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Die
vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Erfassung der Amplifizierung
eines Target-Polynucleotids (zuweilen auch als Polynucleinsäure bekannt)
an, bevorzugt ein Verfahren zur quantitativen Erfassung, ferner
auch Sonden zur Verwendung bei diesen Verfahren.
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Bekannte
Techniken zur Überwachung
der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) über
die Fluoreszenz umfassen sowohl strangspezifische als auch generische
DNA-Interkalierungstechniken, die auf einigen wenigen Temperaturzyklus-PCR-Vorrichtungen
der zweiten Generation eingesetzt werden können.
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Bei
generischen Verfahren werden DNA-Interkalationsfarbstoffe eingesetzt,
die eine erhöhte
Fluoreszenz zeigen, wenn sie an doppelsträngige DNA-Species gebunden
sind. Die Erhöhung
der Fluoreszenz aufgrund eines Anstiegs in der Bulk-Konzentration
an DNA während
der Amplifizierungen kann zur Messung des Fortschreitens der Reaktion
und zur Bestimmung der Kopienzahl des Target-Moleküls herangezogen
werden. Diese Verfahren sind allerdings lediglich quasi-strangspezifisch,
da irgendeine stattfindende nichtspezifische Amplifizierung doppelsträngige DNA
erzeugt und somit eine Signalerhöhung
hervorruft.
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Bei
strangspezifischen Verfahren werden zusätzliche Polynucleotideaktionskomponenten
zur Überwachung
des Fortschritts der Amplifizierungsreaktionen verwendet. Bei diesen
Verfahren wird die Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) als Basis
für die
Detektion herangezogen. Eine oder mehrere Polynucleotidsonden werden
mit fluoreszierenden Molekülen,
einem Donor-Molekül
und einem Akzeptor-Molekül (zuweilen
auch als Reporter-Molekül
beziehungsweise als Quencher-Molekül bekannt), markiert. Das Donor-Molekül wird mit
einer spezifischen Lichtwellenlänge
angeregt, bei der es normalerweise eine Fluoreszenzemissionswellenlänge zeigt.
Das Akzeptor-Molekül
wird bei der Emissionswellenlänge
derart hoch angeregt, dass es die Emissionsenergie des Donor-Moleküls durch
Resonanzübertragung
aufzunehmen vermag, wenn sich diese Moleküle in unmittelbarer Nachbarschaft
befinden (zum Beispiel am gleichen oder einem benachbarten Molekül). Die
FRET-Detektion beruht auf der Überwachung
der Änderungen
bei den Donor- und Akzeptor-Emissionswellenlängen. Es gibt zwei Arten von
FRET-Sonden, nämlich solche,
bei denen die Hydrolyse von Polynucleotidsonden dazu verwendet wird,
den Donor vom Akzeptor zu trennen, und solche, bei denen Hybridisierung
angewandt wird, um die räumliche
Beziehung von Donor-Molekül
und Akzeptor-Molekül zu ändern.
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Hydrolysesonden
sind als TaqManTM-Sonden im Handel erhältlich.
Sie bestehen aus DNA-Oligonucleotiden, die mit einem Donor- und
einem Akzeptor-Molekül
markiert sind. Die Sonden sind so ausgebildet, dass sie an einem
spezifischen Bereich an einem Strang eines PCR-Produkts binden.
Nach dem Reassoziieren des PCR-Primers
mit diesem Strang verlängert
das Enzym Taq die DNA mit 5'- an 3'-Polymerase-Aktivität. Das Enzym
Taq weist ferner auch 5'-
an 3'-Exonuclease-Aktivität auf. Die
TaqManTM-Sonden sind am 3'-Ende durch Phosphorylierung
geschützt,
um zu verhindern, dass sie für
die Taq-Verlängerung
als Primer wirken. Wenn die TaqManTM-Sonde
mit dem Produktstrang hybridisiert ist, kann ein verlängertes
Taq-Molekül die Sonde
ebenfalls hydrolysieren, wodurch der Donor vom Akzeptor freigesetzt
wird, was die Grundlage für
die Detektion bildet.
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Hybridisierungssonden
sind in einer Reihe von Formen erhältlich. Molecular Beacons sind
Oligonucleotide, die komplementäre
5'- und 3'-Sequenzen aufweisen,
sodass sie haarnadelförmige
Schleifen ausbilden. Bei der Ausbildung der Haarnadelstruktur befinden
sich endständige
Fluoreszenzmarkierungen in enger Nachbarschaft zueinander, sodass
FRET eintreten kann. Nach der Hybridisierung der Molecular Beacons
zu einer komplementären
Sequenz werden die Fluoreszenzmarkierungen getrennt, sodass keine
FRET eintritt; dies bildet die Grundlage für die Detektion. Eine Modifizierung
eines solchen Systems, bei dem der Molecular Beacon an einem Amplifizierungsprimer
angebracht wird, ist in Nucl. Acids. Res. (1997) 25, 12, 2516-2521, beschrieben.
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Das
von solchen Sequenzen erzeugte Signal ist allerdings durch die Länge der
Sonde begrenzt, da diese den begrenzenden Faktor beim Signal/Rausch-Verhältnis darstellt,
das erzielt werden kann.
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WO-A-96/21144
offenbart ein Verfahren zur Erfassung einer Amplifizierungsreaktion,
bei dem eine an beiden Enden fluoreszenzmarkierte Sonde sowie ein
Restriktionsenzym verwendet werden.
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Von
den Anmeldern wurde ein System entwickelt, das eine genaue Erfassung
und/oder Überwachung von
bestimmten Reaktionen einschließlich
Amplifizierungsreaktionen erlaubt.
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Die
Erfindung gibt daher ein Verfahren zur Erfassung einer Nucleinsäure-Amplifizierung
in einer Probe an, das umfasst: Durchführen einer Nucleinsäure-Amplifizierung
an einem Target-Polynucleotid
in Gegenwart
- (a) einer Nucleinsäurepolymerase,
- (b) eines Primers, der befähigt
ist, mit dem Target-Polynucleotid zu hybridisieren, und
- (c) einer Oligonucleotid-Sonde, die befähigt ist, mit dem Target-Polynucleotid zu
hybridisieren, und ein Fluoreszenz-Donor- Molekül, ein Fluoreszenz-Akzeptor-Molekül und eine
einzelsträngige
Sequenz aufweist, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird,
das diese Sequenz schneidet, wenn sie in doppelsträngiger Form
vorliegt, wobei diese Sequenz zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül angeordnet
ist,
Anwenden des Restriktionsenzyms auf das Amplifizierungsprodukt,
so dass das doppelsträngige
Amplifizierungsprodukt so gespalten wird, dass das Akzeptor-Molekül vom Donor-Molekül freigesetzt
wird, und
Erfassen eines Fluoreszenzsignals von dem Reaktionsgemisch,
wobei die Sonde so ausgebildet ist, dass die Oligonucleotid-Sonde
befähigt
ist, mit dem Target-Polynucleotid im Bereich des 3'-Endes des Polynucleotids zu
hybridisieren, das in Gegenwart der Polymerase verlängert werden
kann und den komplementären
Strang liefert, der in Form einer doppelsträngigen DNA mit der Oligonucleotid-Sonde
vorliegt. Die Restriktionsstelle befindet sich geeigneterweise im
Verlängerungsbereich.
In diesem Fall wirkt das Target-Polynucleotid selbst als Primer
für die
Verlängerung,
und während
einer Kettenverlängerungsreaktion
erstreckt sich die Polynucleotidsequenz längs der Länge der Sonde, wodurch sie
doppelsträngig
wird. Wenn dies eingetreten ist, kann das Restriktionsenzym den
verlängerten
Bereich schneiden, wodurch der Akzeptor von der Sonde freigesetzt
und so ein Signal erzeugt wird.
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Das
3'-Ende der Sonde
ist geeigneterweise 'blockiert', beispielsweise
durch Phosphorylierung, sodass es während der Verlängerungsphasen
des Amplifizierungstypus nicht in der Richtung des Polynucleotids
verlängert
wird.
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Dies
bedeutet, dass die Polymerase-Verlängerungsreaktion zu einer Verlängerung
des Target-Polynucleotidstrangs in dem Bereich führt, der zum Overhang-Bereich
der Sonde komplementär
ist, was zur Erzeugung einer doppelsträngigen Restriktionsstelle in
diesem Bereich führt.
Wenn das Enzym so ausgewählt
ist, dass sich die Restriktionsstelle nicht an einer anderen Stelle
im Amplicon befindet, führt
die Anwendung des Restriktionsenzyms nicht zum Schneiden innerhalb
der Target-Polynucleotidsequenz, sodass danach ein Produkt mit voller
Länge isoliert
werden kann.
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Das
Verfahren kann dazu herangezogen werden, das Vorliegen eines Target-Polynucleotids
in einer Probe zu erfassen. Wenn bei dem Verfahren der Erfindung
eine Amplifizierung erfasst wird, dann liegt das Target-Polynucleotid
in der Probe vor und wirkt als Matrize.
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Durch
Verwendung eines Restriktionsenzyms zur Freisetzung des Donor-Moleküls vom Akzeptor-Molekül wird die
Zeitverzögerung
vermieden, die beispielsweise auftritt, wenn mehrere Hydrolysereaktionen
erforderlich sind, um die Trennung herbeizuführen.
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Die
Trennung des Akzeptor-Moleküls
vom Donor-Molekül
ist ferner nicht so durch die Länge
der Sonde eingeschränkt,
weshalb ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis erzielt werden kann.
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Das
Verfahren der Erfindung kann zur Endpunkterfassung herangezogen
werden, wobei das Enzym nach der Amplifizierungsreaktion zugegeben
wird, oder das Enzym kann während
der gesamten Amplifizierungsreaktion vorliegen. Der letztgenannte
Fall eröffnet
die Möglichkeit
der Erfassung der Amplifizierungsreaktion in Echtzeit. In einigen
Fällen
können
allerdings die für
den enzymatischen Abbau erforderlichen Reagentien die Amplifizierungsreaktion
inhibieren. In diesen Fällen
kann eine Endpunkterfassung in einem separaten Röhrchen wünschenswert sein.
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Die
Oligonucleotid-Sonde kann so ausgelegt sein, dass sie die Stelle
für das
Restriktionsenzym innerhalb des Bereichs des Amplicons enthält. In diesem
Fall erfolgt die Detektion der Amplifizierung durch Zugabe des Restriktionsenzyms
zu der Reaktion bei vollständiger
Umsetzung. Das Enzym schneidet das Amplifizierungsprodukt zwischen
dem Donor-Molekül
und dem Akzeptor-Molekül
der Sonde und setzt so das Donor-Molekül frei, das ein Endpunktsignal
erzeugt. Dies kann für
PCR-Situationen in situ herangezogen werden. Die Verwendung hängt allerdings
davon ab, dass innerhalb des Amplicons eine Stelle vorliegt, die
mit der Sonde hybridisiert. Hinzu kommt, dass eine vollständige Isolierung
des Amplicons mit voller Länge
nach der Erfassung auf diese Weise nicht möglich sein kann.
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Alternativ
kann die Sonde an einem Amplifizierungsprimer angebracht werden.
In solchen Fällen
liegen bevorzugt sowohl das Akzeptor-Molekül als auch das Donor-Molekül an einem
nicht bindenden Bereich des Primers vor. Wenn das so erzeugte Amplicon
einem nachfolgenden Verlängerungszyklus
unter dem Einfluss des anderen Primers unterzogen wird, schließt die Verlängerungsreaktion
den gesamten Bereich der Sonde ein, wodurch die Restriktionsstelle
doppelsträngig
wird und dadurch vom Restriktionsenzym geschnitten werden kann.
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Wenn
das Restriktionsenzym während
der gesamten Amplifizierungsreaktion vorliegt, kann ferner das Fortschreiten
der Amplifizierungsreaktion selbst überwacht werden, da die Donor-Moleküle in Mengen
freigesetzt werden, die der Anzahl der im Reaktionsgemisch bei jedem
Zyklus der Amplifizierungsreaktion vorliegenden Amplicons proportional
sind. Der Anstieg des Signals von den Donor-Molekülen kann
beobachtet werden, und der Anstieg kann zum Beispiel zur Berechnung
der Menge des Target-Polynucleotids
verwendet werden, das in der Probe zu Beginn vorliegt, wobei die
Art einer Berechnung angewandt wird, die in Verbindung mit dem TaqManTM-System wohl bekannt ist.
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Restriktionsendonucleasen
sind Enzyme, die an doppelsträngigen
DNA-Molekülen
an spezifischen Basenpaarsequenzen, die als Restriktionsstellen
oder Erkennungsstellen bekannt sind, binden und dort spalten. Es
gibt drei Typen von Restriktionsenzymen. Jeder Typ besitzt zwei
spezifische Enzymaktivitäten,
die einer DNA-Methylase und die einer Endonuclease, welche die Spaltung
und Trennung der doppelsträngigen DNA
katalysieren.
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Restriktionsenzyme
vom Typ I besitzen Methylase-Aktivität und ATP-abhängige
Nuclease-Aktivität
im gleichen Molekül.
Die Methylierung tritt am Erkennungsort auf, und die Spaltung tritt
in einem Abstand vom Erkennungsort ein, da sich die DNA um das gebundene
Enzym herumschlingt. Die Enzyme vom Typ I und vom Typ III sind ähnlich.
Enzyme vom Typ III besitzen ebenfalls Methylase- und Nuclease-Aktivität im gleichen
Molekül.
Die Enzyme brauchen jedoch kein ATP, und die Spaltungsstelle liegt
näher am
Erkennungsort. Restriktionsenzyme vom Typ II spalten am Erkennungsort.
Sie erkennen Strukturen einer Länge
von vier oder mehr Nucleotiden. Jeder Enzymtyp spaltet auf unterschiedliche
Weise. Das Enzym kann an beiden Strängen an genau der gleichen
Stelle spalten, wodurch glatte Enden an der DNA gebildet werden.
Andere Enzyme können an
jedem Strang der DNA an symmetrischen Positionen spalten, wodurch
Fragmente mit einzelsträngigem Overhang
oder überstehenden
Enden gebildet werden. Sie können
Fragmente mit 3'-Overhang und 5'-Overhang erzeugen.
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Beim
Verfahren der Erfindung können
alle bekannten Restriktioinsenzyme verwendet werden, insbesondere,
wenn sie am Ende einer Amplifizierungsreaktion zugegeben werden,
wobei lediglich vorauszusetzen ist, dass sie, wenn ein spezielles Reaktionsprodukt
zu gewinnen ist, keine internen Stellen enthalten, die durch die
Enzyme erkannt werden. Restriktionsenzyme, die den bei der Reaktion
angewandten Bedingungen, zum Beispiel bei der Amplifizierungsreaktion,
widerstehen können,
sind thermostabile Enzyme.
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Ein
zur Verwendung beim Verfahren der Erfindung besonders geeignetes
Restriktionsenzym ist Taq 1. Dieses Restriktionsenzym ist, wie TAQ-Polymerase,
aus Thermus aquaticus erhältlich.
Es hält
entsprechend die Bedingungen aus, die während der bei Amplifizierungsreaktionen
durchgeführten
Zyklen auftreten, wie etwa bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Ein weiteres derartiges Enzym ist das thermostabile Restriktionsenzym "PspG 1" (New England Biolabs).
Dieses Enzym wird aus Pyrococcus sp. isoliert und erkennt CCWGG
und schneidet vor dem ersten C. Die Stabilität beträgt 2 Stunden bei 95 °C, und das
Enzym überlebt 30
Zyklen einer Block-PCR.
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Die
PCR-Reaktion ist ein bevorzugtes Amplifizierungsverfahren im Kontext
der Erfindung.
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Geeigneterweise
werden das Amplicon und/oder das Restriktionsenzym so ausgewählt, dass
der vom Enzym erkannte Ort im Amplicon nicht auftritt. Falls erforderlich,
können
verfügbare
Restriktionsenzyme isoliert, einer Mutation unterzogen oder so manipuliert
werden, dass sie bei den erforderlichen Reaktionstemperaturen thermostabil
sind.
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Die
im Verfahren der Erfindung verwendete Nucleinsäurepolymerase ist geeigneterweise
eine thermostabile Polymerase, wie etwa TAQ-Polymerase.
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Die
beim Verfahren der Erfindung verwendete Sonde kann die Form eines
Molecular Beacons annehmen, sodass sie vor der Hybridisierung mit
dem Target-Polynucleotid eine haarnadelartige Form annimmt. In diesem
Fall besitzt die Sonde komplementäre Sequenzen im 5'-Bereich und im 3'-Bereich, sodass
der 5'-Bereich und
der 3'-Bereich vor
der Bindung mit der Target-Polynucleotidsequenz
miteinander binden. Die Restriktion befindet sich in diesem Fall
in einem nicht komplementären
Bereich der Sonde, sodass sie einsträngig bleibt, bevor die Sonde
mit der Target-Sequenz
hybridisiert.
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Das
Donor-Molekül
wird geeigneterweise an einem Ende der Sonde angeordnet, und der
Akzeptor befindet sich am anderen Ende. Somit können das Donor-Molekül am 5'-Ende der Sonde und
der Akzeptor am 3'-Ende
angeordnet werden, oder umgekehrt. In solchen Fällen ist die Haarnadelanordnung
des Molecular Beacons besonders wirkungsvoll, da der Donor und der
Akzeptor vor der Hybridisierung mit der Target-Sequenz in enger
Nachbarschaft gehalten werden. Dadurch wird das Risiko eines unerwünschten
Untergrundsignals vom Donor-Molekül verringert.
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Bei
der Hybridisierung der Sonde mit der Target-Sequenz wird die Haarnadel
geöffnet,
wodurch das Akzeptor-Molekül
vom Donor-Molekül räumlich getrennt
und somit ein Signal erzeugt wird. Im Fall der Erfindung schneidet
allerdings das Restriktionsenzym das Sonden-Targetsequenz-Hybrid
zwischen dem Donor-Molekül
und dem Akzeptor-Molekül,
wodurch diese Reste weiter voneinander getrennt werden, wodurch das
Signal verstärkt
wird.
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Bei
einer weiteren Modifizierung davon wird die Sonde an einem ihrer
Enden am Amplifizierungsprimer angebracht. Die Sonde kann gegebenenfalls
in Form einer Haarnadel vorliegen. Der Bereich, der das Donor-Molekül und das
Akzeptor-Molekül
enthält,
sollte allerdings stromauf vom 3'-Ende
des Primers angeordnet sein. Die Verlängerung des Primers führt zu einem
Amplicon, bei dem die Sonde an seinem 5'-Ende hängt. Während eines nachfolgen den
Amplifizierungszyklus wird nach der Bindung des anderen Amplifizierungsprimers
an das entfernte Ende des Amplicons ein komplementärer Strang
gebildet. Dieser komplementäre
Strang wird während
der Kettenverlängerung
verlängert,
und zwar nicht nur längs
der Länge
der Targetkette, sondern auch über
die Probe hinweg, wodurch sie doppelsträngig wird und damit vom Restriktionsenzym
geschnitten werden kann.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von
modifizierten Nucleotiden durchgeführt, die gegenüber dem
Schneiden durch Restriktionsenzyme resistent sind. Beispiele für solche
Nucleotide sind methylierte Nucleotide. In diesem Fall enthält die in
dem Verfahren verwendete Sonde keine modifizierten Nucleotide. Dies
bedeutet, dass die bei der Reaktion erzeugten Amplicons restriktionsresistent
sind.
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Wenn
allerdings die Sonde mit einem Amplicon hybridisiert, wird sie durch
das Restriktionsenzym erkannt, das sie dann an der Restriktionsstelle
schneidet. Der komplementäre
Strang wird allerdings nicht geschnitten, und das Resultat davon
ist, dass die doppelsträngige
DNA lediglich "angeschnitten" ist. Beim anschließenden Schmelzen
der Sonde trennen sich das Akzeptor-Molekül und das Donor-Molekül, wodurch
ein modifiziertes Signal erzeugt wird, das erfasst werden kann.
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Diese
Ausführungsform
kann bei der Endpunkterfassung herangezogen werden, wobei das Restriktionsenzym
bei Vervollständigung
der Amplifizierung zugesetzt wird. Wenn es im Verlauf der Reaktion
verwendet werden soll, um zum Beispiel die Amplifizierung zu überwachern
und/oder quantitativ zu verfolgen, ist es notwendig, sicherzustellen,
dass das Restriktionsenzym das Target-Molekül (das allgemein nicht restriktionsresistent
ist) nicht vor dem Beginn der Amplifizierung aufschneidet. Dies
kann auf verschiedenen Wegen erzielt werden. Die Zugabe des Restriktionsenzyms
kann verzögert
werden, bis mindestens der erste Zyklus der Amplifizierung stattgefunden
hat. Dies kann automatisch vorgenommen werden, zum Beispiel unter
Anwendung der "Hot
start"-Techniken,
bei denen das Polymeraseenzym vom restlichen Reaktionsgemisch getrennt
gehalten wird, zum Beispiel mit einer Wachsbarriere, die lediglich
nach Erreichen der erwünschten
Temperaturniveaus schmilzt und das Enzym freisetzt. Ähnliche
Verfahren können
auch beim Assay der Erfindung angewandt werden, um das Restriktionsenzym
zurückzuhalten,
bis es im Prozess gebraucht wird. Alternativ können andere Mittel zur Unterdrückung einer
Reaktion angewandt werden, zum Beispiel durch Einbringen eines Antikörpers gegen
das Restriktionsenzym in das Reaktionsgemisch, der seine Aktivität inhibiert,
jedoch selbst bei der gewünschten
Temperatur denaturiert wird, oder durch Verwendung von Enzymen,
insbesondere modifizierten Enzymen, die im Stand der Technik bekannt
sind, wie zum Beispiel TAQ GoldTM, die ein
Erhitzen auf ein bestimmtes Niveau erfordern, bevor sie aktiviert
werden.
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Geeignete
Kombinationen von Donor- und Akzeptor-Molekülen sind im Stand der Technik
bekannt. So können
zum Beispiel das Donor-Molekül ein Fluorescein-Farbstoff
und das Akzeptor-Molekül
ein Rhodamin-Farbstoff sein.
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Geeignete
Bedingungen, unter denen die Amplifizierungsreaktion durchgeführt werden
kann, sind im Stand der Technik bekannt. Die optimalen Bedingungen
können
je nach dem speziellen betreffenden Amplicon, der Art der verwendeten
Primer und der Art der angewandten Enzyme in jedem Fall variieren.
Die optimalen Bedingungen können
in jedem Fall von Fachleuten ermittelt werden. Typische Denaturierungstemperaturen
liegen bei größenordnungsmäßig 95 °C, typische
Reassoziierungstemperaturen liegen bei größenordnungsmäßig bei
55 °C, und
Verlängerungstemperaturen
liegen bei größenordnungsmäßig 72 °C.
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Das
Verfahren der Erfindung kann zur Anwendung bei der Qualitätskontrolle
von Enzymen angepasst werden, wobei das Enzym eine Restriktionsendonuclease
ist. Gegenwärtig
wird bei der Enzymqualitätskontrolle
eine Einheitsaktivität
angewandt, welche die Konzentration bei speziellen Niveaus des aktiven
Enzyms bestimmt. Wenn allerdings das Enzym beim Verfahren der Erfindung
als Restriktionsenzym verwendet werden soll, wobei das Vorliegen
oder die Menge des Target-Polynucleotids in der Probe bekannt ist,
kann die Qualität des
Enzyms durch seine Fähigkeit
beurteilt werden, ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen, das die Trennung
des Signals von den fluoreszierenden Sonden anzeigt, wodurch eine
genauere Aktivitätsmessung
ermöglicht
wird.
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Die
Verwendung von Oligonucleotid-Sonden bei den oben beschriebenen
Verfahren bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Diese Sonden
enthalten insbesondere ein Donor-Molekül und ein Akzeptor-Molekül sowie
eine Stelle für
ein Restriktionsenzym, das an einer spezifischen doppelsträngigen DNA-Sequenz schneidet,
die sich zwischen dem Donor-Molekül und dem Akzeptor-Molekül befindet.
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Die
Sonden können
andere Merkmale aufweisen, wie oben erläutert. So kann die Sonde zum
Beispiel in Form eines Molecular Beacons vorliegen, sodass sie komplementäre Sequenzen
im 5'-Bereich und
im 3'-Bereich aufweist,
die aneinander binden.
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Beispiele
für geeignete
Donor-Moleküle
sind Fluorescein-Farbstoffe, wie Fluorescein, und das Akzeptor-Molekül kann ein
Rhodamin- Farbstoff
oder ein anderer Farbstoff wie etwa Cy5 sein, jedoch können auch beliebige
andere Farbstoffkombinationen verwendet werden, die zu FRET-Wechselwirkungen
in der Lage sind.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung umfasst einen Kit zur Durchführung eines
Verfahrens wie oben beschrieben, wobei der Kit eine Sonde, wie sie
oben beschrieben wurde, sowie ein Restriktionsenzym enthält, das
befähigt
ist, die Sonde zwischen dem Akzeptor-Molekül und dem Donor-Molekül zu schneiden.
Der Kit enthält
ferner ein modifiziertes Nucleotid, das befähigt ist, eine Nucleotidkette
zu erzeugen, die gegen Restriktionsenzyme resistent ist, zum Beispiel
methylierte Nucleotide.
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezug auf
die beigefügten
schematischen Zeichnungen näher
erläutert:
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1 zeigt schematisch Stufen der Reaktion,
die eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung bildet;
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2 erläutert
ein Verfahren, das nicht in den Rahmen der Erfindung fällt;
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3 erläutert
ein weiteres Verfahren, das nicht in den Rahmen der Erfindung fällt;
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4 ist
ein Diagramm, das die Abhängigkeit
der Fluoreszenz von einem Donor-Molekül von der Zeit bei einer PCR-Reaktion
gemäß der Erfindung
zeigt;
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5 ist
ein Diagramm, welches das Verhältnis
der Fluoreszenz des Donors zur Fluoreszenz des Akzeptors bei einem
Endpunkt-PCR-Assay
der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive Reaktionen und (C) eine
negative Kontrolle darstellen;
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6 ist
ein Diagramm, welches das Verhältnis
der Fluoreszenz des Donors zur Fluoreszenz des Akzeptors bei einem
Endpunkt-PCR-Assay
der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive Reaktionen und (C) eine
negative Kontrolle darstellen;
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7 ist
ein Diagramm, das die Abhängigkeit
der Donor-Fluoreszenz
von der Zeit für
ein Endpunkt-PCR-Assay der Erfindung zeigt, wobei (A) und (B) positive
Reaktionen und (C) eine negative Kontrolle darstellen;
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8 ist
ein Diagramm, das die Änderung
der Fluoreszenz des Donors (A) und des Akzeptors (B) in Abhängigkeit
von der Zeit in Gegenwart eines Restriktionsenzyms zeigt, das zwischen
dem Donor und dem Akzeptor schneidet, und
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9 ist
ein Diagramm, das kumulativ die Erhöhung der Fluoreszenz im Verlauf
der Reaktion zeigt, die zu 8 führt.
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Bei
der dargestellten Amplifizierungsreaktion wird ein DNA-Molekül (1)
zuerst einzelsträngig
gemacht (1B). Zwei Amplifizierungsprimer (2),
(3) binden als Forward-Primer und Reverse-Primer bei einer
Amplifizierungsreaktion, wie wohl bekannt ist. Das Ergebnis ist
ein Amplicon-Produkt (4), das lediglich die Target-Sequenz
enthält.
Wenn dieses Produkt während
der nachfolgenden Phase der Amplifizierung dem Schmelzen unterworfen
wird, bindet die Sonde (5), die ein Donor-Molekül (6)
und ein Akzeptor-Molekül
(7) enthält,
am 3'-Ende der Target-Sequenz
(1D). In Gegenwart einer DNA-Polymerase verlängert sich
die Target-Sequenz längs
des Overhang-Bereichs der Sonde, wodurch eine doppelsträngige Stelle
für ein
Restriktionsenzym erzeugt wird, die durch den Pfeil angegeben ist.
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Das
Restriktionsenzym ist dann befähigt,
die verlängerte
Kette zu schneiden, wobei das Akzeptor-Molekül (7) vom Donor-Molekül (6)
freigesetzt und ein Signal (1F) erzeugt wird.
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Bei
dem Verfahren von 2 nimmt die Sonde
(8) die Form eines Molecular Beacons an, der am 5'-Ende eines Amplifizierungsprimers
(9) angebracht ist. Der Sonde-Primer-Komplex wird an einem
Ende der Target-Sequenz gebunden, wenn sie vorliegt und zur einsträngigen Form
geschmolzen ist. Die Verlängerung des
Primers im ersten Zyklus ergibt einen Amplicon-Strang (10)
mit der Molecular Beacon-Struktur, die an ihrem 5'-Ende angehängt ist.
Während
des nachfolgenden Amplifizierungszyklus wird der entgegengesetzte Amplifizierungsprimer
am 3'-Ende des Amplicon-Strangs
(10) gebunden; die Verlängerung
dieses Strangs öffnet
die Struktur des Molecular Beacons und macht sie ferner über ihre
Länge doppelsträngig. Die
so gebildete doppelsträngige
Stelle für
das Restriktionsenzym kann dann durch dieses Enzym geschnitten werden
(2D), wodurch ferner noch das Donor-Molekül vom Akzeptor-Molekül getrennt
wird (2E) und somit ein verstärktes Fluoreszenzsignal erzeugt
wird.
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Bei
dem in 3 erläuterten V erfahren wird die
Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von modifizierten Nucleotiden
(11) wie etwa von methylierten Nucleotiden vorgenommen.
Als Ergebnis sind die Amplicon-Stränge (12) gegenüber dem
Restriktionsenzym resistent, obwohl das Enzym seine Restriktionsstelle (durch
den weißen
Pfeil angegeben – 3D)
erkennt, wenn die doppelsträngige
Form vorliegt. Wenn der Amplicon-Strang (12) mit der Sonde
hybridisiert ist, die keine modifizierten Nucleotide enthält, liegt
im Ergebnis ein "Schlitz" (13) in
der Sonde vor, während
der Amplicon-Strang intakt bleibt. Beim anschließenden Schmelzen (3F)
werden das Donor-Molekül
und das Akzeptor-Molekül voneinander
getrennt, wodurch das Donor-Molekül ein verstärktes Signal erzeugen kann,
das erfasst werden kann.
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Das
Schneiden mit einem Restriktionsenzym stellt ein schnelles und wirksames
Mittel zur Trennung des Akzeptor-Moleküls vom Donor-Molekül dar, wodurch
die Geschwindigkeit der Erfassung verbessert wird. Darüber hinaus
wird durch die Sicherstellung einer schnellen und vollständigen Trennung
des Akzeptor-Moleküls
vom Donor-Molekül das Signal/Rausch-Verhältnis gegenüber dem
unter Verwendung der herkömmlichen Molecular
Beacon-Technologie erzielbaren Signal/Rausch-Verhältnis erhöht.
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Das
nachfolgende Beispiel dient der Erläuterung.
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Demonstration 1
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Test-Amplifizierungsreaktionen
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Ein
Amplicon des Anticoagulase-Gens von Yersinia pestis mit 104 Basenpaaren
wurde in den pBluescript SK-Vektor (Stratagene) unter Bildung des
pYP100ML-Phagemid-Konstrukts geklont. Das Konstrukt pYP100ML wurde
amplifiziert, wobei ein Vorwärts-Primer
YPPA155 der Sequenz
dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC (SEQ ID
NO 1) und
ein Rückwärts-Primer
YPP229R der Sequenz
dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT (SEQ ID
NO 2)
verwendet wurden.
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Die
PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
Primer jeweils 1 µM (Endkonzentration)
dNTPs
jeweils 200 µM
(Endkonzentration)
TAQ 0,025 U/µl Endkonzentration
Puffer:
250 ng/µl
Rinderserumalbumin, 500 mM Tris, pH 8,3, 20 mM Magnesium.
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Das
Gemisch wurde dann 30 Zyklen unter folgenden Bedingungen unterworfen:
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Die
Amplifizierung erforderte weniger als 6 Minuten.
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Demonstration 2
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Es
wurde eine Sonde (YPPAMP) hergestellt, die am 5'-Ende mit Fluorescein als Donor und
10 Basenpaare stromab davon mit Cy5 als Akzeptor markiert war. Die
Sequenz der Sonde ist
5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT
3'
(SEQ ID
NO 3),
wobei X die Position von Cy5 darstellt.
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Diese
Sonde sollte befähigt
sein, bei der oben angegebenen PCR-Reaktion als Rückwärtsprimer zu wirken. Zwischen
diesen beiden fluoreszierenden Molekülen befindet sich eine Taq
1-Restriktionsstelle
(TCGA), die in der Sequenz mit "/" markiert ist. Das
3'-Ende wurde nicht
phosphoryliert und kann so in der PCR-Reaktion verlängert werden.
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Die
Endonuclease Taq 1 (Sigma), ein Enzym vom Typ II, spaltet die doppelsträngige DNA
an diesem spezifischen Bereich. Dabei wird der Fluorescein-Donor
vom Cy5-Akzeptor getrennt, was die Grundlage der Erfassung bildet.
Die Sonde war so ausgelegt, dass die zusätzlichen Nucleotide am 5'-Ende eingebracht
wurden und das resultierende Produkt pYP100ML unverändert blieb.
Das Amplicon enthält
in diesem Fall keine Taq 1-Stellen.
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Das
Donor-Molekül
und das Akzeptor-Molekül
befinden sich in hinreichend naher Nachbarschaft an der Sonde, dass
FRET eintreten kann. Wenn allerdings das Enzym Taq 1 das Amplicon
spaltet, wird der Donor freigesetzt, und es tritt keine FRET mehr
auf.
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Die
Sonde YPPAMP wurde dann in einer PCR-Reaktion eingesetzt, die optimiert
worden war. Die Sonde YPPAMP wurde bei einer Konzentration von 2 µM mit einem
Gerät Perkin
Elmer 9700 in einer pYP100ML-Amplifizierung eingebracht. Das Programm
umfasste 30 Zyklen wie folgt:
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Die
Produkte wurden durch Gelelektrophorese an Agarose analysiert. Die
Produktbande ergab sich bei Anwendung der Gelelektrophorese an Agarose
als größer als
das native Fragment pYP100ML mit 104 Basenpaaren, was nahelegt,
dass die Sonde das Target erfolgreich amplifizierte.
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Beispiel 1
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Danach
wurde eine Amplifizierungsreaktion, wie sie oben unter Demonstration
1 beschrieben wurde, mit der Sonde YPPAMP unter Ersatz des Rückwärts-Primers
YPP229R wiederholt.
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Nach
der Amplifizierung wurde das Restriktionsenzym Taq 1 zusammen mit
dNTPs und Palette Buffer Black (Sigma) zu dem PCR-Produkt zugegeben.
Palette Buffer Black enthält
NaCl, das für
die Endonuclease-Aktivität
von Taq 1 erforderlich ist. Die Reaktion wurde in einem Zyklus wie
folgt durchgeführt:
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Dieses
Programm aktiviert die Spaltungsaktivität der Endonuclease, die das
Ende des Fragments abschneidet. Eine Negativkontrolle wurde ohne
Enzym durchgeführt,
und die Fragmente wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Das
erhaltene Bandenmuster zeigte an, dass das Fragment durch das Restriktionsenzym
geschnitten worden war.
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Sowohl
die durch das Enzym geschnittene Probe als auch die Kontrollprobe
wurden unter Verwendung eines Fluorimeters analysiert. Das PCR-Produkt
wurde so verdünnt,
dass die Konzentration der Sonde bei der Reaktion 0,1 µM betrug.
Bei höherer
Konzentration war das Fluoreszenzsignal für die LightCyclerTM-Detektoren zu intensiv.
Das Fluorescein-Fluoreszenzsignal war höher als das von Cy5 bei den
Testproben, was nahelegt, dass das Fluorescein freigesetzt wurde
und Cy5 nicht nahe genug war, um seine Fluoreszenzenergie zu quenchen.
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Die
Kontrollproben ergaben hohe Messwerte der Cy5-Fluoreszenz, was nahelegt,
dass noch FRET auftrat. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Sonde
amplifizierte und die Endonuclease bei der Entfernung des Endes
des Fragments wirksam war.
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Beispiel 2
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Die
oben beschriebene Sonde YPPAMP und die Endonuclease Taq 1 wurden
bei einer Amplifizierungsreaktion unter Verwendung des LightCycler
TM-Systems eingesetzt. Das untenstehende
Programm umfasste 40 Zyklen wie folgt:
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Die
Zeit für
die Verlängerung
ist gegenüber
der üblichen
pYP100ML-Amplifizierung
erhöht,
sodass das Enzym Zeit hat, das Fragment zu schneiden.
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Die
Fluoreszenz wurde in jedem Zyklus einmal gemessen; die Ergebnisse
sind in 4 dargestellt. Mit der Amplifizierung
des Produkts stieg die Fluoreszein-Fluoreszenz an, was nahelegt,
dass die fluoreszierenden Moleküle
getrennt werden.
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Beispiel 3
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Zur
Verbesserung des Signals wurde die Sonde YPPAMP bei 0,5 µM in zwei
gleichen Amplifizierungsreaktionen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben
worden waren, ohne Taq 1 eingesetzt. Wiederum wurde eine negative
Kontrolle bei Abwesenheit von DNA durchgeführt. Das Programm war das übliche Amplifizierungsprogramm
für pYP100ML
und umfasste 30 Zyklen wie folgt:
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Nach
der PCR-Amplifizierung wurde ein enzymatischer Abbau des PCR-Produkts
mit Taq 1, dNTPs und Palette Buffer Black durchgeführt. Das
Programm für
den enzymatischen Abbau war ein Zyklus wie folgt:
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5 zeigt
die Ergebnisse, die als Verhältnis
der Fluoreszenzsignale von Fluorescein/Cy5 (F1/F2) in Abhängigkeit
von der Zeit dargestellt sind. Mit fortschreitender Zeit steigt
die Fluoreszenz bei den beiden oberen Kurven (A) und (B) an, die
positive Proben sind. Die Ergebnisse sind ebenfalls in 6 in
Form des Verhältnisses
F1/1 in Abhängigkeit
von der Zeit dargestellt. Ein kontinuierlicher Anstieg der Fluorescein-Fluoreszenz
ist klar erkennbar, da Taq 1 das Ende des Fragments abbaut, wodurch
das Fluorescein freigesetzt wird. Möglicherweise aufgrund einer
Verunreinigung stieg die Fluoreszenz der negativen Probe (Kurve
C) leicht an, jedoch war die Fluoreszenz deutlich erheblich geringer
als die der positiven Proben. Das pYP100ML-Amplicon liegt in der
Umgebungsluft vor, und lediglich ein einziges Amplicon aus der Luft
genügt
für eine
Amplifizierung in einer Amplifizierungsreaktion.
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Bei
der Darstellung in Form eines Diagramms von F2/1 in Abhängigkeit
von der Zeit (7) ist die Abnahme der Fluoreszenz
sichtbar, wenn die FRET zwischen Fluorescein und Cy5 stoppt.
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Beispiel 4
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Sondenabbauversuche
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Eine
Probe der Sonde YPPAMP wurde mit Taq 1 während einer Zeitdauer von 60
Minuten unter den in Beispiel 3 aufgeführten Bedingungen abgebaut.
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8 zeigt
die Fluoreszenz bei der Wellenlänge
des Donors und des Akzeptors in Abhängigkeit von der Zeit, wenn
die Sonde durch das Restriktionsenzym geschnitten wird.
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Anfänglich ist
die Sonde intakt, wobei ein hohes Cy5-Signal (B) und ein niederes
Fluorescein-Signal vorliegen. Wenn die Sonde geschnitten wird, steigt
das Fluorescein-Signal (A) an, da Fluorescein von der Sonde freigesetzt
wird, und es tritt ein Abfall des Cy5-Signals auf, da die Moleküle sich
nicht mehr in enger Nachbarschaft befinden, als dass noch FRET eintreten
könnte. 9 veranschaulicht
die relative Fluoreszenz F1/F2 (Fluorescein/Cy5) in Abhängigkeit
von der Zeit. Das Diagramm zeigt insgesamt einen kontinuierlichen Anstieg
als Ergebnis des Schneidens der Sonde.