CN106434877A - HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述方法包括：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶HaeIII对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型。本发明简单易行，快速高效，成本低廉，酶切结果容易辨识，为食管癌易感基因PTEN多态性rs701848的基因分型提供了简捷途径。
Description
技术领域
本发明属于基因多态性检测技术领域，尤其涉及一种HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法。
背景技术
目前，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人类长期进化过程中环境选择的结果，已成为第3代分子遗传的标记，具有标记密度高、稳定、易于分型检测的优势，是人种之间、个体之间差异的遗传基础之一，已确定为多种遗传学相关疾病的易感基础，成为患病危险程度的评价指标。PCR-RFLP(Polymerase Chain Reactionrestriction fragment length polymorphisms)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶反应，在体外进行特异DNA序列扩增，扩增后将PCR产物进行酶切、电泳、显色，即可对目的基因进行分类分型，方法比较简单，易于操作，成本低，因此在大样本的基因流行病学研究中最为常用。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。食管癌是世界第六大常见恶性肿瘤死因，在特殊地区的发病率呈上升趋势。我国的食管癌发病率居世界首位，食管癌死因在全国恶性肿瘤死因中位居第四，死亡人数占全国恶性肿瘤死亡人数的1/5。近年的研究表明，食管癌的发生和发展是多因素共同作用的结果，其发生和发展除与长期吸烟、饮酒、亚硝胺类及霉菌的摄人、膳食中缺乏维生素及微量元素(如钼)、热损伤(喜食烫食)等环境因素有关外，与个体遗传易感性也有密切关系。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)是一种新的抑癌基因，通过在PI3K信号传导通路中发挥负向调节作用从而起到抑癌基因的作用。PTEN可以抑制细胞生长，促进凋亡，并且可以调节细胞的粘附、迁移、扩散和分化。已经在许多肿瘤中都发现了PTEN活性的丢失。细胞核PTEN表达可能是食管癌的一个生物标记，并且在致癌作用和食管癌的进展中发挥着重要作用。MicroRNA(miRNA)为长度大约22个碱基左右非编码的单链RNA，通过非特异结合基因3’UTR区抑制基因表达，从而在癌症的发生中发挥作用。MiRNA通过沉默转录后的mRNA从而达到调控癌症发生。MiRNA与靶基因结合位点的多态性，可以破坏或者增加miRNA与靶基因的结合。近年来miRNA靶位点SNP在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在食管癌领域的研究开展相对较少，因此将一定功能相关的在PTEN基因上miRNA靶位点多态性与食管癌结合起来可以更好的探讨其对食管癌形成过程的作用，揭示其与食管癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。序列特异性引物PCR也称等位基因特异性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA多聚酶不能修复DNA引物在3′末端的单个碱基错配。所以，当引物的3′端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物3′端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。每个等位基因的检测，需设计两套引物，一套为等位基因特异性引物，一套为普通引物。PCR产物凝胶电泳以后，通过紫外线透射来检测DNA的存在与否，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。在同一反应中的另一对引物(通常扩增人生长激素基因的一段)总会产生一个DNA片断，与SNP基因型无关，作为PCR有效性的控制。基因特异性PCR(AS-PCR)的缺点是扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差。TaqMan探针法是指PCR扩增时，在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。Taqman荧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高，难以在实验室中普及使用。SNaPshot也被称为minisequencing。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。SNaPshot基因型分析方法的缺点在于所需试剂必须从国外进口，而且成本较高，不适合实验室应用。综上所述，为了最终实现降低食管癌的发病率，本领域迫切需要食管癌易感基因miRNA靶位点SNP检测，并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测食管癌易感基因多态性的试剂盒。
发明内容
本发明旨在解决现有的食管癌易感基因多态性检测方法，克服操作复杂、需昂贵的仪器和繁琐的步骤、检测成本较高、适用范围小、难以在实验室中普及使用的问题。
本发明是这样实现的，一种引物，所述引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法包括以下步骤：
步骤一，抽提样品的基因组DNA；
步骤二，提供扩增人PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，rs701848上游引物:5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，rs701848下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
步骤三，使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为TC基因型。
进一步，所述PCR扩增体系的反应条件包括：
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至57.9℃，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至72℃。
进一步，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法的具体步骤如下：
(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次；
2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；
3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液1:1，剧烈震荡，变成奶咖色；12000rpm离心10min；
4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体，加入等体积的氯仿后颠倒混匀，12000rm离心10min；
5)取上清，加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清，
6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净；
7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得食管癌组织基因组DNA；
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μl PCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
进一步，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法的具体步骤如下：
(l)获取周围静脉血细胞，采用酚-氯仿法提取血细胞基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min；
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μl PCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述引物的检测食管癌易感基因多态性试剂盒。
本发明提供的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，提取待测人基因组DNA模板，人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组模板；PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物；对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切反应，得到酶切产物；酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型；该用HaeIII检测人食管癌易感基因PTEN多态性rs701848的方法，方法简单易行，快速高效，成本低廉，酶切结果容易辨识，为食管癌易感基因PTEN多态性rs701848的基因分型提供了一个简捷的新途径。为了克服现有基因多态性基因分型技术中存在的缺陷，本发明提供一种用HaeIII检测人食管癌易感基因PTEN多态性位点rs701848的分型方法，该方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，应用限制性内切酶对DNA扩增片段进行酶切，然后将酶切产物进行琼脂糖电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特异酶切位点，通过片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。简而言之，就是先PCR扩增相应目的片段，然后进行限制性内切酶酶切反应，电用后观察比较限制性图谱来分析序列之间的差异。此方法重复性好，操作简单，成本低廉，酶切结果容易辨识。因此，本发明的目的在于提供一种用HaeIII检测人食管癌易感基因PTEN多态性rs701848的方法，
附图说明
图1是本发明实施例提供的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法流程图。
图2是本发明实施例提供的PTEN基因多态性rs701848附近序列PCR扩增酶切位点分析示意图。
图3是本发明实施例提供的PTEN基因多态性rs701848位点的电泳图谱示意图；
图中：M道：Marker(100bp DNA Ladder)；1道：rs701848的TT基因型；2道：rs701848的CT基因型；3道：rs701848的CC基因型。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法包括以下步骤：
S101：抽提样品的基因组DNA；
S102：提供扩增人PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，rs701848上游引物:5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，rs701848下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
S103：使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
S104：将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型。其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为TC基因型。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
本发明提供了一种检测食管癌易感基因多态性基因型的方法，由于识别特定位点的限制性内切酶HaeIII适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。经在线酶切位点分析
(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/cutshow.php？name＝26419975-)发现，SNP位点附近只有三种酶(HaeIII，Sau96I，CvikI-1)的酶切位点，而当SNP位点由C变为T时，CvikI-1酶切位点仍然存在，不适合作为分型内切酶。因此，检测该C/T多态的方法只有表一中的2种酶，其中Sau96I含一错配碱基，此错配碱基的位置离突变位点往往很是接近，这大大增加了引物设计的难度，加之要求上游或下游引物必须包含此错配碱基，这对引物的设计又增加了新的难度。综合考虑简单操作性与经济实用性，限制性内切酶HaeIII是最佳选择。
表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司
(http://www.neb-china.com)，限制性内切酶的选择从NEBcutter限制性内切酶分析软件上获取
(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/cutshow.php？name＝26419975-)，以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。
表1两种限制性内切酶识别序列及其价格
在本发明的实施中，正向引物和反向引物的设计采用Primer6.0软件进行，设计的原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度以及扩增效率的影响。按照碱基互不配对的原则设计引物，引物长度一般在15～30碱基之间，过长或短均会造成特异性差，过长还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40％～60％之间，Tm值最好在55℃到65℃之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性，引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，以确保其与其它基因不具有互补性。在此基础上，最终选取的上游引物为5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’。由此引物扩增出的面的片段344bp，扩增产物如下：
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第53位bp R代表T/C多态即SNP位点rs701848。该长为344bp的扩增产物经限制性内切酶HaeIII酶切后可产生344bp，293bp，51bp共三种片段类型。基因型判定结果：野生型CC经限制性内切酶酶切后产生2个片段293bp和51bp，突变杂合子TC则产生3个片段344bp、293bp和51bp，突变纯合子TT则产生1个片段344bp。
凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的制备电泳。聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式：一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。但综合考虑实用性、便利性以及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中，引物扩增条件如图2所示，目的扩增产物使用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h。酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
在本发明中，PCR扩增体系的反应条件并不受特别的限制，基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～94℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)(图2)。而对于待测DNA也没有较高的浓度及纯度要求，既可以是人体体液或组织中提取的DNA，也可以是经过预先降解处理的基因组。但为了方便实施以及减少受试者痛苦，一般优先选择从血液中进行基因组DNA的提取。
本发明经过多年研究，首次证明了PTEN基因单核苷酸多态性位点rs701848位于3’-UTR端，是miRNA-1304的靶位点，发现了PTEN基因多态性rs701847C→T在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P<0.05)。在此基础上本发明提供了一种检测食管癌易感性基因多态性rs701848基因型的方法，还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增位点的引物。利用本发明检测位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为食管癌易感基因多态性基因型的检测提供了一个简捷的新途径。
在本发明的具体实施方案中，本发明检测人PTEN基因多态rs701848的具体步骤如下：
(l)提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组模板。
(2)PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物。
(3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切反应，得到酶切产物；
(4)酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
实施例1.人食管癌组织标本测定人PTEN rs701848多态性
在本发明的具体实施方案中，检测人PTEN基因多态rs701848的具体步骤如下：
(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次。
2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜。
3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液(1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。12000rpm离心10min。
4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体。加入等体积的氯仿后颠倒混匀。12000rm离心10min。
5)取上清，注意避免触及中间介质以及下层液体。加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清。
6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净。
7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得食管癌组织基因组DNA。
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物。
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型(见表2)。
表2 rs701848位点基因型判定
实施例2.人外周血全血标本测定人PTEN rs701848多态性
与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从人外周血中提取基因组DNA作为待测DNA。
按照NEP004-1全血基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行待测血样基因组DNA的提取，具体步骤如下：
1)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min。
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA。
提取完毕基因组DNA后按照案例一的步骤进行基因型的鉴定，鉴定结果如下：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下拍照鉴定。对于不同的基因型，rs701848位点不同基因型展现出不同的条带(见图3)，野生型CC经限制性内切酶酶切后产生2个片段344bp和51bp，突变杂合子TC则产生3个片段344bp、293bp和51bp，突变纯合子TT则产生1个片段344bp。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1主要仪器与试剂
仪器：BCD-228CH冰箱(新飞电器)，HH-2数显恒温水浴锅(华峰仪器)，SmartGel凝胶成像仪(北京赛智创业)，GT9612梯度PCR仪(百泰克生物)，WD900SL23-2型号微波炉(格兰仕电器)，DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。
试剂：NEP004-1DNA提取试剂盒(鼎国昌盛生物)，100bp DNA Ladder(莱风生物)，2×Taq PCR Mix(莱风生物)，HaeIII(NEB)，琼脂糖(SIGMA)等。
1.2引物设计
在NCBI的dbSNP数据库中，查PTEN rs701848的核苷酸序列如下：
基因序列的第501个碱基R代表了C/T多态，即为rs701848的多态性位点。将以上序列粘贴至引物设计软件Primer Premier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为正向引物SEQ ID NO：1序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，下游引物SEQ ID NO：2:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成。
1.3限制性内切酶的选择
根据dbSNP中rs701848位点的碱基序列，用NEBcutter在线限制性内切酶分析软件，在线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性选择最佳的限制性内切酶HaeIII。
1.4从全血中提取待测样本的基因组DNA
严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min；
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；
10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和纯度。
2结果
2.1PCR扩增
(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl。
(2)PCR扩增体系为2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。
(3)PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共30个循环，依次设置为94℃/30s、57.9℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min。扩增后的产物序列为：
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第53位bp R代表C/T多态即SNP位点rs701848。
2.2酶切反应
酶切体系为PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶HaeIII 0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴4-16小时。
2.3基因型的判定
将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs701848位点不同基因型展现出不同的条带(见图3)，野生型CC经限制性内切酶酶切后产生2个片段293bp和51bp，突变杂合子TC则产生3个片段344bp、293bp和51bp，突变纯合子TT则产生1个片段344bp。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种引物，其特征在于，所述引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2.一种利用权利要求1所述引物的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法包括以下步骤：
步骤一，抽提样品的基因组DNA；
步骤二，提供扩增PTEN基因多态性rs701848位点附近序列的正向引物和反向引物，rs701848上游引物:5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’，rs701848下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
步骤三，使用限制性内切酶HaeIII对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
步骤四，将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定PTEN基因多态性rs701848的各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为TC基因型。
3.如权利要求2所述的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述PCR扩增体系的反应条件包括：
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至57.9℃，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至72℃。
4.如权利要求2所述的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法的具体步骤如下：
(l)获取手术切取的食管癌组织，采用酚-氯仿法提取食管癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
1)将食管癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次；
2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；
3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液1:1，剧烈震荡，变成奶咖色；12000rpm离心10min；
4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体，加入等体积的氯仿后颠倒混匀，12000rm离心10min；
5)取上清，加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清，
6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净；
7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得食管癌组织基因组DNA；
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μl PCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
5.如权利要求2所述的HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法，其特征在于，所述HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法的具体步骤如下：
(l)获取静脉血细胞，采用酚-氯仿法提取血细胞基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min；
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-GTGCAGTGTTGAATCATTTC-3’,下游引物:5’-GGTCCTATTCAATCTGTATTTG-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μl PCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括30个循环三个步骤，首先94℃变性30s，57.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为344bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶HaeIII 5U水浴锅中酶切6-14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
6.一种包含权利要求1所述引物的检测食管癌易感基因多态性试剂盒。
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