ES2305233T3 - Procedimiento y equipo analitico. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para detectar la presencia o cantidad de una secuencia de ADN objetivo en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en presencia de (a) una sonda de ARN que es específica para por lo menos una parte de dicha secuencia de ADN objetivo; (b) una enzima que hidroliza ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN y (c) una o más enzimas y/o reactivos necesarios para convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina; añadir a la muestra reactivos bioluminiscentes que reaccionan en presencia de TFA, detectar una señal de dichos reactivos bioluminiscentes y referirla a la presencia o cantidad de la secuencia de ácidos nucleicos objetivo.

Description

Procedimiento y equipo analítico.

La presente invención se refiere a un procedimiento para analizar una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo para detectar la presencia de una secuencia concreta en una muestra, o para determinar la secuencia precisa de un ácido nucleico particular, y a equipos y reactivos para la aplicación en estos procedimientos.

Actualmente existe una amplia gama de procedimientos para llevar a cabo un análisis de ácidos nucleicos. Los procedimientos analíticos pueden ir dirigidos a aquellos que detectan la presencia o la cantidad de una secuencia nucleica concreta en una muestra que se sospecha que contiene esa secuencia. Otros procedimientos dilucidan la estructura similar de un ácido nucleico para determinar su secuencia de nucleótidos para información o para fines de diagnóstico.

Las reacciones de amplificación se utilizan comúnmente para efectuar o asistir en este análisis, en particular si la secuencia de ácidos nucleicos concreta está presente solamente en pequeñas cantidades. Es conocida la aplicación de reacciones de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de secuencias de ácidos nucleicos objetivo. Uno o más iniciadores son específicos para la secuencia particular incluida en una mezcla de una reacción de amplificación. Estos hibridizarán la secuencia objetivo específica cuando se encuentra en forma de cadena única en un tubo de muestra. Si la secuencia objetivo está presente, el iniciador se unirá a la misma, tras lo cual la enzima de la polimerasa presente en la mezcla extenderá el iniciador, en determinadas condiciones de temperatura, para formar una cadena complementaria completa. Esta materia forma entonces otras plantillas para la amplificación en posteriores ciclos de desnaturalización, recocido y prolongación del iniciador.

El producto amplificado puede detectarse, por ejemplo en un gel electroforético. Sin embargo, ahora se utilizan con frecuencia procedimientos de marcado para detectar si se ha efectuado una reacción de amplificación, y/o para controlar su progreso. Ejemplos de dichos análisis incluyen el análisis TAQMAN^{TM}, así como los análisis descritos y reivindicados por ejemplo en WO 99/28500, WO 99/28501, WO 99/42611, WO 99/66071 y en Holland y otros, P. N. A. S, 1991, vol. 88 p. 7276. En WO 98/04738 se describe un análisis que utiliza sondas marcadas con ribo-oligonucleótidos. El marcado de las sondas es, sin embargo, un procedimiento complejo que incrementa el coste.

También son bien conocidos procedimientos para secuenciar secuencias de ácidos nucleicos. Los procedimientos con gel son convencionales. Se han llevado a cabo procedimientos más recientes utilizando aparatos tales como el Pyrosequencer disponible de Pyrosequencing AB, que se basan en la generación de una señal visible cuando se añade un nucleótido correcto durante la construcción de una cadena complementaria en una plantilla de ácidos nucleicos de cadena única. En WO 99/46409 se describen otros procedimientos para interrogar la identidad de una base específica en una muestra de ácido nucleico utilizando reacciones de pirofosforólisis.

Los solicitantes han encontrado que las sondas de ARN, que no están marcadas, pueden proporcionar medios apropiados para controlar o detectar tales casos.

De acuerdo con la presente invención, se dispone un procedimiento para detectar la presencia o la cantidad de una secuencia de ADN objetivo en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en presencia de (a) una sonda de ARN que es específica para por lo menos una parte de dicha secuencia de ADN objetivo; (b) una enzima que hidroliza el ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN y (c) una o más enzimas y/o reactivos necesarios para convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina; añadir a la muestra reactivos bioluminiscentes que reaccionan en presencia de TFA, detectar una señal de dichos reactivos bioluminiscentes y referirla a la presencia o cantidad de la secuencia de ácidos nucleicos objetivo.

Las sondas de ARN pueden hidrolizarse fácilmente mediante una variedad de enzimas, cuando se encuentran en forma de dúplex ARN/ADN. Éstas incluyen enzimas polimerasa utilizadas comúnmente en reacciones PCR tales como Taq polimerasa.

Alternativamente pueden hidrolizarse mediante enzimas ARNsa, que las hidrolizarán solamente cuando se encuentren en forma de dúplex ARN/ADN. Éstos dúplex pueden formarse en el curso de una reacción de amplificación tal como una reacción PCR, pero éste no es necesariamente el caso.

La hidrólisis de ARN tal como se lleva a cabo en el procedimiento de la invención produce monofosfato de adenosina (MFA). Éste puede ser fosforilado a trifosfato de adenosina (TFA) enzimáticamente de manera directa o bien mediante la producción de difosfato de adenosina.

El TFA puede detectarse fácilmente utilizando dispositivos bioluminescentes, un ejemplo particular de los cuales es el sistema de detección de luciferasa/luciferina. Ejemplos de la aplicación de dichos sistemas de detección se describen por ejemplo en WO 96/02665.

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Los dispositivos bioluminescentes tales como el dispositivo de luciferasa/luciferasa no reaccionan con el deoxiTFA (dTFA) que habitualmente se añade a las reacciones PCR para obtener la actividad de la polimerasa requerida. De este modo, podrá distinguirse entre el TFA producido como resultado de la hidrólisis de la sonda de ARN y cualquier dTFA que pueda requerirse añadir a la mezcla de reacción para otros fines.

Los sistemas de detección bioluminescentes son más sensibles que los dispositivos fluorescentes. En consecuencia, el uso de sondas de hidrólisis de ARN en procedimientos analíticos facilita la detección de interacciones a nivel de ácido nucleico en una muestra y de este modo se obtienen mejores procedimientos de análisis.

En una realización particular, la invención presenta un procedimiento para detectar la presencia o la cantidad de un ácido nucleico objetivo en una muestra, llevándose a cabo dicho procedimiento en el contexto de una reacción de amplificación y comprendiendo la desnaturalización de ácidos nucleicos en una muestra, ponerlos en contacto con una sonda de hidrólisis de ARN que sea específica para por lo menos una parte de dicho ácido nucleico objetivo de modo que la sonda forme dúplex con el ácido nucleico objetivo; la adición de una enzima que hidroliza ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN y unas o más enzimas o reactivos necesarios para convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina; la adición a la muestra de reactivos bioluminescentes que reaccionan en presencia de TFA, la detección de una señal de dichos agentes reactivos bioluminescentes y referirla a la presencia o la cantidad de la secuencia de ácidos nucleicos objetivos.

Convenientemente la enzima que hidroliza el ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN ((b) anteriormente), es la polimerasa utilizada en la reacción de amplificación. Ejemplos de ADN polimerasas adecuadas que pueden utilizarse en el contexto de la invención son polimerasas termoestables tales como la polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), polimerasa de Thermus especie NH (TspNH); polimerasa de Thermus brockianus (Tbr) (todas obtenibles por ejemplo de GeneSys Limited, Farnborough, U. K.), polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) (obtenible de Stratagene), polimerasa de exo-ADN 9ºN7, y ADN polimerasa de Thermococcus literalis (obtenible del New England Biolabs como ADN polimerasa VENT®).

Sin embargo, si esto no hidroliza el ARN lo suficientemente rápido, por ejemplo si se emplea una PCR rápida, entonces puede añadirse también una ARNasa adecuada y en particular una ARNasa dependiente de ADN, tal como es conocido en la técnica.

La una o más enzimas necesarias para convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina ((c) anteriormente sobre), pueden seleccionarse por ejemplo de fosfoenol piruvato sintasa que produce TFA directamente de AMP en presencia de fosfato y fosfoenol piruvato, que también se añaden como reactivo a la mezcla de reacción. Alternativamente, una combinación de un nucleósido trifosfato de adenilato quinasa y NTP producirá difosfato de adenosina (DFA), que puede entonces convertirse a TFA por inclusión o adición de una enzima tal como adelinato quinasa.

Todavía otros ejemplos de enzimas adecuadas incluyen piruvato fosfato diquinasa tal como describen Eisaki y otros, Biochim. et Biophys Acta 1431 (1999) 363-373.

Reactivos bioluminescentes particularmente adecuados, que reaccionan en presencia de TFA, incluyen luciferina y luciferasa, acompañados, si es necesario, por una fuente de iones de magnesio tales como acetato de magnesio. En presencia de TFA, estos reactivos producen una señal luminiscente que puede controlarse fácilmente por ejemplo utilizando aparatos luminómetros convencionales.

Al generar una señal, estos reactivos regeneran una molécula AMP que, en presencia de las enzimas y/o reactivos de (c), se volverán a convertir de nuevo a TFA. De este modo, la señal se acumula exponencialmente y así se detectará de manera fácil y rápida. Un ejemplo de dicho dispositivo lo describe Sakakibara y otros, Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999). Este aumento exponencial de la señal puede significar que la detección puede realizarse directamente, en las circunstancias en las que puede haberse requerido previamente reacciones de amplificación.

Convenientemente, los reactivos bioluminescentes están presentes o se introducen durante la reacción de amplificación para poder controlar el progreso de la reacción. En términos generales, la termoestabilidad de reactivos tales como la luciferasa no es suficiente para permitir que esté presente durante toda una reacción de amplificación y de este modo, se añade adecuadamente al final de cada ciclo. Dicha información puede utilizarse entonces en la cuantificación de la secuencia de ácidos nucleicos objetivo en la muestra, utilizando algoritmos etc., que son conocidos en la técnica.

La reacción de amplificación puede llevarse a cabo de manera habitual, por ejemplo repitiendo cíclicamente la mezcla de reacción por temperaturas de desnaturalización, recocido y extensión.

La reacción tal como se ha descrito anteriormente podría llevarse a cabo en una variedad de equipos convencionales. Éstos incluyen por ejemplo el Pyrosequencer (disponible de Pyrosequencing AB, Suecia), que ya viene dotado de medios de detección de señales apropiados. Alternativamente, la reacción puede llevarse a cabo utilizando dispositivos de calentamiento en bloque tal como se describe por ejemplo en EP-A-0810. 030 y suministrado por Perkin-Elmer Corporation, secuenciadores térmicos rápidos de aire caliente tales como el RapidCycler® y el LightCycler® de Idaho Technologys Inc. u otros tipos de secuenciadores térmicos tales como los descritos en W098/24548.

Este procedimiento se ilustra de manera esquemática en lo sucesivo en la figura 1. En la fase inicial de una reacción PCR, una muestra que contiene o se sospecha que contiene una secuencia de ácidos nucleicos particular se calienta a una temperatura en la cual el ADN se desnaturaliza para formar cadenas plantilla de cadena única (1). Un iniciador de PCR convencional (2) se une a un extremo de la cadena plantilla, mientras que la sonda de ARN complementaria (3) se une en otra parte de la secuencia objetivo. La enzima polimerasa opera entonces durante la fase del prolongación de la reacción para extender el iniciador (2) en la dirección de la flecha para formar una cadena complementaria de longitud completa. Durante el curso de este procedimiento, la sonda de ARN (3) se hidrolizará según se ilustra mediante la línea discontinua, liberando AMP, que se convierte in situ en TFA. Este TFA se detecta entonces como una señal de luz.

El procedimiento de la invención también puede adaptarse para secuenciar aplicaciones y/o para detectar polimorfismos o variaciones en secuencias de ADN.

En este procedimiento se llevan a cabo las siguientes etapas:

(i)

unir una sonda de ARN a una zona conocida de dicha secuencia tal que por lo menos un nucleótido en un extremo de dicha sonda alcance a una zona desconocida o incierta de la secuencia;

(ii)

llevar a cabo una reacción de amplificación durante la cual la sonda de ARN se hidroliza utilizando una enzima que hidroliza ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN;

(iii)

convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina;

(iv)

añadir a la muestra reactivos bioluminescentes que reaccionan en presencia de TFA;

(v)

detectar una señal de dichos reactivos bioluminescentes;

(vi)

referir esa señal a la presencia de una zona de la secuencia que es complementaria o de otra manera al extremo de la sonda.

En tales casos, si el uno o más nucleótidos en el extremo de la sonda son precisamente complementarios a la secuencia desconocida o incierta, la sonda se le unirá de manera mucho más eficaz, con lo cual la enzima hidrolizará eficientemente la sonda unida durante el etapa (ii). En consecuencia, se genera AMP, el cual se convierte en TFA tal como se ha descrito anteriormente, y se detectada utilizando un dispositivo bioluminiscente.

Sin embargo, si el/los nucleótido(s) en un extremo de la sonda de ARN no es una coincidencia correcta para el ADN plantilla, entonces el efecto de la enzima en (ii) será sacar en gran parte la sonda intacta, de la plantilla. En consecuencia, no se produce ninguna hidrólisis significativa y esto se verá reflejado en la ausencia o reducción sustancial en cualquier señal bioluminiscente generada.

Esta reacción puede llevarse a cabo más de una vez, utilizando sondas con diferentes nucleótidos en las zonas extremas. Por ejemplo, si el nucleótido encontrado en la secuencia en esta posición no se conoce, pueden prepararse cuatro sondas distintas, cada una con un nucleótido diferente, C, G, U y A en el extremo. Llevando a cabo el procedimiento de la invención con cada uno de éstos individualmente, debería ser fácilmente evidente cuál es el nucleótido correcto en esta posición por el nivel de señal generado. Una buena señal solamente se esperaría en la reacción en la que la sonda incluye el nucleótido complementario en el extremo.

Si se desea, puede incluirse más de un nucleótido desconocido en el extremo, por ejemplo hasta tres nucleótidos. En tales casos, pueden realizarse sondas que representen todas las posibles combinaciones de secuencias en las posiciones. Se esperaría que la sonda que presente una secuencia precisamente complementaria en el extremo sea hidrolizada eficientemente.

El extremo utilizado puede ser el extremo de la sonda 3' o el 5', en función de la naturaleza de la secuencia conocida frente a la desconocida o incierta. La enzima utilizada la etapa (ii) se seleccionará teniendo esto en cuenta. La hidrólisis de una sonda de ARN unida firmemente puede efectuarse mejor cuando el extremo es el extremo 3' y la enzima utilizada en la etapa (ii) es capaz de una hidrólisis 3' - 5' (en comparación con la hidrólisis 3'-5'), como a menudo se encuentra en las enzimas que se considera que tienen una buena función de "corrección".

Si se lleva a cabo una pluralidad de reacciones, éstas puede realizarse convenientemente de manera simultánea en tubos, cavidades o recipientes de reacción separados, los cuales se disponen en una matriz. Los tubos, cavidades o recipientes pueden repetirse cíclicamente juntos y las señales de cada tubo pueden controlarse utilizando un luminómetro situado de manera apropiada.

Alternativamente, puede inmovilizarse una sonda en un soporte, por ejemplo de tipo "varilla", para proporcionar una prueba de diagnóstico, por ejemplo para un polimorfismo o una variación alélica en una secuencia de la prueba concreta tal como se describe a continuación.

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Las enzimas y los reactivos utilizados en el procedimiento serán similares a los utilizados en el procedimiento para detectar la presencia o la cantidad de una muestra de ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente. De manera similar, la reacción puede realizarse en un equipo tal como se ha descrito anteriormente.

La reacción se utiliza en combinación con una reacción de amplificación tal como una reacción PCR. Por lo menos algunas fases de la reacción PCR se realizan para conseguir la hidrólisis en la etapa (ii).

Dichos procedimientos serían útiles en la secuenciación, donde por lo menos una parte de la secuencia de partida es conocida (por ejemplo, una secuencia de iniciación universal). Las secuencias completas pueden resolverse entonces reiterando el proceso a lo largo de la secuencia. Las reacciones paralelas para dilucidar la secuencia pueden ser posible utilizando bibliotecas de oligonucleótidos de ARN como sondas, donde por ejemplo se conoce que la secuencia contiene varias zonas conservadas a lo largo de las mismas, por ejemplo tal como ocurre durante una ribotipificación. Estas zonas pueden utilizarse cada una como secuencia conocida para localizar las sondas de ARN.

También puede realizarse una secuenciación del sentido inverso a modo de confirmación utilizando el procedimiento de la invención. Si es posible como resultado de la presencia de zonas conservadas, esto puede realizarse en paralelo utilizando una matriz de reacciones.

Alternativamente, los procedimientos pueden utilizarse en la detección de polimorfismos o variaciones alélicas para su uso en diagnóstico. En tales casos, la secuencia puede conocerse substancialmente excepto para una zona pequeña de uno o más nucleótidos que puedan ser inciertos en el lugar geométrico del polimorfismo o variación. En tales casos, la sonda de ARN se diseña tal que por lo menos un nucleótido de la zona extrema corresponde al polimorfismo o variación en la secuencia, con lo cual una hidrólisis eficaz o de otra manera, indicará si la secuencia real es o no complementaria a la secuencia de la sonda.

Estas reacciones pueden llevarse a cabo en tubos, cavidades o recipientes de reacción tal como se ha descrito anteriormente. De nuevo, se encontrarán apropiadamente en una matriz donde se efectuarán múltiples reacciones.

Todavía en otro aspecto, la invención presenta un equipo para su uso en un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente. Dichos equipos comprenderán por lo menos una sonda de ARN que sea específica para la secuencia de ADN objetivo, una enzima que pueda hidrolizar ARN cuando se encuentre en forma de dúplex ARN/ADN, un iniciador de amplificación y medios para convertir AMP en TFA. En el caso del procedimiento para detectar polimorfismos, el equipo puede comprender hasta cuatro sondas de ARN similares, que se difieran solamente en la presencia de un nucleótido distinto en el extremo 3'.

Los equipos comprenderán convenientemente uno o más reactivos adicionales para su uso en el procedimiento. En particular, pueden contener también reactivos bioluminescentes tales como luciferasa y/o luciferina. Otros componentes opcionales concretos del equipo pueden incluir iniciadores para su uso en una amplificación particular. Además, los equipos pueden contener una ADN polimerasa que hidrolice el ARN o una ARNasa tal como se ha descrito anteriormente.

Pueden incluirse también otros reactivos tales como búferes, nucleótidos, enzimas de polimerasa, etc. que puedan requerirse para efectuar una amplificación.

Las sondas de hidrólisis de ARN proporcionan por lo tanto medios muy versátiles para generar señales que indican la presencia de secuencias de ácidos nucleicos muy específicas en una muestra. La sensibilidad de los análisis utilizando dichas sondas en combinación con sistemas de detección bioluminiscente es elevada y las señales pueden generarse rápidamente.

Claims (15)

1. Procedimiento para detectar la presencia o cantidad de una secuencia de ADN objetivo en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en presencia de (a) una sonda de ARN que es específica para por lo menos una parte de dicha secuencia de ADN objetivo; (b) una enzima que hidroliza ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN y (c) una o más enzimas y/o reactivos necesarios para convertir el monofosfato de adenosina producido a trifosfato de adenosina; añadir a la muestra reactivos bioluminiscentes que reaccionan en presencia de TFA, detectar una señal de dichos reactivos bioluminiscentes y referirla a la presencia o cantidad de la secuencia de ácidos nucleicos objetivo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que la enzima de (b) es un ADN polimerasa utilizado en la reacción de amplificación, o una ARNasa.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que (c) comprende fosfoenol piruvato sintasa, fosfato y fosfoenol piruvato.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que (c) comprende una combinación de un nucleósido trifosfato de adenilato quinasa, nucleósido 5'-trifosfato (NTP) y adenilato quinasa.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que (c) comprende piruvato fosfato diquinasa.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que los reactivos bioluminescentes comprenden luciferina y luciferasa.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que los reactivos bioluminescentes comprenden además una fuente de iones de magnesio.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que los reactivos bioluminescentes se añaden durante la reacción de amplificación.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que el desarrollo de la reacción se controla durante la misma y esta información se utiliza en la cuantificación de la secuencia de ADN objetivo en la muestra.

11. Equipo para su utilización en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que comprende por lo menos una sonda de ARN que es específica para una secuencia de ADN objetivo, una enzima que puede hidrolizar ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN, un iniciador de amplificación de ácidos nucleicos y medios para convertir AMP en TFA.

12. Equipo según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que dichos medios comprenden una combinación de fosfoenol piruvato sintasa, fosfato y fosfoenol piruvato; una combinación de un nucleósido trifosfato de adenilato quinasa, nucleósido 5'-trifosfato (NTP) y adenilato quinasa; o piruvato fosfato diquinasa.

13. Equipo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que comprende además un reactivo bioluminiscente.

14. Equipo según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que comprende luciferina y luciferasa.

15. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado por el hecho de que comprende además un ADN polimerasa que hidroliza ARN cuando se encuentra en forma de dúplex ARN/ADN o una ARNasa.