KR101474914B1

KR101474914B1 - 열구 저항성 양배추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101474914B1
Application number: KR1020140062417A
Authority: KR
Inventors: 임용표; 나종현; 최수련; 방문성
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-12-19

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

Description

열구 저항성 양배추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 {Primer set, method and kit for selecting head splitting-resistant cabbage cultivar}

본 발명은 양배추 품종의 열구 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종에서 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종에서 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종에서 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 키트에 관한 것이다.

양배추는 십자화과에 속하는 작물로서 전세계적으로 재배되고 이용되는 경제적 가치가 큰 식물 중 하나이다. 이러한 양배추는 포기(head)를 수확하여 식용으로 사용하고 있는데, 포기가 정상적인 모습을 갖추어야 양배추 성장이 잘 될 뿐 아니라 상업적 가치가 있다. 재배 과정 중 재배초기에 포기 열구(쪼개짐) 현상이 일어나서 양배추가 제대로 성숙하지 못하거나 성숙 만기에 도달하였을 때 열구 현상이 일어나게 되어 양배추의 상품성을 떨어뜨림으로써 경제적 큰 손실을 가져온다. 따라서 이같은 열구 현상이 일어나지 않는 품종이 상업적으로 유용한 양배추 품종이다. 이에, 열구에 대한 저항성을 가지는 양배추 품종을 육성하기 위해서 열구와 연관된 분자표지의 개발이 요구되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1095220호에는 뿌리혹병 저항성 배추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0130199호에서는 내서성 양배추 품종의 조기 선발을 위한 분자표지 개발 및 이의 이용이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 양배추 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 양배추의 열구(head splitting) 저항성 계통과 발현성 양배추 계통을 이용하여 만든 분리집단을 육성 및 표현형 검정하여 유전자 좌를 탐색하고, 상기 유전자 좌에 위치하는 열구 저항성과 연관된 유전체 단편을 분리한 후, 상기 유전체 단편들의 염기서열을 분석함으로써, 열구 저항성과 이병성에 차이를 나타낼 수 있는 프라이머 쌍을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 양배추의 포기 열구 저항성 검출용 프라이머 세트는 포기 열구 저항성과 발현성에 있어 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는바, 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고, 정적으로 양배추의 포기 열구 저항성 품종을 검출, 선별 또는 육성하는데 유용할 뿐만 아니라, 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따른 분자표지 및 본 발명에서 제공하는 양배추 품종 선별 방법은 포기 열구로 인한 양배추 작물의 수율 손실 및 상품성이 저하되는 것을 방지할 수 있어 양배추 육종농가의 수입을 증가시키는데도 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 두 분자표지(BRMS137 및 BRPGM0676)를 포함하는 양배추 유전자 지도를 나타낸다.
도 2는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍으로 증폭한 PCR 산물의 분자표지(BRMS137)를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림을 나타낸다(747: 열구, 748: 열구 저항).
도 3은 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 증폭한 PCR 산물의 분자표지(BRPGM0676)를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림을 나타낸다(747: 열구, 748: 열구 저항).
도 4는 수확 직후(A)와 가식부위만 남긴 후(B), 열구 및 열구 저항 현상이 일어난 양배추의 사진을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 또는 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 또는 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 또는 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.

본 발명의 프라이머 세트는 열구에 대한 저항성인 양배추 품종을 선별하기 위한 분자표지로 이용된다. 상기 분자표지를 개발하기 위해, 양배추의 열구 저항성 계통과 발현성 양배추 계통을 이용하여 만든 분리집단을 육성 및 표현형 검정하여 유전자좌를 탐색하고, 상기 유전자좌에 위치하는 열구 저항성과 연관된 분자표지(유전체 단편)를 분석하였다. 최종적으로 상기 분자표지의 염기서열을 분석함으로써, 열구 저항성과 발현성에 차이를 나타낼 수 있는 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 선발하였다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은

양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 폴리머라제를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 되며, 이렇게 표지 된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 증폭 산물의 검출 단계에서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 마커 BRMS137을 탐지하여 약 250-300bp 크기의 PCR 산물을 생성하며, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 마커 BRPGM0676을 탐지하여 약 200bp 크기의 PCR 산물을 생성한다. 증폭 산물을 전기영동함으로써 열구 저항성과 발현성 양배추 품종을 구별할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명에서 용어 "열구 저항성"과 "열구 발현성"은 열구 현상을 보이지 않는 것과 열구 현상을 보이는 것을 각각 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 저항성 계통과 발현성 계통을 이용한 분리집단 F2와 F3 육성 및 열구 표현형 검정

열구 현상을 심하게 보이는 발현성 계통 747과 열구에 대한 저항성을 나타내는 저항성 계통인 748를 교배하여 얻은 잡종 1세대 F1을 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하여 585개체를 선택하였고, 상기 F2를 자가 수정하여 분리집단 F3을 육성하였다. F2 집단의 표현형 검정을 해본 결과 총 개체수 585개에서 열구저항(non splitting type) 426개, 열구(splitting type) 159개로 3:1 유사한 비율이 검정되므로 멘델의 유전법칙에 의해 하나의 유전자에 관련됨을 알 수 있었다(표 1).

747 및 748의 교배로 얻은 F2 집단의 표현형 검정결과

F2 총 개체수	열구	열구저항	카이 제곱값	비고
585	159	426	1.48	단일 유전자

실시예 2. 양배추의 유전자 지도 제작 및 열구 저항성에 연관된 분자표지

실시예 1을 통해 얻은 분리집단 F2 및 F3으로부터 잎 조직의 게놈 DNA를 RBC 게놈 DNA 추출 키트(RealBiotech Corp., 대만)를 이용하여 추출한 후, ACMP (Ramchiary et al., 2011, DNA Res. 18:305-320)에서 밝혀진 707개의 EST-SSRs, 앞머리에 "cnu", "nia"(Li et al., 2010, Genome 53:39-47), "BrgMS" 및 "BRPGM"을 붙인 BAC 유래된 2410개의 SSRs, 272개의 IP 표지, 브라시카 나푸스(B. napus), 브라시카 라파(B. rapa), 및 브라시카 올레라케아(B. oleracea)로부터 밝혀진 332개의 다른 SSR 표지(앞머리에 BRAS, CB, MR, OI, Na, Ni, FITO 및 BRMS을 붙인)를 이용하여 양친계통(747, 748)간의 다형성 조사를 하였고, 상기 참고 표지들의 개시된 방법에 따라 SSR 다형성 조사, 표현형 및 점수화(scoring)를 수행하였다. 그 결과 총 276 개의 다형성 표지 좌위를 얻었고, 9개 연관군(linkage group;LG)과 맵핑된 양배추의 유전자 지도를 작성하였다(표 2 참조).

작성된 양배추의 유전자 지도를 이용하여 열구 저항성에 연관된 양적형질유전자좌(quantitative trait loci;QTL) 맵핑을 실시하였다. 그 결과 도 1에서 보이는 양배추의 LG2(chr2)에 위치하는 두 개의 분자표지(BRMS137 및 BRPGM0676)를 선별하였고, 이들의 염기서열을 분석한 후 하기의 표 3에 기재된 프라이머 세트를 제작하였다.

사용된 프라이머 서열

분자표지 이름	프라이머 서열(5'-3')	서열번호
BRMS137	CCTAAAGTCCAAATAGGCGTAACAG	1
BRMS137	GTTTTGTGCACGATTTTACTCAAC	2
BRPGM0676	CGTCATCCCAAAGTAGGTCA	3
BRPGM0676	GCAATTCCACGAGTAGACGA	4

상기 두개의 분자표지(BRMS137 및 BRPGM0676)가 열구 저항성을 판별하는지 여부를 알아보기 위하여 임의로 선발된 F2 및 F3 식물체의 표현형을 조사하고 분자 표지로 유전자형을 비교 분석하였다. 도 2 및 3에서 보는 바와 같이, BRMS137 및 BRPGM0676 분자표지를 통해 열구 저항성과 발현성을 구분하는 것을 확인하였다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Primer set, method and kit for selecting head splitting-resistant cabbage cultivar <130> PN14049 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cctaaagtcc aaataggcgt aacag 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gttttgtgca cgattttact caac 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtcatccca aagtaggtca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaattccac gagtagacga 20

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양배추 품종의 열구에 대한 저항성 여부를 판별하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추 품종의 열구에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 키트.
제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 키트.