ES2262249T3 - Metodo fluorometrico para monitorizar y detectar la ampliacion de acidos nucleicos. - Google Patents
Metodo fluorometrico para monitorizar y detectar la ampliacion de acidos nucleicos.Info
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Abstract
Un método para detectar la amplificación de un ácido nucleico en una muestra, que comprende llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico para un polinucleótido diana en presencia de (a) una polimerasa del ácido nucleico, (b) a cebador capaz de hibridarse a dicho polinucleótido diana, y (c) una sonda oligonucleótida capaz de hibridarse a dicho polinucleótido y que comprende una molécula fluorescente donante y una molécula fluorescente aceptora con una separación entre sí de modo que la molécula aceptora reduzca la fluorescencia del donante, y una secuencia monocatenaria reconocida por una enzima de restricción que corte en el lugar de dicha secuencia cuando ésta está en forma bicatenaria, siendo localizada dicha secuencia entre dicha molécula donante y dicha molécula aceptora; aplicar dicha enzima de restricción al producto de amplificación de modo que el producto bicatenario de amplificación se escinda para liberar la molécula aceptora de la molécula donante; y detectar una señal fluorescente de la muestra, en donde dicha sonda oligonucleótida es capaz de hibridarse a dicho polinucleótido diana en la región del extremo 3¿ de dicho polinucleótido de modo que el extremo 3¿ del polinucleótido pueda extenderse durante la amplificación para proporcionar una región complementaria con la sonda oligonucleótida.
Description
Método fluorométrico para monitorizar y detectar
la amplificación de ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona un método para
detectar la amplificación de un polinucleótido (a veces conocido
como un ácido polinucleico) diana, preferiblemente de forma
cuantitativa, y las sondas que se vaya usar en dichos métodos.
Las técnicas conocidas de seguimiento de
fluorescencia mediante RCP incluyen tanto las técnicas específicas
para la cadena como las técnicas genéricas con intercaladores del
ADN que pueden utilizarse en algunos dispositivos de ciclaje
térmico de RCP de segunda generación.
Los métodos genéricos utilizan colorantes
intercalados en el ADN que exhiben una fluorescencia aumentada al
estar unidos a las especies de ADN bicatenario. El aumento en la
fluorescencia debido al aumento en la concentración del seno del
ADN durante las amplificaciones puede utilizarse para medir el
progreso de la reacción y para determinar el número de la copia de
la molécula diana. Sin embargo, estos métodos sólo son
semi-específicos para la cadena ya que cualquier
amplificación no específica que se produce generará ADN bicatenario
y por lo tanto resultará en un aumento de la señal.
Los métodos específicos para la cadena utilizan
componentes adicionales de la reacción de polinucleótidos para
seguir el progreso de las reacciones de amplificación. La detección
en estos métodos se basa en la transferencia fluorescente de
energía resonante (TFER). Una o más sondas de polinucleótido se
marcan con moléculas fluorescentes, una molécula donante y una
molécula aceptora (a veces conocida como una molécula indicadora y
una molécula de desactivación, respectivamente). La molécula
donante se excita a una longitud de onda de luz específica para
luego normalmente exhibir fluorescencia a una longitud de honda de
emisión. La molécula aceptora está altamente excitada a la longitud
de onda de emisión de modo que puede aceptar la energía de emisión
de la molécula donante mediante la transferencia por resonancia
cuando las dos están en estrecha proximidad (por ejemplo, en la
misma molécula o una molécula vecina). La base de la detección por
TFER es la determinación de los cambios a las longitudes de onda de
emisión de la molécula donante y aceptora. Existen dos tipos de
sonda para TFER, las que hacen uso de la hidrólisis de sondas de
polinucleótidos para separar la molécula donante de la aceptora, y
las que utilizan la hibridación para cambiar la relación espacial de
las moléculas donantes y aceptoras.
Las sondas de hidrólisis están disponibles
comercialmente como sondas TaqMan^{TM}. Éstas consisten en
oligonucleótidos de ADN que se marcan con las moléculas donantes y
aceptoras. Las sondas son diseñadas para unirse a una región
específica de una cadena del producto de la RCP. Después de la
hibridación del cebador de la RCP a esta cadena, la enzima
Taq extiende el ADN con actividad polimerasa 5' a 3'. La
enzima Taq también exhibe actividad exonucleasa 5' a 3'. Las
sondas TaqMan^{TM} se protegen en el extremo 3' mediante la
fosforilación para evitar que ceben la extensión mediante
Taq. Si la sonda TaqMan^{TN} se hibrida a la cadena del
producto, una molécula Taq de extensión puede también
hidrolizar la sonda, liberando así el donante del aceptor lo que
sirve como la base de la detección.
Las sondas de hibridación están disponibles en
un número de formas. Los faros moleculares son oligonucleótidos que
tienen secuencias 5' y 3' complementarias de modo que formen lazos
en horquilla. Marcadores fluorescentes terminales tienen que estar
en estrecha proximidad para que se produzca TFER cuando se forma el
lazo en horquilla. Después de la hibridación de los faros
moleculares a una secuencia complementaria, los marcadores
fluorescentes se separan, con lo que no se produce la TFER, el
fenómeno que forma la base de la detección. Una modificación de
este tipo de sistema en tanto que el faro molecular se acopla a un
cebador de amplificación se describe en Nucl. Acids. Res. (1997)
25, 12, 2516-2521.
Sin embargo, la señal generada por estas
secuencias está limitada por la longitud de la sonda ya que ésta
forma el factor limitante en el nivel de la relación de señal a
ruido que se puede conseguir.
WO-A-9621144
describe un método para la detección de una reacción de
amplificación que comprende el uso de a) una sonda con marcaje
fluorescente en ambos extremos de una enzima de restricción.
Los solicitantes han desarrollado un sistema que
permite la detección exacta y/o el seguimiento de ciertas
reacciones incluidas las reacciones de amplificación.
Por lo tanto, la invención proporciona un método
para detectar la amplificación del ácido nucleico que comprende
llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico para un
polinucleótido diana en presencia de (a) una polimerasa del ácido
nucleico, (b) a cebador capaz de hibridarse a dicho polinucleótido
diana, y (c) una sonda oligonucleótida capaz de hibridarse a dicho
polinucleótido y que comprende una molécula donante, una molécula
fluorescente aceptora y una secuencia monocatenaria reconocida por
una enzima de restricción que corte en el lugar de dicha secuencia
cuando está en forma bicatenaria, siendo localizada dicha secuencia
entre dicha molécula donante y dicha molécula aceptora; aplicar
dicha enzima de restricción al producto de amplificación de modo que
el producto bicatenario de amplificación se escinda para liberar la
molécula aceptora de la molécula donante; y detectar una señal
fluorescente de la molécula donante en la mezcla de reacción, en
donde la sonda se diseña de tal forma que la sonda oligonucleótida
sea capaz de hibridarse a dicho polinucleótido diana en la región
del extremo 3' de dicho polinucleótido que puede extenderse en
presencia de la polimerasa para proporcionar el ADN bicatenario de
cadena complementaria con la sonda oligonucleótida. El sitio de
restricción está localizado apropiadamente en la región de
extensión. En este caso, el polinucleótido diana mismo actuará como
un cebador para la extensión y durante la reacción en cadena de la
extensión, la secuencia polinucleótida se extenderá a lo largo de
la sonda convirtiéndola así en bicatenaria. Una vez ocurrido esto,
la enzima de restricción puede cortar la región extendida,
liberando así la molécula aceptora de la sonda con lo que se genera
una señal.
Apropiadamente, el extremo 3' de la sonda está
"bloqueado" por ejemplo mediante la fosforilación para que no
se extienda en la dirección del polinucleótido durante las fases de
extensión del ciclo de amplificación.
Esto significa que la reacción de la extensión
de la polimerasa resultará en la extensión de la cadena diana del
polinucleótido en la región complementaria a la región sobresaliente
de la sonda, que desembocará en la producción de un sitio
bicatenario de restricción en esta región. En el caso de seleccionar
la enzima de modo que el sitio de restricción no se encuentre en
otra parte del amplicón, la aplicación de la enzima de restricción
no cortará dentro de la secuencia diana polinucleótida y por lo
tanto, a continuación se puede aislar el producto de longitud
completa.
El método puede utilizarse para detectar la
presencia de un polinucleótido diana en la muestra. Si se detecta
la amplificación en el método de la invención, el polinucleótido
diana está presente en la muestra para actuar de la plantilla.
Mediante el uso de la enzima de restricción para
liberar la molécula donante de la molécula aceptora, se evita el
retraso que se produce, por ejemplo, cuando se precisan reacciones
múltiples de hidrólisis para efectuar la separación.
Además, la separación de la molécula aceptora de
la donante no se limita en función de la longitud de la sonda y,
por lo tanto, puede conseguirse una mejor relación de señal a
ruido.
El método de la invención puede usarse para la
detección final, donde se añade la enzima después de la reacción de
amplificación, o la enzima puede estar presente durante la duración
de la reacción de amplificación. El segundo caso abre las puertas
al seguimiento de la reacción de amplificación en tiempo real. Sin
embargo, en estos casos, los reactivos precisados para la digestión
enzimática pueden inhibir la reacción de amplificación. En estos
casos, la detección del punto final en una probeta aparte podría ser
deseable.
La sonda oligonucleótida puede diseñarse de modo
que incluya el sitio para la enzima de restricción dentro de la
región del amplicón. En este caso, la detección de la amplificación
se efectúa mediante la adicción de la enzima de restricción a la
reacción al llegar a su punto final. La enzima corta el producto de
amplificación entre la molécula donante y aceptora de la sonda,
liberando así la molécula donante que genera una señal de punto
final. Esto puede utilizarse para situaciones de RCP in situ.
Sin embargo, su uso dependerá de la presencia dentro del amplicón
de un sitio que puede hibridarse con la sonda. Además, puede que el
aislamiento completo de un amplicón de longitud completa no sea
posible con esta forma de detección.
Como alternativa, se puede acoplar la sonda a un
cebador de amplificación. En estos casos, preferiblemente tanto las
moléculas aceptoras como las donantes están presentes en una región
de no unión del cebador. Cuando un amplicón así producido participa
en un ciclo de extensión posterior bajo la influencia del otro
cebador, la reacción de extensión incluirá la región entera de la
sonda, haciendo así que el sitio de restricción sea bicatenario y
por lo tanto, susceptible al corte por la enzima de restricción.
Además, si la enzima de restricción está
presente por la duración de la reacción de amplificación, el
progreso de la misma reacción de amplificación puede seguirse ya
que las moléculas donantes se liberarán en cantidades que son
proporcionales al número de amplicones presentes en la mezcla de
reacción en cada ciclo de la reacción de amplificación. La
acumulación de señal de las moléculas donantes puede observarse y
este aumento puede, por ejemplo, usarse para calcular la cantidad
de polinucleótido diana presente en la muestra al principio
aplicando el tipo de cálculo que se conoce bien con relación al
sistema TaqMan^{TM}.
Las endonucleasas de restricción son enzimas que
se unen a y escinden moléculas de ADN bicatenario en secuencias
específicas de pares de bases conocidas como sitios de restricción o
reconocimiento. Existen tres tipos de enzima de restricción. Cada
tipo tiene dos actividades enzimáticas específicas: una metilasa de
ADN y una endonucleasa que cataliza la escisión y separación del
ADN bicatenario.
Las enzimas de restricción tipo I exhiben
actividad metilasa y nucleasa dependiente de ATP en la misma
molécula. La metilación se produce en el sitio de reconocimiento y
la escisión se produce lejos del sitio de reconocimiento mientras
que el ADN se enrolla alrededor de la enzima unida. Las enzimas tipo
I y tipo III son parecidas. Las enzimas tipo III también exhiben
actividades metilasa y nucleasa en la misma molécula. Sin embargo,
la enzima no necesita el ATP y el sitio de escisión está más cerca
del sitio de reconocimiento. Las enzimas de restricción tipo II
cortan en el sitio de reconocimiento. Reconocen estructuras que
tienen una longitud de cuatro o más nucleótidos. Cada tipo de
enzima corta de forma diferente. La enzima puede corta ambas cadenas
en exactamente el mismo sitio para producir extremos despuntados en
el ADN. Otras enzimas pueden cortar en posiciones simétricas en
cada cadena de los fragmentos productores de ADN con partes
monocatenarias sobresalientes o "extremos pegajosos". Pueden
crear fragmentos con protuberancias 3' o 5'.
Pueden utilizarse cualquiera de las enzimas de
restricción conocidas en el método de la invención, sobre todo si
éstas se añaden al final de la reacción de amplificación, con la
única condición de que si se pretende recuperar un producto de
reacción específico, éstos no contengan sitios internos reconocidos
por la enzima. Las enzimas de restricción que pueden resistir las
condiciones empleadas en la reacción, por ejemplo, en la reacción
de amplificación son las enzimas termoestables.
Una enzima especialmente apropiada para usar en
el método de la invención es Taq1. Esta enzima de restricción,
igual que la polimerasa TAQ, puede obtenerse de Thermus
aquaticus. Por lo tanto, podrá soportar las condiciones que se
dan durante los ciclos de las reacciones de amplificación tal como
la reacción polimerasa en cadena (RPC). Otra de estas enzimas es el
enzima de restricción termoestable "PspG 1" (New England
Biolabs). Esta enzima se aísla de Pyrococcus sp. y reconoce
CCWGG, que corte por delante de la primera C. Es estable durante 2
horas a 95ºC y sobrevivirá 30 ciclos de RCP en bloque.
La RCP es el método preferido en el contexto de
la invención.
De forma apropiada, el amplicón y/o la enzima de
restricción se seleccionan de modo que el sitio reconocido por la
enzima no aparezca en el amplicón. Si es necesario, las enzimas de
restricción disponibles pueden aislarse, mutarse, o fabricarse para
que sean termoestables a las temperaturas de reacción
necesarias.
De forma apropiada, la polimerasa del ácido
nucleico utilizada en el método de la invención es una polimerasa
termoestable tal como la polimerasa TAQ.
La sonda que se utiliza en el método de la
invención puede ser en forma de un faro molecular de modo que tenga
forma de un lazo de horquilla antes de la hibridación al
polinucleótido diana. En este caso, la sonda tiene secuencias
complementarias en la región 5' y la región 3' de tal forma que
antes que unirse a la secuencia diana de polinucleótidos, la región
5' y la región 3' se unen entre sí. En este caso, la restricción
siempre se localizará en la región no complementaria de la sonda
para que permanezca monocatenaria antes de que la sonda hibride a
la secuencia diana.
De forma apropiada, la molécula donante se
dispone en un extremo de la sonda y la molécula aceptora en el otro
extremo. Así, la molécula donante puede disponerse en el extremo 5'
de la sonda y la aceptora está en el extremo 3' o viceversa. En
estos casos, la disposición en lazo de horquilla de un faro
molecular es especialmente efectiva ya que la molécula donante y
aceptora se mantienen en estrecha proximidad antes de hibridación a
la secuencia diana. De esta manera, se reduce el riesgo de una señal
de fondo no deseada procedente de la molécula donan-
te.
te.
Al hibridar la sonda a la secuencia diana, el
lazo de horquilla se abre, separando así la molécula aceptora de la
donante, lo que genera una señal. Sin embargo, en el caso de la
invención, la enzima de restricción cortará el híbrido de la
secuencia de la sonda y de la diana entre la molécula donante y
aceptora con lo que estos grupos se alejan aún más y la señal se
potencia.
En otra modificación adicional, la sonda se
acopla a un extremo de un cebador de amplificación. Puede o no
puede que la sonda sea en forma de lazo de horquilla. Sin embargo,
la región que contiene las moléculas donantes y aceptoras debería
colocarse aguas arriba del extremo 3' del cebador. La extensión del
cebador hace que un amplicón tenga acoplada la sonda en el extremo
5' del mismo. Durante un ciclo de amplificación posterior, una
cadena complementaria se forma después de la unión del otro cebador
de amplificación al extremo remoto del amplicón. Esta cadena
complementaria se extenderá durante la extensión en cadena, no sólo
a lo largo de la cadena diana sino también a través de la sonda,
haciendo así que sea bicatenaria y por lo tanto susceptible a un
corte por la enzima de restric-
ción.
ción.
En otra realización de la invención, la reacción
de amplificación se realiza con nucleótidos modificados que son
resistentes al corte por las enzimas de restricción. Ejemplos de
estos nucleótidos son los nucleótidos metilados. En este caso, la
sonda utilizada en el proceso no contendrá nucleótidos modificados.
Esto significa que los amplicones producidos en la reacción serán
resistentes a la restricción.
Sin embargo, cuando la sonda hibride a un
amplicón, será reconocida por la enzima de restricción que a
continuación la cortará en el sitio de restricción. Sin embargo, la
cadena complementaria no se cortará con lo que el resultado es que
al ADN bicatenario sólo se le "melle". Después de la fusión
posterior de la sonda, las moléculas aceptoras y donantes se
separan generando así una señal modificada que puede detectarse.
Esta realización puede utilizarse en la
detección del punto final, cuando la enzima de restricción se añade
en la terminación de la amplificación. Cuando es para usar durante
el transcurso de la reacción, por ejemplo para seguir y/o
cuantificar la amplificación, sería necesario asegurarse de que la
enzima de restricción no corte la molécula diana (que generalmente
no sería resistente a la restricción) antes de comenzar la
amplificación. Éste puede efectuarse de varias maneras. El
suministro de la enzima de restricción puede retrasarse hasta
después de que al menos el primer ciclo de amplificación se haya
producido. Esto puede llevarse a cabo de forma automática, por
ejemplo, utilizando técnicas de "arranque en caliente" en las
cuales la enzima polimerasa se mantiene separada de la mezcla de
reacción restante mediante, por ejemplo, una barrera de cera, que se
funde para liberar la enzima sólo después de alcanzar los niveles
deseados de temperatura. Métodos similares pueden utilizarse en el
ensayo de la invención para frenar la enzima de restricción hasta
que se requiera en el proceso. Como alternativa, pueden emplearse
otros modos de supresión, por ejemplo, se puede incluir en la
mezcla de reacción un anticuerpo a la enzima de restricción que
inhibe su actividad pero que se desnaturaliza a la temperatura
deseada, o mediante el uso de enzimas, sobre todo, enzimas
modificadas conocidas en el estado de la técnica, tal como TAQ
Gold^{TM} que necesita calentarse hasta una temperatura específica
antes de activarse.
Se conocen combinaciones indicadas de moléculas
donantes y aceptoras en el estado de la técnica. Por ejemplo, la
molécula donante puede comprender un colorante tal como la
fluoresceína y la molécula aceptora es un colorante tal como la
rodamina.
Se conocen condiciones apropiadas en las cuales
la reacción de la amplificación puede llevarse a cabo en la
técnica. Las condiciones óptimas pueden variar en cada caso en
función del amplicón particular implicado, la naturaleza de los
cebadores utilizados y las enzimas empleadas. Las condiciones
óptimas pueden determinarse en cada caso mediante una persona que
conozca la técnica. Temperaturas típicas de desnaturalización son
del orden de 95ºC, y temperaturas típicas de hibridación del orden
de 55ºC y las temperaturas de extensión del orden de 72ºC.
El método de la invención puede adaptarse para
usar en el control de calidad de las enzimas donde la enzima es una
endonucleasa de restricción. Actualmente, el control de calidad
enzimático utiliza una actividad unitaria que determina la
concentración que corresponde a niveles específicos de enzima
activa. Sin embargo, si la enzima se utilizara como una enzima de
restricción en el método de la invención donde se tiene constancia
de la presencia o la cantidad de polinucleótido diana en la muestra,
la calidad de la enzima puede juzgarse mediante su capacidad de
generar una señal fluorescente, indicativa de la separación de la
señal de las sondas fluorescentes, proporcionando así una
determinación más precisa de la actividad.
El uso de sondas oligonucleótidas en los métodos
descritos anteriormente componen otro aspecto adicional de la
invención. Específicamente, estas sondas comprenderán una molécula
donante y una molécula aceptora y un sitio para la enzima de
restricción que corta la cadena en la secuencia específica de ADN
bicatenario localizado entre dicha molécula donante y dicha
molécula aceptora.
Las sondas pueden incluir otras características
mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la sonda puede ser en forma
de un faro molecular de modo que tenga secuencias complementarias en
la región 5' y la región 3' que se unen la una a la otra.
Moléculas donantes apropiadas incluyen un
colorante tipo fluoresceína y la molécula aceptora puede ser un
colorante tipo rodamina u otro colorante tal como Cy5 pero puede
usarse cualquier otra combinación de colorante que sea capaz de
someterse a interacciones de TFER.
Otro aspecto de la invención comprende un equipo
para realizar un método tal como se ha descrito anteriormente,
conteniendo dicho equipo una sonda tal como se ha descrito
anteriormente y una enzima de restricción que sea capaz de cortar
dicha sonda entre las moléculas donantes y aceptoras. El equipo
comprende adicionalmente un nucleótido modificado que es capaz de
generar una cadena nucleótida que se resiste a las enzimas de
restricción, por ejemplo, los nucleótidos metilados.
A continuación, se describe la invención a
través de ejemplos con referencia a las figuras acompañantes en las
que:
La figura 1 representa esquemáticamente las
etapas de la reacción que forma una realización preferida de la
invención;
La figura 2 ilustra un método no comprendido en
el alcance de la invención;
La figura 3 ilustra otro método no comprendido
en el alcance de la invención;
La figura 4 es un gráfico que muestra la
fluorescencia de una molécula donante frente al tiempo en una RCP
según la invención;
La figura 5 es un gráfico de la relación de
fluorescencia de donante/fluorescencia de aceptor en el punto final
de un ensayo de RCP de la invención, donde (A) y (B) son reacciones
positivas y (C) representa el control negativo;
La figura 6 es un gráfico de la relación de
fluorescencia de aceptor/fluorescencia de donante en el punto final
de un ensayo de RCP de la invención, donde (A) y (B) son reacciones
positivas y (C) representa el control negativo;
La figura 7 es un gráfico que representa la
fluorescencia donante frente al tiempo en un punto final del ensayo
RCP de la invención, donde (A) y (B) son reacciones positivas y (C)
representa el control negativo.
La figura 8 es un gráfico que ilustra los
cambios en la fluorescencia del donante (A) y el aceptor (B) frente
al tiempo en la presencia de una enzima de restricción que corta la
cadena entre éstos; y
La figura 9 es un gráfico que ilustra que, de
forma acumulativa, la fluorescencia aumenta durante el transcurso
de la reacción para proporcionar la figura 8.
En la reacción ejemplificada de la
amplificación, una molécula de ADN (1) se convierte primero en
monocatenario (1B). Un par de cebadores de amplificación (2), (3)
se unen como cebadores sentido y antisentido en la reacción de la
amplificación tal como es sabido. El resultado es un producto
amplicón (4) que contiene sólo la secuencia diana. Cuando este
producto se funde durante la fase consiguiente de la amplificación,
la sonda (5) que comprende una molécula donante (6) y una molécula
aceptora (7) se une en el extremo 3' de la secuencia diana (1D). En
presencia de una polimerasa de ADN, la secuencia diana se extenderá
a lo largo de una región sobresaliente de la sonda, creando un
sitio bicatenario para una enzima de restricción indicado por la
flecha.
A continuación, la enzima de restricción puede
cortar la cadena extendida, lo que libera la molécula aceptora (7)
de la molécula aceptora (6), generando así una señal (1F).
En el método de la figura 2, la sonda (8) tiene
la forma de un faro molecular que se fusiona en el extremo 5' del
cebador de la amplificación (9). El complejo de
sonda-cebador se une a un extremo de la secuencia
diana cuando está presente y cuando se fusiona en una forma
monocatenaria. La extensión del cebador en el primer ciclo
proporciona una cadena de amplicón (10) con la estructura del faro
molecular acoplada en el extremo 5' del mismo. Durante el ciclo
posterior de la amplificación, el cebador antisentido de la
amplificación se unirá al extremo 3' de la cadena del amplicón
(10). La extensión de esta cadena abrirá la estructura del faro
molecular y también la convertirá en bicatenaria a lo largo de toda
su extensión. El sitio bicatenario así formado para la enzima de
restricción es cortado a continuación por dicha enzima (2D),
separando así aún más la molécula donante de la molécula aceptora
(2E), y produciendo así una señal de fluorescencia potenciada.
En el método ilustrado en la figura 3, la
reacción de la amplificación se realiza utilizando nucleótidos
modificados (11) tales como nucleótidos metilados. Como resultado,
las cadenas de amplicón (12) son resistentes a la enzima de
restricción aunque la enzima reconocerá su sitio de restricción
(indicado en la flecha sombreada – 3D) cuando esté en forma
bicatenaria. Cuando la cadena de amplicón (12) se hibrida a la sonda
que no contiene los nucleótidos modificados, el resultado será una
"mella" (13) en la sonda mientras que la cadena del amplicón
permanecerá intacta. Después de la fusión posterior (3F), las
moléculas donantes y aceptoras se separarán permitiendo que la
molécula donante genere una señal potenciada que puede
detectarse.
El corte con una enzima de restricción
proporciona un modo rápido y efectivo de separar la molécula
aceptora de la donante, mejorando así la velocidad de detección.
Además, al asegurar la separación rápida y completa de la molécula
aceptora de la donante, la relación de señal a ruido se aumenta en
comparición con la que se puede obtener con la tecnología
convencional de los faros moleculares.
El siguiente ejemplo se detalla como una
ilustración.
Demostración
1
Un amplicón de 104 pares de bases del gen de la
anticoagulasa de Yersinia pestis se clonó en un vector
pBluescript SK (Stratagene) para formar una construcción del
fagemido pYP100ML. El pYP100ML se amplificó con un cebador sentido
YPPA155 con la secuencia:
- dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC (Sec. Id. Núm 1) y
el cebador antisentido YPP229R con la
secuencia:
- dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT (Sec. Id. Núm 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de la RCP fueron las
siguientes:
- Cebadores 1 \muM (final) cada uno
- dNTPs 200 \muM (final) cada uno
- TAQ 0,025 U/\mul concentración final
- Tampón: 250 ng/\mul albúmina de suero bovino, 500 mM Tris, pH 8,3, 20 mM magnesio.
A continuación, la mezcla se sometió a 30 ciclos
en las siguientes condiciones:
\newpage
| Temperatura | Tiempo | Temperatura de | Seguimiento de la |
| ºC | Segundos | transición ºC/seg. | fluorescencia |
| 95 | 1 | 10 | |
| Secundario 85 | |||
| (1ºC incremento por ciclo) | |||
| 55 | 1 | 10 | |
| 74 | 1 | 10 | Sencillo |
| (una vez por ciclo) |
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación duró menos de 6 minutos
Demostración
2
Una sonda (YPPAMP), marcada en el extremo 5' con
fluoresceína como el donante y 10 Bp aguas abajo se marcó con el
aceptor Cy5. La secuencia de la sonda es
- 5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT 3, (Sec. Id. Núm. 3)
donde X representa la posición de
Cy5.
La sonda debería poder actuar como un cebador
antisentido en la RCP detallada anteriormente. Entre estas dos
moléculas fluorescentes se encuentra el sitio Taq 1 de
restricción (TCGA), indicado con un "/" en la secuencia. El
extremo 3' no se ha fosforilado y, por lo tanto, puede extenderse en
la RCP.
La endonucleasa Taq 1 (Sigma), una enzima
tipo II, escinde el ADN bicatenario en esta región específica. Al
hacerlo, se separaría la molécula donante de fluoresceína del
aceptor Cy5, y esta forma la base de la detección. La sonda se
diseñó de modo que los nucleótidos adicionales se incluyeran en el
extremo 5', para dejar el producto pYP100ML resultante sin cambios.
El amplicón en este caso no contiene ningún sitio Taq 1.
Las moléculas donantes y aceptoras se posicionan
en suficiente proximidad en la sonda para que se produzca TFER. Sin
embargo, una vez que la enzima Taq 1 escinde el amplicón, se
libera el donante y TFER ya no se produce.
A continuación, la sonda YPPAMP se utilizó en la
RCP que se había optimizado. La sonda YPPAMP a una concentración de
2 \muM se incluyó en una amplificación pYP100ML con un Perkin
Elmer 9700. El programa fue 30 ciclos de
\vskip1.000000\baselineskip
| Temperatura ºC | Tiempo Segundos/minuto |
| 96 | (30 seg) |
| (50) | (30 seg) |
| (72) | (4 min) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron los productos mediante
electroforesis en gel de agarosa. Se demostró que la banda del
producto fue más grande que el fragmento nativo pYP100ML de 104 pB
con electroforesis en gel de agarosa, lo que indica que la sonda
había amplificado la diana con éxito.
Ejemplo
1
A continuación, se repitió la reacción de la
amplificación tal como se ha descrito en la Demostración 1 con la
sonda YPPAMP en lugar del cebador antisentido YPP229R.
Después de la amplificación, la enzima de
restricción Taq 1 se añadió al producto de RCP junto con los
dNTP's y el tampón de paleta negro (Sigma). El tampón de paleta
negro contiene NaCl, que es preciso para la actividad endonucleasa
de Taq 1. La reacción se realizó con un ciclo de:
\newpage
| Temperatura ºC | Tiempo Segundos/minuto |
| 65 | (60 mins) |
\vskip1.000000\baselineskip
Este programa activa las actividades de escisión
de la endonucleasa al cortar el extremo del fragmento. Un control
negativo se realizó sin la enzima y los fragmentos se analizaron
mediante electroforesis en gel. El patrón de bandas obtenido indica
que la enzima de restricción había cortado el fragmento.
Tanto las muestras cortadas enzimáticamente como
las de control se analizaron con el fluorímetro. El producto de RCP
se diluyó para que la concentración de la sonda en la reacción fuera
0,1 \muM. A concentraciones más altas, la señal de fluorescencia
fue demasiado intensa para los detectores LightCycler^{TM}. La
señal de fluorescencia de la fluoresceína fue mayor que la del Cy5
en las muestras de prueba, lo que sugiere que la fluoresceína se
liberó y el Cy5 no estuvo lo suficientemente cerca como para
desactivar la energía fluorescente.
Las muestras de control tuvieron una señal alta
de fluorescencia de Cy5, lo que sugiere que todavía se producía
TFER. Los resultados indicaron que la sonda amplificó y que la
endonucleasa eliminaba el extremo del fragmento de forma
eficaz.
Ejemplo
2
La sonda YPPAMP descrita anteriormente y la
endonucleasa Taq 1 se incluyeron en una reacción de
amplificación utilizando el programa de LightCycler^{TM} indicado
abajo, con 40 ciclos de:
\vskip1.000000\baselineskip
| Temperatura | Tiempo | Temperatura de | Seguimiento de la |
| ºC | Segundos | transición ºC/seg. | fluorescencia |
| 95 | 0 | 10 | |
| 55 | 0 | 10 | |
| 74 | 20 | 10 | Sencillo |
\vskip1.000000\baselineskip
El tiempo para la extensión se aumentó desde lo
habitual para la amplificación con pYP100ML para darle tiempo a la
enzima para cortar el fragmento.
Una lectura de fluorescencia se tomó una vez en
cada ciclo y los resultados se muestran en la figura 4. A medida
que el producto se amplificó, la fluorescencia de fluoresceína
aumentó, lo que sugiere que se separaron las moléculas
fluorescentes.
Ejemplo
3
Con tal de mejorar la señal, se utilizó la sonda
YPPAMP a 0,5 \muM en dos reacciones de amplificación similares a
las descritas en el ejemplo 2 sin Taq 1. De nuevo, se realizó
un control negativo en ausencia de ADN. El programa fue el programa
habitual para pYP100ML, con 30 ciclos de:
\vskip1.000000\baselineskip
| Temperatura | Tiempo | Temperatura de | Seguimiento de la |
| ºC | Segundos | transición ºC/seg. | fluorescencia |
| 95 Secundario 85 | 1 | 10 | |
| (1ºC incremento por ciclo) | |||
| 55 | 1 | 10 | |
| 74 | 1 | 10 | Sencillo |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la amplificación por RCP, se realizó
una digestión con el producto Taq 1 de CRP, dNTP's y el
tampón de paleta negro. El programa de digestión consistió en un
ciclo de
\newpage
| Temperatura | Tiempo | Temperatura de | Seguimiento de la |
| ºC | Segundos | transición ºC/seg. | fluorescencia |
| 65 | 60 minutos | 20 | Continuo |
La figura 5 muestra los resultados, expresados
como una relación de la señal fluorescente de fluoresceína/Cy5
(F1/F2) frente al tiempo. A medida que aumenta el tiempo, se reduce
la fluorescencia en las dos líneas más altas (A) y (B) que son las
muestras positivas. Los resultados se presentan nuevamente en la
figura 6 en forma de una relación de F1/1 frente al tiempo. Se
observa claramente un incremento continuo en la fluorescencia de
fluoresceína a medida que Taq 1 digiere el extremo del
fragmento, así liberando la fluoresceína. Posiblemente debido a la
contaminación, la fluorescencia de la muestra negativa (línea C) se
aumentó ligeramente pero la fluorescencia fue claramente menor que
en las muestras positivas. El amplicón pYP100ML está presente en el
aire ambiente y sólo se necesita un amplicón del aire para que la
reacción se amplifique.
Cuando se expresa en la forma de un gráfico de
F2/1 frente al tiempo, (figura 7), se puede observar la reducción
en la fluorescencia debida a la acción de TFER entre fluoresceína y
Cy5.
Ejemplo
4
Una muestra de la sonda YPPAMP se digirió con
Taq 1 durante un periodo de 60 minutos en las condiciones que se
han expuesto en el ejemplo 3.
La figura 8 muestra la fluorescencia en las
longitudes de onda del donante y aceptor a medida que la enzima de
restricción corta la sonda a lo largo del tiempo.
Inicialmente, la sonda es intacta con una señal
alta de Cy5 (B) y una señal baja de fluoresceína. A medida que se
corta la sonda, la señal de fluoresceína (A) aumenta mientras que se
libera de la sonda y se reduce la señal de Cy5 a medida que se va
quedando sin moléculas en estrecha proximidad para que se produzca
TFER. La figura 9 ilustra la fluorescencia relativa F1/F2
(fluoresceína/Cy5) durante el transcurso del experimento. Esto
demuestra un aumento global continuo como resultado del corto de la
sonda.
Claims (28)
1. Un método para detectar la amplificación de
un ácido nucleico en una muestra, que comprende llevar a cabo la
amplificación del ácido nucleico para un polinucleótido diana en
presencia de (a) una polimerasa del ácido nucleico, (b) a cebador
capaz de hibridarse a dicho polinucleótido diana, y (c) una sonda
oligonucleótida capaz de hibridarse a dicho polinucleótido y que
comprende una molécula fluorescente donante y una molécula
fluorescente aceptora con una separación entre sí de modo que la
molécula aceptora reduzca la fluorescencia del donante, y una
secuencia monocatenaria reconocida por una enzima de restricción que
corte en el lugar de dicha secuencia cuando ésta está en forma
bicatenaria, siendo localizada dicha secuencia entre dicha molécula
donante y dicha molécula aceptora; aplicar dicha enzima de
restricción al producto de amplificación de modo que el producto
bicatenario de amplificación se escinda para liberar la molécula
aceptora de la molécula donante; y detectar una señal fluorescente
de la muestra, en donde dicha sonda oligonucleótida es capaz de
hibridarse a dicho polinucleótido diana en la región del extremo 3'
de dicho polinucleótido de modo que el extremo 3' del
polinucleótido pueda extenderse durante la amplificación para
proporcionar una región complementaria con la sonda
oligonucleótida.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde
dicha enzima de restricción está presente durante el transcurso de
la reacción de amplificación y el progreso de la reacción de
amplificación se sigue mediante la medición del aumento en la señal
de la molécula donante.
3. Un método según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, en donde dicha enzima de restricción
es Taq1 o PspG1.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la polimerasa del ácido nucleico es
una polimerasa termoestable.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la sonda tiene secuencias
complementarias en las regiones 5' y 3' de modo que antes de unirse
a la secuencia polinucleótida diana, las regiones 5' y 3' se unan
entre sí.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en donde dicha molécula donante
comprende un colorante tipo fluoresceína.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en donde dicha molécula aceptora
comprende un colorante rodamina o Cy5.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha molécula donante se acopla a
un nucleótido en la región del extremo 3' de la sonda y la molécula
aceptora se acopla en la región del extremo 5' de la sonda.
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha molécula donante se acopla a
un nucleótido en la región del extremo 5' de la sonda y la molécula
aceptora se acopla en la región del extremo 3' de la sonda.
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde la reacción de la amplificación se
realiza con nucleótidos modificados que son resistentes al corte por
enzimas de restricción.
11. Un método según la reivindicación 10 en
donde los nucleótidos modificados son nucleótidos metilados.
12. Un método según la reivindicación 10 ó 11,
en donde la actividad de la enzima de restricción se inhibe hasta
que la reacción de la amplificación haya progresado de modo que
existe al menos algo del producto del amplicón.
13. Un método según la reivindicación 12, en
donde la enzima de restricción se mantiene alejada del resto de la
mezcla de reacción hasta que se obtenga algo del producto del
amplicón.
14. Un método según la reivindicación 13, en
donde la enzima de restricción es retenida por una barrera
fundible.
15. Un método según la reivindicación 12, en
donde la enzima de restricción es inhibida por la presencia de un
anticuerpo.
16. Un método según la reivindicación 12, en
donde la enzima de restricción es una enzima que se activa sólo al
exponerse a temperaturas determinadas.
17. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde la reacción de amplificación se
realiza mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP).
18, Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde la sonda se acopla al extremo 5'
de un cebador de amplificación.
19. Un método para evaluar la actividad de una
enzima de restricción, que comprende realizar la amplificación del
ácido nucleico en un polinucleótido diana en presencia de (a) una
polimerasa del ácido nucleico, (b) a cebador capaz de hibridarse a
dicho polinucleótido diana, y (c) una sonda oligonucleótida capaz de
hibridarse a dicho polinucleótido y que comprende una molécula
fluorescente donante y aceptora separadas entre sí de modo que la
molécula aceptora reduzca la fluorescencia del donante, y una
secuencia monocatenaria reconocida por una enzima de restricción
que corte en el lugar de dicha secuencia cuando ésta está en forma
bicatenaria, siendo localizada dicha secuencia entre dicha molécula
donante y dicha molécula aceptora; aplicar dicha enzima de
restricción al producto de amplificación de modo que el producto
bicatenario de amplificación se escinda para liberar la molécula
aceptora de la molécula donante; y detectar una señal fluorescente
de la muestra, en donde dicha señal fluorescente proporciona una
medición de la actividad de la enzima.
20. Un método según la reivindicación 19, en
donde dicha sonda oligonucleótida es capaz de hibridarse a dicho
polinucleótido diana en la región del extremo 3' de dicho
polinucleótido de modo que el extremo 3' del polinucleótido pueda
extenderse durante la amplificación para formar una región
complementaria de la sonda.
21. El uso de una sonda oligonucleótida que
comprende una molécula donante y una molécula aceptora y un sitio
para la enzima de restricción que corta en secuencias específicas
del ADN bicatenario localizadas entre dichas moléculas donante y
aceptora, en un método según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
22. El uso según la reivindicación 20, en donde
la sonda tiene secuencias complementarias en la región 5' y la
región 3' de modo que antes que unirse a la secuencia polinucleótida
diana, la región 5' y la región 3' se unen entre sí.
23. El uso según la reivindicación 20 ó 21, en
donde dicha molécula donante comprende un colorante tipo
fluoresceína y dicha molécula aceptora es un colorante rodamina o
Cy5.
24. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en donde al menos 15 nucleótidos separan
la sonda de dicha molécula donante.
25. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula donante se acopla a
un nucleótido en la región del extremo 3' de la sonda y la molécula
aceptora se acopla a un nucleótido en la región del extremo 5' de
la sonda.
26. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, en donde la molécula donante se acopla al
nucleótido en la región del extremo 5' de la sonda y la molécula
aceptora se acopla a un nucleótido en la región del extremo 3' de
la sonda.
27. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25, en donde dicha sonda oligonucleótida se
acopla al extremo 5' de un cebador de amplificación.
28. Un equipo para llevar a cabo un método según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, dicho equipo comprende
una sonda oligonucleótida que es capaz de hibridarse a un
polinucleótido diana y que incluye una molécula fluorescente
donante, una molécula fluorescente aceptora, y una secuencia
monocatenaria reconocida por una enzima de restricción que corta
dicha secuencia cuando está en forma bicatenaria, siendo localizada
dicha secuencia entre dicha molécula donante y dicha molécula
aceptora, una enzima de restricción que es capaz de cortar dicha
sonda entre dichas moléculas donante y aceptora y un nucleótido
modificado que es capaz de generar una cadena nucleótida que es
resistente a las enzimas de restricción.
29. Un equipo según la reivindicación 28, en
donde el nucleótido modificado comprende un nucleótido metilado.
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