CN102234691B - 靶多核苷酸的扩增效率的调节方法 - Google Patents

靶多核苷酸的扩增效率的调节方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102234691B
CN102234691B CN201110119525.3A CN201110119525A CN102234691B CN 102234691 B CN102234691 B CN 102234691B CN 201110119525 A CN201110119525 A CN 201110119525A CN 102234691 B CN102234691 B CN 102234691B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
target polynucleotide
amount
mentioned
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201110119525.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102234691A (zh
Inventor
小森真理子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Publication of CN102234691A publication Critical patent/CN102234691A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102234691B publication Critical patent/CN102234691B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供：使用下述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法包括：通过调节下述(i)～(iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率。(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。

Description

靶多核苷酸的扩增效率的调节方法
技术领域
本发明涉及调节靶多核苷酸的扩增效率的方法、以及调节靶多核苷酸的检测效率的方法、使用该方法的靶多核苷酸的检测方法。本发明还涉及疾病的试验方法和诊断方法。此外，本发明还涉及用于扩增靶多核苷酸的引物组合的制造方法、用于检测靶多核苷酸的试剂盒的制造方法。
背景技术
等位基因特异性PCR法(ASP-PCR法(Allele Specific Primer-PCR法))是用于检测SNPs等的突变的方法。典型的等位基因特异性PCR法是以组合的形式使用3’末端具有与突变等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸的引物和与该引物形成对以扩增包含SNP位点的区的引物，通过特异性地扩增包含突变等位基因的靶多核苷酸，来检测突变等位基因(日本专利第2853864号公报)。
但是，在上述的等位基因特异性PCR法中，为了特异性地扩增包含突变等位基因的靶多核苷酸，必需设定严格的PCR条件，因此存在着难以得到高的检测灵敏度的问题(日本特开2010-35532号公报)。
作为解决上述问题的技术，已知有作为典型的等位基因特异性PCR法的应用技术的核酸扩增方法，其特征在于，使用下述(i)～(iii)的引物进行上述靶核酸的PCR反应：(i)第1正向引物，该引物除了只在从3’末端数起第2碱基和第3碱基的其中一方中具有作为上述SNP位点的野生型核苷酸以外，还具有与包含上述靶核酸内的SNP位点的部分区同源的核苷酸序列；(ii)第2正向引物，该引物除了只在从3’末端数起第2碱基和第3碱基的其中一方中具有作为上述SNP位点的突变型核苷酸以外，还具有与包含上述靶核酸内的SNP位点的部分区同源的核苷酸序列；(iii)反向引物，该引物在上述靶核酸的互补链的、上述SNP位点的5’末端侧具有与不包含上述SNP位点所对应的位点的部分区同源的核苷酸序列(日本特开2010-35532号公报)。
发明内容
然而，通过检测基因中存在或不存在突变，来测定该突变所关联的疾病的可能性时，出于得到可用于疾病的诊断的有意义的检测结果的目的，必需分析各种检测灵敏度下的上述突变的检测结果和与该突变所关联的疾病有关的临床所见的关系，确定用于进行可用于诊断的检测的检测灵敏度的基准。
作为用于调节检测灵敏度的途径，通常认为是：通过根据作为检测目标的突变设法进行引物的设计，调节包含突变等位基因的靶多核苷酸的扩增效率。但是，在这样的途径中，必需反复进行引物的设计、引物的制作、确认扩增效率的工作，往往需要很大的劳力。
于是，本发明的课题在于：在扩增靶多核苷酸的技术中，提供简便地调节靶多核苷酸的扩增效率的技术。
作为解决上述课题的方法，本发明提供：在使用下述(i)～(iii)的引物通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法包括：通过调节下述(i)～(iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率。
各引物如下。
(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合(对合)；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；
(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。
利用上述方法，可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。
作为上述引物的量比，可以列举：第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量、第1引物的量相对第2引物的量。通过如此地调节引物的量比，可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。
本发明还提供：使用上述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸，再使用所得的扩增产物检测该靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)的方法，该方法通过利用本发明的扩增效率的调节方法，来调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。
利用上述方法，可以简便地调节靶多核苷酸的检测效率。
本发明还提供靶多核苷酸的检测方法，该方法包括：利用上述方法调节靶多核苷酸的检测效率，使用实现所调节的检测效率的量比的上述(i)～(iii)的引物进行PCR，检测所得的PCR扩增产物中的靶多核苷酸。
利用上述检测方法，可以以适当的检测灵敏度简便地进行靶多核苷酸的检测。
本发明还提供试验方法，该方法包括：使用上述检测方法检测来自受检者的基因中存在或不存在突变，将得到的检测结果与检测该突变时上述受检者有可能具有由该突变的存在引起的疾病的基准进行比较，从而试验由于存在上述突变而引起的疾病的可能性。
利用上述试验方法，可以降低得到临床上意义小的试验结果的可能性。
本发明还提供药效的预测方法，该方法包括：使用上述检测方法检测在来自受检者的基因中存在或不存在突变，通过比较所得的检测结果和该突变是否存在以及特定的药物的效果的关系，预测上述特定的药物对上述受检者的效果。
利用上述药效的预测方法，可以在给药时预测药效，期待可以进行有效的给药。
并且，本发明提供疾病的诊断方法，该方法包括：根据利用上述试验方法得到的试验结果来诊断疾病。
利用上述诊断方法，可以降低得到不适当的诊断结果的可能性。
本发明还提供引物组合的制造方法，所述引物组合用于通过PCR扩增或检测靶多核苷酸。该制造方法包括：使用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，组合实现所调节的扩增效率的量比的上述(i)～(iii)的引物。
利用上述制造方法，可以简便地制造实现靶多核苷酸的任意的扩增效率、检测效率的引物组合。
本发明还提供检测试剂盒的制造方法，所述检测试剂盒用于利用PCR检测靶多核苷酸。该制造方法包括：使用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，之后组合实现所调节的扩增效率的量比的上述(i)～(iii)的引物和探针，所述探针包含与靶多核苷酸互补的序列，末端用荧光色素标记，且杂交时荧光增加或减少。
利用上述制造方法，可以简便地制造实现靶多核苷酸的任意的检测效率的检测试剂盒。
本发明还提供引物组合，该引物组合包含上述(i)～(iii)的引物，且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于1倍。
本发明还提供引物组合，该引物组合包含上述(i)～(iii)的引物，且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于1倍。
发明效果
本发明可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。本发明还可以简便地调节靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。通过适当设定靶多核苷酸的检测灵敏度，期待着可以使靶多核苷酸所关联的疾病的可能性的测定、疾病的诊断更准确。
附图说明
图1显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响。
图2是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。
图3是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。
图4是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。
图5A是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为1倍。
图5B是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为2倍。
图5C是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为4倍。
图5D是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为8倍。
图5E是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为16倍。
图6A是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为1倍。
图6B是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为2倍。
图6C是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为4倍。
图6D是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为8倍。
图6E是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为16倍。
图7A是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1/3倍。
图7B是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1/2倍。
图7C是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1倍。
图7D是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为2倍。
图7E是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Frnt)以摩尔比计为3倍。
图8A是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1/4倍。
图8B是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1/2倍。
图8C是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为1倍。
图8D是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为2倍。
图8E是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(Fwt/Fmt)以摩尔比计为3倍。
具体实施方式
边例示优选的方案边对本发明进行说明。
第一本发明涉及：使用下述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率的方法。
本发明的特征在于：通过调节下述(i)～(iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率。
各引物如下。
(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；
(iii)第3引物，其与第1引物形成对，被设计成可以扩增靶多核苷酸。
“靶多核苷酸”例如是包含突变的多核苷酸。此时的突变包括取代、缺失、插入中的任一种。作为突变，可以列举：例如一碱基取代。本发明适合调节包含SNP位点的多核苷酸中的、包含突变等位基因的靶多核苷酸的扩增效率。
关于第1引物，“与靶多核苷酸结合”的用语是指，在PCR中，在PCR的退火条件下与靶多核苷酸杂交，使发生伸长反应。但是，如本领域技术人员所明了，不必与靶多核苷酸的部分区的序列完全互补。第1引物可以是与靶多核苷酸的正义链结合的引物，也可以是与靶多核苷酸的反义链结合的引物。第1引物的设计根据靶多核苷酸的序列来设计。
关于第1引物，可以列举：通常在引物的3’末端侧、例如从3’末端数起第1～5位左右的区(以下，有时称作“3’末端区”。)配置与靶多核苷酸结合的核苷酸。需要说明的是，在本说明书中，所说的“从3’末端数起第1～5位”的情形是指将3’末端作为第1位来计数。这样的引物设计可以由本领域技术人员适当地进行。
例如，当靶多核苷酸为具有核苷酸的取代的突变型多核苷酸时，第1引物可以将已取代的核苷酸配置在上述3’末端的区。
当靶多核苷酸包含SNP位点时，第1引物在从3’末端数起第1～5位的任一位、优选第1～3位的任一位、进一步优选第1或2位的任一位、最优选在3’末端具有与上述SNP位点的第1等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸，与上述包含SNP位点的区杂交。这里，“与第1等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸”的用语，当第1引物为与正义链杂交的引物时，是指与第1等位基因特异性核苷酸互补的核苷酸；当第1引物为与反义链杂交的引物时，是指与第1等位基因特异性核苷酸同源的核苷酸。需要说明的是，“第1等位基因特异性核苷酸”是由其与后述的“第2等位基因特异性核苷酸”的组合规定的，例如有：第1等位基因特异性核苷酸为突变核苷酸、第2等位基因特异性核苷酸为野生核苷酸的组合或其相反的组合；以及第1等位基因特异性核苷酸为第1突变核苷酸、第2等位基因特异性核苷酸为第2突变核苷酸的组合。
此外，在靶多核苷酸为具有核苷酸的插入的突变型多核苷酸的情况下，也可以与上述取代的情形同样地进行设计，可以将与所插入的核苷酸结合的核苷酸配置在上述3’末端区。
当靶多核苷酸为具有核苷酸的缺失的突变型多核苷酸时，可以将与包含缺失位点的前后的区结合的核苷酸配置在上述3’末端区。
关于第2引物，“与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合”是指，在PCR的退火条件下，边与第1引物竞争边与第1引物所结合的靶多核苷酸的区结合。因此，第2引物与第1引物通常具有60～95％左右的同源性。这里，与第1引物相比，第2引物不易发生PCR的伸长反应。这样的第2引物的设计可以考虑靶多核苷酸的序列、以及第1引物的序列来进行。通常可以列举：将未与靶多核苷酸结合的核苷酸配置在PCR的伸长方向(3’末端侧)上。此外，以第2引物的Tm值小于第1引物的Tm值的方式设计序列。这样的引物设计本领域技术人员可以适当地进行。通常，在引物的3’末端侧、例如从3’末端数起第1～5位左右的区(以下有时称作“3’末端区”。)配置未与靶多核苷酸结合的核苷酸。例如，当靶多核苷酸为包含突变的多核苷酸时，第2引物将与野生型序列结合的核苷酸、而不是与突变部分的序列结合的核苷酸配置在上述3’末端区。
当靶多核苷酸包含SNP位点时，第2引物在从3’末端数起第1～5位的任一位、优选第1～3位的任一位、进一步优选第1或2位的任一位、最优选在3’末端具有与上述SNP位点的第2等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸，与上述包含SNP位点的区杂交。
第3引物是与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸的引物。即，第3引物被设计成与第1引物的伸长方向的下游区的、第1引物所结合的多核苷酸链的互补链结合。
各引物的长度和Tm值可以根据靶多核苷酸的序列适当设计。通常长度为10～40mer、Tm值为40～70℃，优选长度为15～30mer、Tm值为50～60℃。需要说明的是，Tm值是利用最邻近碱基对(NearestNeighbor)法算出的值。
在本发明的一个方案中，第1引物的Tm值高于第2引物的Tm值。需要说明的是，Tm值是利用最邻近碱基对(Nearest Neighbor)法算出的值。此时，第1引物的Tm值与第2引物的Tm值之差优选0.1～10℃，进一步优选为0.5～5℃。第1引物的Tm值高于第2引物的Tm值时，利用本发明的方法提高靶多核苷酸的扩增效率变得容易。
Tm值可以由CG含量和核苷酸的数量求得。将第1引物的Tm值设计成高于第2引物的Tm值的最简便的方法是：使第1引物的长度长于第2引物的长度。例如，使第1引物的长度较第2引物的长度长1～10碱基左右、优选长2～5碱基左右的方法。
此外，优选在第1引物的5’末端和第2引物的5’末端分别添加包含多个碱基的不同序列的寡核苷酸。该添加序列通常具有1～20个碱基左右、优选3～10个碱基左右的长度。这是为了降低第1引物与不同于靶多核苷酸的多核苷酸杂交、并以靶多核苷酸以外的核苷酸为模板进行扩增的可能性，更确实地进行靶多核苷酸的扩增效率的调节。
在第一本发明的一个方案中，当第1引物的Tm值高于第2引物的Tm值时，通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量增加，可以提高靶多核苷酸的扩增效率。
反之，通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量减少，可以降低靶多核苷酸的扩增效率。
即，通过利用上述方法改变引物量比，可以提高或降低靶多核苷酸的扩增效率。
在该方案中，具体而言，通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于1倍，可以提高靶多核苷酸的扩增效率。在以往的、与本发明持有同样系统的PCR法(例如日本特开2010-35532号公报)中，由于正向引物与反向引物的量比以摩尔比计为约1∶1，所以通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于1倍，与以往的PCR法中的靶多核苷酸的扩增效率相比，可以提高该靶多核苷酸的扩增效率。
此外，通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于2倍，可以进一步提高靶多核苷酸的扩增效率。另外，由实施例还可知：通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于4倍、进一步以摩尔比计大于8倍，可以进一步提高靶多核苷酸的扩增效率。
具体而言，通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于1倍，可以降低靶多核苷酸的扩增效率。在以往的、与本发明持有同样系统的PCR法(例如日本特开2010-35532号公报)中，由于正向引物与反向引物的量比以摩尔比计为约1∶1，所以通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于1倍，与以往的PCR法中的靶多核苷酸的扩增效率相比，可以降低该靶多核苷酸的扩增效率。
通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于0.5倍，可以进一步降低靶多核苷酸的扩增效率。通过使第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于0.25倍、进一步以摩尔比计小于0.125倍，可以进一步降低靶多核苷酸的扩增效率。
在第一本发明的其他方案中，通过使第1引物的量相对第2引物的量增加，可以提高上述靶多核苷酸的扩增效率。
反之，通过使第1引物的量相对第2引物的量减少，可以降低上述靶多核苷酸的扩增效率。
即，通过利用上述方法改变引物的量比，可以提高或降低上述靶多核苷酸的扩增效率。
在该方案中，具体而言，通过使第1引物的量相对第2引物的量以摩尔比计大于1倍，可以提高上述靶多核苷酸的扩增效率。
需要说明的是，在以往的、与本发明持有同样系统的PCR法(例如日本特开2010-35532号公报)中，由于第1引物与第2引物的量比以摩尔比计为约1∶1，所以通过使第1引物的量相对第2引物的量以摩尔比计大于1倍，与以往的PCR法中的靶多核苷酸的扩增效率相比，可以提高该靶多核苷酸的扩增效率。
通过使第1引物的量相对第2引物的量以摩尔比计大于2倍，可以进一步提高上述靶多核苷酸的扩增效率。
第1引物的量相对第2引物的量的上限优选以摩尔比计为4倍。
此外，还优选将上述的调节上述第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量的方案与调节第1引物的量相对第2引物的量的方案组合起来的方案。
通过利用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，可以确定实现与该靶多核苷酸的扩增的目的相应的扩增效率的引物量比。即，本发明还提供：使用上述(i)～(iii)的引物通过PCR扩增靶多核苷酸时，确定引物量比的方法。
通过使用如此操作确定的量比的引物进行PCR，可以实现与靶多核苷酸的目的相应的扩增效率。
即，本发明提供靶多核苷酸的扩增方法，该方法包括：利用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，使用实现所调节的扩增效率的量比的上述(i)～(iii)的引物进行PCR。
利用上述的第一本发明，可以调节PCR中的靶多核苷酸的扩增效率。而且，使用第一本发明，通过调节靶多核苷酸的扩增效率，可以调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。
即，第二本发明涉及：使用上述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸，使用所得的扩增产物检测该靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)的方法，该方法通过使用本发明的扩增效率的调节方法，来调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。
关于引物量比的调节方法的方案，如关于第一本发明的说明。即，存在下述关系：通过上述的引物的量比的调节，靶多核苷酸的扩增效率越提高，则该靶多核苷酸的检测灵敏度越高。
通过利用上述方法调节靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)，可以确定实现与该靶多核苷酸的检测的目的相应的检测效率的引物量比。即，本发明还提供：使用上述(i)～(iii)的引物，通过PCR检测靶多核苷酸时，确定引物量比的方法。
使用如此操作而确定的量比的引物进行PCR，通过检测所得的PCR扩增产物中的靶多核苷酸，可以实现与目的相应的检测效率。
即，本发明提供靶多核苷酸的检测方法，该方法包括：利用上述方法调节靶多核苷酸的检测效率，使用实现所调节的检测效率的量比的上述(i)～(iii)的引物进行PCR，检测所得的PCR扩增产物中的靶多核苷酸。
作为检测靶多核苷酸的方法，可以采用公知的方法，例如可以采用融解曲线分析(Tm分析)、测序、电泳等。其中，优选利用融解曲线分析(Tm分析)进行的检测。这是由于：在进行Tm分析时，不必特别对靶多核苷酸的扩增产物实施处理，可将包含扩增产物的反应液直接用于分析。此外，连续进行扩增和Tm分析的仪器(参照实施例)也已实用化，因此简便。
在Tm分析中，可以使用：探针(Probe)，该探针包含与靶多核苷酸互补的序列，末端用荧光色素标记，并与靶多核苷酸杂交，形成双链时荧光增加或减少；或插入双链DNA中的SYBR-Green(SYBR：注册商标)；或HybProbe，其利用两种接近的探针引发荧光共振能量转移(FRET)。可以列举下述方法，该方法使用若DNA的鸟嘌呤碱基接近则荧光消失的荧光色素的荧光DNA探针、所谓的QProbe(注册商标)作为末端用荧光色素标记、与靶多核苷酸杂交、形成双链时荧光减少的探针(http://unit.aist.go.jp/brf/ci/research_result/aist_today/vol08_02_p18_p19.pdf、http://www.wipo.int/pctdb/ja/wo.jsp？WO＝2008117782&IA＝JP2008055469&DISPLAY＝FT)。这样的探针中使用的荧光色素是公知的，制作这样的探针的方法也是公知的。这里，“与靶多核苷酸互补的序列”是指，在上述检测方法中的通常条件下，只要以可以与靶多核苷酸杂交的程度进行互补即可，不必完全互补。
作为形成双链时荧光减少的探针中使用的荧光色素，例如有Invitrogen公司制的Pacific Blue、TAMRA、BODIPY FL等。探针的长度可以根据作为检测的靶的多核苷酸适当设计，通常为10～40mer左右。
Tm分析可以通过测定将反应液阶段性地升温时所检测的荧光强度来进行。荧光强度的测定通过使用与所用荧光色素对应的波长的激发光，测定发光波长的光来进行。Tm分析中的升温速度通常为0.1～1℃/5秒。进行Tm分析时的反应液的组成，只要能够进行探针与具有与其核苷酸序列互补的序列的多核苷酸的杂交即可，没有特别限定，但通常一价阳离子浓度为1.5～50mM、pH为7～9。PCR等使用DNA聚合酶的扩增方法的反应液通常满足该条件，所以扩增中使用的反应液可以直接用于Tm分析。
接着，根据Tm分析的结果，检测靶多核苷酸。基于Tm分析的结果的靶多核苷酸的检测，可以利用常规方法进行。本发明中，“检测”是指除了检测是否存在靶多核苷酸以外，还包含样品中的靶多核苷酸的定量、样品中的靶多核苷酸与其他多核苷酸的比率的测定的概念。
通过使用上述检测方法，可以检测在来自受检者的基因中存在或不存在突变。即，第三本发明涉及试验方法，该方法包括：将利用上述检测方法得到的检测结果与检测该突变时上述受检者有可能具有由于存在上述突变而引起的疾病的基准进行比较，试验由于存在上述突变而引起的疾病的可能性。本发明还提供：根据上述试验结果诊断疾病的方法。
第四本发明涉及药效的预测方法，该方法包括：通过比较利用上述检测方法得到的检测结果和是否存在该突变以及特定的药物的效果的关系，预测上述特定的药物对上述受检者的效果。即，在已知特定的突变与特定药物的效果的关系的情况下，通过检测是否存在特定的突变，可以通过参照上述关系预测特定的药物的效果。
例如，已知分子靶向药物吉非替尼若在EGFR基因中具有特定的突变(外显子21的L858R的突变等)，则奏效率变高。另外，已知分子靶向药物西妥昔单抗若具有kras基因的密码子12或13的突变或braf基因的V600E突变，则失去了药效。即，利用本发明的检测方法，通过检测EGFR基因的上述突变，可以预测吉非替尼对受检者的药效。另外，利用本发明的检测方法，通过检测kras基因或braf基因的上述突变，可以预测西妥昔单抗对受检者的药效。
本发明还提供引物组合的制造方法，所述引物组合用于使用上述(i)～(iii)的引物来扩增靶多核苷酸的方法。
即，第五本发明涉及引物组合的制造方法，该方法包括：使用上述的第一本发明调节靶多核苷酸的扩增效率，组合实现所调节的扩增效率的量比的上述引物。
根据这样的制造方法，可以提供适于靶多核苷酸的扩增或检测的引物组合。
这里，“组合”中除了具有混合上述引物的方案以外，还具有另外包含使能够在使用时混合的方案等。
本发明还提供引物组合的设计方法，所述引物组合用于使用上述的(i)～(iii)的引物来扩增靶多核苷酸的方法。
即，本发明的其他方案涉及下述的设计引物组合的方法：使用上述的第一本发明调节靶多核苷酸的扩增效率，确定实现所调节的扩增效率的引物量比，来设计引物组合的方法。
根据这样的设计方法，可以简便地设计适于靶多核苷酸的扩增或检测的引物组合。
作为第六本发明的引物组合例如可以采取以下的构成。该引物组合被用于靶多核苷酸的扩增或检测。
引物组合，该组合包含下述(i)～(iii)的引物，其中，第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于1倍：
(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；
(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。
上述引物组合例如用于包含SNP位点的靶多核苷酸的扩增或检测。此时，第1引物在从3’末端数起第1～5位的任一位中具有与上述SNP位点的第1等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸；第2引物在从3’末端数起第1～5位的任一位中具有与上述SNP位点的第2等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸。
此外，关于各引物的优选方案，如关于第一本发明的说明。在一个方案中，第1引物的Tm值高于第2引物的Tm值。
第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计优选大于2倍，进一步优选大于4倍，更优选大于8倍。
本发明还提供：包含上述(i)～(iii)的引物、且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于1倍的引物组合、以摩尔比计小于0.5倍的引物组合、以摩尔比计小于0.25倍的引物组合、以摩尔比计小于0.125倍的引物组合等。
作为第六本发明的引物组合的其他方案例如有以下方案。
引物组合，包含下述(i)和(ii)的引物，且第1引物的量相对第2引物的量以摩尔比计大于1倍：
(i)第1引物，其与上述靶多核苷酸结合；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与上述靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应。
第1引物的量相对第2引物的量优选以摩尔比计大于2倍。第1引物的量相对第2引物的量的上限优选以摩尔比计为4倍。
本发明还提供检测试剂盒的制造方法，所述检测试剂盒在使用上述(i)～(iii)的引物扩增靶多核苷酸，之后检测扩增产物中的靶多核苷酸的方法中使用。
该检测试剂盒的制造方法包括：使用上述第一本发明调节靶多核苷酸的扩增效率，组合实现所调节的扩增效率的量比的上述引物和探针，所述探针包含与靶多核苷酸互补的序列、末端用荧光色素标记、且杂交时荧光增加或减少。关于这样的探针，如关于第一本发明的说明。
本发明还提供检测试剂盒，其中组合有第六发明的引物组合和上述探针。
实施例
<实施例1>
SEQ ID NO：1是JAK2基因序列的部分序列。SEQ ID NO：1相当于GenBank的检索号NG_009904的第88381～88680位的序列。在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，将包含第18位～第237位的DNA片段通过TA克隆插入pT7Blue T-载体的EcoR V位点，通过EcoRI进行线状化。将其作为野生型质粒(JAK2Wt质粒)。此外，对包含SEQID NO：1所示的核苷酸序列中的第147位的鸟嘌呤(G)取代成胸腺嘧啶(T)的序列的DNA片段进行同样的处理，作为突变型质粒(JAK2V617F质粒)。样品是上述JAK2Wt质粒和JAK2V617F质粒以99∶1混合的混合物。
混合包含104拷贝上述样品的、表1所示的PCR反应液的各成分使达到下述浓度，对于得到的50μL PCR反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。引物使用野生型JAK2引物Fwt(3’末端为野生型核苷酸、SEQIDNO：2)、突变型JAK2引物Fmt(3’末端为突变型核苷酸、SEQ ID NO：3)、以及与这些引物形成对的JAK2引物R(SEQ ID NO：4)。探针使用3’末端用荧光色素(TAMRA)标记的、形成双链时荧光减少的探针(SEQID NO：5)。引物和探针的序列及长度见表2。表中，JAK2引物Fwt和JAK2引物Fmt的5’末端侧的包含以大写字母表示的核苷酸的序列是用于抑制假阳性的添加序列。
通过如表3所示改变JAK2引物R的浓度，来改变JAK2引物Fwt和JAK2引物Fmt的总量与JAK2引物R的量比，试验该量比对突变型质粒的检测灵敏度的影响。
PCR和Tm分析的条件如表4所示。Tm分析中的激发波长和检测波长分别为520～555nm、585～700nm。
表1
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2引物Fwt(表2)
0.25μmol/L JAK2引物Fmt(表2)
0.2μmol/L JAK2mt探针(表2)
*JAK2引物R(表2)的浓度参照表3
表2
Tm是利用http://www.m-neko.net/tm_calc/的最邻近碱基对(NearestNeighbor)法，在引物浓度为250nM、Na+浓度为50mM下计算的值。
表3
表4
PCR条件/Tm分析条件
95℃，60秒
↓
(95℃，1秒→60℃，15秒)×50循环
↓
95℃，1秒
↓
40℃，60秒
↓
Tm分析40℃→75℃、1℃/3秒
PCR和Tm分析的结果见图1。图1的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值，横轴为温度(℃)。在51℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰，在59℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图1判定：随着JAK2引物R的量相对JAK2引物Fwt和JAK2引物Fmt的总量(R/(Fwt+Fmt))增加至2摩尔倍、4摩尔倍、8摩尔倍，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此可知下述规律性：R/(Fwt+Fmt)越大，则突变型质粒的扩增效率越高。
<实施例2>
SEQ ID NO：6是ab1基因序列的部分序列。SEQ ID NO：6相当于GenBank的检索号NG_012034的第158941～159060位的序列。在SEQID NO：6所示的核苷酸序列中，将至少包含第19位～第100位的序列的DNA片段通过TA克隆插入pT7Blue T-载体的EcoR V位点，通过KpnI进行线状化。将其作为野生型质粒(abl Wt质粒)。另外，对包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列中的第77位的胞嘧啶(C)取代成胸腺嘧啶(T)的序列的DNA片段进行同样的处理，作为突变型质粒(ablC944T质粒)。样品是上述abl Wt质粒与abl C944T质粒以99∶1混合的混合物。
混合包含104拷贝上述样品的、表5所示的PCR反应液的各成分使达到下述浓度，对于得到的50μL PCR反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。引物使用野生型abl引物Rwt(3’末端为野生型核苷酸、SEQIDNO：8)、突变型abl引物Rmt(3’末端为突变型核苷酸、SEQ ID NO：9)、以及与这些引物形成对的abl引物F(SEQ ID NO：7)。探针使用5’末端用荧光色素(BODIPY FL)标记、3’末端被磷酸化(表6中用“P”表示。)、形成双链时荧光减少的探针(SEQ ID NO：10)。引物和探针的序列及长度见表6。
通过如表7所示改变abl引物F的浓度，来改变abl引物Rwt和abl引物Rmt的总量与abl引物F的量比，试验该量比对突变型质粒的检测灵敏度的影响。
PCR和Tm分析的条件如表8所示。Tm分析中的激发波长和检测波长分别为420～485nm、520～555nm。
表5
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L abl引物Rwt(表6)
O.25μmol/L abl引物Rmt(表6)
0.2μmol/L abl mt探针(表6)
*abl引物F(表6)的浓度参照表7
表6
Tm是指利用http://www.m-neko.net/tm_calc/的最邻近碱基对(NearestNeighbor)法，在引物浓度为250nM、Na+浓度为50mM下计算的值。
表7
引物量比：F/(Rwt+Rmt) 4摩尔倍 8摩尔倍
PCR反应液中abl引物F的浓度(μmol/L) 2 4
表8
PCR条件/Tm分析条件
95℃，60秒
↓
(95℃，1秒→65℃，15秒)×50循环
↓
95℃，1秒
↓
40℃，60秒
↓
Tm分析40℃→75℃、1℃/3秒
PCR和Tm分析的结果见图2。图2的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在47℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰，在54℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图2判定：随着abl引物F的量相对abl引物Rwt和abl引物Rmt的总量(F/(Rwt+Rmt))增加至4摩尔倍、8摩尔倍，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此可知下述规律性：F/(Rwt+Rmt)越大，则突变型质粒的扩增效率越高。
由实施例1和实施例2得到的结果可知：通过调节具有等位基因特异性碱基的引物与等位基因非特异性引物的量比，可以提高具有特定的等位基因特异性碱基的DNA的扩增效率。
<实施例3>
SEQ ID NO：11是试剂盒基因序列的部分序列。SEQ ID NO：11相当于GenBank的检索号NG_007456的第75001～第75360位的序列。在SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列中，将包含第59位～第358位的DNA片段通过TA克隆插入pT7Blue T-载体的EcoR V位点，通过EcoRI进行线状化。将其作为野生型质粒(试剂盒Wt质粒)。另外，对包含SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列中的第228位的腺嘌呤(A)取代成胸腺嘧啶(T)的序列的DNA片段进行同样的处理，作为突变型质粒(试剂盒D617V质粒)。样品是上述试剂盒Wt质粒与试剂盒D617V质粒以99∶1混合的混合物。
混合包含104拷贝上述样品的、表9所示的PCR反应液的各成分使达到下述浓度，对于得到的50μL PCR反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。引物使用野生型试剂盒引物Fwt(3’末端为野生型核苷酸、SEQIDNO：12)、突变型试剂盒引物Fmt(3’末端为突变型核苷酸、SEQ IDNO：13)、以及与这些引物形成对的试剂盒引物R(SEQ ID NO：14)。探针使用5’末端用荧光色素(TAMRA)标记、3’末端被磷酸化、且形成双链时荧光减少的探针(SEQ ID NO：15)。引物和探针的序列及长度见表10。
通过如表11所示改变试剂盒引物Fwt的浓度，来改变试剂盒引物Fwt与试剂盒引物Fmt的量比，试验该量比对突变型质粒的检测灵敏度的影响。
PCR和Tm分析的条件如表12所示。Tm分析中的激发波长和检测波长分别为520～555nm、585～700nm。
表9
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L试剂盒引物Fmt(表10)
1μmol/L试剂盒引物R(表10)
0.2μmol/L试剂盒mt探针(表10)
*试剂盒引物Fwt(表10)的浓度参照表11
表10
试剂盒引物Fwt 5’-attttggtctagccagagA-3’ 19mer
试剂盒引物Fmt 5’-tgattttggtctagccagagT-3’ 21mer
试剂盒引物R 5’-aaatccrttgcaggactgtc-3’ 20mer
试剂盒mt探针 5’-(TAMRA)-ccagagTcatcaagaatg-P-3’ 18mer
表11
引物量比：Fwt/Fmt 1摩尔倍 2摩尔倍
PCR反应液中试剂盒引物Fwt的浓度(μmol/L) 0.25 0.5
表12
PCR条件/Tm分析条件
95℃，60秒
↓
(95℃，1秒→61℃，15秒)×50循环
↓
95℃，1秒
↓
40℃，60秒
↓
Tm分析40℃→75℃、1℃/3秒
PCR和Tm分析的结果见图3。图3的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在48℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰，而在56℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图3判定：随着试剂盒引物Fwt的量相对试剂盒引物Fmt的量(Fwt/Fmt)由2摩尔倍减小至1摩尔倍，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此可知下述规律性：Fwt/Fmt越小，突变型质粒的扩增效率越高。
<实施例4>
以实施例1中制作的JAK2Wt质粒与JAK2V617F质粒以99∶1混合的混合物作为样品，使用表2所示的各种引物和探针进行以下试验。
混合包含104拷贝上述样品的、表13所示的PCR反应液的各成分使达到下述浓度，对于得到的50μL PCR反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。
通过如表14所示改变JAK2引物Fmt的浓度，来改变JAK2引物Fwt与JAK2引物Fmt的量比，试验该量比对突变型质粒的检测灵敏度的影响。
PCR和Tm分析的条件如表15所示。Tm分析中的激发波长和检测波长分别为520～555nm、585～700nm。
表13
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2引物Fwt(表2)
2μmol/L JAK2引物R(表2)
0.2μmol/L JAK2mt探针(表2)
*JAK2引物Fmt(表2)的浓度参照表14
表14
表15
PCR条件/Tm分析条件
95℃，60秒
↓
(95℃，1秒→60℃，15秒)×50循环
↓
95℃，1秒
↓
40℃，60秒
↓
Tm分析40℃→75℃、1℃/3秒
PCR和Tm分析的结果见图4。图4的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值，横轴为温度(℃)。在51℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰，在59℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图4判定：随着JAK2引物Fwt的量相对JAK2引物Fmt的量(Fwt/Fmt)由2摩尔倍减小至0.5摩尔倍，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此明确了下述规律性：Fwt/Fmt越小，则突变型质粒的扩增效率越高。
由实施例3和实施例4得到的结果可知：通过调节具有等位基因特异性碱基的多个引物(第1引物和第2引物)的量比，可以提高具有特定的等位基因特异性碱基的DNA的扩增效率。
<实施例5>
以实施例3中制备的试剂盒Wt质粒与试剂盒D617V质粒以1∶0、99∶1、97∶3、9∶1混合的样品分别作为Wt、Mt1％、Mt3％、Mt10％的样品。混合包含104拷贝本样品的、下表所示的PCR反应液的各成分使达到下表的浓度，对于得到的50μL反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L试剂盒引物Fwt(表10)
0.25μmol/L试剂盒引物Fmt(表10)
0.2μmol/L试剂盒mt探针(表10)
*试剂盒引物R(表10)的浓度参照下表
表16
其他反应条件与实施例3相同。
PCR和Tm分析的结果见图5。图5的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在48℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰、在56℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图5A～E可知：随着试剂盒引物R的量相对试剂盒引物Fwt和试剂盒引物Fmt的总量(R/(Fwt+Fmt))增加至1摩尔倍(图5A)、2摩尔倍(图5B)、4摩尔倍(图5C)、8摩尔倍(图5D)、16摩尔倍(图5E)，来自突变型质粒的存在的峰变大。但是，当为16摩尔倍时，几乎看不到来自野生型的峰。
由此可知下述规律性：R/(Fwt+Fmt)越大，则突变型质粒的扩增效率越高，但达到16摩尔倍时，几乎看不到来自野生型的峰，所以判断：难以与反应不良区别开来。
<实施例6>
以实施例1中制作的JAK2Wt质粒与JAK2V617F质粒以1∶0、99∶1、97∶3、9∶1混合的样品分别作为Wt、Mt1％、Mt3％、Mt10％的样品。混合包含104拷贝本样品的、下表所示的PCR反应液的各成分使达到下表的浓度，对于得到的50μL反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2引物Fwt(表2)
0.25μmol/L JAK2引物Fmt(表2)
0.2μmol/L JAK2mt探针(表2)
*JAK2引物R(表2)的浓度参照下表
表17
其他反应条件与实施例1相同。
PCR和Tm分析的结果见图6。图6的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在51℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰、在59℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图6A～E判定：随着JAK2引物R的量相对JAK2引物Fwt和JAK2引物Fmt的总量(R/(Fwt+Fmt))增加至1摩尔倍(图6A)、2摩尔倍(图6B)、4摩尔倍(图6C)、8摩尔倍(图6D)、16摩尔倍(图6E)，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此判明下述规律性：R/(Fwt+Fmt)越大，则突变型质粒的扩增效率越高。
<实施例7>
混合包含104拷贝实施例5中制作的Wt、Mt1％、Mt3％、Mt10％的样品的、下表所示的PCR反应液的各成分，使达到下表的浓度，对于得到的50μL反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
1μmol/L试剂盒引物R(表10)
0.2μmol/L试剂盒mt探针(表10)
*试剂盒引物Fwt(表10)和试剂盒引物Fmt(表10)的浓度参照下表
表18
其他反应条件与实施例3相同。
PCR和Tm分析的结果见图7。图7的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在48℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰、在56℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图7A～E判定：随着试剂盒引物Fwt的量相对试剂盒引物Fmt的量(Fwt/Fmt)减小至3摩尔倍(图7E)、2摩尔倍(图7D)、1摩尔倍(图7C)、1/2摩尔倍(图7B)、1/3摩尔倍(图7A)，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此明确了下述规律性：Fwt/Fmt越小，则突变型质粒的扩增效率越高。还明确了：当为3摩尔倍时，在所有样品中几乎都看不到野生型的峰。
<实施例8>
混合包含104拷贝实施例6中制作的Wt、Mtl％、Mt3％、Mt10％的样品的、下表所示的PCR反应液的各成分，使达到下表的浓度，对于得到的50μL反应液，使用全自动SNPs检查装置(商品名：i-densy(商标)、ア一クレイ公司制)进行PCR和Tm分析。
在50μL的PCR反应液中：
1×反应缓冲液
1.25U Taq聚合酶
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
1μmol/L JAK2引物R(表2)
0.2μmol/L JAk2mt探针(表2)
*JAK2引物Fwt(表2)和JAK2引物Fmt(表2)的浓度参照下表
表19
其他反应条件与实施例1相同。
PCR和Tm分析的结果见图8。图8的纵轴为荧光强度(相对荧光单位(RFU))的微分值、横轴为温度(℃)。在51℃附近看到的峰是来自野生型质粒的存在的峰、在59℃附近看到的峰是来自突变型质粒的存在的峰。
由图8A～E判定：随着JAK2引物Fwt的量相对JAK2引物Fmt的量(Fwt/Fmt)减小至3摩尔倍(图8E)、2摩尔倍(图8D)、1摩尔倍(图8C)、1/2摩尔倍(图8B)、1/4摩尔倍(图8A)，来自突变型质粒的存在的峰变大。
由此明确了下述规律性：Fwt/Fmt越小，则突变型质粒的扩增效率越高。还明确了：当为3摩尔倍时，在所有样品中几乎都看不到野生型的峰。
产业实用性
本发明提供对于各种基因的突变探索具有临床利用价值的检测灵敏度的工具。

Claims (8)

1.调节靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法是在使用下述(i)～(iii)的引物通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率，
该方法包括：通过调节下述(i)～(iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率，
(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；
(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸，
其中通过增加第3引物的量，使其相对于第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于2倍但不超过8倍，来提高靶多核苷酸的扩增效率。
2.权利要求1所述的方法，其中，
靶多核苷酸包含SNP位点；
第1引物和第2引物与上述包含SNP位点的区杂交；
第1引物在从3’末端数起第1～5位的任一位中具有与上述SNP位点的第1等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸；
第2引物在从3’末端数起第1～5位的任一位中具有与上述SNP位点的第2等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸。
3.权利要求1所述的方法，其中，第1引物的Tm值高于第2引物的Tm值。
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，该方法包括：通过使第1引物的量相对第2引物的量增加，来提高上述靶多核苷酸的扩增效率。
5.调节靶多核苷酸的检测效率的方法，该方法是使用上述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸，使用所得的扩增产物检测该靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的检测效率，
该方法包括：通过使用权利要求1～4中任一项所述的方法调节靶多核苷酸的扩增效率，来调节该靶多核苷酸的检测效率。
6.靶多核苷酸的非诊断性检测方法，该方法包括：
利用权利要求5所述的方法调节靶多核苷酸的检测效率；
使用实现所调节的检测效率的量比的上述(i)～(iii)的引物进行PCR；以及
检测所得的PCR扩增产物中的上述靶多核苷酸。
7.引物组合的制造方法，该方法包括：
使用权利要求1～4中任一项所述的方法调节靶多核苷酸的扩增效率；
组合实现所调节的扩增效率的量比的上述(i)～(iii)的引物。
8.引物组合，该组合包含下述(i)～(iii)的引物，且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于2倍但不超过8倍，
(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；
(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；
(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。
CN201110119525.3A 2010-04-30 2011-04-29 靶多核苷酸的扩增效率的调节方法 Active CN102234691B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010105188 2010-04-30
JP2010-105188 2010-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102234691A CN102234691A (zh) 2011-11-09
CN102234691B true CN102234691B (zh) 2016-08-31

Family

ID=44305082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110119525.3A Active CN102234691B (zh) 2010-04-30 2011-04-29 靶多核苷酸的扩增效率的调节方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP2383348B1 (zh)
JP (1) JP5830268B2 (zh)
KR (1) KR101747090B1 (zh)
CN (1) CN102234691B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120252024A1 (en) * 2009-12-24 2012-10-04 Arkray, Inc. Probe for Detection of Polymorphism in C-Kit Gene and Use Thereof
JP5836763B2 (ja) 2011-11-08 2015-12-24 矢崎総業株式会社 車両用計器における液晶パネルの照明構造
US9428802B2 (en) * 2012-07-03 2016-08-30 Mackay Memorial Hospital Selective-competitive primer and method of use
CN103571959B (zh) * 2013-11-04 2015-07-15 北京海思特临床检验所有限公司 用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒
JP7245164B2 (ja) * 2017-08-31 2023-03-23 公益財団法人がん研究会 高感度かつ定量的な遺伝子検査方法、プライマーセット、及び検査キット

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1597976A (zh) * 2004-07-20 2005-03-23 四川大学 复合扩增引物设计方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US6015664A (en) * 1995-11-03 2000-01-18 Mcw Research Foundation Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B
DE19808534A1 (de) * 1998-02-28 1999-09-02 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Nukleinsäuren
CN101501251A (zh) * 2006-06-16 2009-08-05 塞昆纳姆股份有限公司 扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物
US20080153097A1 (en) * 2006-11-15 2008-06-26 Eragen Biosciences, Inc. Methods and kits for detecting jak2 nucleic acid
WO2010001969A1 (ja) 2008-07-02 2010-01-07 アークレイ株式会社 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬
JP2010035532A (ja) * 2008-08-08 2010-02-18 Canon Inc アレル特異的ｐｃｒ法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1597976A (zh) * 2004-07-20 2005-03-23 四川大学 复合扩增引物设计方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110121574A (ko) 2011-11-07
JP5830268B2 (ja) 2015-12-09
KR101747090B1 (ko) 2017-06-14
EP2383348B1 (en) 2015-03-04
EP2383348A1 (en) 2011-11-02
CN102234691A (zh) 2011-11-09
JP2011244816A (ja) 2011-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103459612A (zh) 用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒
CN102234691B (zh) 靶多核苷酸的扩增效率的调节方法
KR20140006844A (ko) 돌연변이 분석
CN102796817B (zh) 一种快速检测kras基因突变的方法
JP2013090622A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
US9012619B2 (en) Probe for detecting ABL gene mutation and uses thereof
US20220298557A1 (en) Method for designing a probe combination
CN102766682B (zh) 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒
CN102776276B (zh) Egfr外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途
JP2012105644A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、および多型検出用キット
US9340833B2 (en) Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide
US9085803B2 (en) Probe for detection of polymorphism in ABL gene, and use thereof
JP5570657B2 (ja) 遺伝子存在量の測定方法
KR20110121587A (ko) ＪＡＫ2 유전자의 ｅｘｏｎ 12에 있어서의 변이의 검출법, 및 그를 위한 핵산 프로브 및 키트
JP5860667B2 (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途
KR20120124033A (ko) 유전자 변이 검출용 프로브, 유전자 변이 검출 방법 및 유전자 변이 검출용 시약 키트

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant