されたガラス状炭素電極にＡｕＮＰｓ−ＮＨ２を結合するために、グルタルアルデヒドがリンクとして使用される。Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーで修飾した電極を０．５％グルタルアルデヒドの溶液に２０分間浸漬し、注意深くすすいだ。次いで、１００μｌのＡｕＮＰｓ−ＮＨ２中において、周囲温度、２時間、電極をインキュベートする。様々なインキュベーション時間が試験され、２時間が、検出システムの良好な性能のための最適な時間である。再蒸留水で電極を慎重にすすぎ、ＣＶ及びＥＩＳ測定によって分析する。
−フェロセンレドックス分子及びｓｓＤＮＡプローブの結合
２個のフタルイミジルＦｃ（ＮＨＰ）２基によって修飾されたフェロセンは、その表面が修飾されたＡｕＮＰｓ−ＮＨ２と結合している。この反応は、アセトニトリルのフェロセン１ｍＭ溶液において、室温、１時間、電極を浸漬することによって行われる。非結合残基をアセトニトリル及び再蒸留水で洗浄する。次いで、ＰＢＳ中で製造したｓｓＤＮＡ−Ｃ６ＮＨ２プローブの１０μＭ溶液において、室温、１時間、電極を浸漬する。次いで、蒸留水及びＰＢＳで電極をすすぎ、そしてフェロセンフタルイミドエステルを飽和させるために、ＰＢＳの１ｍＭエタノールアミン溶液中において、周囲温度、３０分間、電極を浸漬する。次いで、検出システムを蒸留水及びＰＢＳで洗浄し、そして、使用するまで４℃でＰＢＳに保存する。ＤＮＡ検出システムを構築するための各工程の後に、表面修飾が、ＳＷＶ法によってモニタリングされる。
−配列番号２で表される配列の目的の合成ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーション
目的合成ＤＮＡ分子（配列番号２）の、その表面に結合したｓｓＤＮＡプローブ（配列番号１）へのハイブリダイゼーションは、目的合成ＤＮＡ分子の溶液中において、４０℃、１時間、電極を浸漬することによって行う。ハイブリダイゼーションに使用される様々な濃度は、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭである。各インキュベーション後に、蒸留水及びＰＢＳで注意深く電極を洗浄し、ＳＷＶ法で電極を分析する。対照試験は、目的ＤＮＡ分子と同じ条件下（４０℃、１時間）で、ＰＢＳ中の配列番号３で表される配列の非相補的なＤＮＡ分子（１μＭ）に電極を浸漬することによって行われ、そして、インキュベートされる。同じ条件が、ＰＣＲに由来するサンプルを検出するために適用される。
結果
ａ）目的合成ＤＮＡ分子の検出
目的ＤＮＡ分子（配列番号２）の検出は、ＳＷＶ法によって行われる。検出システムは、１００ｆＭと１ｎＭとの間で変化するＤＮＡ濃度を含む溶液中において、連続してインキュベートされ、各濃度についてＳＷＶによる分析が行われる。図５ｃは、配列番号２の目的合成ＤＮＡ分子の各濃度での、０．１１Ｖにおける、フェロセンに相当する電流の増加を示す。この電流の変化は、目的合成ＤＮＡ分子の濃度に比例する。
目的ＤＮＡ分子（配列番号２）の検出中における第１の正シグナルは、目的ＤＮＡ分子（配列番号２）の１ｐＭの溶液中における検出システムのインキュベーション後に得られ、そして、１０％の電流変動をもたらす。
そして、検出システムの飽和は、９７％の電流変動を伴い、１００ｐＭで観察され、これは、フェロセンの変化に相当する。しかしながら、１００ｐＭ〜１ｎＭの濃度での分析が、使用される検出システムでは可能である（図５ｃ）。
ｂ）結核菌の変異ｒｐｏＢ遺伝子（ｃＰＣＲ）に相当するＰＣＲ産物を含むサンプルを検出するために、配列番号４のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、実施例２で述べた検出システムと同じ検出システムを構築する。
前記検出システムは、ｃＰＣＲ産物がサンプル中に存在する場合には、特異的な電気シグナルを生成することができる（図５ａ及び５ｂ）。
ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの合成ＤＮＡのサンプルを検出するために、配列番号５で表される配列のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、実施例３ａ）で述べた検出システムと同じ検出システムを構築する。
前記検出システムは、合成ＤＮＡ分子の存在下で電気シグナルを生成することができる（図６）。従って、前記システムは、Ｃ型肝炎ウイルスを検出することを可能にする。
以下の表Ｉは、上記の様々な実施例に従って得られた検出範囲を要約したものである。
実施例４：Ｇ４ ＰＡＭＡＭを含む検出システムによるオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）の検出
実施例１で述べた検出システムと同じ検出システムは、食品サンプル（例えば、ミルク又はワイン）中でのＯＴＡ（このマトリックスは、複雑である）の有無を検出するために、配列番号６で表される配列のアプタマープローブを用いて構築される。
前記検出システムは、ＯＴＡの存在下で電気シグナルを生成することができる（図７ａ及び図７ｂ）。従って、前記システムによって、ＯＴＡ毒素の検出が可能となる。別のアプタマーの非特異的毒素（例えば、ＯＴＢ）の存在は、検出しない（図７ｂ）。
実施例５：Ｇ２ ＰＡＭＡＭを含む検出システムによるＯＴＡの検出
−Ｇ２ ＰＡＭＡＭデンドリマーによるガラス状炭素電極の表面の修飾
ガラス状炭素電極上でのＧ２ ＰＡＭＡＭデンドリマーの共有結合は、０．５ＭのＬｉＣｌＯ４を含有する水中において、０．０〜１．１の電位（Ｖ ｖｓ．（参照電極としての）Ａｇ／ＡｇＣｌ）をスキャンすることによるＣＶ法によって、５０ｍＶ．ｓ−１のスキャン速度でのサイクル中に生成される。反応中において、作用電極及び対極は、Ｇ２ ＰＡＭＡＭの５０μＭ溶液の２００μｌを含む低容量のセル（ＢＡＳｉ）中で分離されている。分子を表面に固定し、再蒸留水で注意深く電極を洗浄した後に、ＣＶ及びＥＩＳ分析を行う。
−ナフトキノンレドックス分子及びＧ２ ＰＡＭＡＭの結合
プロパン酸で変性されたナフトキノンは、デンドリマーと結合している。この反応は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）をカップリング剤として使用して、プロパン酸とデンドリマーの表面上のアミン官能基との間のペプチドカップリングによって行われる。
デンドリマー表面へのレドックス分子の良好なグラフトを確認するために、シグナルを分析し、表面に固定化されたレドックス分子の電位（−０．２２Ｖ）に強いピークを示す。
−配列番号６で表される配列の修飾されたオリゴヌクレオチドプローブ及びＧ２ ＰＡＭＡＭの結合
５’末端位置がＣＯＯＨ基によって修飾されたＯＴＡに対して特異的なアプタマーＤＮＡ溶液中において、電極をインキュベートする。アプタマーは、表面アミンとアプタマーの５’位の酸官能基との間のペプチドカップリングによって、デンドリマーの表面に共有結合的にグラフトされる。この反応の持続時間は１時間である。表面を洗浄し、次いでＰＢＳ緩衝溶液中で安定化させ、シグナルを測定する（図８）。
デンドリマーの表面へのアプタマーの形成における配列番号６のオリゴヌクレオチドプローブの良好なグラフトを確認するために、レドックス分子によって放出されたシグナルが分析され、そして、そのシグナルは、表面に固定化されたレドックス分子の電位（−０．２２Ｖ）の顕著な低下を示す。
−ＯＴＡとＧ２ ＰＡＭＡＭを含む検出システムとの接触
ＯＴＡは、製造された検出システムと１時間接触させ、次いでその表面を洗浄する。
結果
上記の検出システムは、食品サンプル（例えば、ミルク又はワイン）中でのＯＴＡ（このマトリックスは、複雑である）の有無を検出するために、使用される。
ナフトキノンシグナルの分析（図８）では、−０．２２Ｖの電位におけるシグナルの増加が示され、これは、ＯＴＡとそれと相補的なアプタマー（配列番号６）との間の相補的な結合によって引き起こされるレドックス分子のアンマスキングに起因する。
換言すれば、Ｇ２ ＰＡＭＡＭを含有する前記検出システムは、ＯＴＡ毒素の存在下で電気シグナルを生成することができる。
実施例６：磁性ナノ粒子を含む検出システムによるＯＴＡの検出
実施例５で述べた検出システムと同じ検出システムが、食品サンプル（例えば、ミルク又はワイン）中でのＯＴＡ（このマトリックスは、複雑である）の有無を検出するために、ナノ材料としてキトサンによって修飾された磁性ナノ粒子で構築される。
磁性ナノ粒子は、１０ｎｍ〜１００ｎｍサイズの酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）の磁性ナノ粒子であり、従来の合成法で得られ、次いでカチオン性にするためにキトサンで修飾される。
ナフトキノンシグナルの分析（図９）では、−０．４Ｖの電位におけるシグナルの増加が示され、これは、ＯＴＡとそれと相補的なアプタマー（配列番号６）との間における相補的な結合によって引き起こされるレドックス分子のアンマスキングに起因する。
換言すれば、キトサンで修飾された磁性ナノ粒子を含む前記検出システムは、ＯＴＡ毒素の存在下で電気シグナルを生成することができる。
実施例７：キトサンのナノ粒子を含む検出システムによるＯＴＡの検出
実施例６で述べた検出システムと同じ検出システムが、食品サンプル（例えば、ミルク又はワイン）中でのＯＴＡ（このマトリックスは、複雑である）の有無を検出するために、ナノ材料としてキトサンによって修飾された磁性ナノ粒子で構築される
ナフトキノンシグナルの分析（図１０）では、−０．２２Ｖの電位におけるシグナルの増加が示され、これは、ＯＴＡとそれの相補的アプタマー（配列番号６）との間における相補的な結合によって引き起こされるレドックス分子のアンマスキングに起因する。
言い換えれば、キトサンのマイクロスフェアを含有する前記検出システムは、以前よりも重要でないシグナルの変化にもかかわらず、ＯＴＡ毒素の存在下で電気シグナルを生成することができる。
しかしながら、これらのキトサンのミクロスフェアのサイズの最適化によって、シグナルのより大きな変動を可能にする。

Claims (17)

  1. 目的分子を電気化学検出するためのシステムであって、
    前記システムが、
    −導電性材料、
    −前記導電性材料に共有結合され、正の官能基を有する少なくとも１つのナノ材料、
    −少なくとも１つのレドックス分子、及び
    −目的分子を標的とする少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ
    を含み；
    前記レドックス分子が、前記ナノ材料に共有結合しており；
    前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ナノ材料又は前記レドックス分子に共有結合しており；
    前記ナノ材料の正の官能基の数が、オリゴヌクレオチドプローブの数よりも多い；
    ことを特徴とする、前記システム。
  2. 前記レドックス分子が、前記ナノ材料及び前記オリゴヌクレオチドプローブの両方に共有結合していることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学検出システム。
  3. 前記システムが、
    −少なくとも２種類のレドックス分子であって、これらのレドックス分子についての酸化還元電位が異なる、前記のレドックス分子；及び
    −少なくとも２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであって、各プローブが、異なる目的分子を標的とする、前記オリゴヌクレオチドプローブ；
    を含み、
    同種類のオリゴヌクレオチドプローブが、同種類のレドックス分子に結合していることを特徴とする、請求項２に記載の電気化学検出システム。
  4. 前記オリゴヌクレオチドプローブ及び前記レドックス分子が、それぞれ、前記ナノ材料に共有結合していることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学検出システム。
  5. 前記の正の官能基を有するナノ材料が、下記の群：
    −デンドリマー、好ましくはポリ（アミドアミン）型のデンドリマー、特に第２世代、第４世代又は第６世代のデンドリマー；
    −金属粒子、例えば金ナノ粒子；
    −磁性ナノ粒子、例えば酸化鉄；
    −キトサンを主成分とするハイブリッドナノ材料；及び
    −導電性ポリマー、場合により、正の官能基によって修飾された導電性ポリマー；
    から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の電気化学検出システム。
  6. 前記導電性材料が、カーボン、特に、カーボンナノチューブ、グラッシーカーボン、グラファイト、グラフェン又は金属から形成されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学検出システム。
  7. 前記の正の官能基を有するナノ材料が導電性である場合において、前記導電性材料が前記システムには無いことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気化学検出システム。
  8. 前記レドックス分子が、フェロセン、キノン、メチレンブルー、メタロポルフィリン、ビオロゲンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の電気化学検出システム。
  9. 前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、又は毒素から独立して選択される少なくとも１つの目的分子を標的とすることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の電気化学検出システム。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学検出システムを製造するための修飾された支持体であって、
    その修飾された支持体が、
    −導電性材料；
    −正の官能基を有するナノ材料；及び
    少なくとも１つのレドックス分子；
    を含み、
    前記ナノ材料が前記導電性材料と前記レドックス分子との間に位置し、更に、そのナノ材料がその導電性材料及びそのレドックス分子に共有結合している、前記修飾された支持体。
  11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学検出システムを製造するためのキットであって、
    そのキットが、
    （ｉ）請求項１０に記載の修飾された支持体、及び
    （ｉｉ）目的分子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
    を含む、前記キット。
  12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学検出システムを製造する方法であって、
    その方法が、
    （ｉ）請求項１０に記載の修飾された支持体と、目的分子を標的とする少なくとも１つの官能化されたオリゴヌクレオチドとを接触させること；
    （ｉｉ）前記の修飾された支持体と前記の官能化されたオリゴヌクレオチドとの間に共有結合を形成すること；
    を含む、前記方法。
  13. サンプル中における少なくとも１種類の目的分子を検出するための電気化学方法であって、
    その電気化学方法が、以下の工程：
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の検出システムと、前記目的分子を含有することのできるサンプルとを接触させる工程；
    （ｉｉ）前記目的分子に特異的な酸化還元シグナルの電気化学測定
    を含むことを特徴とする、前記電気化学方法。
  14. 工程（ｉ）及び（ｉｉ）に加えて、工程（ｉｉ）の後に、検量線を基準とする前記の目的分子の定量分析を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の電気化学検出方法。
  15. サンプル中の少なくとも２種類の目的分子を検出するための電気化学方法であって、
    その電気化学方法が、以下の工程：
    （ｉ）請求項３に記載の検出システムと、前記目的分子を含有することのできるサンプルとを接触させる工程；
    （ｉｉ）前記目的分子に特異的な酸化還元シグナルを測定する工程；
    を含むことを特徴とする、前記電気化学方法。
  16. 医薬品に対する耐性を同定し、かつ生体液中における医薬品の存在をモニタリングするための、疾患をインビトロ若しくはインビボ診断するのに用いる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学検出システムの使用、又は請求項１１に記載の前記システムを製造するためのキットの使用。
  17. 農業食品若しくは薬剤サンプル若しくは廃液中における病原体又は毒素の存在を検出するために用いる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学検出システムの使用、又は請求項１１に記載の前記システムを製造するためのキットの使用。
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