TW201315812A - 檢測ｄｎａ樣品中預定位點的突變的試劑盒、方法及應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及檢測DNA樣品中預定位點的突變的引子、試劑盒、方法及應用。檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法包括以下步驟：使用擴增引子對DNA樣品進行PCR擴增反應；使用延伸引子以及ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物；以及基於延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。可以有效地確定在預定位點是否發生了突變，以及所發生突變的類型。

Description

檢測DNA樣品中預定位點的突變的試劑盒、方法及應用
本發明涉及檢測DNA樣品中預定位點的突變的試劑盒、引子組合、方法及應用。
在特定位點形成突變是分子生物學實驗中常用的研究手段，可以有助於分析特定位點的點突變對於基因功能的作用。通常而言，在構建了目標突變體後，如何對該位點是否正確發生了突變，是本領域具有通常知識者所面臨的問題。
然而，目前分子生物學領域中，對於特定位點突變的檢測仍有待改進。
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種能夠有效檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法。
根據本發明的第一方面，本發明提出了一種檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：使用擴增引子對所述DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得 擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；使用延伸引子以及ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點；對所述延伸產物進行分子量檢測，以便獲得所述延伸產物的分子量；以及基於所述延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。由於延伸反應是以包含預定位點的擴增產物為模板，並且進行延伸反應的延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點，並且在進行延伸反應時使用ddNTP作為原料，因而可以保證延伸反應可以僅延伸一個鹼基，即對應預定的位點，基於各個不同鹼基的分子量存在較為顯著的區別，因而，通過對延伸產物的分子量進行檢測，可以通過所獲得的延伸產物的分子量，來確定在預定位點是否發生了突變，以及所發生突變的類型。由此，可以廣泛應用於分子生物領域，例如檢測是否成功構建了相應的突變體。
根據本發明的實施例，上述檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法還可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述DNA樣品為人全基因組DNA。由此，可以有效地對人類中的基因突變進行檢測。
根據本發明的一個實施例，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的 突變。由此，可以有效地檢測與耳聾相關的基因突變。
根據本發明的一個實施例，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種。由此，可以有效地檢測遺傳性耳聾相關的基因突變。
根據本發明的一個實施例，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對所述GJB2基因的35delG突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：1所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：33所示；針對所述GJB2基因的167delT突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：3所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：4所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：34所示；針對所述GJB2基因的176-191del16突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：5所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：35所示；針對所述GJB2基因的299_300delAT突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：7所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：36所示；針對所述GJB2基因的235delC突變，所述第一引子為如 SEQ ID NO：9所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：10所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：37所示；針對所述GJB3基因的538C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：11所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：38所示；針對所述GJB3基因的547G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：13所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：39所示；針對所述SLC26A4基因的281C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：15所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：40所示；針對所述SLC26A4基因的589G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：17所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：19所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：43所示；針對所述SLC26A4基因的1226G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：44所示；針對所述SLC26A4基因的1229C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：45所示；針對所述SLC26A4基因的1975G>C突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：25所示，所述第二引子為如 SEQ ID NO：26所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：47所示；針對所述SLC26A4基因的2027T>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：25所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：27所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：27所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：50所示；針對所述SLC26A4基因的IVS15+5G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：23所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：24所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：46所示；針對所述mtDNA基因的1494C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：29所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：51所示；以及針對所述mtDNA基因的1555A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NQ：31所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：52所示。
為方便表述，將上述引子組合分別總結與下表1和2中。
表2：針對上述20個耳聾基因突變位點的延伸引子。
如表1和表2所示，擴增引子的長度為大約30個鹼基，延伸引子的長度為17-28個鹼基。另外，發明人發現，基於前述引子組合，不同位點的延伸引子與延伸產物、延伸產物與延伸產物間的分子量差異不小於30D。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，並且適於同時檢測 多個位點的多種突變類型，根據本發明的實施例，可以同時對上述20種突變類型進行精確快速地檢測。
根據本發明的一個實施例，在進行所述寡核苷酸延伸反應之前，進一步包括：使用鹼性磷酸酶對所述擴增產物進行處理的步驟。由此，通過鹼性磷酸酶對擴增產物進行處理，可以除去擴增產物中殘存的dNTP，從而可以提高後續延伸反應的效率，進而能夠實現高效地檢測DNA樣品中預定位點的突變。
根據本發明的一個實施例，通過MALDI-TOF質譜檢測對所述延伸產物進行分子量檢測。由此，能夠精確、高效地對延伸產物進行分子量檢測，發明人驚奇地發現通過MALDI-TOF質譜檢測甚至可以實現對DNA樣品中雜合突變或純合突變的檢測。
根據本發明的一個實施例，在對所述延伸產物進行MALDI-TOF質譜檢測之前，進一步包括對所述延伸產物進行純化的步驟。由此，可以進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。
根據本發明的具體示例，利用陰離子樹脂對所述延伸產物進行純化。由此，能夠更進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。
根據本發明的第二方面，本發明提出了一種用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統。根據本發明的實施例，該用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統包括：DNA樣品擴增裝置，所述DNA樣品擴增裝置，用於對所述DNA樣品進行PCR擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；擴增產物延伸裝置，所述擴增產物延伸裝置與所述DNA樣品擴增裝置相連，以便從所述DNA樣品擴增裝置接收擴增產物，並且對所述擴增產物進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點；分子量檢測裝置，所述分子量檢測裝置與所述擴增產物延伸裝置相連，以便確定所述延伸產物的分子量；以及突變分析裝置，所述突變分析裝置基於所述延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。利用該系統，能夠有效地實施根據本發明實施例的檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法，從而有效地確定DNA樣品中預定位點的突變。
根據本發明的實施例，上述檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統還可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述DNA樣品擴增裝置內設置有擴增引子對，所述擴增產物延伸裝置內設置有延伸引子。由此，便於DNA樣品擴增裝置和擴增產物延伸裝置分別對DNA樣品進行擴增，和進行寡核苷酸延伸反應。
根據本發明的一個實施例，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對這些突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型。
根據本發明的一個實施例，進一步包括：擴增產物淨化裝置，所述擴增產物淨化裝置分別與所述DNA樣品擴增裝置和所述擴增產物延伸裝置相連，以便對所述擴增產物進行淨化處理，並將經過淨化的擴增產物輸入至所述擴增產物延伸裝置。由此，可以除去擴增產物中殘存的dNTP，從而可以提高後續延伸反應的效率，進而能夠實現高效地檢測DNA樣品中預定位點的突變。
根據本發明的一個實施例，所述分子量檢測裝置為MALDI-TOF質譜裝置。
根據本發明的一個實施例，進一步包括延伸產物純化裝置，其 中，所述延伸產物純化裝置分別與所述擴增產物延伸裝置和所述MALDI-TOF質譜裝置相連，以便對所述延伸產物進行純化處理，並將經過純化的延伸產物輸入至所述MALDI-TOF質譜裝置。
根據本發明的一個實施例，所述延伸產物純化裝置為陰離子樹脂。
根據本發明的第三方面，本發明提出了一種用於確定DNA樣品中預定位點的突變的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括：擴增引子對，所述擴增引子對適於對所述DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；以及延伸引子，所述延伸產物適於利用ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點。利用該試劑盒，所製備的延伸產物，可以有效地用於確定DNA樣品中預定位點的突變，從而實施根據本發明實施例的確定DNA樣品中預定位點的突變的方法。
根據本發明的實施例，上述用於確定DNA樣品中預定位點的突變的試劑盒還可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、 299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對這些突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型。
根據本發明的第四方面，本發明提出了一種診斷遺傳性耳聾的方法。根據本發明的實施例，包括以下步驟：提取懷疑患有遺傳性耳聾的受試者的DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中預定位點的突變的方法，對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於所述DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述受試者患有遺傳性耳聾，其中，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G 的至少一種。由此，根據本發明實施例的診斷遺傳性耳聾的方法，能夠有效地診斷受試者是否屬於遺傳性耳聾，並且能夠輔助確認耳聾的病因，進而能夠針對病因採用相應的治療和輔助措施。
根據本發明的實施例，上述診斷遺傳性耳聾的方法還可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對前述突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以高效地確定受試者是否患有遺傳性耳聾。
根據本發明的第五方面，本發明提出了一種產前診斷遺傳性耳聾的方法。根據本發明的實施例，該產前診斷遺傳性耳聾的方法包括以下步驟：分離胎兒DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中預定位點的突變的方法，對所述胎兒DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於所述胎兒DNA樣品中存在所述預定位點的突變，推測所述胎兒患有遺傳性耳聾，其中，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、 1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種。由此，根據本發明實施例的診斷遺傳性耳聾的方法，能夠輔助推測胎兒患有遺傳性耳聾，並且能夠輔助確認耳聾的病因，進而能夠針對病因採用相應的治療和輔助措施。
根據本發明的一個實施例，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對前述突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以推測胎兒是否患有遺傳性耳聾。
根據本發明的一個實施例，所述胎兒DNA是從孕婦的絨毛膜、羊水或臍帶血中提取的。由此，可以在孕早期即能夠推測胎兒是否患有遺傳性耳聾，並且不會由於直接從胎兒組織提取樣本而造成胎兒流產等事故。
根據本發明的第六方面，本發明提出了一種預測電子耳蝸效果的方法。根據本發明的實施例，該預測電子耳蝸效果的方法包括以下步驟：提取耳聾患者的DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中預定位點的突變的方法，對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；基於所述DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述耳 聾患者患有遺傳性耳聾；基於所述耳聾患者患有遺傳性耳聾，預測電子耳蝸對於所述耳聾患者有效，其中，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種。由此，可以通過確定耳聾患者的病因，來確定是否可以採用電子耳蝸來輔助耳聾患者獲得聽力。
根據本發明的實施例，上述預測電子耳蝸效果的方法可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對前述突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以高效地推測胎兒是否患有遺傳性耳聾。
根據本發明的第七方面，本發明提出了一種試劑盒，其中，包括：擴增引子對，所述擴增引子對適於對DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；以及 延伸引子，所述延伸產物適於利用ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對前述突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合製備的延伸產物，能夠非常有效地用於檢測所列出的突變類型，從而可以高效地確定遺傳性耳聾。
根據本發明的一個實施例，所述試劑盒可以用於選自診斷遺傳性耳聾、產前診斷遺傳性耳聾、以及預測電子耳蝸效果的至少一種。由此，利用該試劑盒，可以有效地實施前述的根據本發明實施例的診斷遺傳性耳聾、產前診斷遺傳性耳聾、以及預測電子耳蝸效果的方法。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在圖式中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考圖式描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
在本發明中使用的術語「第一」和「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說明，「多個」的含義是兩個或多於兩個。
本發明是基於發明人的下列發現而完成的：對於已知位點的基因突變，因其突變類型是已知的，因而通過檢測包含該已知位點的一段特定長度的寡核苷酸序列的分子量，可以基於該分子量的數值判斷出在該位點是否存在突變，並且通過計算，可以獲知該突變的類型。
檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法
根據本發明的第一方面，本發明提出了一種檢測DNA樣品中 預定位點的突變的方法。在本文中所使用的術語「預定位點」是指DNA樣品突變分析的目標位點，通常指的是已經對該位點的突變類型進行充分研究，其功能已經明瞭的位點。在本文中，所使用的術語「突變」，指的是與野生型DNA序列有區別的情況，其可以包括插入、置換、缺失一個或者多個鹼基，既可以是點突變，也可以一段序列的整體改變。
參考第1圖，根據本發明的實施例，檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法包括以下步驟：
S100：使用擴增引子對DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，擴增產物包含預定位點。根據本發明的實施例，可以採用的DNA樣品的來源，不受特別限制。根據本發明的一個示例，可以採用的DNA樣品為人全基因組DNA。根據本發明的一個實施例，可以採用含有待測位點的DNA片段的DNA樣品進行檢測，這樣可以提高檢測的效率和精度。例如，可以首先提取生物樣本中的全基因組DNA，然後通過常規的分離方法，獲得含有特定位點的DNA片段。
根據本發明的實施例，可以通過本發明的方法進行研究的預定位點的突變不受特別限制。根據本發明一些實施例，可以通過本發明的方法，進行檢測的預定位點的突變是為選自人類GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變。本發明的發明人驚奇地發現，借助本發明實施例的方法，可以有效 地對上述基因中的突變位點進行檢測。根據本發明的一個具體示例，可以進行檢測的突變位點以及常見的突變類型為下表3中所列出的任意一種：
需要說明的是，這些突變位點的表示方法均為本領域具有通常知識者已知的表達方式。鑒於突變位點既可以發生在cDNA序列上，也有可能發生在內含子上。為此，發明人提供突變說明，以對突變的精確位點進行描述。其中，說明規則為：
1)在位點前面加字母以區分所參考序列的類型：
①「c.」表示參考cDNA的序列，如：c.235delC，表示cDNA序列的第25個鹼基C缺失。
②「m.」表示參考粒線體的序列，如：m.1494C>T，表示粒線體DNA序列第1494個鹼基C被置換為T。
2)以內含子(intron)開始：外顯子(exon)序號+該位點在內含子的位置如：IVS15+5G>A，表示在SLC26A4基因第15個外顯子的下游的第5個鹼基G置換為A。
3)c.176-191del16表示缺失176位至191位的16個鹼基。
4)c.299_300delAT表示缺失299位至300位的2個鹼基(AT鹼基)。
關於人類野生型的上述基因，可以通過NCBI索取號獲得。人類野生型GJB2的NCBI索取號為NG_008358.1、GJB3的NCBI索取號為NG_008309.1、SLC26A4的NCBI索取號為NG_008489.1、mtDNA(粒線體DNA)的NCBI索取號為NC_012920。
為方便理解，下面對GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA(粒線 體DNA)進行簡要介紹。
GJB2基因：該基因定位於常染色體13q11-12區域，DNA全長4804bp，含2個外顯子，編碼區為678bp，編碼由266個氨基酸殘基組成的縫隙連接蛋白Connexin 26，屬於β-2蛋白，是鉀離子循環通路的一部分。GJB2基因突變為遺傳性耳聾最常見的病因，GJB2基因突變導致的耳聾為語前、雙側、對稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數為重度或極重度耳聾。在中國人群中，常見GJB2基因突變類型主要有235delC、299_300delAT、176_191del16等，可占GJB2基因突變人群的80%以上。關於該基因的詳細描述，可以參見Dai P,Yu F,Han B,et al.GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment[J].J Transl Med,2009,7：26，在此通過參照並入本文。
GJB3基因：該基因定位在1p33-p35，有2個外顯子，編碼含有270個氨基酸的縫隙連接蛋白Connexin 31。GJB3基因突變可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合症性耳聾，被認為與高頻聽力下降有關。關於該基因的詳細描述，可以參見Xia JH，Liu CY，Tang BS，et al．Mutations in the gene encoding gap junction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. Nat Genet,1998,20：370-373，在此通過參照並入本文。
SLC26A4基因：也被稱為PDS基因，該基因定位於常染色體 7q31區域，含21個外顯子，編碼1個由780個氨基酸殘基組成的多次跨膜蛋白Pendrin，屬於離子轉運體家族，主要與碘/氯離子轉運有關。臨床上表現為先天性或後天性耳聾，耳聾發生或加重與外傷、感冒有關。PDS基因突變種類較多，但919--2A>G、2168A>G、1226G>A、1975G>C、1229C>T、1174A>T、1687_1692insA、IVS15+5G>A、2027T>A、589G>A與281C>T突變體頻率高達82.51%。關於該基因的詳細描述，可以參見袁永一，王國建，黃德亮，等.大前庭水管相關SLC26A4基因熱點突變區域篩查方案探討.中華耳科學雜志；2010，8(3)：292-295，在此通過參照並入本文。
粒線體DNA基因：粒線體基因突變與氨基糖苷類抗生素(AmAn)引起的藥物性耳聾有關，粒線體基因突變會導致粒線體的缺陷，影響到與聽力直接相關的耳蝸毛細胞粒線體的產能不足，從而導致耳蝸與前庭細胞損傷或死亡。粒線體DNA基因突變為母系遺傳，常在成年早期發生，表現為雙側對稱性、以高頻聽力下降為主、程度不等的感音神經性耳聾。粒線體基因突變的主要位點有1555A>G與1494C>T。
關於上述基因突變類型的詳細描述，可以見相關的研究文獻，為方便描述特列表如下，通過參考將所列舉的文獻並入本文。
由此，利用根據本發明實施例的方法，可以有效地檢測耳聾相關的基因突變，並且進而能夠有效地預測受試者罹患遺傳性耳聾，例如可以輔助診斷患者耳聾的發病原因，從而可以針對性地採用相應的治療方案。
本領域具有通常知識者能夠理解的是，可以採用任何PCR方法DNA樣品進行擴增，只要所得到的擴增產物中包含預定位點即可。根據本發明的具體示例，為了診斷前面表3中所列出的突變類型，可以採用表1中所列出的引子對分別作為擴增引子的第一引子和第二引子。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的擴增引子，能夠有效地實現對預定位點的擴增，並且在後續能夠有效地提高檢測突變類型的效率和精確性，從而可以高效地確定受試者是否患有遺傳性耳聾。根據本發明的一個實施例，在表1中所示出的第一引子和第二引子5'端還可以都具有10個鹼基acgttggatg(SEQ ID NO：53)的標簽序列，發明人發現，通過採用上述標簽序列，可以使得 上述第一引子和第二引子的分子量不在後續質譜的檢測範圍內，由此，能夠進一步提高檢測的精確度和效率。
S200：在獲得包含預定位點的擴增產物之後，可以使用延伸引子以及ddNTP，以所獲得的擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物。根據本發明的實施例，延伸引子的3’端緊鄰預定位點。由此，所獲得的延伸產物的3’末端所對應的鹼基包含有預定位點的突變訊息，在後續可以通過分子量的分析，確定該位點是否具有突變事件，並且可以確定該突變事件的類型。本領域具有通常知識者可以理解，可以通過任何已知的PCR方法對擴增產物進行上述寡核苷酸延伸反應。根據本發明的一個實施例，可以採用表2中所列出的引子作為延伸引子進行上述寡核苷酸延伸反應。本發明的發明人驚奇地發現通過使用表1和表2中所列出的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型。
根據本發明的一個實施例，在進行所述寡核苷酸延伸反應之前，可以進一步包括使用鹼性磷酸酶對所獲得的擴增產物進行處理的步驟。由此，通過鹼性磷酸酶對擴增產物進行處理，可以除去擴增產物中殘存的dNTP，從而可以提高後續延伸反應的效率，進而能夠實現高效地檢測DNA樣品中預定位點的突變。
S300：在獲得上述延伸產物之後，可以對延伸產物進行分子量 檢測，以便獲得延伸產物的分子量。根據本發明的實施例，可以採用任何已知的方法對延伸產物進行分子量檢測。根據本發明的一個實施例，通過MALDI-TOF質譜(基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜，Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)檢測對所述延伸產物進行分子量檢測。MALDI-TOF質譜是近年來發展起來的一種新型的軟電離生物質譜，主要由兩部分組成：基質輔助雷射解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質量分析器(TOF)。MALDI的原理是用雷射照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從雷射中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，實現對離子的檢測。
由此，能夠精確、高效地對延伸產物進行分子量檢測。發明人驚奇地發現，通過MALDI-TOF質譜檢測甚至可以實現對DNA樣品中雜合突變或純合突變的檢測。根據本發明的一個實施例，在對延伸產物進行MALDI-TOF質譜檢測之前，進一步包括對所述延伸產物進行純化的步驟。由此，可以進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。根據本發明的具體實例，利用陰離子樹脂對所述延伸產物進行純化。由此，能夠更進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。
S400：最後，基於所檢測獲得的延伸產物分子量，確定所述預定位點的突變類型。由於延伸反應是以包含預定位點的擴增產物為模板，並且進行延伸反應的延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點，並且在進行延伸反應時使用ddNTP作為原料，因而可以保證延伸反應可以僅延伸一個鹼基，即對應預定的位點，基於各個不同鹼基的分子量存在較為顯著的區別，因而，通過對延伸產物的分子量進行檢測，可以通過所獲得的延伸產物的分子量，來確定在預定位點是否發生了突變，以及所發生突變的類型。需要說明的是，這裏的分析可以是通過將延伸產物的分子量與標準參照進行比較來獲得。這裏使用的術語「標準參照」可以是預先對具有已知突變的樣品進行平行試驗獲得的分子量數值。
與現有技術相比，根據本發明實施例的方法至少具有下列優點之一：(1)使用的試劑耗材相對簡單且穩定，不需要螢光染料、特殊的酶等價格昂貴的試劑；(2)反應可以在微量體系中進行，減少了樣品和各種消耗品的使用；(3)由於質譜技術直接檢測DNA的分子量(質荷比)且直接確定鹼基的類型(即，不需要經過任何形式的信號轉換)，因此，理論上只要有一個拷貝的突變片段例如單核苷酸多態性(SNP)被擴增即可識別，從而杜絕了假陽性發生的可能； (4)質譜技術還有自動化、高通量檢測等特點，因此，質譜技術與多引子延伸技術結合使用，可以在一個反應體系中同時檢測多個耳聾突變位點，結合DNA自動提取設備、多重PCR引子設計軟體及數據分析軟體，大大減輕工作量，提高檢測通量，並降低檢測費用；(5)與基因序列測定相比具有操作簡便、結果準確、通量高、價格低廉的優點。
用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統
根據本發明的第二方面，本發明提出了一種用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統。參考第2圖，根據本發明的實施例，該用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統1000包括：DNA樣品擴增裝置100、擴增產物延伸裝置200、分子量檢測裝置300以及突變分析裝置400。
根據本發明的實施例，DNA樣品擴增裝置100用於對DNA樣品進行PCR擴增，以便獲得包含預定位點的擴增產物。根據本發明的一個實施例，DNA樣品擴增裝置100內設置有擴增引子對，所述擴增產物延伸裝置200內設置有延伸引子。由此，便於DNA樣品擴增裝置100和擴增產物延伸裝置200分別對DNA樣品進行擴增，和進行寡核苷酸延伸反應。如前所述，根據本發明的實施例，DNA樣品擴增裝置100不受特別限制，其可以是任何適於對DNA樣品進行擴增的裝置。根據本發明的一個實施例，可以採用已知的PCR 裝置作為DNA樣品擴增裝置100。另外，根據本發明的實施例，可以在DNA樣品擴增裝置100中預先設置擴增引子對，由此可以方便進行操作。本領域具有通常知識者可以根據所要進行分析的位點來確定可以採用的擴增引子序列。根據本發明的一個實施例，所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種。關於這些突變，在前面已經進行了詳細描述，在此不再贅述。針對這些突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)作為擴增引子對。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型。需要說明的是，在本發明中所使用的術語「相連」應做廣義理解，其可以是直接相連，也可以是通過媒介間接相連，只要可以實現功能上的銜接即可。
根據本發明的實施例，擴增產物延伸裝置300與DNA樣品擴增裝置100相連，以便從DNA樣品擴增裝置100接收擴增產物，並且對擴增產物進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子 的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點。根據本發明的一個實施例，可以進一步包括擴增產物淨化裝置(圖中未示出)，擴增產物淨化裝置可以分別與DNA樣品擴增裝置100和擴增產物延伸裝置200相連，以便對擴增產物進行淨化處理，並將經過淨化的擴增產物輸入至擴增產物延伸裝置200。由此，可以除去擴增產物中殘存的dNTP，從而可以提高後續延伸反應的效率，進而能夠實現高效地檢測DNA樣品中預定位點的突變。
根據本發明的實施例，分子量檢測裝置300可以與擴增產物延伸裝置200相連，以便確定所述延伸產物的分子量。根據本發明的一個實施例，所述分子量檢測裝置為MALDI-TOF質譜裝置。由此，能夠精確、高效地對延伸產物進行分子量檢測，發明人驚奇地發現通過MALDI-TOF質譜檢測甚至可以實現對樣品中雜合突變或純合突變的檢測。根據本發明的一個實施例，進一步包括延伸產物純化裝置(圖中未示出)。延伸產物純化裝置可以分別與擴增產物延伸裝置200和MALDI-TOF質譜裝置300相連，以便對延伸產物進行純化處理，並將經過純化的延伸產物輸入至所述MALDI-TOF質譜裝置。由此，可以進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。根據本發明的一個實施例，所述延伸產物純化裝置為陰離子樹脂。由此，能夠更進一步提高MALDI-TOF質譜檢測的精確度，從而提高檢測DNA樣品中預定位點的突變的效率和精確度。
根據本發明的實施例，突變分析裝置400可以與分子量檢測裝置300相連，基於所得到的延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。根據本發明的實施例，突變分析裝置400可以與存有標準參照，通過將延伸產物的分子量與標準參照進行比較可以得出是否存在突變以及突變類型的結論。這裏使用的術語「標準參照」可以是預先對具有已知突變的樣品進行平行試驗獲得的分子量數值。另外，根據本發明的實施例，突變分析裝置400還可以適於進行各種統計檢驗分析，以便實現更精確更準確地分析。
由此，利用根據本發明實施例的系統，能夠有效地實施根據本發明實施例的檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法，從而有效地確定DNA樣品中預定位點的突變。需要說明的是，上面所提到的各個裝置的功能可以在相同的容器內完成，只要能夠實現上述功能即可。
應用
根據本發明的實施例，確定DNA樣品中預定位點的突變的方法可以應用於多種與基因突變相關的檢測。例如，可以有效地對實驗室中構建的突變體的突變類型進行檢測。
根據本發明的實施例，還可以將上述方法應用於診斷遺傳性耳聾的方法、產前診斷遺傳性耳聾的方法、產前診斷遺傳性耳聾的方 法。
具體地，根據本發明的一個方面，本發明提出了一種診斷遺傳性耳聾的方法。根據本發明的實施例，診斷遺傳性耳聾的方法包括以下步驟：提取懷疑患有遺傳性耳聾的受試者的DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中預定位點的突變的方法，對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述受試者患有遺傳性耳聾，其中，所述預定位點的突變為表3中所列出的突變的至少一種。由此，根據本發明實施例的診斷遺傳性耳聾的方法，能夠有效地診斷受試者是否屬於遺傳性耳聾，並且能夠輔助確認耳聾的病因，進而能夠針對病因採用相應的治療和輔助措施。根據本發明的實施例，可以採用的DNA樣品的類型並不受特別限制，可以採用受試者的全基因組DNA，也可以採用來自於包含特定基因的DNA片段，這裏所說的特定基因指的是耳聾相關基因。根據本發明的實施例，針對表3中所列出的突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以高效地確定受試者是否患有遺傳性耳聾。關於各步驟的細節，可以參見前面的相關描述，在此不再贅述。
進一步，本發明提出了一種產前診斷遺傳性耳聾的方法。根據本發明的實施例，該產前診斷遺傳性耳聾的方法包括以下步驟：分 離胎兒DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中預定位點的突變的方法，對所述胎兒DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於所述胎兒DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述胎兒患有遺傳性耳聾，其中，所述預定位點的突變為表3中所列出的突變的至少一種。由此，根據本發明實施例的診斷遺傳性耳聾的方法，能夠輔助推測胎兒患有遺傳性耳聾，並且能夠輔助確認耳聾的病因，進而能夠針對病因採用相應的治療和輔助措施。針對表3中所列出的突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以推測胎兒是否患有遺傳性耳聾。根據本發明的實施例，可以採用的DNA樣品的類型並不受特別限制，可以採用胎兒的全基因組DNA，也可以採用來自於胎兒的包含特定基因的DNA片段，這裏所說的特定基因指的是耳聾相關基因。根據本發明的實施例，胎兒基因組DNA的來源不受特別限制。根據本發明的一個實施例，胎兒全基因組DNA是從孕婦的絨毛膜、羊水或臍帶血中提取的。由此，可以在孕早期就能夠有效推測胎兒是否患有遺傳性耳聾。另外，根據本發明的一個實施例，也可以通過從孕婦的外周血中分離來自於胎兒的游離核酸，作為進行耳聾相關檢測的DNA樣品。
根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種預測電子耳蝸效果的方法。根據本發明的實施例，該預測電子耳蝸效果的方法包括以下步驟：提取耳聾患者的DNA樣品；根據前述確定DNA樣品中 預定位點的突變的方法，對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；基於所述DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述耳聾患者患有遺傳性耳聾；基於所述耳聾患者患有遺傳性耳聾，預測電子耳蝸對於所述耳聾患者有效，其中，所述預定位點的突變為表3中所列出的突變的至少一種。由此，可以通過確定耳聾患者的病因，來確定是否可以採用電子耳蝸來輔助耳聾患者獲得聽力。針對表3中所列出的突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合，能夠非常有效地檢測所列出的突變類型，從而可以預測耳聾患者是否具有殘餘的螺旋神經節，以便在沒有對疾病進行治療的前提下，採用電子耳蝸繞過受損的毛細胞直接利用電流刺激聽神經從而重建聽覺。根據本發明的實施例，可以採用的DNA樣品的類型並不受特別限制，可以採用胎兒的全基因組DNA，也可以採用來自於胎兒的包含特定基因的DNA片段，這裏所說的特定基因指的是耳聾相關基因。
試劑盒
本發明還提出了一種試劑盒，其中，包括：擴增引子對以及延伸引子。根據本發明的實施例，擴增引子對適於對DNA進行PCR擴增反應，以便獲得包含預定位點的擴增產物，延伸產物適於利用ddNTP，以所得到的擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點，所述預定位點的突變為表3中所 列出的突變的至少一種。針對表3中所列出的突變，可以採用表1和表2中所列出的引子組合(前面已有詳細描述，在此不再贅述)分別作為擴增引子對和延伸引子。本發明的發明人驚奇地發現通過使用上述的引子組合製備的延伸產物，能夠非常有效地用於檢測所列出的突變類型，從而可以高效地確定遺傳性耳聾。根據本發明的一個實施例，利用該試劑盒，可以有效地實施前述的根據本發明實施例的檢測DNA樣品中預定位點的突變、診斷遺傳性耳聾、產前診斷遺傳性耳聾、以及預測電子耳蝸效果的方法。根據本發明的實施例，本發明還提出了一組可以用於上述試劑盒的引子組合。利用該引子組合，可以有效地檢測DNA樣品中預定位點的突變、診斷遺傳性耳聾、產前診斷遺傳性耳聾、以及預測電子耳蝸效果的方法。
下面根據具體的實施例對本發明進行說明。需要說明的是，這些實施例僅僅是為了說明本發明，而不應以任何方式解釋為對本發明的限制。另外，除非特別說明，在下面的實施例中所涉及的方法為常規方法，所涉及的材料和製劑也為市售可得的。
實施例1 ①引子設計
根據所選擇的待檢測和/或分型的耳聾基因突變位點20個，包括4個基因，分別是：GJB2基因(包含位點35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT與235delC)、GJB3基因(包含位點538C>T與547G>A)、SLC26A4基因(包含位點281C>T、589G>A、 919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G與IVS15+5G>A)與mtDNA的1494C>T與1555A>G。
根據突變位點的位置和基因型設計擴增引子對和一條延伸引子，其中擴增引子的長度在30個鹼基左右，其擴增引子在5'端具有10個鹼基acgttggatg的標簽序列；延伸引子的長度為17-28個鹼基，允許5'端有1-5個鹼基與模板不完全配對，並且3'末端鹼基與突變位點3'端相鄰鹼基完全匹配。另外，不同位點的延伸引子與延伸產物、延伸產物與延伸產物間的分子量差異不小於30D。本發明設計的針對上述20個耳聾基因突變位點的擴增引子參見表1(在第一序列和第二序列的5’端均帶有標簽序列acgttggatg)，延伸引子參見表2。
②DNA提取
收集正常人血液樣本和臨床收集的8份臨床血液樣品(命名為臨床樣本1-8)，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。DNA溶於水中作為模板DNA，濃度統一調整為50ng/μL。
③PCR擴增
通過PCR擴增，獲得靶序列PCR擴增產物。PCR擴增反應體系參見表4。其中，所有試劑購買自美國Sequenom公司，PCR儀為GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module。
PCR反應條件為94℃，2分鐘；94℃變性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共擴增45循環；最終72℃延伸5分鐘。在本實施例中，使用的模板是已知位點299_300delAT、281C>T、1229C>T、IVS15+5G>A、2168A>G與1494C>T出現突變的人類基因組DNA，陽性對照是已知序列的正常的人類基因組DNA，陰性對照是無菌雙蒸水。
④SAP處理
通過SAP酶(蝦鹼性磷酸酶)處理，除去步驟③獲得的擴增產物中含有的dNTP，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基。SAP酶反 應體系見下表5。所有試劑購買自美國Sequenom公司，PCR儀為GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module。
其中，SAP酶及SAP酶緩衝液來自iPLEX® Gold Reagent Kit 384。
SAP酶反應條件為37℃溫育40分鐘，以去除PCR擴增反應中剩餘的dNTP；85℃溫育5分鐘，以使SAP酶失活。
⑤延伸反應
以④中獲得的PCR擴增產物為模板，通過延伸反應，在延伸引子的3’端連接一個鹼基，從而得到延伸產物。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個鹼基，又能使整個系統的分辨率提高。延伸反應體系見表6。所有試劑購買自美國Sequenom公司，PCR儀為GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module。
其中，iPLEX酶、iPLEX ddNTP混合物及iPLEX緩衝液來自iPLEX® Gold Reagent Kit 384。
＊其中延伸引子混合物按照各引子的分子量大小進行線性關係 調整(即，根據每種延伸引子的分子量計算每種引子的使用量)，以達到最優的延伸反應，獲得最優的質譜峰圖。
延伸反應條件為94℃，30秒；94℃變性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共擴增40個循環，且在每個循環中退火和延伸進行5個小循環；最終72℃延伸3分鐘。
⑥樹脂純化
採用樹脂(型號08040，購買自美國Sequenom公司)純化步驟⑤獲得的延伸產物。在延伸產物中加入6 mg樹脂，18.00微升水，垂直搖勻40 min。經過本步反應後，樹脂將與反應體系中的陽離子充分結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成後的純化產物可在4℃保存數天，也可在-20℃保存數周。所得的純化產物在4000 rpm離心5分鐘後，取上清直接用於質譜檢測。
⑦質譜檢測
通過點樣儀(型號MassARRAY Nanodispenser RS1000，購買自美國Sequenom公司)把經步驟⑥化後的延伸產物轉移到384孔spectroCHIP Ⅱ晶片上，晶片基質與產物共結晶，該晶片在Sequenom MALDI-TOF質譜儀(型號MassARRAY Analyzer Compact，購買自美國Sequenom公司)上進行質譜檢測，從而確定待檢測突變位點的基因型。
質譜檢測結果顯示於第3圖至第8圖中。
第3圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：36對測試樣本位點 299_300delAT進行檢測的結果。從第3A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6545.3處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型AT(樣本來源於正常人)，結果與實際一致。從第3B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6545.3和6561.3處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合缺失突變(樣本來源於臨床樣本1)，結果與實際一致。從第3C圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6561.3處檢測到峰，所述峰經分析確認為純合缺失突變(樣本來源於臨床樣本2)，結果與實際一致。
第4圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：40對測試樣本位點281C>T進行檢測的結果。從第4A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6121處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型C(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第4B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6121與6200.9處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合CT(樣本來源於臨床樣本3)，結果與實際一致。
第5圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：41對測試樣本位點1229C>T進行檢測的結果。從第5A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7053.6處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型C(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第5B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7053.6與7133.5處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合CT(樣本來源於臨床樣本4)，結果與實際一致。
第6圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：46對測試樣本位點IVS15+5G>A進行檢測的結果。從第6A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7961.3處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型G(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第6B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7961.3與8041.2處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合GA(樣本來源於臨床樣本5)，結果與實際一致。
第7圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：50對測試樣本位點2168A>G進行檢測的結果。從第7A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7413.7處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型A(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第7B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量7333.8與7413.7處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合AG(樣本來源於臨床樣本6)，結果與實際一致。
第8圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：51對測試樣本位點1494C>T進行檢測的結果。從第8A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5925.9處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型C(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第8B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6005.8處檢測到峰，所述峰經分析確認為突變純合T(樣本來源於臨床樣本7)，結果與實際一致。
實施例2 ①引子設計
根據所選擇的待檢測和/或分型的耳聾基因突變位點14個，分布於3個基因中，分別是：GJB2基因(包含位點299_300delAT與235delC)、SLC26A4基因(包含位點281C>T、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G與IVS15+5G>A)與mtDNA的1494C>T與1555A>G。本發明設計的針對上述14個耳聾基因突變位點的擴增引子選自實施例1設計的擴增引子(參見表7)。本發明設計的針對上述14個耳聾基因突變位點的延伸引子選自實施例1設計的延伸引子(參見表8)。
後續實驗步驟(即：DNA提取、PCR擴增、SAP處理、延伸反應、樹脂純化和質譜檢測)與實施例1相同，不同的是使用的模板是已知位點235delC、1226G>A、2027T>A與1555A>G出現突變的人類基因組DNA(正常人樣品和臨床樣本8-11)。
質譜檢測結果顯示於第9圖至第12圖中。
第9圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：37對測試樣本位點235delC進行檢測的結果。從第9A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5449.6處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型C(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第9B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5449.6與5529.5處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合缺失突變(樣本來源於臨床樣本8)，結果與實際一致。
第10圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：44對測試樣本位點1226G>A進行檢測的結果。從第10A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5304.5處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型G(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第10B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5288.5與5304.5處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合GA(樣本來源於臨床樣本9)，結果與實際一致。
第11圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：48對測試樣本位點2027T>A進行檢測的結果。從第11A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5355.5處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型G(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第11B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5355.5與5411.4處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合GA(樣本來源於臨床樣本10)，結果與實際一致。
第12圖顯示了使用延伸引子SEQ ID NO：52對測試樣本位點1555A>G進行檢測的結果。從第12A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6394.1處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型A(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第12B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6314.2處檢測到峰，所述峰經分析確認為突變純合G(樣本來源於臨床樣本11的樣本來源)，結果與 實際一致。
實施例3 ①引子設計
根據所選擇的待檢測和/或分型的耳聾基因突變位點4個，分布於3個基因中，分別是：GJB2基因(包含位點235delC)、SLC26A4基因(包含位點919-2A>G)與mtDNA的1494C>T與1555A>G。本發明設計的針對上述4個耳聾基因突變位點的擴增引子參見表9，延伸引子參見表10。
後續實驗步驟(即：DNA提取、PCR擴增、SAP處理、延伸反應、樹脂純化和質譜檢測)與實施例1相同，不同的是使用的模板是已知位點919-2A>G與1555A>G出現突變的人類基因組DNA(正常人樣品和臨床樣本12-13)。
質譜檢測結果顯示於第13圖至第14圖中。
第13圖為使用延伸引子SEQ ID NO：42對測試樣本位點919-2A>G進行檢測的結果。從第13A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5825.7處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型A(樣 本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第13B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5745.8與5825.7處檢測到峰，所述峰經分析確認為雜合AG，結果與實際一致。從第13-3圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量5745.8處檢測到峰，所述峰經分析確認突變純合G(樣本來源於臨床樣本13)，結果與實際一致。
第14圖為使用延伸引子SEQ ID NO：52對測試樣本位點1555A>G進行檢測的結果。從第14A圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6394.1處檢測到峰，所述峰經分析確認為野生型A(樣本來源同第3A圖的樣本來源)，結果與實際一致。從第14B圖可知，MALDI-TOF質譜檢測在分子量6314.2處檢測到峰，所述峰經分析確認為突變純合G(樣本來源於臨床樣本13)，結果與實際一致。在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
儘管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通具有通常知識者可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由申 請專利範圍及其等同物限定。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
100‧‧‧DNA樣品擴增裝置
S100‧‧‧步驟
200‧‧‧擴增產物延伸裝置
S200‧‧‧步驟
300‧‧‧分子量檢測裝置
S300‧‧‧步驟
400‧‧‧突變分析裝置
S400‧‧‧步驟
1000‧‧‧用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面圖式對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：第1圖是根據本發明一個實施例的檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法的流程示意圖；第2圖是本發明一個實施例的用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統的示意圖；第3A圖、第3B圖、第3C圖、第4A圖、第4B圖、第5A圖、第5B圖、第6A圖、第6B圖、第7A圖、第7B圖、第8A圖、第8B圖、第9A圖、第9B圖、第10A圖、第10B圖、第11A圖、第11B圖、第12A圖、第12B圖、第13A圖、第13B圖、第13C圖、第14A圖、第14B圖是根據本發明實施例的檢測遺傳性耳聾相關基因突變的質譜檢驗結果。
<110> 深圳華大基因科技有限公司深圳華大基因研究院
<120> 檢測DNA樣品中預定位點的突變的試劑盒、方法及應用
<130> PIDC111512
<160> 53
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
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<223> 用於擴增位點35delG的擴增引物
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<223> 位點1975G>C的延伸引物
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<223> 位點2162C>T的延伸引物
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<223> 標簽序列
<400> 53
S100‧‧‧步驟
S200‧‧‧步驟
S400‧‧‧步驟
S500‧‧‧步驟

Claims (10)

  1. 一種檢測DNA樣品中預定位點的突變的方法，其中，包括以下步驟：使用擴增引子對所述DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；使用延伸引子以及ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點；對所述延伸產物進行分子量檢測，以便獲得所述延伸產物的分子量；以及基於所述延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，通過MALDI-TOF質譜檢測對所述延伸產物進行分子量檢測。
  3. 一種用於檢測DNA樣品中預定位點的突變的系統，其中，包括：DNA樣品擴增裝置，所述DNA樣品擴增裝置，用於對所述DNA樣品進行PCR擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含所述預定位點；擴增產物延伸裝置，所述擴增產物延伸裝置與所述DNA樣品擴增裝置相連，以便從所述DNA樣品擴增裝置接收擴增產物，並且對所述擴增產物進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊 鄰所述預定位點；分子量檢測裝置，所述分子量檢測裝置與所述擴增產物延伸裝置相連，以便確定所述延伸產物的分子量；以及突變分析裝置，所述突變分析裝置基於所述延伸產物的分子量，確定所述預定位點的突變類型。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之系統，其中，所述分子量檢測裝置為MALDI-TOF質譜裝置。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之系統，其中，進一步包括延伸產物純化裝置，其中，所述延伸產物純化裝置分別與所述擴增產物延伸裝置和所述MALDI-TOF質譜裝置相連，以便對所述延伸產物進行純化處理，並將經過純化的延伸產物輸入至所述MALDI-TOF質譜裝置。
  6. 一種診斷遺傳性耳聾的方法，其中，包括以下步驟：提取懷疑患有遺傳性耳聾的受試者的DNA樣品；如申請專利範圍第1或2項所述的方法對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於所述DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述受試者患有遺傳性耳聾。
  7. 一種產前診斷遺傳性耳聾的方法，其中，包括以下步驟： 分離胎兒的DNA樣品，較佳所述胎兒的DNA樣品是從絨毛膜、羊水或臍帶血取樣中提取的；如申請專利範圍第1或2項所述的方法對所述胎兒的DNA樣品中預定位點的突變進行分析；以及基於所述胎兒的DNA樣品中存在所述預定位點的突變，推測所述胎兒患有遺傳性耳聾。
  8. 一種預測電子耳蝸效果的方法，其中，包括以下步驟：提取耳聾患者的DNA樣品；如申請專利範圍第1或2項所述的方法對所述DNA樣品中預定位點的突變進行分析；基於所述DNA樣品中存在所述預定位點的突變，確定所述耳聾患者患有遺傳性耳聾；以及基於所述耳聾患者患有遺傳性耳聾，預測電子耳蝸對於所述耳聾患者有效。
  9. 一種引子組合，其中，包括：擴增引子對，所述擴增引子對適於對DNA樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，所述擴增產物包含預定位點；以及延伸引子，所述延伸產物適於利用ddNTP，以所述擴增產物為模板，進行寡核苷酸延伸反應，以便獲得在所述延伸引子的3’端連接一個鹼基的延伸產物，其中，所述延伸引子的3’端緊鄰所述預定位點， 所述預定位點的突變為選自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一種基因的突變，所述GJB2基因的突變為選自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一種，所述GJB3基因的突變為選自位點538C>T和547G>A的至少一種，所述SLC26A4基因的突變為選自281C>T、589G>A、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A的至少一種，以及所述mtDNA的突變為選自1494C>T和1555A>G的至少一種，所述擴增引子包括第一引子和第二引子，其中，針對所述GJB2基因的35delG突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：1所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：33所示；針對所述GJB2基因的167delT突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：3所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：4所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：34所示；針對所述GJB2基因的176-191del16突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：5所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：35所示：針對所述GJB2基因的299_300delAT突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：7所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：36所示；針對所述GJB2基因的235delC突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：9所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：10所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：37所示；針對所述GJB3基因的538C>T突變，所述第一引子 為如SEQ ID NO：11所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：38所示；針對所述GJB3基因的547G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：13所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：39所示；針對所述SLC26A4基因的281C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：15所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：40所示；針對所述SLC26A4基因的589G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：17所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：41所示；針對所述SLC26A4基因的919-2A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：19所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：42所示；針對所述SLC26A4基因的1174A>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：43所示；針對所述SLC26A4基因的1226G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：44所示；針對所述SLC26A4基因的1229C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：21所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：45所示；針對所述SLC26A4基因的1975G>C突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：25所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：47所示；針對所述SLC26A4基因的2027T>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：25所示， 所述第二引子為如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：48所示；針對所述SLC26A4基因的2162C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：27所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：49所示；針對所述SLC26A4基因的2168A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：27所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：50所示；針對所述SLC26A4基因的IVS15+5G>A突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：23所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：24所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：46所示；針對所述mtDNA基因的1494C>T突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：29所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：51所示；以及針對所述mtDNA基因的1555A>G突變，所述第一引子為如SEQ ID NO：31所示，所述第二引子為如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引子為如SEQ ID NO：52所示。
  10. 一種試劑盒，其中，包括：申請專利範圍第9項所述的一種引子組合，所述試劑盒用於選自檢測DNA樣品中預定位點的突變、診斷遺傳性耳聾、產前診斷遺傳性耳聾、以及預測電子耳蝸效果的至少一種。
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