KR101747090B1 - 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율의 조절 방법 - Google Patents

표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율의 조절 방법 Download PDF

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Abstract

하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 방법으로서,
하기 (i)∼(iii)의 프라이머의 양비(量比)를 조절함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것을 포함하는, 방법,
(i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합(對合)하는 제1 프라이머,
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머,
(iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머.

Description

표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율의 조절 방법{METHOD FOR ADJUSTING AMPLIFICATION EFFICIENCY OF TARGET POLYNUCLEOTIDE}
본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 방법, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하는 방법, 이것을 사용한 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 질환의 시험 방법 및 진단 방법에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭에 사용하는 프라이머 세트의 제조 방법, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출에 사용하는 키트의 제조 방법에 관한 것이기도 하다.
알렐 특이적 PCR법(ASP-PCR법(Allele Specific Primer-PCR법))은, SNPs 등의 변이의 검출에 이용되는 방법이다. 전형적인 알렐 특이적 PCR법은, 변이 알렐에 특이적인 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단에 갖는 프라이머와, 이것과 쌍을 이루며 SNP 부위를 포함하는 영역을 증폭하는 프라이머를 세트로서 사용하여, 변이 알렐을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭함으로써, 변이 알렐을 검출하고자 하는 것이다(일본 특허 제2853864호 공보).
그러나, 상기와 같은 알렐 특이적 PCR법으로는, 변이 알렐을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하기 때문에 엄밀한 PCR 조건의 설정이 필요하며, 그 때문에 높은 검출 감도를 얻는 것이 곤란하다는 문제가 있었다(일본 특개2010-35532호 공보).
이와 같은 문제를 해결하는 기술로서, 전형적인 알렐 특이적 PCR법의 응용 기술인, (i) 3' 말단으로부터 세어 2염기째 및 3염기째의 한쪽만에 상기 SNP 부위로서 야생형 뉴클레오티드를 갖는 이외는, 상기 표적 핵산 내의 SNP 부위를 포함하는 부분 영역과 동일한 염기 서열을 갖는 제1 순방향 프라이머와, (ii) 3' 말단으로부터 세어 2염기째 및 3염기째의 한쪽만에 상기 SNP 부위로서 변이형 뉴클레오티드를 갖는 이외는, 상기 표적 핵산 내의 SNP 부위를 포함하는 부분 영역과 동일한 염기 서열을 갖는 제2 순방향 프라이머와, (iii) 상기 표적 핵산의 상보쇄의, 상기 SNP 부위보다도 5' 말단측에서, 상기 SNP 부위에 대응하는 부위를 포함하지 않는 부분 영역과 동일한 염기 서열을 갖는 역방향 프라이머를 사용하여 상기 표적 핵산의 PCR 반응을 행하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법이 알려져 있다(일본 특개2010-35532호 공보).
그런데, 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출함으로써, 당해 변이가 관련한 질환의 가능성을 측정하는 경우에는, 질환의 진단에 이용할 수 있는 의의있는 검출 결과를 얻는 목적에서, 각종 검출 감도에서의 상기 변이의 검출 결과와, 당해 변이가 관련한 질환에 관한 임상적 지견과의 관계를 분석하여, 진단에 이용할 수 있는 검출을 행하기 위한 검출 감도의 기준을 정하는 것이 필요하다.
검출 감도를 조절하기 위한 어프로치로서, 검출의 목적으로 하는 변이에 따라 프라이머의 설계를 고안함으로써, 변이 알렐을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것이, 통상 생각된다. 그러나, 이와 같은 어프로치에서는, 프라이머의 설계, 프라이머의 제작, 증폭 효율의 확인의 작업을 반복하는 것이 필요하며, 다대한 노력을 요하는 경우가 많다.
그래서, 본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 기술에 있어서, 간편하게 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하는 수단으로서, 하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 방법으로서, 하기 (i)∼(iii)의 프라이머의 양비(量比)를 조절함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
각 프라이머는 이하와 같다.
(i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합(對合)하는 제1 프라이머
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머
(iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머
상기 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 간편하게 조절할 수 있다.
상기 프라이머의 양비로서, 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을 들 수 있다. 이와 같이 프라이머의 양비를 조절함으로써, 간편하게 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 얻어진 증폭산물을 사용하여 당해 표적 폴리뉴클레오티드를 검출할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절하는 방법으로서, 본 발명의 증폭 효율의 조절 방법을 사용함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 간편하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 방법으로 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하고, 조절된 검출 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 증폭산물 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 방법을 제공한다.
상기 검출 방법에 의해, 적절한 검출 감도로 간편하게, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출을 행할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 검출 방법을 사용하여, 피험자에 유래하는 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출하고, 얻어진 검출 결과를, 당해 변이가 검출된 경우에는 상기 피험자가 당해 변이의 존재에 의해 일어나는 질환을 가질 가능성이 있다는 기준과 비교함으로써, 상기 변이의 존재에 의해 일어나는 질환의 가능성을 시험하는 것을 포함하는, 시험 방법을 제공한다.
상기 시험 방법에 의해, 임상상 의의가 작은 시험 결과가 얻어질 가능성을 저감시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 검출 방법을 사용하여, 피험자에 유래하는 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출하고, 얻어진 검출 결과와, 당해 변이의 유무 및 특정의 의약의 효과의 관계를 비교함으로써, 상기 피험자에 대한 상기 특정의 의약의 효과를 예측하는 것을 포함하는, 약효의 예측 방법을 제공한다.
상기 약효의 예측 방법에 의해, 투약시 약효를 예측할 수 있어, 효과적인 투약을 가능하게 하는 것이 기대된다.
또한, 본 발명은, 상기 시험 방법에 의해 얻어진 시험 결과에 의거하여, 질환을 진단하는 것을 포함하는, 질환의 진단 방법을 제공한다.
상기 진단 방법에 의해, 부적절한 진단 결과가 얻어질 가능성을 저감시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭 또는 검출하기 위한 프라이머 세트의 제조 방법을 제공한다. 당해 제조 방법은, 상기 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 조합하는 것을 포함한다.
상기 제조 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 임의의 증폭 효율, 검출 효율을 실현하는 프라이머 세트를 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드를, PCR을 사용하여 검출하기 위한 검출 키트의 제조 방법을 제공한다. 당해 제조 방법은, 상기 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머와, 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열로 이루어지고, 말단이 형광 색소로 표지되어 하이브리다이제이션(hybridization)했을 때에 형광이 증가 또는 감소하는 프로브를 조합하는 것을 포함한다.
상기 제조 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 임의의 검출 효율을 실현하는 검출 키트를 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 포함하고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양이, 몰비로 1배보다 큰, 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 포함하고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양이, 몰비로 1배보다 작은, 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은, 간편하게 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명은, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 간편하게 조절하는 것을 가능하게 한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도를 적절하게 설정함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드가 관련한 질환의 가능성의 측정, 질환의 진단을, 보다 적확한 것으로 할 수 있는 것이 기대된다.
[도 1] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 2] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 3] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 4] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 5a] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 1배.
[도 5b] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 2배.
[도 5c] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 4배.
[도 5d] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 8배.
[도 5e] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 16배.
[도 6a] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 1배.
[도 6b] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 2배.
[도 6c] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 4배.
[도 6d] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 8배.
[도 6e] 제1 프라이머와 제2 프라이머의 총량과, 제3 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(R/(Fwt+Fmt))는 몰비로 16배.
[도 7a] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1/3배.
[도 7b] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1/2배.
[도 7c] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1배.
[도 7d] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 2배.
[도 7e] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 3배.
[도 8a] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1/4배.
[도 8b] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1/2배.
[도 8c] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 1배.
[도 8d] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 2배.
[도 8e] 제1 프라이머와 제2 프라이머와의 양비가 변이형 플라스미드(표적 폴리뉴클레오티드)의 검출 감도에 주는 영향을 나타내는 도면이다. 양비(Fwt/Fmt)는 몰비로 3배.
본 발명에 대해, 바람직한 형태를 예시하면서 설명한다.
제1의 본 발명은, 하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특징은, 하기 (i)∼(iii)의 프라이머의 양비를 조절함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 점에 있다.
각 프라이머는 이하와 같다.
(i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하는 제1 프라이머
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머
(iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머
「표적 폴리뉴클레오티드」는, 예를 들면, 변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 이 경우의 변이는, 치환, 결실(缺失), 삽입 중 어느 하나도 포함한다. 변이로서는, 예를 들면 1염기 치환을 들 수 있다. 본 발명은, SNP 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서의, 변이 알렐을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절함에 호적(好適)하다.
제1 프라이머에 대해, 「표적 폴리뉴클레오티드에 대합하기」의 용어는, PCR에 있어서, 신장 반응이 일어나도록, PCR의 어닐링 조건에 있어서 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 단, 당업자에 명백한 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드의 부분 영역의 서열에 완전히 상보적일 필요는 없다. 제1 프라이머는, 표적 폴리뉴클레오티드의 센스쇄에 대합하는 것이어도, 표적 폴리뉴클레오티드의 안티센스쇄에 대합하는 것이어도 좋다. 제1 프라이머의 설계는, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 설계한다.
제1 프라이머는, 통상, 프라이머의 3' 말단측, 예를 들면, 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 정도의 영역(이하, 「3' 말단 영역」이라 하는 경우가 있다)에, 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하는 뉴클레오티드를 배치하는 것을 들 수 있다. 또, 본 명세서에서, 「3' 말단으로부터 세어 1∼5번째」의 경우는, 3' 말단을 1번째로 하여 센다. 이와 같은 프라이머의 설계는, 당업자이면 적절히 행할 수 있다.
예를 들면, 표적 폴리뉴클레오티드가, 뉴클레오티드의 치환을 갖는 변이형 폴리뉴클레오티드인 경우에는, 제1 프라이머는, 치환한 뉴클레오티드를 상기 3' 말단의 영역에 배치하면 된다.
표적 폴리뉴클레오티드가 SNP 부위를 포함하는 경우에는, 제1 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 것, 바람직하게는 1∼3번째 중 어느 것, 더욱 바람직하게는 1 또는 2번째 중 어느 것, 가장 바람직하게는, 3' 말단에 갖고, 상기 SNP 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈한다. 여기서, 「제1 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드」의 용어는, 제1 프라이머가 센스쇄에 하이브리다이즈하는 것인 경우에는, 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 의미하며, 제1 프라이머가 안티센스쇄에 하이브리다이즈하는 것인 경우에는, 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 의미한다. 또, 「제1 알렐 특이적 뉴클레오티드」는, 후술하는 「제2 알렐 특이적 뉴클레오티드」와의 조합에 의해 규정되는 것이며, 예를 들면, 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드가 변이 뉴클레오티드이며 제2 알렐 특이적 뉴클레오티드가 야생 뉴클레오티드인 조합, 또는 그 역의 조합 외에, 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드가 제1 변이 뉴클레오티드이며, 제2 알렐 특이적 뉴클레오티드가 제2 변이 뉴클레오티드인 조합을 들 수 있다.
또한, 표적 폴리뉴클레오티드가, 뉴클레오티드의 삽입을 갖는 변이형 폴리뉴클레오티드인 경우도, 상기 치환의 경우와 같이 설계할 수 있으며, 삽입된 뉴클레오티드에 대합하는 뉴클레오티드를 상기 3' 말단의 영역에 배치하면 된다.
또한, 표적 폴리뉴클레오티드가, 뉴클레오티드의 결실을 갖는 변이형 폴리뉴클레오티드인 경우는, 결실 부위의 전후를 포함하는 영역에 대합하는 뉴클레오티드를 상기 3' 말단의 영역에 배치하면 된다.
제2 프라이머에 대해, 「표적 폴리뉴클레오티드에 제1 프라이머와 경합적으로 대합한다」함은, PCR의 어닐링 조건에 있어서, 제1 프라이머가 대합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에, 제1 프라이머와 경합하면서 대합하는 것을 의미한다. 따라서, 제2 프라이머는, 제1 프라이머에 대해, 통상 60∼95% 정도의 상동성(相同性)을 갖는다. 여기서, 제2 프라이머는, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어렵다. 이와 같은 제2 프라이머의 설계는, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, 및 제1 프라이머의 서열을 고려하여 행할 수 있다. 일반적으로는, PCR의 신장 방향(3' 말단측)에, 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하지 않는 뉴클레오티드를 배치하는 것을 들 수 있다. 또한, 제2 프라이머의 Tm값이 제1 프라이머의 Tm값보다 작아지도록 서열을 설계하는 것을 들 수 있다. 이와 같은 프라이머의 설계는, 당업자이면 적절히 행할 수 있다. 통상, 프라이머의 3' 말단측, 예를 들면, 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 정도의 영역(이하 「3' 말단 영역」이라 하는 경우가 있다)에, 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하지 않는 뉴클레오티드를 배치한다. 예를 들면, 표적 폴리뉴클레오티드가, 변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드인 경우에는, 제2 프라이머는, 상기 3' 말단 영역에 변이 부분의 서열에 대합하는 뉴클레오티드가 아니고, 야생형의 서열에 대합하는 뉴클레오티드를 배치하는 것을 들 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드가 SNP 부위를 포함하는 경우에는, 제2 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제2 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 것, 바람직하게는 1∼3번째 중 어느 것, 더욱 바람직하게는 1 또는 2번째 중 어느 것, 가장 바람직하게는, 3' 말단에 갖고, 상기 SNP 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈한다.
제3 프라이머는, 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계되는 것이다. 즉, 제1 프라이머에 의한 신장 방향의 하류의 영역의, 제1 프라이머가 대합하는 폴리뉴클레오티드쇄의 상보쇄에 대합하도록 설계된 것이다.
각각의 프라이머의 길이 및 Tm값은, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 적절히 설계할 수 있다. 통상은 10∼40mer로 40∼70℃, 바람직하게는 15∼30mer로 50∼60℃이다. 또, Tm값은 최근접 염기쌍(Nearest Neighbor)법에 의해 산출한 값이다.
본 발명의 한 형태에서는, 제1 프라이머의 Tm값이, 제2 프라이머의 Tm값보다 높다. 또, Tm값은 최근접 염기쌍(Nearest Neighbor)법에 의해 산출한 값이다. 이 경우, 제1 프라이머의 Tm값과, 제2 프라이머의 Tm값의 차는, 바람직하게는 0.1∼10℃, 더욱 바람직하게는 0.5∼5℃이다. 제1 프라이머의 Tm값이, 제2 프라이머의 Tm값보다 높은 경우에는, 본 발명의 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올리는 것이 용이하게 된다.
Tm값은, CG 함유량 및 뉴클레오티드수로부터 구할 수 있다. 제1 프라이머의 Tm값을, 제2 프라이머의 Tm값보다 높게 설계하는 가장 간편한 방법으로서는, 제1 프라이머의 길이를 제2 프라이머의 길이보다 길게 한다. 예를 들면, 제1 프라이머의 길이를 제2 프라이머의 길이보다 1∼10염기 정도, 바람직하게는 2∼5염기 정도 길게 하는 방법을 들 수 있다.
또한, 제1 프라이머 5' 말단과 제2 프라이머의 5' 말단에, 각각, 수(數)염기로 이루어지는 다른 서열의 올리고뉴클레오티드를 부가하는 것이 바람직하다. 이 부가 서열은, 통상 1∼20염기 정도, 바람직하게는 3∼10염기 정도의 길이를 갖는다. 이것은, 제1 프라이머가 표적 폴리뉴클레오티드와는 다른 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하여, 표적 폴리뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드를 주형(鑄型)으로서 증폭할 가능성을 낮게 하여, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율의 조절을 보다 확실하게 행하기 위해서이다.
제1의 본 발명의 한 형태에서는, 제1 프라이머의 Tm값이, 제2 프라이머의 Tm값보다 높은 경우에, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 크게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다.
반대로, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 작게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 내릴 수 있다.
즉, 프라이머 양비를 상기 방법으로 바꿈으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올리거나 내리거나 할 수 있다.
당해 형태에 있어서, 구체적으로는, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 1배보다 크게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다. 종래의, 본 발명과 같은 계를 갖는 PCR법(예를 들면 일본 특개2010-35532호 공보)에서는, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 양비는, 몰비로 약 1:1이었으므로, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 1배보다 크게 함으로써, 종래의 PCR법에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율에 비해, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다.
또한, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 2배보다 크게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 더욱 올릴 수 있다. 또한, 실시예로부터도 명백한 바와 같이, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 4배보다 크게, 더욱 바람직하게는 몰비로 8배보다 크게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 더욱 올릴 수 있다.
또한, 구체적으로는, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 1배보다 작게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 내릴 수 있다. 종래의, 본 발명과 같은 계를 갖는 PCR법(예를 들면 일본 특개2010-35532호 공보)에서는, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 양비는, 몰비로 약 1:1이었으므로, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 1배보다 작게 함으로써, 종래의 PCR법에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율에 비해, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 내릴 수 있다.
또한, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 0.5배보다 작게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 더욱 내릴 수 있다. 또한, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 0.25배보다 작게, 더욱 바람직하게는 몰비로 0.125배보다 작게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 더욱 내릴 수 있다.
제1의 본 발명의 다른 형태에서는, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을 크게 함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다.
반대로, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을 작게 함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 내릴 수 있다.
즉, 프라이머의 양비를 상기 방법으로 바꿈으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올리거나 내리거나 할 수 있다.
당해 형태에 있어서, 구체적으로는, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을, 몰비로 1배보다 크게 함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다.
또, 종래의, 본 발명과 같은 계를 갖는 PCR법(예를 들면 일본 특개2010-35532호 공보)에서는, 제1 프라이머와 제2 프라이머의 양비는, 몰비로 약 1:1이므로, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을, 몰비로 1배보다 크게 함으로써, 종래의 PCR법에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율에 비해, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올릴 수 있다.
또한, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을, 몰비로 2배보다 크게 함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 더욱 올릴 수 있다.
제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양의 상한은, 바람직하게는 몰비로 4배이다.
또한, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을 조절하는 형태에, 상술한 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 상기 제3 프라이머의 양을 조절하는 형태를 조합하는 형태도 바람직하다.
상기 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭의 목적에 따른 증폭 효율을 실현하는 프라이머 양비를 결정할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭할 때의, 프라이머 양비를 결정하는 방법도 제공한다.
이와 같이 하여 결정한 양비의 프라이머를 사용하여 PCR을 행함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 목적에 따른 증폭 효율을 실현할 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 방법으로 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 방법을 제공한다.
상술한 제1의 본 발명에 의해, PCR에 있어서의 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절할 수 있다. 그리고, 제1의 본 발명을 사용하고, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절할 수 있다.
즉, 제2의 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 얻어진 증폭산물을 사용하여 당해 표적 폴리뉴클레오티드를 검출할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절하는 방법으로서, 본 발명의 증폭 효율의 조절 방법을 사용함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절하는 방법이다.
프라이머의 양비의 조절 방법의 형태에 대해서는, 제1의 본 발명에 대해 설명한 대로이다. 즉, 상술한 프라이머의 양비의 조절에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 높일수록, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도가 높아지는 관계에 있다.
상기 방법에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율(검출 감도)을 조절함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출의 목적에 따른 검출 효율을 실현하는 프라이머 양비를 결정할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 검출할 때의, 프라이머 양비를 결정하는 방법도 제공한다.
이와 같이 하여 결정한 양비의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 증폭산물 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출함으로써, 목적에 따른 검출 효율을 실현할 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 방법으로 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하고, 조절된 검출 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 증폭산물 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 방법을 제공한다.
표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법으로서는, 공지의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, 융해 곡선 분석(Tm 해석), 시퀀싱, 전기 영동 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 융해 곡선 분석(Tm 해석)에 의한 검출이 바람직하다. 이것은, Tm 해석을 행하는 경우에는, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭산물을 특히 처리를 실시하지 않고, 증폭산물을 함유하는 반응액을 그대로 해석에 부칠 수 있기 때문이다. 또한, 증폭과 Tm 해석을 연속적으로 행하는 기기(실시예를 참조)도 실용화되어 있으므로, 간편하다.
Tm 해석에는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열로 이루어지고, 말단이 형광 색소로 표지되어 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이제이션하여, 2본쇄가 되었을 때에 형광이 증가 또는 감소하는 프로브(Probe)나 2본쇄 DNA에 인터컬레이트(intercalate)하는 SYBR-Green(SYBR : 등록상표)이나 2종류의 근접하는 프로브로 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 일으키는 HybProbe를 사용할 수 있다. 말단이 형광 색소로 표지되어 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이제이션하여, 2본쇄가 되었을 때에 형광이 감소하는 프로브로서는, DNA의 구아닌 염기가 근접하면 형광이 소광하는 형광 색소를 사용한 형광 DNA 프로브, 이른바 QProbe(등록상표)를 사용하는 방법(http://unit.aist.go.jp/brf/ci/research_result/aist_today/vol08_02_p18 _p19.pdf, http://www.wipo.int/pctdb/ja/wo.jsp?WO=2008117782&IA=JP2008055469& DISPLAY=FT)을 들 수 있다. 이와 같은 프로브에 사용되는 형광 색소는 공지이며, 이와 같은 프로브를 제작하는 방법도 공지이다. 여기서, 「표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열」이란, 상기 검출 방법에 있어서의 통상의 조건에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈할 수 있을 정도로 상보적이면 충분하며, 완전히 상보적일 필요는 없다.
또한, 2본쇄가 되었을 때에 형광이 감소하는 프로브에 사용되는 형광 색소로서는, Invitrogen사제의 Pacific Blue, TAMRA, BODIPY FL 등을 들 수 있다. 프로브의 길이는, 검출의 표적이 되는 폴리뉴클레오티드에 따라 적절히 설계할 수 있지만, 통상은 10∼40mer 정도이다.
Tm 해석은, 반응액을 단계적으로 승온해갈 때에 검출되는 형광 강도를 측정함으로써 행할 수 있다. 형광 강도의 측정은, 사용하는 형광 색소에 따른 파장의 여기광을 사용하여 발광 파장의 광을 측정함으로써 행한다. Tm 해석에 있어서의 승온은, 통상 0.1∼1℃/5초의 스피드이다. Tm 해석을 행할 때의 반응액의 조성은, 프로브와 그 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리다이제이션이 가능하면 특히 제한되지 않지만, 통상은, 1가의 양이온 농도가 1.5∼50mM, pH가 7∼9이다. PCR 등의 DNA 폴리머라제를 사용한 증폭 방법의 반응액은, 통상, 이 조건을 만족하므로, 증폭에 사용한 반응액을 그대로 Tm 해석에 사용할 수 있다.
계속해서, Tm 해석의 결과에 의거하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 검출한다. Tm 해석의 결과에 의거한 표적 폴리뉴클레오티드의 검출은, 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 본 발명에 있어서 「검출」이란, 표적 폴리뉴클레오티드의 유무의 검출 외에, 샘플에 있어서의 표적 폴리뉴클레오티드의 정량, 샘플에 있어서의 표적 폴리뉴클레오티드와 그 밖의 폴리뉴클레오티드의 비율의 측정을 포함하는 개념이다.
또한, 상기 검출 방법을 사용함으로써, 피험자에 유래하는 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출하는 것이 가능하게 된다. 즉, 제3의 본 발명은, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과를, 당해 변이가 검출된 경우에는 상기 피험자가 당해 변이의 존재에 의해 일어나는 질환을 가질 가능성이 있다는 기준과 비교함으로써, 상기 변이의 존재에 의해 일어나는 질환의 가능성을 시험하는 것을 포함하는, 시험 방법이다. 또한, 본 발명은, 상기 시험 결과에 의거하여, 질환을 진단하는 방법도 제공한다.
제4의 본 발명은, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과와, 당해 변이의 유무 및 특정의 의약의 효과의 관계를 비교함으로써, 상기 피험자에 대한 상기 특정의 의약의 효과를 예측하는 것을 포함하는, 약효의 예측 방법이다. 즉, 특정의 변이와 특정의 의약의 효과와의 관계가 알려져 있는 경우에, 특정의 변이의 유무를 검출함으로써, 상기 관계를 참조함으로써, 특정의 의약의 효과를 예측하는 것이 가능하게 된다.
예를 들면, 분자 표적약 게피티니브(gefitinib)는 EGFR 유전자에 특정의 변이(exon21의 L858R의 변이 등)가 있으면 주효율(奏效率)이 높아지는 것이 알려져 있다. 또한, 분자 표적약 세툭시맙(cetuximab)은 kras 유전자의 codon12 또는 13의 변이나 braf 유전자의 V600E 변이가 있으면 약이 듣지 않게 되는 경우가 알려져 있다. 즉, 본 발명의 검출 방법을 사용하여, EGFR 유전자의 상기 변이를 검출함으로써, 피험자에 대한 게피니티브의 약효를 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법을 사용하여, kras 유전자 또는 braf 유전자의 상기 변이를 검출함으로써, 피험자에 대한 세툭시맙의 약효를 예측할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상술한 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 방법에 사용하는 프라이머 세트의 제조 방법을 제공한다.
즉, 제5의 본 발명은, 상술한 제1의 본 발명을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 프라이머를 조합하는 것을 포함하는, 프라이머 세트의 제조 방법이다.
이와 같은 제조 방법에 의하면, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭이나 검출에 적합한 프라이머 세트를 제공하는 것이 가능하게 된다.
여기서, 「조합한다」함은, 상기 프라이머를 혼합하는 형태 외에, 사용시에 혼합할 수 있도록 별개로 포함하는 형태 등이 있다.
또한, 본 발명은, 상술한 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 방법에 사용하는 프라이머 세트의 설계 방법을 제공한다.
즉, 본 발명의 다른 형태는, 상술한 제1의 본 발명을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 프라이머 양비를 결정하여, 프라이머 세트를 설계하는 방법이다.
이와 같은 설계 방법에 의하면, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭이나 검출에 적합한 프라이머 세트를 간편하게 설계하는 것이 가능하게 된다.
제6의 본 발명인 프라이머 세트는, 예를 들면, 이하와 같은 구성을 취할 수 있다. 당해 프라이머 세트는, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭이나 검출에 사용된다.
하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 포함하고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양이, 몰비로 1배보다 큰, 프라이머 세트,
(i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하는 제1 프라이머
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머
(iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머.
상기 프라이머 세트는, 예를 들면, SNP 부위를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭이나 검출에 사용된다. 이 경우, 제1 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제1 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 곳에 갖고, 제2 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제2 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 곳에 갖는다.
그 밖에, 각 프라이머의 바람직한 형태에 대해서는, 제1의 본 발명에 대해 설명한 대로이다. 한 형태에서는, 제1 프라이머의 Tm값은, 제2 프라이머의 Tm값보다 높다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양은, 몰비로, 바람직하게는 2배보다 크고, 더욱 바람직하게는 4배보다 크고, 보다 바람직하게는 8배보다 크다.
또한, 본 발명은, 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 포함하고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양이, 몰비로 1배보다 작은 프라이머 세트, 몰비로 0.5배보다 작은 프라이머 세트, 몰비로 0.25배보다 작은 프라이머 세트, 몰비로 0.125배보다 작은 프라이머 세트 등도 제공한다.
제6의 본 발명인 프라이머 세트의 다른 형태로서는, 예를 들면, 이하와 같은 것을 들 수 있다.
하기 (i) 및 (ii)의 프라이머를 포함하고, 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양이, 몰비로 1배보다 큰, 프라이머 세트,
(i) 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하는 제1 프라이머
(ii) 상기 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머
제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양은, 바람직하게는 몰비로 2배보다 크다. 제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양의 상한은, 바람직하게는 몰비로 4배이다.
또한, 본 발명은, 상술한 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하여, 증폭산물 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법에 사용하는 검출 키트의 제조 방법을 제공한다.
당해 검출 키트의 제조 방법은, 상술한 제1의 본 발명을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고, 조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 프라이머와, 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열로 이루어지고, 말단이 형광 색소로 표지되어 하이브리다이제이션했을 때에 형광이 증가 또는 감소하는 프로브를 조합하는 것을 포함한다. 이와 같은 프로브에 대해서는, 제1의 본 발명에 대해 설명한 대로이다.
또한, 본 발명은, 제6의 발명의 프라이머 세트와 상기 프로브를 조합한 검출 키트도 제공한다.
[실시예]
<실시예1>
서열번호 1은 JAK2 유전자 서열의 부분 서열이다. 서열번호 1은, GenBank의 Accession No. NG_009904의 88381∼88680번째의 서열에 상당한다. 서열번호 1에 나타내는 염기 서열 중, 18번째∼237번째로 이루어지는 DNA 단편을 pT7Blue T-vector의 EcoR V 사이트에 TA 클로닝으로 삽입하여, EcoRI로 선상화했다. 이것을, 야생형 플라스미드(JAK2 Wt 플라스미드)로 했다. 또한, 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 147번째의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환한 서열로 이루어지는 DNA 단편을 마찬가지로 처리하여, 변이형 플라스미드(JAK2 V617F 플라스미드)로 했다. 샘플은 상기 JAK2 Wt 플라스미드와 JAK2 V617F 플라스미드를 99:1로 혼합한 것으로 했다.
상기 샘플 104카피를 포함하고, 표 1에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 하기의 농도가 되도록 혼합한 PCR 반응액 50μL를, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 프라이머는, 야생형 JAK2 프라이머 Fwt(3' 말단이 야생형 뉴클레오티드, 서열번호 2), 변이형 JAK2 프라이머 Fmt(3' 말단이 변이형 뉴클레오티드, 서열번호 3), 및 이들과 쌍을 이루는 JAK2 프라이머 R(서열번호 4)을 사용했다. 또한, 프로브는, 3' 말단이 형광 색소(TAMRA)로 표지된, 2본쇄가 되면 형광이 감소하는 프로브(서열번호 5)를 사용했다. 프라이머 및 프로브의 서열 및 길이를 표 2에 나타낸다. 표 중, JAK2 프라이머 Fwt와 JAK2 프라이머 Fmt의 5' 말단측의 대문자로 나타내는 뉴클레오티드로 이루어지는 서열은, 의양성(擬陽性)을 억제하기 위한 부가 서열이다.
JAK2 프라이머 R의 농도를 표 3에 나타내는 바와 같이 바꿈으로써, JAK2 프라이머 Fwt와 JAK2 프라이머 Fmt의 총량과 JAK2 프라이머 R의 양비를 바꾸고, 당해 양비가 변이형 플라스미드의 검출 감도에 주는 영향을 시험했다.
PCR 및 Tm 해석의 조건은 표 4에 나타내는 바와 같다. 또한, Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520∼555nm, 585∼700nm이었다.
[표 1]
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2 프라이머 Fwt(표 2)
0.25μmol/L JAK2 프라이머 Fmt(표 2)
0.2μmol/L JAK2 mt 프로브(표 2)
*JAK2 프라이머 R(표 2)의 농도는 표 3 참조
[표 2]
Figure 112011031975270-pat00001
[표 3]
Figure 112011031975270-pat00002
[표 4]
PCR 조건/Tm 해석 조건
95℃, 60초
↓
(95℃, 1초→60℃, 15초)×50사이클
↓
95℃, 1초
↓
40℃, 60초
↓
Tm 해석 40℃→75℃, 1℃/3초
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 51℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 59℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, JAK2 프라이머 Fwt와 JAK2 프라이머 Fmt의 총량에 대한 JAK2 프라이머 R의 양(R/(Fwt+Fmt))이, 2몰배, 4몰배, 8몰배로 커짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, R/(Fwt+Fmt)가 커질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다.
<실시예2>
서열번호 6은 abl 유전자 서열의 부분 서열이다. 서열번호 6은, GenBank의 Accession No. NG_012034의 158941∼159060번째의 서열에 상당한다. 서열번호 6에 나타내는 염기 서열 중, 적어도 19번째∼100번째의 서열을 포함하는 DNA 단편을 pT7Blue T-vector의 EcoR V 사이트에 TA 클로닝으로 삽입하여, KpnI로 선상화했다. 이것을, 야생형 플라스미드(abl Wt 플라스미드)로 했다. 또한, 서열번호 6에 나타내는 염기 서열에 있어서의 77번째의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환한 서열로 이루어지는 DNA 단편을 마찬가지로 처리하여, 변이형 플라스미드(abl C944T 플라스미드)로 했다. 샘플은 상기 abl Wt 플라스미드와 abl C944T 플라스미드를 99:1로 혼합한 것으로 했다.
상기 샘플 104카피를 포함하고, 표 5에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 하기의 농도가 되도록 혼합한 PCR 반응액 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 프라이머는, 야생형 abl 프라이머 Rwt(3' 말단이 야생형 뉴클레오티드, 서열번호 8), 변이형 abl 프라이머 Rmt(3' 말단이 변이형 뉴클레오티드, 서열번호 9), 및 이들과 쌍을 이루는 abl 프라이머 F(서열번호 7)를 사용했다. 또한, 프로브는, 5' 말단이 형광 색소(BODIPY FL)로 표지되고, 3' 말단이 인산화된(표 6 중, "P"로 나타낸다), 2본쇄가 되면 형광이 감소하는 프로브(서열번호 10)를 사용했다. 프라이머 및 프로브의 서열 및 길이를 표 6에 나타낸다.
abl 프라이머 F의 농도를 표 7에 나타내는 바와 같이 바꿈으로써, abl 프라이머 Rwt와 abl 프라이머 Rmt의 총량과 abl 프라이머 F의 양비를 바꾸고, 당해 양비가 변이형 플라스미드의 검출 감도에 주는 영향을 시험했다.
PCR 및 Tm 해석의 조건은 표 8에 나타내는 바와 같다. 또한, Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 420∼485nm, 520∼555nm이었다.
[표 5]
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L abl 프라이머 Rwt(표 6)
0.25μmol/L abl 프라이머 Rmt(표 6)
0.2μmol/L abl mt 프로브(표 6)
*abl 프라이머 F(표 6)의 농도는 표 7 참조
[표 6]
Figure 112011031975270-pat00003
[표 7]
Figure 112011031975270-pat00004
[표 8]
PCR 조건/Tm 해석 조건
95℃, 60초
↓
(95℃, 1초→65℃, 15초)×50사이클
↓
95℃, 1초
↓
40℃, 60초
↓
Tm 해석 40℃→75℃, 1℃/3초
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 47℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 54℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, abl 프라이머 Rwt와 abl 프라이머 Rmt의 총량에 대한 abl 프라이머 F의 양(F/(Rwt+Rmt))이, 4몰배, 8몰배로 커짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, F/(Rwt+Rmt)가 커질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다.
실시예1과 실시예2에서 얻어진 결과에서, 알렐 특이적인 염기를 갖는 프라이머와, 알렐 비특이적인 프라이머와의 양비를 조절함으로써, 특정의 알렐 특이적인 염기를 갖는 DNA의 증폭 효율을 올릴 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예3>
서열번호 11은 kit 유전자 서열의 부분 서열이다. 서열번호 11은, GenBank의 Accession No. NG_007456의 75001∼75360번째의 서열에 상당한다. 서열번호 11에 나타내는 염기 서열 중, 59번째∼358번째로 이루어지는 DNA 단편을 pT7Blue T-vector의 EcoR V 사이트에 TA 클로닝으로 삽입하여, EcoRI로 선상화했다. 이것을, 야생형 플라스미드(kit Wt 플라스미드)로 했다. 또한, 서열번호 11에 나타내는 염기 서열에 있어서의 228번째의 아데닌(A)이 티민(T)으로 치환한 서열로 이루어지는 DNA 단편을 마찬가지로 처리하여, 변이형 플라스미드(kit D617V 플라스미드)로 했다. 샘플은 상기 kit Wt 플라스미드와 kit D617V 플라스미드를 99:1로 혼합한 것으로 했다.
상기 샘플 104카피를 포함하고, 표 9에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 하기의 농도가 되도록 혼합한 PCR 반응액 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 프라이머는, 야생형 kit 프라이머 Fwt(3' 말단이 야생형 뉴클레오티드, 서열번호 12), 변이형 kit 프라이머 Fmt(3' 말단이 변이형 뉴클레오티드, 서열번호 13), 및 이들과 쌍을 이루는 kit 프라이머 R(서열번호 14)을 사용했다. 또한, 프로브는, 5' 말단이 형광 색소(TAMRA)로 표지되고, 3' 말단이 인산화된, 2본쇄가 되면 형광이 감소하는 프로브(서열번호 15)를 사용했다. 프라이머 및 프로브의 서열 및 길이를 표 10에 나타낸다.
kit 프라이머 Fwt의 농도를 표 11에 나타내는 바와 같이 바꿈으로써, kit 프라이머 Fwt와 kit 프라이머 Fmt의 양비를 바꾸고, 당해 양비가 변이형 플라스미드의 검출 감도에 주는 영향을 시험했다.
PCR 및 Tm 해석의 조건은 표 12에 나타내는 바와 같다. 또한, Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520∼555nm, 585∼700nm이었다.
[표 9]
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L kit 프라이머 Fmt(표 10)
1μmol/L kit 프라이머 R(표 10)
0.2μmol/L kit mt 프로브(표 10)
*kit 프라이머 Fwt(표 10)의 농도는 표 11 참조
[표 10]
Figure 112011031975270-pat00005
[표 11]
Figure 112011031975270-pat00006
[표 12]
PCR 조건/Tm 해석 조건
95℃, 60초
↓
(95℃, 1초→61℃, 15초)×50사이클
↓
95℃, 1초
↓
40℃, 60초
↓
Tm 해석 40℃→75℃, 1℃/3초
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 48℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 56℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, kit 프라이머 Fmt의 양에 대한 kit 프라이머 Fwt의 양(Fwt/Fmt)이, 2몰배에서 1몰배로 작아짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, Fwt/Fmt가 작아질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다.
<실시예4>
실시예1에서 제작한 JAK2 Wt 플라스미드와 JAK2 V617F 플라스미드를 99:1로 혼합한 것을 샘플로 하여, 표 2에 나타내는 각종 프라이머 및 프로브를 사용하고, 이하의 시험을 행했다.
상기 샘플 104카피를 포함하고, 표 13에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 하기의 농도가 되도록 혼합한 PCR 반응액 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
JAK2 프라이머 Fmt의 농도를 표 14에 나타내는 바와 같이 바꿈으로써, JAK2 프라이머 Fwt와 JAK2 프라이머 Fmt의 양비를 바꾸고, 당해 양비가 변이형 플라스미드의 검출 감도에 주는 영향을 시험했다.
PCR 및 Tm 해석의 조건은 표 15에 나타내는 바와 같다. 또한, Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520∼555nm, 585∼700nm이었다.
[표 13]
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2 프라이머 Fwt(표 2)
2μmol/L JAK2 프라이머 R(표 2)
0.2μmol/L JAK2 mt프로브(표 2)
*JAK2 프라이머 Fmt(표 2)의 농도는 표 14 참조
[표 14]
Figure 112011031975270-pat00007
[표 15]
PCR 조건/Tm 해석 조건
95℃, 60초
↓
(95℃, 1초→60℃, 15초)×50사이클
↓
95℃, 1초
↓
40℃, 60초
↓
Tm 해석 40℃→75℃, 1℃/3초
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 51℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 59℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, JAK2 프라이머 Fmt의 양에 대한 JAK2 프라이머 Fwt의 양(Fwt/Fmt)이, 2몰배에서 0.5몰배로 작아짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, Fwt/Fmt가 작아질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다.
실시예3과 실시예4에서 얻어진 결과에서, 알렐 특이적인 염기를 갖는 복수의 프라이머(제1 프라이머와 제2 프라이머)의 양비를 조절함으로써, 특정의 알렐 특이적인 염기를 갖는 DNA의 증폭 효율을 올릴 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예5>
실시예3에서 작성한 kit Wt 플라스미드와 kit D617V 플라스미드를 1:0, 99:1, 97:3, 9:1로 혼합한 샘플을 각각 Wt, Mt1%, Mt3%, Mt10%의 샘플로 했다. 본 샘플을 104카피 포함하고, 아래 표에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 아래 표의 농도가 되도록 혼합한 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L kit 프라이머 Fwt(표 10)
0.25μmol/L kit 프라이머 Fmt(표 10)
0.2μmol/L kit mt 프로브(표 10)
*kit 프라이머 R(표 10)의 농도는 아래 표 참조
[표 16]
Figure 112011031975270-pat00008
그 밖의 반응 조건은 실시예3과 동일하게 했다.
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 48℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 56℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 5a∼e에서 알 수 있는 바와 같이, kit 프라이머 Fwt와 kit 프라이머 Fmt의 총량에 대한 kit 프라이머 R의 양(R/(Fwt+Fmt))이, 1몰배(도 5a), 2몰배(도 5b), 4몰배(도 5c), 8몰배(도 5d), 16몰배(도 5e)로 커짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다. 그러나, 16몰배의 경우, 야생형 유래의 피크가 거의 보이지 않게 되었다.
이로부터, R/(Fwt+Fmt)가 커질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성은 명백해졌지만, 16몰배가 되면 야생형 유래의 피크가 거의 보이지 않게 되기 때문에, 반응 불량과의 구별이 나기 어려워짐을 알 수 있었다.
<실시예6>
실시예1로 작성한 JAK2 Wt 플라스미드와 JAK2 V617F 플라스미드를 1:0, 99:1, 97:3, 9:1로 혼합한 샘플을 각각 Wt, Mt1%, Mt3%, Mt10%의 샘플로 했다. 본 샘플을 104카피 포함하고, 아래 표에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 아래 표의 농도가 되도록 혼합한 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
0.25μmol/L JAK2 프라이머 Fwt(표 2)
0.25μmol/L JAK2 프라이머 Fmt(표 2)
0.2μmol/L JAK2 mt 프로브(표 2)
*JAK2 프라이머 R(표 2)의 농도는 아래 표 참조
[표 17]
Figure 112011031975270-pat00009
그 밖의 반응 조건은 실시예1과 동일하게 했다.
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 51℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 59℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 6a∼e에서 알 수 있는 바와 같이, JAK2 프라이머 Fwt와 JAK2 프라이머 Fmt의 총량에 대한 JAK2 프라이머 R의 양(R/(Fwt+Fmt))이, 1몰배(도 6a), 2몰배(도 6b), 4몰배(도 6c), 8몰배(도 6d), 16몰배(도 6e)로 커짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, R/(Fwt+Fmt)가 커질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다.
<실시예7>
실시예5에서 작성한 Wt, Mt1%, Mt3%, Mt10%의 샘플을 104카피 포함하고, 아래 표에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 아래 표의 농도가 되도록 혼합한 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
1μmol/L kit 프라이머 R(표 10)
0.2μmol/L kit mt 프로브(표 10)
*kit 프라이머 Fwt(표 10)와 kit 프라이머 Fmt(표 10)의 농도는 아래 표 참조
[표 18]
Figure 112011031975270-pat00010
그 밖의 반응 조건은 실시예3과 동일하게 했다.
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 48℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 56℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 7a∼e에서 알 수 있는 바와 같이, kit 프라이머 Fmt의 양에 대한 kit 프라이머 Fwt의 양(Fwt/Fmt)이, 3몰배(도 7e), 2몰배(도 7d), 1몰배(도 7c), 1/2몰배(도 7b), 1/3몰배(도 7a)로 작아짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, Fwt/Fmt가 작아질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다. 또한, 3몰배의 경우는 야생형의 피크가 모든 샘플에 있어서 거의 보이지 않게 되는 것이 명백해졌다.
<실시예8>
실시예6에서 작성한 Wt, Mt1%, Mt3%, Mt10%의 샘플을 104카피 포함하고, 아래 표에 나타내는 PCR 반응액의 각 성분을, 아래 표의 농도가 되도록 혼합한 50μL를 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 : i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
50μL의 PCR 반응액에 있어서 :
1×반응 버퍼
1.25U Taq 폴리머라제
1.5mmol/L MgCl2
0.2mmol/L dNTP
1μmol/L JAK2 프라이머 R(표 2)
0.2μmol/L JAK2 mt 프로브(표 2)
*JAK2 프라이머 Fwt(표 2)와 JAK2 프라이머 Fmt(표 2)의 농도는 아래 표 참조
[표 19]
Figure 112011031975270-pat00011
그 밖의 반응 조건은 실시예1과 동일하게 했다.
PCR 및 Tm 해석의 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8의 종축은 형광 강도(Relative Fluorescence Units(RFU))의 미분값, 횡축은 온도(℃)이다. 51℃ 부근에 보이는 피크는, 야생형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크, 59℃ 부근에 보이는 피크가, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크이다.
도 8a∼e에서 알 수 있는 바와 같이, JAK2 프라이머 Fmt의 양에 대한 JAK2 프라이머 Fwt의 양(Fwt/Fmt)이, 3몰배(도 8e), 2몰배(도 8d), 1몰배(도 8c), 1/2몰배(도 8b), 1/4몰배(도 8a)로 작아짐에 따라, 변이형 플라스미드의 존재에 유래하는 피크가 커졌다.
이로부터, Fwt/Fmt가 작아질수록 변이형 플라스미드의 증폭 효율이 상승한다는 규칙성이 명백해졌다. 또한, 3몰배의 경우는 야생형의 피크가 모든 샘플에 있어서 거의 보이지 않게 되는 것이 명백해졌다.
본 발명은, 각종 유전자의 변이에 대해, 임상적으로 이용가치가 있는 검출 감도를 탐지하는 툴을 제공한다.
<110> ARKRAY, Inc. <120> METHOD FOR ADJUSTING AMPLIFICATION EFFICIENCY OF TARGET POLYNUCLEOTIDE <130> P-110326 <150> JP2010-105188 <151> 2010-04-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcagagaga attttctgaa ctatttatgg acaacagtca aacaacaatt ctttgtactt 60 ttttttttcc ttagtctttc tttgaagcag caagtatgat gagcaagctt tctcacaagc 120 atttggtttt aaattatgga gtatgtgtct gtggagacga gagtaagtaa aactacaggc 180 tttctaatgc ctttctcaga gcatctgttt ttgtttatat agaaaattca gtttcaggat 240 cacagctagg tgtcagtgta aactataatt taacaggagt taagtatttt tgaaactgaa 300 300 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 2 tgctcatttg gttttaaatt atggagtatg tg 32 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 3 gtctggcatt tggttttaaa ttatggagta tgtt 34 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 4 gctctgagaa aggcattaga aagcctg 27 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe <400> 5 agtatgtttc tgtggagac 19 <210> 6 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gcggagccac gtgttgaagt cctcgttgtc ttgttggcag gggtctgcac ccgggagccc 60 ccgttctata tcatcactga gttcatgacc tacgggaacc tcctggacta cctgagggag 120 120 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 7 ggacggacgg accgtcctcg ttgtcttgtt ggc 33 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 8 ctacgttccc gtaggtcatg aactcag 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 9 tgctcaggtt cccgtaggtc atgaactcaa 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe <400> 10 ctcaatgatg atatagaacg 20 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tttttggtgt actgaatact ttaaaacaaa agtattggat tttttataat ataagcaaca 60 ctatagtatt aaaaagttag ttttcactct ttacaagtta aaatgaattt aaatggtttt 120 cttttctcct ccaacctaat agtgtattca cagagacttg gcagccagaa atatcctcct 180 tactcatggt cggatcacaa agatttgtga ttttggtcta gccagagaca tcaagaatga 240 ttctaattat gtggttaaag gaaacgtgag tacccattct ctgcttgaca gtcctgcaaa 300 ggatttttag tttcaacttt cgataaaaat tgtttcctgt gattttcata atgtaaatcc 360 360 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 12 attttggtct agccagaga 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 13 tgattttggt ctagccagag t 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer <400> 14 aaatcctttg caggactgtc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized probe <400> 15 ccagagtcat caagaatg 18

Claims (15)

  1. 하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 방법으로서,
    하기 (i)∼(iii)의 프라이머의 양비(量比)를 조절함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것을 포함하며,
    (i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합(對合)하는 제1 프라이머,
    (ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머,
    (iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머
    제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 몰비로 2배보다 크게 함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율이 오르는, 방법
  2. 제1항에 있어서,
    제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양을 조절함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드는, SNP 부위를 포함하고,
    제1 프라이머 및 제2 프라이머는 상기 SNP 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈하며,
    제1 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제1 알렐(allele) 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 곳에 갖고,
    제2 프라이머는, 상기 SNP 부위의 제2 알렐 특이적 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 세어 1∼5번째 중 어느 곳에 갖는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 프라이머의 Tm값은, 제2 프라이머의 Tm값보다 높은, 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 프라이머의 양에 대한 제1 프라이머의 양을 크게 함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 올리는 것을 포함하는, 방법.
  10. (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 얻어진 증폭산물을 사용하여 당해 표적 폴리뉴클레오티드를 검출할 때의, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하는 방법으로서,
    제1항 또는 제2항에 기재된 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절함으로써, 당해 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 기재된 방법으로 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 효율을 조절하고,
    조절된 검출 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고,
    얻어진 PCR 증폭산물 중의 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 방법.
  12. 제11항에 기재된 검출 방법을 사용하여, 피험자에 유래하는 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출하고, 얻어진 검출 결과를, 당해 변이가 검출된 경우에는 상기 피험자가 당해 변이의 존재에 의해 일어나는 질환을 가질 가능성이 있다는 기준과 비교함으로써, 상기 변이의 존재에 의해 일어나는 질환의 가능성을 시험하는 것을 포함하는, 시험 방법.
  13. 제11항에 기재된 검출 방법을 사용하여, 피험자에 유래하는 유전자에 있어서의 변이의 존재 또는 비존재를 검출하고, 얻어진 검출 결과와, 당해 변이의 유무 및 특정의 의약의 효과의 관계를 비교함으로써, 상기 피험자에 대한 상기 특정의 의약의 효과를 예측하는 것을 포함하는, 약효의 예측 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 효율을 조절하고,
    조절된 증폭 효율을 실현하는 양비의 상기 (i)∼(iii)의 프라이머를 조합하는 것을 포함하는, 프라이머 세트의 제조 방법.
  15. 하기 (i)∼(iii)의 프라이머를 포함하고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 총량에 대한 제3 프라이머의 양이, 몰비로 2배보다 큰, 프라이머 세트,
    (i) 표적 폴리뉴클레오티드에 대합하는 제1 프라이머
    (ii) 표적 폴리뉴클레오티드에, 제1 프라이머와 경합적으로 대합하지만, 제1 프라이머보다 PCR에 의한 신장 반응이 일어나기 어려운 제2 프라이머
    (iii) 제1 프라이머와 쌍을 이루어, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭 가능하게 설계된 제3 프라이머.
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