KR20030092136A - 분석 방법 및 키트 - Google Patents

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KR20030092136A
KR20030092136A KR10-2003-7014486A KR20037014486A KR20030092136A KR 20030092136 A KR20030092136 A KR 20030092136A KR 20037014486 A KR20037014486 A KR 20037014486A KR 20030092136 A KR20030092136 A KR 20030092136A
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KR10-2003-7014486A
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스퀴렐데이비드제임스
리마틴앨런
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더 세크러터리 오브 스테이트 포 디펜스
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Abstract

핵산 서열의 검출 또는 분석을 위한 RNA 프로브를 사용하는 분석 방법이 기술된다. 상기 프로브는 핵산 서열을 함유하는 것으로 추측되는 표본과 접촉하고 이들이 이중체를 형성한다면, 이들은 가수분해된다. 상기 과정은, 예를 들어 증폭 반응 동안 수행될 수 있다. 가수분해 결과로서 생성된 AMP는 ATP로 전환된다. ATP는 이후에 생발광성 시약을 사용하여 검출될 수 있다.

Description

분석 방법 및 키트 {Analytical method and kit}
본 발명은, 예를 들면 표본내에서 특정한 서열의 존재를 검출하거나, 또는 특정한 핵산의 정확한 서열을 결정하기 위한, 핵산 서열의 분석 방법 및 상기 방법에서 사용하기 위한 키트 및 시약에 관한 것이다.
현재 핵산의 분석을 실시하는 다양한 범위의 방법이 있다. 분석 방법은 특정한 핵산을 함유하고 있다고 추측되는 표본내에서 그 핵산 서열의 존재 또는 양을 검출하는 것이다. 다른 방법은 정보 또는 진단 목적으로 뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해서 핵산의 구조를 규명하는 것이다.
증폭 반응은 상기 분석을 실시하거나 보조하기 위해서, 특히 특정한 핵산 서열이 미미한 양만으로 존재하는 경우에 통상적으로 사용된다. 표적 핵산 서열의 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 반응의 용도는 잘 공지되어 있다. 특정한 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머는 증폭 반응 혼합물에 포함된다. 이는 표본 튜브내에서 단일 쇄 형태인 경우의 특이적 표적 서열에 대해 하이브리드화될 것이다. 표적 서열이 존재한다면, 프라이머는 이에 결합하고, 그 결과로 임의의 온도 상태에서, 혼합물에 존재하는 폴리머라제 효소가 완전히 상보적인 쇄를 형성하기 위해서 프라이머를 신장시킬 것이다. 상기 물질은 이후에 변성, 프라이머 어닐링(annealing) 및 신장의 연속적인 순환에서 증폭을 위한, 추가적인 주형을 형성한다.
증폭된 생산물은, 예를 들어 전기영동 겔 상에서 검출될 수 있을 것이다. 그러나, 형광 표지 방법은 증폭 반응이 실시된 때 이의 진행을 검출하고/하거나 조사하기 위해서 현재 자주 사용된다. 상기 분석의 예는 타크맨TM(TAQMANTM) 분석뿐 아니라, 예를 들면 WO 99/28500, WO 99/28501, WO 99/42611 및 WO 99/66071에서 기술되고 청구된 분석법을 포함한다. 표지된 리보-올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 분석은 WO 98/04738에서 기술되었다. 그러나 프로브의 표지화는 비용을 증가시키는 복잡한 절차이다.
핵산 서열을 분석하는 방법은 또한 널리 공지되었다. 겔 방법은 통상적이다. 최신 방법은 단일 쇄 핵산 주형 상에 상보적인 쇄를 구성하는 동안 정확한 뉴클레오티드가 부가될 때 가시적 신호의 생성에 의존하는, 피로시퀀싱 AB(Pyrosequencing AB)사로부터 이용 가능한 피로시퀀서(Pyrosequencer)와 같은 기기를 사용하여서 수행된다. 피로인산첨가분해(pyrophosphorolysis) 반응을 사용하여 핵산 표본에서 특이적 염기의 동일성의 정보를 얻는 다른 방법은 WO 99/46409에 기술되어 있다.
본 출원인은 표지되지 않은 RNA 프로브가 상기 현상들을 조사하거나 검출하기 위한 바람직한 수단을 제공할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명에서는 프로브가 서열에 결합할 수 있도록 하는 상태하에서 RNA 프로브를 서열과 접촉시키는 단계, 임의의 핵산/프로브 복합체를, 핵산에 결합된 RNA프로브가 가수분해되어 아데노신 모노포스페이트(AMP)를 생성하도록 하는 상태가 되게 하는 단계, 생산된 AMP를 검출하는 단계, 및 이를 표본에서 핵산 서열의 존재 또는 특성에 관련시키는 단계를 포함하는, 표본에서 핵산 서열을 검출하거나 분석하는 방법에 관한 것이다.
RNA 프로브는, 이중 쇄 형태일 때, 다양한 효소에 의해서 쉽게 가수분해될 수 있다. 여기에는 Taq 폴리머라제와 같은 PCR 반응에서 일반적으로 사용되는 폴리머라제 효소를 포함한다. 대안적으로, 이들 프로브는 예를 들어 RNA/DNA 이중체와 같은 이중 쇄 형태일 때만 이들을 가수분해할 수 있는 RNase 효소에 의해서도 가수분해될 수 있다. 상기 이중체는 PCR 반응과 같은 증폭 반응의 과정에서 형성될 수 있으나, 반드시 그런 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 수행된 것과 같은 RNA의 가수분해는 아데노신 모노포스페이트(AMP)를 생산한다. 이는 직접적으로 또는 아데노신 디포스페이트의 생산 경로를 거쳐서 효소적으로 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 인산화될 수 있다.
ATP는 생발광성 시스템, 특정한 예로 루시페라제(luciferase)/루시페린(luciferin) 검출 시스템을 사용하여서 쉽게 검출할 수 있다. 상기 검출 시스템의 적용의 예는 예를 들면 WO 96/02665에서 기술되어 있다.
루시페라제/루시페린 시스템과 같은 생발광성 시스템은 필요한 폴리머라제 활성을 획득하기 위해서 PCR 반응에 일반적으로 부가되는 데옥시ATP(dATP)와 함께 반응하지 않는다. 그러므로, 이는 RNA 프로브의 가수분해 결과로서 생산된 ATP 및다른 목적을 위해 반응 혼합물에 부가되는 것이 요구될 수 있는 dATP 사이를 구별할 수 있다.
생발광성 검출 시스템은 형광 시스템보다 더 민감하다. 그 결과로, 분석 방법에서 RNA 가수분해 프로브의 사용으로 표본내에서 핵산 수준에서 상호작용의 검출이 용이해지고 이로써 분석 방법이 강화된다.
특정한 양태에서, 본 발명은 표본내에서 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 표본내에서 핵산을 변성시키는 단계, 프로브가 표적 핵산과 이중체를 형성하도록 표적 핵산의 적어도 한 부분에 특이적인 RNA 가수분해 프로브를 상기 핵산과 접촉시키는 단계; 이중 쇄 형태(예를 들어 RNA/DNA 이중체)인 경우의 RNA를 가수분해하는 효소 및 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하기 위해 필요한 하나 이상의 효소 및 시약을 부가하는 단계; ATP 존재에 반응하는 생발광성 시약을 표본에 부가하는 단계; 생발광성 시약으로부터 신호를 검출하는 단계; 및 이를 핵산 서열의 존재 또는 양에 관련시키는 단계를 포함한다.
상기 방법은 증폭 반응에서 자주 수행될 것이다. 그러므로 추가적 특정한 양태에서, 본 발명은 표본내에서 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 표적 핵산의 한 부분 이상에 특이적인 RNA 프로브 ; (b) 이중 쇄 형태(예를 들어 RNA/DNA 이중체)인 경우의 RNA를 가수분해하는 효소 및 (c) 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하는데 필요한 하나 이상의 효소 또는 시약의 존재하에, 중합효소 연쇄 반응과 같은 증폭반응을 실시하는 단계, ATP 존재에 대해 반응하는 생발광성 시약을 표본에 부가하는 단계, 생발광성 시약으로부터 신호를 검출하는 단계, 및 이를 표적 핵산 서열의 존재 또는 양에 관련시키는 단계를 포함한다.
이중 쇄 형태(상기 (b))인 경우의 RNA를 가수분해하는 적절한 효소는, 증폭 반응에서 사용되는 폴리머라제이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적절한 DNA 폴리머라제의 예는 덜머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 폴리머라제(Taq), 덜머스 덜모필러스(Thermus thermophilus) 폴리머라제(Tth), 덜머스 스페시스 NH(Thermus species NH) 폴리머라제(TspNH), 덜머스 브로키아누스(Thermus brockianus) 폴리머라제(Tbr)[모두 영국, 판보로(Farnborough)의 제네시스 리미티드(Genesys Limited)사로부터 획득할 수 있음], 피로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus) 폴리머라제(Pfu)[스트라타진(Stratagene)사로부터 획득할 수 있음], 9°N7 엑소-DNA(exo-DNA) 폴리머라제, 및 덜모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 폴리머라제[VENTTMDNA 폴리머라제로서 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)사로부터 획득할 수 있음]과 같은 내열성 폴리머라제이다.
그러나, 만일 상기의 효소가 RNA를 충분히 빠르게 가수분해하지 않는다면, 예를 들어 빠른 PCR이 사용되어진다면, 당해 분야에서 공지된 바와 같은, 적절한 RNase 및 특정한 DNA 의존 RNase가 이후에 또한 부가될 수 있다.
생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하는데 필요한 하나 이상의 효소(상기 (c))는, 예를 들면 포스페이트 및 포스포에놀피루베이트의 존재하에 AMP로부터 직접 ATP를 생산하는 포스포에놀피루베이트 신타제로부터 선택되는데, 이는 또한 반응 혼합물에 시약처럼 첨가될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오시드 트리포스페이트-아데닐레이트 키나제 및 NTP의 배합물은 아데노신 디포스페이트(ADP)를 생성시킬 것이고, 이는 후에 아데닐레이트 키나제와 같은 효소의 포함 또는 부가에 의해서 ATP로 전환될 수 있다.
적절한 효소의 추가적인 예는 문헌[참고 자료 : Eisaki et al, Biochem. et Biophys Acta 1431 (1999) 363-373]에서 기술된 바와 같은 피루베이트 포스페이트 디키나제를 포함한다.
ATP 존재에 반응하는 특히 적절한 생발광성 시약은, 필요하다면 마그네슘 아세테이트와 같은 마그네슘 이온원에 의해 동반되는, 루시페린 및 루시페라제를 포함한다. ATP의 존재하에, 상기 시약은 발광 신호를 생산하는데, 이는 예를 들어 통상적인 발광분석기를 사용하여서 쉽게 조사될 수 있다.
신호를 생성하는데, 상기 시약은 AMP 분자를 재생시켜서, (c)의 효소 및/또는 시약의 존재에서, 다시 ATP로 재전환될 것이다. 그러므로 신호는 기하급수적으로 증강되어서 쉽고 빠르게 검출될 것이다. 상기 시스템의 예는 문헌[참고 자료 : Sakakibara et al., Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)]에서 기술되었다. 신호에서 이같은 기하급수적 증가는, 증폭 반응이 선행적으로 요구될 수 있는 상황에서, 검출이 직접적으로 수행될 수 있음을 의미한다.
적절하게 생발광성 시약은 증폭 반응 내내 존재하거나 부가되어서 반응의 진행이 조사될 수 있다. 일반적으로, 루시페라제와 같은 시약의 내열성은 증폭 반응내내 존재하기에는 충분하지 않아서, 각 순환의 끝에서 적절하게 첨가된다. 상기 정보는 이후에 당해 분야에서 공지된 알고리듬 등을 사용하여서, 표본내 표적 핵산 서열의 정량화에 사용될 수 있다.
증폭 반응은 통상적인 방법으로, 예를 들어 변성, 어닐링 및 신장 온도를 통하여 반응 혼합물을 순환함으로써 실시될 수 있다.
상기에서 기술된 바와 같이 반응은 다양한 통상적인 설비에서 수행될 수 있다. 이는 예를 들어 적당한 신호 검출 수단으로 이미 제공된, 피로시퀀서(스웨덴 소재의 피로시퀀싱 AB사로부터 이용가능함)를 포함한다. 또한, 반응은 예를 들어 EP-A-0810030에서 기술되고 펄킨-엘머 코포레이션(Perkin-Elmer Corporation)사에 의해서 공급되는 것과 같은 통상적인 블럭 가열 기기, 아이다호 테크놀러지 인코포레이티드(Idaho Technologies Inc.)사로부터 래피드사이클러TM(RapidCyclerTM) 및 라이트사이클러TM(LightCyclerTM)과 같은 고속 증기 열 순환기 또는 WO 98/24548에서 기술된 것과 같은 열 순환기의 다른 형태를 사용하여서 수행될 수 있다.
상기 방법은 하기 도 1에서 도해적으로 예시된다. PCR 반응의 초기 단계에서, 특정한 핵산 서열을 함유하거나 함유하고 있다고 추측되는 표본은 단일 쇄 주형 쇄 (1)를 형성하기 위해서 DNA가 변성되는 온도로 가열시킨다. 통상적인 PCR 프라이머 (2)는 주형 쇄의 말단에 결합하는 반면에, 상보적인 RNA 프로브 (3)는 표적 서열상의 임의의 위치에 결합한다. 폴리머라제 효소는 이후에 상보적인 전체-길이 쇄를 형성하기 위한 화살표 방향에서 프라이머(2)를 신장시키기 위해서 반응의신장 단계동안 작용한다. 상기 절차의 과정 동안, RNA 프로브 (3)는 점선으로 도해된 것과 같이 가수분해되어서, AMP를 방출하고, 이는 원위치에서 ATP로 전환될 것이다. 상기 ATP는 이후에 밝은 신호로서 검출된다.
본 발명의 방법은 또한 DNA 또는 RNA 서열에서 서열분석의 적용 및/또는 다형성(polymorphism) 또는 변이를 검출하기 위해 응용될 수 있다.
추가적인 면에서, 본 발명은 핵산의 서열을 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(ⅰ) 프로브 말단에 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열의 불명하거나 불확실한 영역에 도달하도록 당해 서열의 주지 영역에 RNA 프로브를 결합하는 단계;
(ⅱ) 이중 쇄 형태(예를 들면 RNA/DNA 이중체)인 경우의 RNA만을 가수분해하는 효소를 사용하여서 RNA 프로브를 가수분해하는 단계;
(ⅲ) 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하는 단계;
(ⅳ) ATP 존재에 반응하는 생발광성 시약을 표본에 부가하는 단계;
(ⅴ) 상기 생발광성 시약으로부터 신호를 검출하는 단계; 및
(ⅵ) 상기 신호를 상보적인 서열 영역의 존재 또는 그렇지 않다면 프로브 말단에 관련시키는 단계를 포함한다.
상기 경우에, 프로브의 말단의 하나 이상의 뉴클레오티드가 불명하거나 불확실한 서열에 정확하게 상보적이라면, 프로브는 이에 가장 효율적으로 결합하고, 그 결과로 효소는 단계 (ⅱ) 동안 결합된 프로브를 효율적으로 가수분해할 것이다.결과적으로, AMP가 생성되고, 상기에 기술된 바와 같이 ATP로 전환되며, 생발광성 시스템을 사용하여서 검출된다.
그러나, RNA 프로브의 말단에서 뉴클레오티드(들)이 주형 DNA에 정확하게 합치되지 않는다면, (ⅱ)에서 효소의 효과는 주형으로부터, 프로브 손상없이 대부분 제거될 것이다. 결과적으로 현저한 가수분해는 발생하지 않고 이는 생성된 생발광성 신호의 부족 또는 실질적인 감소로 반영될 것이다.
상기 반응은 말단 영역에 상이한 뉴클레오티드를 가진 프로브를 사용하여서, 1회 이상 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 위치에서 서열내에서 발견된 뉴클레오티드가 공지되지 않았다면, 말단에 상이한 뉴클레오티드 C, G, U 및 A를 각각 가진 네 개 이하의 상이한 프로브가 제조될 수 있다. 이들 각각을 가지고 개별적으로 본 발명의 방법을 실시함으로써, 생성된 신호의 수준에 의해서, 상기 위치에서 어떤 것이 정확한 뉴클레오티드인지 쉽게 밝혀질 수 있다. 충분한 신호는 프로브가 말단에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 반응에서만 예측될 수 있다.
바람직하게, 하나 이상의 불명한 뉴클레오티드, 예를 들어 세 개의 뉴클레오티드까지 말단에 포함될 수 있다. 상기 경우에, 당해 위치에서 서열의 모든 가능한 조합을 나타내는 프로브가 수행될 수 있다. 말단에 정확하게 상보적인 서열을 가진 프로브는 효율적으로 가수분해될 것이라고 예측될 수 있다.
사용되는 말단은 불명하거나 불확실한 서열에 대하여 공지된 서열의 특성에 좌우되어서, 프로브의 3' 또는 5' 말단이 될 수 있다. 단계 (ⅱ) 에서 사용된 효소는 이를 염두에 두어 선택될 것이다. 단단히 결합된 RNA 프로브의 가수분해는말단이 3' 말단이고 단계 (ⅱ) 에서 사용된 효소가, 충분한 "교정" 기능을 가진 것으로 간주되는 효소에서 자주 발견되는 것처럼, 3'-5' 가수분해(3'-5' 가수분해와 비교하여서)가 가능한 때 더 잘 실시될 수 있다.
복수의 반응이 수행되는 경우, 이들은 정렬(array)로 배열되어 있는, 분리된 반응 튜브, 웰(well) 또는 관에서 동시적으로 수행될 수 있다. 튜브, 웰 또는 관은 함께 순환될 수 있고 적당하게 위치한 발광분석기를 사용하여서 각 튜브로부터 신호가 조사될 수 있다.
대안으로, 프로브는, 예를 들면 하기의 대략적인 특정한 시험 서열에서 다형성 또는 대립형질 변이에 대한 진단 시험을 제공하기 위하여, 예를 들면, "딥스틱(dipstick)" 모양과 같은 지지체 상에 고정될 수 있다.
본 방법에서 사용되는 효소 및 시약은 상기에서 기술된 바와 같이 핵산 표본의 존재 또는 양을 검출하는 방법에서 사용되는 것과 유사할 것이다. 유사하게 본 반응은 상기에서 기술된 바와 같은 설비에서 수행될 수 있다.
반응은 PCR 반응과 같은 증폭 반응과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면 반응은 PCR 반응 직후에 수행될 수 있다. PCR 반응의 적어도 일부 단계가 단계 (ⅱ) 에서 가수분해를 성취하기 위해서 실시될 수 있다. 그러나, 일반적으로 검출되는 AMP의 "재활용"의 결과로서, 시스템 자체가 충분히 증폭된 신호를 제공하기 때문에, 이는 필요하지 않을 수 있다.
상기 방법은 시작하는 서열의 한 부분 이상이 공지된 경우(예를 들어 보편적인 프라이밍 서열)에, 서열분석에 유용할 것이다. 전체 서열은 이후에 서열 길이에 따라 절차를 반복함으로써, 해결될 수 있다. 서열을 해석하기 위한 병행 반응은, 예를 들어 리보타이핑(ribotyping)하는 동안 발생할 수 있는 것과 같이 서열이 상기 길이에 따라 몇몇의 보존된 영역을 함유하는 것으로 공지된 경우에, 프로브로써 RNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 사용하여서 가능할 것이다. 상기 영역은 RNA 프로브를 국재화하기 위한 공지된 서열로서 각각 사용될 수 있다.
확인의 수단으로 역방향 서열분석은 또한 본 발명의 방법을 사용하여서 수행될 수 있다. 보존된 영역의 존재 결과로서 가능한 경우, 상기는 반응 정렬을 사용하여서 동시에 행해질 수 있다.
대안으로, 본 방법은 진단에 사용하기 위한 다형성 또는 대립형질 변이의 검출에서 사용될 수 있다. 상기 경우에, 서열은 다형성 또는 변이의 좌위(locus)에서 불확실할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드의 작은 영역을 제외하고 거의 공지될 수 있다. 상기 경우에, RNA 프로브는 서열에서 적어도 말단 영역 뉴클레오티드가 다형성 또는 변이에 상응하도록 설계하고, 그 결과로 효과적인 가수분해가 일어나거나 그렇지 않은 경우는 실제 서열이 프로브 서열에 상보적이거나 그렇지 않다는 것을 나타낼 것이다.
상기 반응은 위에서 기술된 것과 같이 반응 튜브, 웰 또는 관에서 실시될 수 있다. 게다가, 이들은 다중 반응이 수행되는 배열로 있는 것이 편리하다.
추가적인 면에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표적 서열에 특이적인 하나 이상의 RNA 프로브 및 또한 AMP를 ATP로 전환하기 위한 임의의 수단을 포함할 것이다. 다형성을 검출하는 방법의 경우에, 키트는 3' 말단에 상이한 뉴클레오티드의 존재에 의해서만 달라지는 네 개의 유사한 RNA 프로브를 포함할 것이다.
키트는 본 방법에서 사용을 위해 하나 이상의 추가적인 시약을 적절하게 포함할 것이다. 특히, 이는 또한 루시페라제 및/또는 루시페린과 같은 생발광성 시약을 함유할 수 있다. 키트의 다른 특정한 임의의 구성 요소는 특정 증폭에 사용되기 위한 프라이머를 포함할 수 있다. 게다가, 키트는 상기에서 기술된 바와 같이 RNA를 가수분해하는 DNA 폴리머라제 또는 RNase를 함유할 수 있다.
증폭을 실시하기 위해서 요구될 수 있는, 완충액, 뉴클레오티드, 폴리머라제 효소 등과 같은 다른 시약도 또한 포함될 수 있다.
그러므로 RNA 가수분해 프로브는 표본내에서 매우 특이적인 핵산 서열의 존재를 나타내는 신호를 생성하기 위한 매우 융통성 있는 수단을 제공한다. 생발광성 검출 시스템과 결합된 상기 프로브를 사용한 분석의 민감도는 높고 신호는 빠르게 생성될 수 있다.

Claims (35)

  1. 프로브가 서열에 결합할 수 있도록 하는 상태하에서 RNA 프로브를 서열과 접촉시키는 단계, 임의의 핵산/프로브 복합체를, 핵산에 결합된 RNA 프로브가 가수분해되어 아데노신 모노포스페이트(AMP)를 생성하도록 하는 상태가 되게 하는 단계, 생산된 AMP를 검출하는 단계, 및 이를 표본에서 핵산 서열의 존재 및 특성에 관련시키는 단계를 포함하는, 표본에서 핵산 서열을 검출하거나 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생성된 아데노신 모노포스페이트(AMP)가 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 전환되고, ATP가 생발광성 시약을 사용하여 검출되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, AMP가 효소적으로 ATP로 전환되는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 생발광성 시약이 루시페라제(luciferase)/루시페린(luciferin) 검출 시스템을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, RNA 프로브가 PCR 반응에서 사용되는 폴리머라제 효소에 의하여 이중 쇄의 형태인 경우에 가수분해되는 방법.
  6. (a) 표적 핵산의 한 부분 이상에 대하여 특이적인 RNA 프로브; (b) 이중 쇄형태인 경우의 RNA를 가수분해하는 효소; 및 (c) 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하는데 필요한 하나 이상의 효소 및/또는 시약의 존재하에 증폭 반응을 실시하는 단계, ATP의 존재에 대해 반응하는 생발광성 시약을 표본에 부가하는 단계, 생발광성 시약으로부터 신호를 검출하는 단계 및 이를 표적 핵산 서열의 존재 또는 양과 관련시키는 단계를 포함하는, 표본내에서 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 증폭 반응이 중합효소 연쇄 반응(PCR)인 방법.
  8. 제7항에 있어서, (b)의 효소가 증폭 반응에서 사용되는 DNA 폴리머라제, 또는 RNase인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, (c)가 포스포에놀피루베이트 신타제, 포스페이트 및 포스포에놀피루베이트를 포함하는 방법.
  10. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, (c)가 뉴클레오시드 트리포스페이트-아데닐레이트 키나제, 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP) 및 아데닐레이트 키나제의 배합물을 포함하는 방법.
  11. 제6항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 생발광성 시약이 루시페린 및 루시페라제를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 생발광성 시약이 마그네슘 이온원을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제6항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 생발광성 시약이 증폭 반응 내내부가되는 방법.
  14. (ⅰ) 프로브 말단의 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열의 불명하거나 불확실한 영역에 도달하도록 당해 서열의 주지 영역에 RNA 프로브를 결합시키는 단계;
    (ⅱ) 이중 쇄 형태(예를 들면 RNA/DNA 이중체)인 경우의 RNA만을 가수분해하는 효소를 사용하여서 RNA 프로브를 가수분해하는 단계;
    (ⅲ) 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환하는 단계;
    (ⅳ) ATP 존재에 대해 반응하는 생발광성 시약을 표본에 부가하는 단계;
    (ⅴ) 상기 생발광성 시약으로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    (ⅵ) 상기 신호를 상보적인 서열 영역의 존재 또는 그렇지 않다면 프로브 말단에 관련시키는 단계를 포함하는, 핵산의 서열을 결정하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 말단에 상이한 뉴클레오티드를 가진 RNA 가수분해 프로브를 사용하여 1회 이상 수행하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 말단에 C, G, U 및 A 중 상이한 하나를 가지는 유사한 RNA 가수분해 프로브를 사용하여 반응이 4회 실시되는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 반응이 동시에 실시되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 정렬(array)로 배열되어 있는, 분리된 반응 튜브, 웰(well) 또는 관에서 반응이 실시되는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서, 전환이 포스포에놀피루베이트 신타제, 포스페이트 및 포스포에놀피루베이트를 부가함으로써 실시되는 방법.
  20. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서, 전환이 뉴클레오시드 트리포스페이트-아데닐레이트 키나제, 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP) 및 아데닐레이트 키나제의 배합물을 부가함으로써 실시되는 방법.
  21. 제14항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅳ)에서 사용된 생발광성시약이 루시페린 및 루시페라제를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 생발광성 시약이 마그네슘 이온원을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제14항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 다형성(polymorphism) 또는 대립 형질 변이를 검출하기 위해 사용되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, RNA 프로브가 딥스틱(dipstick)과 같은 지지체에 고정된 방법.
  25. 제14항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 핵산을 서열분석하기 위해 사용되는 방법.
  26. 표적 서열에 특이적인 하나 이상의 RNA 프로브, 및 이중 쇄 형태인 경우의 RNA를 가수분해할 수 있는 효소를 포함하는 분석용 키트.
  27. 제26항에 있어서, AMP를 ATP로 전환시키는 수단을 추가로 포함하는 키트.
  28. 제27항에 있어서, 수단이 포스포에놀피루베이트 신타제, 포스페이트 및 포스포에놀피루베이트의 배합물; 또는 뉴클레오시드 트리포스페이트-아데닐레이트 키나제, 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(NTP) 및 아데닐레이트 키나제의 배합물 중 어느 하나를 포함하는 키트.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 말단에 하나의 상이한 뉴클레오티드의 존재만이 상이한 네 개 이하의 유사한 RNA 프로브를 포함하는 키트.
  30. 제27항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서, 생발광성 시약을 추가로 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 루시페라제 및/또는 루시페린을 포함하는 키트.
  32. 제27항 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서, 증폭 프라이머를 추가로 포함하는 키트.
  33. 제27항 내지 제32항중 어느 한 항에 있어서, RNA를 가수분해하는 DNA 폴리머라제 또는 RNase를 추가로 포함하는 키트.
  34. 표본내에서 핵산을 변성시키는 단계; 프로브가 표적 핵산과 이중체를 형성하도록 표적 핵산의 한 부분 이상에 특이적인 RNA 가수분해 프로브를 상기 핵산과 접촉시키는 단계; 이중 쇄 형태(예를 들면 RNA/DNA 이중체 )인 경우의 RNA를 가수분해하는 효소 및 생산된 아데노신 모노포스페이트를 아데노신 트리포스페이트로 전환시키는데 필요한 하나 이상의 효소 또는 시약을 부가하는 단계; ATP 존재에 대해 반응하는 생발광성 시약을 표본에 첨가하는 단계; 생발광성 시약으로 부터 신호를 검출하는 단계 및 이를 표적 핵산 서열의 존재 또는 양과 관련시키는 단계를 포함하는, 표본내에서 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 방법.
  35. 제1항 내지 제26항 또는 제34항중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서 RNA 프로브의 용도.
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