DE69834506T2 - Fluorometrisches verfahren zur überwachung und zum nachweis der amplifizierung von nucleinsäuren - Google Patents

Fluorometrisches verfahren zur überwachung und zum nachweis der amplifizierung von nucleinsäuren Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Erfassung der Amplifizierung eines Target-Polynucleotids (zuweilen auch als Polynucleinsäure bekannt) an, bevorzugt ein Verfahren zur quantitativen Erfassung, ferner auch Sonden zur Verwendung bei diesen Verfahren.
  • Bekannte Techniken zur Überwachung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) über die Fluoreszenz umfassen sowohl strangspezifische als auch generische DNA-Interkalierungstechniken, die auf einigen wenigen Temperaturzyklus-PCR-Vorrichtungen der zweiten Generation eingesetzt werden können.
  • Bei generischen Verfahren werden DNA-Interkalationsfarbstoffe eingesetzt, die eine erhöhte Fluoreszenz zeigen, wenn sie an doppelsträngige DNA-Species gebunden sind. Die Erhöhung der Fluoreszenz aufgrund eines Anstiegs in der Bulk-Konzentration an DNA während der Amplifizierungen kann zur Messung des Fortschreitens der Reaktion und zur Bestimmung der Kopienzahl des Target-Moleküls herangezogen werden. Diese Verfahren sind allerdings lediglich quasi-strangspezifisch, da irgendeine stattfindende nichtspezifische Amplifizierung doppelsträngige DNA erzeugt und somit eine Signalerhöhung hervorruft.
  • Bei strangspezifischen Verfahren werden zusätzliche Polynucleotideaktionskomponenten zur Überwachung des Fortschritts der Amplifizierungsreaktionen verwendet. Bei diesen Verfahren wird die Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) als Basis für die Detektion herangezogen. Eine oder mehrere Polynucleotidsonden werden mit fluoreszierenden Molekülen, einem Donor-Molekül und einem Akzeptor-Molekül (zuweilen auch als Reporter-Molekül beziehungsweise als Quencher-Molekül bekannt), markiert. Das Donor-Molekül wird mit einer spezifischen Lichtwellenlänge angeregt, bei der es normalerweise eine Fluoreszenzemissionswellenlänge zeigt. Das Akzeptor-Molekül wird bei der Emissionswellenlänge derart hoch angeregt, dass es die Emissionsenergie des Donor-Moleküls durch Resonanzübertragung aufzunehmen vermag, wenn sich diese Moleküle in unmittelbarer Nachbarschaft befinden (zum Beispiel am gleichen oder einem benachbarten Molekül). Die FRET-Detektion beruht auf der Überwachung der Änderungen bei den Donor- und Akzeptor-Emissionswellenlängen. Es gibt zwei Arten von FRET-Sonden, nämlich solche, bei denen die Hydrolyse von Polynucleotidsonden dazu verwendet wird, den Donor vom Akzeptor zu trennen, und solche, bei denen Hybridisierung angewandt wird, um die räumliche Beziehung von Donor-Molekül und Akzeptor-Molekül zu ändern.
  • Hydrolysesonden sind als TaqManTM-Sonden im Handel erhältlich. Sie bestehen aus DNA-Oligonucleotiden, die mit einem Donor- und einem Akzeptor-Molekül markiert sind. Die Sonden sind so ausgebildet, dass sie an einem spezifischen Bereich an einem Strang eines PCR-Produkts binden. Nach dem Reassoziieren des PCR-Primers mit diesem Strang verlängert das Enzym Taq die DNA mit 5'- an 3'-Polymerase-Aktivität. Das Enzym Taq weist ferner auch 5'- an 3'-Exonuclease-Aktivität auf. Die TaqManTM-Sonden sind am 3'-Ende durch Phosphorylierung geschützt, um zu verhindern, dass sie für die Taq-Verlängerung als Primer wirken. Wenn die TaqManTM-Sonde mit dem Produktstrang hybridisiert ist, kann ein verlängertes Taq-Molekül die Sonde ebenfalls hydrolysieren, wodurch der Donor vom Akzeptor freigesetzt wird, was die Grundlage für die Detektion bildet.
  • Hybridisierungssonden sind in einer Reihe von Formen erhältlich. Molecular Beacons sind Oligonucleotide, die komplementäre 5'- und 3'-Sequenzen aufweisen, sodass sie haarnadelförmige Schleifen ausbilden. Bei der Ausbildung der Haarnadelstruktur befinden sich endständige Fluoreszenzmarkierungen in enger Nachbarschaft zueinander, sodass FRET eintreten kann. Nach der Hybridisierung der Molecular Beacons zu einer komplementären Sequenz werden die Fluoreszenzmarkierungen getrennt, sodass keine FRET eintritt; dies bildet die Grundlage für die Detektion. Eine Modifizierung eines solchen Systems, bei dem der Molecular Beacon an einem Amplifizierungsprimer angebracht wird, ist in Nucl. Acids. Res. (1997) 25, 12, 2516-2521, beschrieben.
  • Das von solchen Sequenzen erzeugte Signal ist allerdings durch die Länge der Sonde begrenzt, da diese den begrenzenden Faktor beim Signal/Rausch-Verhältnis darstellt, das erzielt werden kann.
  • WO-A-96/21144 offenbart ein Verfahren zur Erfassung einer Amplifizierungsreaktion, bei dem eine an beiden Enden fluoreszenzmarkierte Sonde sowie ein Restriktionsenzym verwendet werden.
  • Von den Anmeldern wurde ein System entwickelt, das eine genaue Erfassung und/oder Überwachung von bestimmten Reaktionen einschließlich Amplifizierungsreaktionen erlaubt.
  • Die Erfindung gibt daher ein Verfahren zur Erfassung einer Nucleinsäure-Amplifizierung in einer Probe an, das umfasst: Durchführen einer Nucleinsäure-Amplifizierung an einem Target-Polynucleotid in Gegenwart
    • (a) einer Nucleinsäurepolymerase,
    • (b) eines Primers, der befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und
    • (c) einer Oligonucleotid-Sonde, die befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und ein Fluoreszenz-Donor- Molekül, ein Fluoreszenz-Akzeptor-Molekül und eine einzelsträngige Sequenz aufweist, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird, das diese Sequenz schneidet, wenn sie in doppelsträngiger Form vorliegt, wobei diese Sequenz zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül angeordnet ist,
    Anwenden des Restriktionsenzyms auf das Amplifizierungsprodukt, so dass das doppelsträngige Amplifizierungsprodukt so gespalten wird, dass das Akzeptor-Molekül vom Donor-Molekül freigesetzt wird, und
    Erfassen eines Fluoreszenzsignals von dem Reaktionsgemisch, wobei die Sonde so ausgebildet ist, dass die Oligonucleotid-Sonde befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid im Bereich des 3'-Endes des Polynucleotids zu hybridisieren, das in Gegenwart der Polymerase verlängert werden kann und den komplementären Strang liefert, der in Form einer doppelsträngigen DNA mit der Oligonucleotid-Sonde vorliegt. Die Restriktionsstelle befindet sich geeigneterweise im Verlängerungsbereich. In diesem Fall wirkt das Target-Polynucleotid selbst als Primer für die Verlängerung, und während einer Kettenverlängerungsreaktion erstreckt sich die Polynucleotidsequenz längs der Länge der Sonde, wodurch sie doppelsträngig wird. Wenn dies eingetreten ist, kann das Restriktionsenzym den verlängerten Bereich schneiden, wodurch der Akzeptor von der Sonde freigesetzt und so ein Signal erzeugt wird.
  • Das 3'-Ende der Sonde ist geeigneterweise 'blockiert', beispielsweise durch Phosphorylierung, sodass es während der Verlängerungsphasen des Amplifizierungstypus nicht in der Richtung des Polynucleotids verlängert wird.
  • Dies bedeutet, dass die Polymerase-Verlängerungsreaktion zu einer Verlängerung des Target-Polynucleotidstrangs in dem Bereich führt, der zum Overhang-Bereich der Sonde komplementär ist, was zur Erzeugung einer doppelsträngigen Restriktionsstelle in diesem Bereich führt. Wenn das Enzym so ausgewählt ist, dass sich die Restriktionsstelle nicht an einer anderen Stelle im Amplicon befindet, führt die Anwendung des Restriktionsenzyms nicht zum Schneiden innerhalb der Target-Polynucleotidsequenz, sodass danach ein Produkt mit voller Länge isoliert werden kann.
  • Das Verfahren kann dazu herangezogen werden, das Vorliegen eines Target-Polynucleotids in einer Probe zu erfassen. Wenn bei dem Verfahren der Erfindung eine Amplifizierung erfasst wird, dann liegt das Target-Polynucleotid in der Probe vor und wirkt als Matrize.
  • Durch Verwendung eines Restriktionsenzyms zur Freisetzung des Donor-Moleküls vom Akzeptor-Molekül wird die Zeitverzögerung vermieden, die beispielsweise auftritt, wenn mehrere Hydrolysereaktionen erforderlich sind, um die Trennung herbeizuführen.
  • Die Trennung des Akzeptor-Moleküls vom Donor-Molekül ist ferner nicht so durch die Länge der Sonde eingeschränkt, weshalb ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis erzielt werden kann.
  • Das Verfahren der Erfindung kann zur Endpunkterfassung herangezogen werden, wobei das Enzym nach der Amplifizierungsreaktion zugegeben wird, oder das Enzym kann während der gesamten Amplifizierungsreaktion vorliegen. Der letztgenannte Fall eröffnet die Möglichkeit der Erfassung der Amplifizierungsreaktion in Echtzeit. In einigen Fällen können allerdings die für den enzymatischen Abbau erforderlichen Reagentien die Amplifizierungsreaktion inhibieren. In diesen Fällen kann eine Endpunkterfassung in einem separaten Röhrchen wünschenswert sein.
  • Die Oligonucleotid-Sonde kann so ausgelegt sein, dass sie die Stelle für das Restriktionsenzym innerhalb des Bereichs des Amplicons enthält. In diesem Fall erfolgt die Detektion der Amplifizierung durch Zugabe des Restriktionsenzyms zu der Reaktion bei vollständiger Umsetzung. Das Enzym schneidet das Amplifizierungsprodukt zwischen dem Donor-Molekül und dem Akzeptor-Molekül der Sonde und setzt so das Donor-Molekül frei, das ein Endpunktsignal erzeugt. Dies kann für PCR-Situationen in situ herangezogen werden. Die Verwendung hängt allerdings davon ab, dass innerhalb des Amplicons eine Stelle vorliegt, die mit der Sonde hybridisiert. Hinzu kommt, dass eine vollständige Isolierung des Amplicons mit voller Länge nach der Erfassung auf diese Weise nicht möglich sein kann.
  • Alternativ kann die Sonde an einem Amplifizierungsprimer angebracht werden. In solchen Fällen liegen bevorzugt sowohl das Akzeptor-Molekül als auch das Donor-Molekül an einem nicht bindenden Bereich des Primers vor. Wenn das so erzeugte Amplicon einem nachfolgenden Verlängerungszyklus unter dem Einfluss des anderen Primers unterzogen wird, schließt die Verlängerungsreaktion den gesamten Bereich der Sonde ein, wodurch die Restriktionsstelle doppelsträngig wird und dadurch vom Restriktionsenzym geschnitten werden kann.
  • Wenn das Restriktionsenzym während der gesamten Amplifizierungsreaktion vorliegt, kann ferner das Fortschreiten der Amplifizierungsreaktion selbst überwacht werden, da die Donor-Moleküle in Mengen freigesetzt werden, die der Anzahl der im Reaktionsgemisch bei jedem Zyklus der Amplifizierungsreaktion vorliegenden Amplicons proportional sind. Der Anstieg des Signals von den Donor-Molekülen kann beobachtet werden, und der Anstieg kann zum Beispiel zur Berechnung der Menge des Target-Polynucleotids verwendet werden, das in der Probe zu Beginn vorliegt, wobei die Art einer Berechnung angewandt wird, die in Verbindung mit dem TaqManTM-System wohl bekannt ist.
  • Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, die an doppelsträngigen DNA-Molekülen an spezifischen Basenpaarsequenzen, die als Restriktionsstellen oder Erkennungsstellen bekannt sind, binden und dort spalten. Es gibt drei Typen von Restriktionsenzymen. Jeder Typ besitzt zwei spezifische Enzymaktivitäten, die einer DNA-Methylase und die einer Endonuclease, welche die Spaltung und Trennung der doppelsträngigen DNA katalysieren.
  • Restriktionsenzyme vom Typ I besitzen Methylase-Aktivität und ATP-abhängige Nuclease-Aktivität im gleichen Molekül. Die Methylierung tritt am Erkennungsort auf, und die Spaltung tritt in einem Abstand vom Erkennungsort ein, da sich die DNA um das gebundene Enzym herumschlingt. Die Enzyme vom Typ I und vom Typ III sind ähnlich. Enzyme vom Typ III besitzen ebenfalls Methylase- und Nuclease-Aktivität im gleichen Molekül. Die Enzyme brauchen jedoch kein ATP, und die Spaltungsstelle liegt näher am Erkennungsort. Restriktionsenzyme vom Typ II spalten am Erkennungsort. Sie erkennen Strukturen einer Länge von vier oder mehr Nucleotiden. Jeder Enzymtyp spaltet auf unterschiedliche Weise. Das Enzym kann an beiden Strängen an genau der gleichen Stelle spalten, wodurch glatte Enden an der DNA gebildet werden. Andere Enzyme können an jedem Strang der DNA an symmetrischen Positionen spalten, wodurch Fragmente mit einzelsträngigem Overhang oder überstehenden Enden gebildet werden. Sie können Fragmente mit 3'-Overhang und 5'-Overhang erzeugen.
  • Beim Verfahren der Erfindung können alle bekannten Restriktioinsenzyme verwendet werden, insbesondere, wenn sie am Ende einer Amplifizierungsreaktion zugegeben werden, wobei lediglich vorauszusetzen ist, dass sie, wenn ein spezielles Reaktionsprodukt zu gewinnen ist, keine internen Stellen enthalten, die durch die Enzyme erkannt werden. Restriktionsenzyme, die den bei der Reaktion angewandten Bedingungen, zum Beispiel bei der Amplifizierungsreaktion, widerstehen können, sind thermostabile Enzyme.
  • Ein zur Verwendung beim Verfahren der Erfindung besonders geeignetes Restriktionsenzym ist Taq 1. Dieses Restriktionsenzym ist, wie TAQ-Polymerase, aus Thermus aquaticus erhältlich. Es hält entsprechend die Bedingungen aus, die während der bei Amplifizierungsreaktionen durchgeführten Zyklen auftreten, wie etwa bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ein weiteres derartiges Enzym ist das thermostabile Restriktionsenzym "PspG 1" (New England Biolabs). Dieses Enzym wird aus Pyrococcus sp. isoliert und erkennt CCWGG und schneidet vor dem ersten C. Die Stabilität beträgt 2 Stunden bei 95 °C, und das Enzym überlebt 30 Zyklen einer Block-PCR.
  • Die PCR-Reaktion ist ein bevorzugtes Amplifizierungsverfahren im Kontext der Erfindung.
  • Geeigneterweise werden das Amplicon und/oder das Restriktionsenzym so ausgewählt, dass der vom Enzym erkannte Ort im Amplicon nicht auftritt. Falls erforderlich, können verfügbare Restriktionsenzyme isoliert, einer Mutation unterzogen oder so manipuliert werden, dass sie bei den erforderlichen Reaktionstemperaturen thermostabil sind.
  • Die im Verfahren der Erfindung verwendete Nucleinsäurepolymerase ist geeigneterweise eine thermostabile Polymerase, wie etwa TAQ-Polymerase.
  • Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Sonde kann die Form eines Molecular Beacons annehmen, sodass sie vor der Hybridisierung mit dem Target-Polynucleotid eine haarnadelartige Form annimmt. In diesem Fall besitzt die Sonde komplementäre Sequenzen im 5'-Bereich und im 3'-Bereich, sodass der 5'-Bereich und der 3'-Bereich vor der Bindung mit der Target-Polynucleotidsequenz miteinander binden. Die Restriktion befindet sich in diesem Fall in einem nicht komplementären Bereich der Sonde, sodass sie einsträngig bleibt, bevor die Sonde mit der Target-Sequenz hybridisiert.
  • Das Donor-Molekül wird geeigneterweise an einem Ende der Sonde angeordnet, und der Akzeptor befindet sich am anderen Ende. Somit können das Donor-Molekül am 5'-Ende der Sonde und der Akzeptor am 3'-Ende angeordnet werden, oder umgekehrt. In solchen Fällen ist die Haarnadelanordnung des Molecular Beacons besonders wirkungsvoll, da der Donor und der Akzeptor vor der Hybridisierung mit der Target-Sequenz in enger Nachbarschaft gehalten werden. Dadurch wird das Risiko eines unerwünschten Untergrundsignals vom Donor-Molekül verringert.
  • Bei der Hybridisierung der Sonde mit der Target-Sequenz wird die Haarnadel geöffnet, wodurch das Akzeptor-Molekül vom Donor-Molekül räumlich getrennt und somit ein Signal erzeugt wird. Im Fall der Erfindung schneidet allerdings das Restriktionsenzym das Sonden-Targetsequenz-Hybrid zwischen dem Donor-Molekül und dem Akzeptor-Molekül, wodurch diese Reste weiter voneinander getrennt werden, wodurch das Signal verstärkt wird.
  • Bei einer weiteren Modifizierung davon wird die Sonde an einem ihrer Enden am Amplifizierungsprimer angebracht. Die Sonde kann gegebenenfalls in Form einer Haarnadel vorliegen. Der Bereich, der das Donor-Molekül und das Akzeptor-Molekül enthält, sollte allerdings stromauf vom 3'-Ende des Primers angeordnet sein. Die Verlängerung des Primers führt zu einem Amplicon, bei dem die Sonde an seinem 5'-Ende hängt. Während eines nachfolgen den Amplifizierungszyklus wird nach der Bindung des anderen Amplifizierungsprimers an das entfernte Ende des Amplicons ein komplementärer Strang gebildet. Dieser komplementäre Strang wird während der Kettenverlängerung verlängert, und zwar nicht nur längs der Länge der Targetkette, sondern auch über die Probe hinweg, wodurch sie doppelsträngig wird und damit vom Restriktionsenzym geschnitten werden kann.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von modifizierten Nucleotiden durchgeführt, die gegenüber dem Schneiden durch Restriktionsenzyme resistent sind. Beispiele für solche Nucleotide sind methylierte Nucleotide. In diesem Fall enthält die in dem Verfahren verwendete Sonde keine modifizierten Nucleotide. Dies bedeutet, dass die bei der Reaktion erzeugten Amplicons restriktionsresistent sind.
  • Wenn allerdings die Sonde mit einem Amplicon hybridisiert, wird sie durch das Restriktionsenzym erkannt, das sie dann an der Restriktionsstelle schneidet. Der komplementäre Strang wird allerdings nicht geschnitten, und das Resultat davon ist, dass die doppelsträngige DNA lediglich "angeschnitten" ist. Beim anschließenden Schmelzen der Sonde trennen sich das Akzeptor-Molekül und das Donor-Molekül, wodurch ein modifiziertes Signal erzeugt wird, das erfasst werden kann.
  • Diese Ausführungsform kann bei der Endpunkterfassung herangezogen werden, wobei das Restriktionsenzym bei Vervollständigung der Amplifizierung zugesetzt wird. Wenn es im Verlauf der Reaktion verwendet werden soll, um zum Beispiel die Amplifizierung zu überwachern und/oder quantitativ zu verfolgen, ist es notwendig, sicherzustellen, dass das Restriktionsenzym das Target-Molekül (das allgemein nicht restriktionsresistent ist) nicht vor dem Beginn der Amplifizierung aufschneidet. Dies kann auf verschiedenen Wegen erzielt werden. Die Zugabe des Restriktionsenzyms kann verzögert werden, bis mindestens der erste Zyklus der Amplifizierung stattgefunden hat. Dies kann automatisch vorgenommen werden, zum Beispiel unter Anwendung der "Hot start"-Techniken, bei denen das Polymeraseenzym vom restlichen Reaktionsgemisch getrennt gehalten wird, zum Beispiel mit einer Wachsbarriere, die lediglich nach Erreichen der erwünschten Temperaturniveaus schmilzt und das Enzym freisetzt. Ähnliche Verfahren können auch beim Assay der Erfindung angewandt werden, um das Restriktionsenzym zurückzuhalten, bis es im Prozess gebraucht wird. Alternativ können andere Mittel zur Unterdrückung einer Reaktion angewandt werden, zum Beispiel durch Einbringen eines Antikörpers gegen das Restriktionsenzym in das Reaktionsgemisch, der seine Aktivität inhibiert, jedoch selbst bei der gewünschten Temperatur denaturiert wird, oder durch Verwendung von Enzymen, insbesondere modifizierten Enzymen, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel TAQ GoldTM, die ein Erhitzen auf ein bestimmtes Niveau erfordern, bevor sie aktiviert werden.
  • Geeignete Kombinationen von Donor- und Akzeptor-Molekülen sind im Stand der Technik bekannt. So können zum Beispiel das Donor-Molekül ein Fluorescein-Farbstoff und das Akzeptor-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff sein.
  • Geeignete Bedingungen, unter denen die Amplifizierungsreaktion durchgeführt werden kann, sind im Stand der Technik bekannt. Die optimalen Bedingungen können je nach dem speziellen betreffenden Amplicon, der Art der verwendeten Primer und der Art der angewandten Enzyme in jedem Fall variieren. Die optimalen Bedingungen können in jedem Fall von Fachleuten ermittelt werden. Typische Denaturierungstemperaturen liegen bei größenordnungsmäßig 95 °C, typische Reassoziierungstemperaturen liegen bei größenordnungsmäßig bei 55 °C, und Verlängerungstemperaturen liegen bei größenordnungsmäßig 72 °C.
  • Das Verfahren der Erfindung kann zur Anwendung bei der Qualitätskontrolle von Enzymen angepasst werden, wobei das Enzym eine Restriktionsendonuclease ist. Gegenwärtig wird bei der Enzymqualitätskontrolle eine Einheitsaktivität angewandt, welche die Konzentration bei speziellen Niveaus des aktiven Enzyms bestimmt. Wenn allerdings das Enzym beim Verfahren der Erfindung als Restriktionsenzym verwendet werden soll, wobei das Vorliegen oder die Menge des Target-Polynucleotids in der Probe bekannt ist, kann die Qualität des Enzyms durch seine Fähigkeit beurteilt werden, ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen, das die Trennung des Signals von den fluoreszierenden Sonden anzeigt, wodurch eine genauere Aktivitätsmessung ermöglicht wird.
  • Die Verwendung von Oligonucleotid-Sonden bei den oben beschriebenen Verfahren bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Diese Sonden enthalten insbesondere ein Donor-Molekül und ein Akzeptor-Molekül sowie eine Stelle für ein Restriktionsenzym, das an einer spezifischen doppelsträngigen DNA-Sequenz schneidet, die sich zwischen dem Donor-Molekül und dem Akzeptor-Molekül befindet.
  • Die Sonden können andere Merkmale aufweisen, wie oben erläutert. So kann die Sonde zum Beispiel in Form eines Molecular Beacons vorliegen, sodass sie komplementäre Sequenzen im 5'-Bereich und im 3'-Bereich aufweist, die aneinander binden.
  • Beispiele für geeignete Donor-Moleküle sind Fluorescein-Farbstoffe, wie Fluorescein, und das Akzeptor-Molekül kann ein Rhodamin- Farbstoff oder ein anderer Farbstoff wie etwa Cy5 sein, jedoch können auch beliebige andere Farbstoffkombinationen verwendet werden, die zu FRET-Wechselwirkungen in der Lage sind.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens wie oben beschrieben, wobei der Kit eine Sonde, wie sie oben beschrieben wurde, sowie ein Restriktionsenzym enthält, das befähigt ist, die Sonde zwischen dem Akzeptor-Molekül und dem Donor-Molekül zu schneiden. Der Kit enthält ferner ein modifiziertes Nucleotid, das befähigt ist, eine Nucleotidkette zu erzeugen, die gegen Restriktionsenzyme resistent ist, zum Beispiel methylierte Nucleotide.
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezug auf die beigefügten schematischen Zeichnungen näher erläutert:
  • 1 zeigt schematisch Stufen der Reaktion, die eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bildet;
  • 2 erläutert ein Verfahren, das nicht in den Rahmen der Erfindung fällt;
  • 3 erläutert ein weiteres Verfahren, das nicht in den Rahmen der Erfindung fällt;
  • 4 ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit der Fluoreszenz von einem Donor-Molekül von der Zeit bei einer PCR-Reaktion gemäß der Erfindung zeigt;
  • 5 ist ein Diagramm, welches das Verhältnis der Fluoreszenz des Donors zur Fluoreszenz des Akzeptors bei einem Endpunkt-PCR-Assay der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive Reaktionen und (C) eine negative Kontrolle darstellen;
  • 6 ist ein Diagramm, welches das Verhältnis der Fluoreszenz des Donors zur Fluoreszenz des Akzeptors bei einem Endpunkt-PCR-Assay der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive Reaktionen und (C) eine negative Kontrolle darstellen;
  • 7 ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit der Donor-Fluoreszenz von der Zeit für ein Endpunkt-PCR-Assay der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive Reaktionen und (C) eine negative Kontrolle darstellen;
  • 8 ist ein Diagramm, das die Änderung der Fluoreszenz des Donors (A) und des Akzeptors (B) in Abhängigkeit von der Zeit in Gegenwart eines Restriktionsenzyms zeigt, das zwischen dem Donor und dem Akzeptor schneidet, und
  • 9 ist ein Diagramm, das kumulativ die Erhöhung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion zeigt, die zu 8 führt.
  • Bei der dargestellten Amplifizierungsreaktion wird ein DNA-Molekül (1) zuerst einzelsträngig gemacht (1B). Zwei Amplifizierungsprimer (2), (3) binden als Forward-Primer und Reverse-Primer bei einer Amplifizierungsreaktion, wie wohl bekannt ist. Das Ergebnis ist ein Amplicon-Produkt (4), das lediglich die Target-Sequenz enthält. Wenn dieses Produkt während der nachfolgenden Phase der Amplifizierung dem Schmelzen unterworfen wird, bindet die Sonde (5), die ein Donor-Molekül (6) und ein Akzeptor-Molekül (7) enthält, am 3'-Ende der Target-Sequenz (1D). In Gegenwart einer DNA-Polymerase verlängert sich die Target-Sequenz längs des Overhang-Bereichs der Sonde, wodurch eine doppelsträngige Stelle für ein Restriktionsenzym erzeugt wird, die durch den Pfeil angegeben ist.
  • Das Restriktionsenzym ist dann befähigt, die verlängerte Kette zu schneiden, wobei das Akzeptor-Molekül (7) vom Donor-Molekül (6) freigesetzt und ein Signal (1F) erzeugt wird.
  • Bei dem Verfahren von 2 nimmt die Sonde (8) die Form eines Molecular Beacons an, der am 5'-Ende eines Amplifizierungsprimers (9) angebracht ist. Der Sonde-Primer-Komplex wird an einem Ende der Target-Sequenz gebunden, wenn sie vorliegt und zur einsträngigen Form geschmolzen ist. Die Verlängerung des Primers im ersten Zyklus ergibt einen Amplicon-Strang (10) mit der Molecular Beacon-Struktur, die an ihrem 5'-Ende angehängt ist. Während des nachfolgenden Amplifizierungszyklus wird der entgegengesetzte Amplifizierungsprimer am 3'-Ende des Amplicon-Strangs (10) gebunden; die Verlängerung dieses Strangs öffnet die Struktur des Molecular Beacons und macht sie ferner über ihre Länge doppelsträngig. Die so gebildete doppelsträngige Stelle für das Restriktionsenzym kann dann durch dieses Enzym geschnitten werden (2D), wodurch ferner noch das Donor-Molekül vom Akzeptor-Molekül getrennt wird (2E) und somit ein verstärktes Fluoreszenzsignal erzeugt wird.
  • Bei dem in 3 erläuterten V erfahren wird die Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von modifizierten Nucleotiden (11) wie etwa von methylierten Nucleotiden vorgenommen. Als Ergebnis sind die Amplicon-Stränge (12) gegenüber dem Restriktionsenzym resistent, obwohl das Enzym seine Restriktionsstelle (durch den weißen Pfeil angegeben – 3D) erkennt, wenn die doppelsträngige Form vorliegt. Wenn der Amplicon-Strang (12) mit der Sonde hybridisiert ist, die keine modifizierten Nucleotide enthält, liegt im Ergebnis ein "Schlitz" (13) in der Sonde vor, während der Amplicon-Strang intakt bleibt. Beim anschließenden Schmelzen (3F) werden das Donor-Molekül und das Akzeptor-Molekül voneinander getrennt, wodurch das Donor-Molekül ein verstärktes Signal erzeugen kann, das erfasst werden kann.
  • Das Schneiden mit einem Restriktionsenzym stellt ein schnelles und wirksames Mittel zur Trennung des Akzeptor-Moleküls vom Donor-Molekül dar, wodurch die Geschwindigkeit der Erfassung verbessert wird. Darüber hinaus wird durch die Sicherstellung einer schnellen und vollständigen Trennung des Akzeptor-Moleküls vom Donor-Molekül das Signal/Rausch-Verhältnis gegenüber dem unter Verwendung der herkömmlichen Molecular Beacon-Technologie erzielbaren Signal/Rausch-Verhältnis erhöht.
  • Das nachfolgende Beispiel dient der Erläuterung.
  • Demonstration 1
  • Test-Amplifizierungsreaktionen
  • Ein Amplicon des Anticoagulase-Gens von Yersinia pestis mit 104 Basenpaaren wurde in den pBluescript SK-Vektor (Stratagene) unter Bildung des pYP100ML-Phagemid-Konstrukts geklont. Das Konstrukt pYP100ML wurde amplifiziert, wobei ein Vorwärts-Primer YPPA155 der Sequenz
    dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC (SEQ ID NO 1) und
    ein Rückwärts-Primer YPP229R der Sequenz
    dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT (SEQ ID NO 2)
    verwendet wurden.
  • Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
    Primer jeweils 1 µM (Endkonzentration)
    dNTPs jeweils 200 µM (Endkonzentration)
    TAQ 0,025 U/µl Endkonzentration
    Puffer: 250 ng/µl Rinderserumalbumin, 500 mM Tris, pH 8,3, 20 mM Magnesium.
  • Das Gemisch wurde dann 30 Zyklen unter folgenden Bedingungen unterworfen:
    Figure 00170001
  • Die Amplifizierung erforderte weniger als 6 Minuten.
  • Demonstration 2
  • Es wurde eine Sonde (YPPAMP) hergestellt, die am 5'-Ende mit Fluorescein als Donor und 10 Basenpaare stromab davon mit Cy5 als Akzeptor markiert war. Die Sequenz der Sonde ist
    5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT 3'
    (SEQ ID NO 3),
    wobei X die Position von Cy5 darstellt.
  • Diese Sonde sollte befähigt sein, bei der oben angegebenen PCR-Reaktion als Rückwärtsprimer zu wirken. Zwischen diesen beiden fluoreszierenden Molekülen befindet sich eine Taq 1-Restriktionsstelle (TCGA), die in der Sequenz mit "/" markiert ist. Das 3'-Ende wurde nicht phosphoryliert und kann so in der PCR-Reaktion verlängert werden.
  • Die Endonuclease Taq 1 (Sigma), ein Enzym vom Typ II, spaltet die doppelsträngige DNA an diesem spezifischen Bereich. Dabei wird der Fluorescein-Donor vom Cy5-Akzeptor getrennt, was die Grundlage der Erfassung bildet. Die Sonde war so ausgelegt, dass die zusätzlichen Nucleotide am 5'-Ende eingebracht wurden und das resultierende Produkt pYP100ML unverändert blieb. Das Amplicon enthält in diesem Fall keine Taq 1-Stellen.
  • Das Donor-Molekül und das Akzeptor-Molekül befinden sich in hinreichend naher Nachbarschaft an der Sonde, dass FRET eintreten kann. Wenn allerdings das Enzym Taq 1 das Amplicon spaltet, wird der Donor freigesetzt, und es tritt keine FRET mehr auf.
  • Die Sonde YPPAMP wurde dann in einer PCR-Reaktion eingesetzt, die optimiert worden war. Die Sonde YPPAMP wurde bei einer Konzentration von 2 µM mit einem Gerät Perkin Elmer 9700 in einer pYP100ML-Amplifizierung eingebracht. Das Programm umfasste 30 Zyklen wie folgt:
    Figure 00180001
  • Die Produkte wurden durch Gelelektrophorese an Agarose analysiert. Die Produktbande ergab sich bei Anwendung der Gelelektrophorese an Agarose als größer als das native Fragment pYP100ML mit 104 Basenpaaren, was nahelegt, dass die Sonde das Target erfolgreich amplifizierte.
  • Beispiel 1
  • Danach wurde eine Amplifizierungsreaktion, wie sie oben unter Demonstration 1 beschrieben wurde, mit der Sonde YPPAMP unter Ersatz des Rückwärts-Primers YPP229R wiederholt.
  • Nach der Amplifizierung wurde das Restriktionsenzym Taq 1 zusammen mit dNTPs und Palette Buffer Black (Sigma) zu dem PCR-Produkt zugegeben. Palette Buffer Black enthält NaCl, das für die Endonuclease-Aktivität von Taq 1 erforderlich ist. Die Reaktion wurde in einem Zyklus wie folgt durchgeführt:
    Figure 00190001
  • Dieses Programm aktiviert die Spaltungsaktivität der Endonuclease, die das Ende des Fragments abschneidet. Eine Negativkontrolle wurde ohne Enzym durchgeführt, und die Fragmente wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Das erhaltene Bandenmuster zeigte an, dass das Fragment durch das Restriktionsenzym geschnitten worden war.
  • Sowohl die durch das Enzym geschnittene Probe als auch die Kontrollprobe wurden unter Verwendung eines Fluorimeters analysiert. Das PCR-Produkt wurde so verdünnt, dass die Konzentration der Sonde bei der Reaktion 0,1 µM betrug. Bei höherer Konzentration war das Fluoreszenzsignal für die LightCyclerTM-Detektoren zu intensiv. Das Fluorescein-Fluoreszenzsignal war höher als das von Cy5 bei den Testproben, was nahelegt, dass das Fluorescein freigesetzt wurde und Cy5 nicht nahe genug war, um seine Fluoreszenzenergie zu quenchen.
  • Die Kontrollproben ergaben hohe Messwerte der Cy5-Fluoreszenz, was nahelegt, dass noch FRET auftrat. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Sonde amplifizierte und die Endonuclease bei der Entfernung des Endes des Fragments wirksam war.
  • Beispiel 2
  • Die oben beschriebene Sonde YPPAMP und die Endonuclease Taq 1 wurden bei einer Amplifizierungsreaktion unter Verwendung des LightCyclerTM-Systems eingesetzt. Das untenstehende Programm umfasste 40 Zyklen wie folgt:
    Figure 00200001
  • Die Zeit für die Verlängerung ist gegenüber der üblichen pYP100ML-Amplifizierung erhöht, sodass das Enzym Zeit hat, das Fragment zu schneiden.
  • Die Fluoreszenz wurde in jedem Zyklus einmal gemessen; die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Mit der Amplifizierung des Produkts stieg die Fluoreszein-Fluoreszenz an, was nahelegt, dass die fluoreszierenden Moleküle getrennt werden.
  • Beispiel 3
  • Zur Verbesserung des Signals wurde die Sonde YPPAMP bei 0,5 µM in zwei gleichen Amplifizierungsreaktionen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben worden waren, ohne Taq 1 eingesetzt. Wiederum wurde eine negative Kontrolle bei Abwesenheit von DNA durchgeführt. Das Programm war das übliche Amplifizierungsprogramm für pYP100ML und umfasste 30 Zyklen wie folgt:
    Figure 00210001
  • Nach der PCR-Amplifizierung wurde ein enzymatischer Abbau des PCR-Produkts mit Taq 1, dNTPs und Palette Buffer Black durchgeführt. Das Programm für den enzymatischen Abbau war ein Zyklus wie folgt:
    Figure 00210002
  • 5 zeigt die Ergebnisse, die als Verhältnis der Fluoreszenzsignale von Fluorescein/Cy5 (F1/F2) in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt sind. Mit fortschreitender Zeit steigt die Fluoreszenz bei den beiden oberen Kurven (A) und (B) an, die positive Proben sind. Die Ergebnisse sind ebenfalls in 6 in Form des Verhältnisses F1/1 in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Ein kontinuierlicher Anstieg der Fluorescein-Fluoreszenz ist klar erkennbar, da Taq 1 das Ende des Fragments abbaut, wodurch das Fluorescein freigesetzt wird. Möglicherweise aufgrund einer Verunreinigung stieg die Fluoreszenz der negativen Probe (Kurve C) leicht an, jedoch war die Fluoreszenz deutlich erheblich geringer als die der positiven Proben. Das pYP100ML-Amplicon liegt in der Umgebungsluft vor, und lediglich ein einziges Amplicon aus der Luft genügt für eine Amplifizierung in einer Amplifizierungsreaktion.
  • Bei der Darstellung in Form eines Diagramms von F2/1 in Abhängigkeit von der Zeit (7) ist die Abnahme der Fluoreszenz sichtbar, wenn die FRET zwischen Fluorescein und Cy5 stoppt.
  • Beispiel 4
  • Sondenabbauversuche
  • Eine Probe der Sonde YPPAMP wurde mit Taq 1 während einer Zeitdauer von 60 Minuten unter den in Beispiel 3 aufgeführten Bedingungen abgebaut.
  • 8 zeigt die Fluoreszenz bei der Wellenlänge des Donors und des Akzeptors in Abhängigkeit von der Zeit, wenn die Sonde durch das Restriktionsenzym geschnitten wird.
  • Anfänglich ist die Sonde intakt, wobei ein hohes Cy5-Signal (B) und ein niederes Fluorescein-Signal vorliegen. Wenn die Sonde geschnitten wird, steigt das Fluorescein-Signal (A) an, da Fluorescein von der Sonde freigesetzt wird, und es tritt ein Abfall des Cy5-Signals auf, da die Moleküle sich nicht mehr in enger Nachbarschaft befinden, als dass noch FRET eintreten könnte. 9 veranschaulicht die relative Fluoreszenz F1/F2 (Fluorescein/Cy5) in Abhängigkeit von der Zeit. Das Diagramm zeigt insgesamt einen kontinuierlichen Anstieg als Ergebnis des Schneidens der Sonde.

Claims (29)

  1. Verfahren zur Erfassung einer Nucleinsäure-Amplifizierung in einer Probe, das umfasst: Durchführen einer Nucleinsäure-Amplifizierung an einem Target-Polynucleotid in Gegenwart (a) einer Nucleinsäurepolymerase, (b) eines Primers, der befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und (c) einer Oligonucleotid-Sonde, die befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und ein Fluoreszenz-Donor-Molekül und ein Fluoreszenz-Akzeptor-Molekül, die über seine Länge in einem Abstand voneinander beabstandet sind, bei dem die Fluoreszenz vom Donor durch den Akzeptor verringert ist, und eine einzelsträngige Sequenz aufweist, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird, das diese Sequenz schneidet, wenn sie in doppelsträngiger Form vorliegt, wobei diese Sequenz zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül angeordnet ist, Anwenden des Restriktionsenzyms auf das Amplifizierungsprodukt, so dass das doppelsträngige Amplifizierungsprodukt so gespalten wird, dass das Akzeptor-Molekül vom Donor-Molekül freigesetzt wird, und Erfassen eines Fluoreszenzsignals von der Probe, wobei die Oligonucleotid-Sonde befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid im Bereich seines 3'-Endes so zu hybridisieren, dass das 3'-Ende des Polynucleotids während der Amplifizierung unter Bildung eines komplementären Bereichs der Sonde verlängert werden kann.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Restriktionsenzym während der gesamten Amplifizierungsreaktion vorliegt, und das Fortschreiten der Amplifizierungsreaktion durch Messung der Zunahme des Signals vom Donor-Molekül überwacht wird.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Restriktionsenzym Taq 1 oder PspG 1 ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Nucleinsäurepolymerase eine thermostabile Polymerase ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Sonde solche komplementären Sequenzen im 5'- und 3'-Bereich aufweist, dass der 5'-Bereich und der 3'-Bereich vor der Bindung an die Target-Polynucleotidsequenz eine Bindung miteinander eingehen.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Donor-Molekül ein Fluorescein-Farbstoff ist.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Akzeptor-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff oder Cy5 ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Donor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 3'-Endes der Sonde angebracht ist und das Akzeptor-Molekül im Bereich des 5'-Endes der Sonde angebracht ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Donor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 5'-Endes der Sonde angebracht ist und das Akzeptor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 3'-Endes der Sonde angebracht ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von modifizierten Nucleotiden durchgeführt wird, die gegen Schneiden durch Restriktionsenzyme resistent sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die modifizierten Nucleotide methylierte Nucleotide sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem das Restriktionsenzym an seiner Wirkung gehindert wird, bis die Amplifizierungsreaktion so weit fortgeschritten ist, dass mindestens etwas Amplicon-Produkt vorliegt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Restriktionsenzym vom Rest des Reaktionsgemischs getrennt gehalten wird, bis etwas Amplicon-Produkt erhalten ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Restriktionsenzym durch eine schmelzbare Barriere zurückgehalten wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Restriktionsenzym durch das Vorliegen eines Antikörpers inhibiert wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Restriktionsenzym ein Enzym ist, das lediglich dann aktiv wird, wenn es bestimmten Temperaturen ausgesetzt wird.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem die Amplifizierungsreaktion durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vorgenommen wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die Sonde am 5'-Ende eines Amplifizierungsprimers angebracht ist.
  19. Verfahren zur Feststellung der Aktivität eines Restriktionsenzyms, das umfasst: Durchführen einer Nucleinsäure-Amplifizierung an einer bekannten Menge eines Target-Polynucleotids in Gegenwart (a) einer Nucleinsäurepolymerase, (b) eines Primers, der befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und (c) einer Oligonucleotid-Sonde, die befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und ein Fluoreszenz-Donor-Molekül und ein Fluoreszenz-Akzeptor-Molekül, die über seine Länge in einem Abstand voneinander beabstandet sind, bei dem die Fluoreszenz vom Donor durch den Akzeptor verringert ist, und eine einzelsträngige Sequenz aufweist, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird, das diese Sequenz schneidet, wenn sie in doppelsträngiger Form vorliegt, wobei diese Sequenz zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül angeordnet ist, Anwenden des Restriktionsenzyms auf das Amplifizierungsprodukt, so dass das doppelsträngige Amplifizierungsprodukt so gespalten wird, dass das Akzeptor-Molekül vom Donor-Molekül freigesetzt wird, und Erfassen eines Fluoreszenzsignals von der Probe, wobei das Fluoreszenzsignal ein Maß für die Aktivität des Enzyms darstellt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Oligonucleotid-Sonde befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid im Bereich seines 3'-Endes so zu hybridisieren, dass das 3'-Ende des Polynucleotids während der Amplifizierung eines komplementären Bereichs der Sonde verlängert werden kann.
  21. Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die ein Donor-Molekül und ein Akzeptor-Molekül sowie eine Stelle für ein Restriktionsenzym aufweist, das die doppelsträngige DNA-Sequenz, die sich zwischen dem Donor-Molekül und dem Akzeptor-Molekül befindet, an einer spezifischen Stelle schneidet, in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Sonde solche komplementären Sequenzen im 5'- und 3'-Bereich aufweist, dass der 5'-Bereich und der 3'-Bereich vor der Bindung an die Target-Polynucleotidsequenz eine Bindung miteinander eingehen.
  23. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Donor-Molekül ein Fluorescein-Farbstoff und das Akzeptor-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff oder Cy5 ist.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei in der Sonde das Donor-Molekül durch mindestens 15 Nucleotide vom Akzeptor-Molekül getrennt ist.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das Donor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 3'-Endes der Sonde angebracht ist und das Akzeptor-Molekül im Bereich des 5'-Endes der Sonde angebracht ist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei das Donor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 5'-Endes der Sonde angebracht ist und das Akzeptor-Molekül an einem Nucleotid im Bereich des 3'-Endes der Sonde angebracht ist.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei die Oligonucleotid-Sonde am 5'-Ende eines Amplifizierungsprimers angebracht ist.
  28. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, der umfasst: eine Oligonucleotid-Sonde, die befähigt ist, mit einem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und ein Fluoreszenz-Donor-Molekül, ein Fluorezenz-Akzeptor-Molekül und eine einzelsträngige Sequenz aufweist, die durch ein Restriktionsenzym erkannt wird, das diese Sequenzschneidet, wenn sie in doppelsträngiger Form vorliegt, wobei diese Sequenz zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül angeordnet ist, ein Restriktionsenzym, das befähigt ist, die Sonde zwischen dem Akzeptor-Molekül und dem Donor-Molekül zu schneiden, und ein modifiziertes Nucleotid, das befähigt ist, eine Nucleotidkette zu erzeugen, die gegen Restriktionsenzyme resistent ist.
  29. Kit nach Anspruch 28, bei dem das modifizierte Nucleotid ein methyliertes Nucleotid ist.
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