CN101487056A - 一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。本发明提供的辅助筛选抗条锈病小麦的引物对，是由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。本发明提供的辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有343bp条带的待测小麦为候选的抗条锈病小麦。本发明还提供了抗条锈病基因YrZH8的分子标记，是序列表的序列3所示的DNA。该分子标记与YrZH84连锁更紧密，可有效地用于小麦抗条锈病分子育种和抗条锈基因YrZH84的克隆。本发明的引物对和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。

背景技术

由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是一种分布广泛的气传病害，几乎在所有小麦主产国家都有发生，冷凉和高海拔地区尤为严重。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，小麦条锈病主要发生在我国的西北和西南地区。从20世纪50年代至今，我国曾发生15次中度流行和7次较大规模小麦条锈病流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行发生面积最大，危害也最重，前两次发病面积达2亿亩以上，后两次发病1.1亿亩以上，分别损失小麦600、300、265和100万吨(万安民等，2002年我国小麦条锈病发生回顾植物保护2003，29：5-8)。最近五年来，我国条锈病每年发生面积均在5500万亩以上，最大年份9000万亩左右，严重威胁着我国小麦安全生产(全国农业技术推广中心张跃进等，2007年全国主要农作物重大病虫发生趋势预报.中国植保导刊，中国植保导刊，2007，2：32-35)。

选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。目前已经命名的小麦抗条锈病基因有44个，分布于41个位点(有3个复等位基因)，这些命名的基因大多是有生理专化性的苗期抗病基因。苗期抗病基因由于其对条锈病害的高抗而深受育种家喜爱，但是当大面积种植抗病基因单一的品种会加速病原菌小种的定向化选择，并哺育优势小种种群的增长，导致抗锈品种在生产上大面积应用几年之后丧失其抗病性。由于“洛类”和“繁6”衍生系的大面积种植导致新致病小种CYR31和CYR32的出现而爆发了2002年的条锈病大流行。由于认识到单一抗病基因的潜在危害，育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Yr5、Yr10、Yr15、Yr24和Yr26，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。

分子标记(包括RFLP、AFLP、RAPD、SCAR、SSR和RGAP)在小麦的基因作图中得到了广泛应用，近年来，利用分子标记定位和标记了20多个小麦抗条锈病基因。

目前，国内外至少已克隆了55个植物抗病基因(R)，虽然这些R基因针对不同的细菌、真菌、病毒、线虫等，但它们编码的蛋白产物却具有惊人的结构相似性，将编码产物具有这些结构的基因序列称之为抗病基因同源序列(RGA)。RGA不仅数量丰富，而且常常成簇排列，有的与抗病基因紧密连锁甚至是抗病基因的一部分。由于RGA存在于大多数植物抗病基因家族中，其编码产物在不同抗病基因中具有同源性，利用它分离克隆基因和寻找与抗病基因连锁的分子标记可能是一条经济、快捷的途径。Chen等(1998)根据抗病基因保守序列NBS、LRR和STK设计引物，在F₆重组自交系中扩增到的多态性条带为单位点遗传，获得的RGA和小麦抗条锈病基因之间存在连锁关系，这种新型指纹技术后来被称为抗病基因同源序列多态性。与已克隆抗病基因同源性较高的RGA可作为探针，筛选抗感分离群体，进行抗病基因的分子标记定位，此技术即为RGAP标记。利用RGAP方法，已成功地为小麦、大麦、大豆、玉米、水稻等的R基因建立了分子标记。小麦上利用RGAP标记已成功地定位了4个抗条锈基因Yr5、Yr9、Yr26和Yr39等。

周8425B是河南省周口市农业科学院创育的矮秆、大穗、抗病骨干亲本，在黄淮地区小麦育种中发挥着重要作用，已育成80多个衍生品种(系)，其中26个新品种通过国家和省级审定，累计推广面积1亿亩以上。李在峰等(Li等，2006)利用26个国内外条锈小种对周8425B进行苗期接种鉴定和抗谱分析，发现周8425B抗国内目前所有条锈流行小种，SSR标记分析发现一个显性抗病新基因，位于7BL染色体上，定名为YrZH84，该抗条锈病基因对我国目前的流行小种都表现抗病，7个7BL上的SSR标记距离抗病基因YrZH84为1.4cM到12.0cM，YrZH84与其两侧最近的SSR标记Xcfa2040-7B和Xbarc32-7B的遗传距离分别为1.4cM和4.8cM(Z.F.Li，T.C.Zheng，R.P.Sing，X.C.Xia，Zheng，Z.H.He，G.Q.Li，S.C.Xu，X.P.Li，G.Y.Yang，2006.Molecular tagging of a novel stripe rustresistance gene YrZH84 in Chinese wheat line Zhou 8425B，TAG，112：1098-1103)。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。

本发明提供的辅助筛选抗条锈病小麦的引物对，是由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对，将该引物对命名为Xrga-1。

本发明还提供了一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有343bp条带的待测小麦为候选的抗条锈病小麦。

所述PCR扩增中，每15μl的PCR反应体系如下：20ng的模板DNA，150μM的dNTPs，0.25U Taq DNA polymerase，序列1所示的引物7pmol、序列2所示的引物7pmol，1.5μl的10×PCR buffer，1.5mM的MgCl₂，用无菌蒸馏水补充反应体系至15μl。所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；随后45个循环：95℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min；最后延伸7min。所述检测扩增产物是对扩增产物进行4％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。

所述引物对在制备辅助筛选抗条锈病小麦的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护含有所述引物对的辅助筛选抗条锈病小麦的试剂盒。

所述引物对、所述方法、所述试剂盒均可应用于小麦育种中。

本发明还保护一种抗条锈病基因YrZH8的分子标记，是序列表的序列3所示的DNA，将其命名为rga-1。所述抗条锈病基因YrZH8位于7BL染色体上，YrZH84与其两侧最近的SSR标记Xcfa2040-7B和Xbarc32-7B的遗传距离分别为1.4cM和4.8cM。具体来说，所述分子标记可用所述引物对扩增周8425B小麦的基因组DNA得到。本发明提供的小麦抗条锈病基因YrZH84的RGAP标记rga-1，连锁距离为0.8cM，比先前的SSR标记更准确。利用该分子标记可以对小麦抗条锈病基因YrZH84进行分子标记辅助选择。

所述分子标记可应用于辅助筛选抗条锈病小麦和/或小麦育种中。

所述条锈病具体可为条锈菌小种条中32号引发的条锈病。

本发明还保护一种辅助检测待测小麦是否为携带抗条锈病基因YrZH8的小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有343bp大小的条带；扩增产物中有343bp大小的条带的待测小麦为候选的携带抗条锈病基因YrZH84的小麦，扩增产物中没有343bp大小的条带的待测小麦为候选的不携带抗条锈病基因YrZH84的小麦。

本发明提供的引物对和分子标记可用于小麦抗条锈病分子育种和抗条锈基因YrZH84的克隆。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为用Xrga-1PCR扩增抗感亲本、F₁群体单株、抗感池和F₂群体单株的结果。

图2为7个SSR标记和rga-1标记与YrZH84基因的连锁图。

图3为rga-1与Rpgg1和Mla部分核苷酸序列比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

所有引物合成均由北京奥科生物公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、Xrga-1和rgga-1的发现

周8425B苗期对条中32表现为中抗(反应型IT＝2)到高抗(IT＝1)，成株期高抗(IT＝1)。中国春苗期和成株期都对条中32高感(IT＝4)。

用周8425B与中国春杂交，获得F₁群体，F₁群体为35个单株。将F₁群体自交得到F₂群体。F₂群体为522个单株。

一、专用引物对的获得

在F₂单株中选取20个苗期反应型为2，且在7BL染色体上的7个与抗病基因连锁的SSR标记基因型均与抗病亲本周8425B一致的单株DNA等量混合，作为抗池。在F₂单株中选取20个苗期反应型为4，且在7BL上的7个SSR标记基因型均与感病亲本中国春一致的单株DNA等量混合，作为为感池。抗池和感池用于筛选与抗病基因连锁的分子标记。

由58条RGA引物自由组合成1711个引物对，用于亲本间和抗感池间多态性筛选，58条RGA引物序列由陈贤明博士(美农部农业研究局)提供(G.P.Yan·X.M.Chen·R.F.Line·C.R.Wellings，Resistance gene-analog polymorphismmarkers co-segregating with the YR5 gene for resistance to wheat stripe rust，Theor Appl Genet(2003)106：636.643)(F.Lin·X.M.Chen，Genetics andmolecular mapping of genes for race-speciWc all-stage resistance andnon-race-speciWc high-temperature adult-plant resistance to stripe rust inspring wheat cultivar Alpowa，Theor Appl Genet(2007)114：1277-1287)。以周8425B、中国春、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR检测。15μl PCR反应体系为：20ng的模板DNA，150μM的dNTPs(TaKaRa公司)，0.25U Taq DNApolymerase(Promega公司)，上、下游引物各7pmol，1.5μl的10×PCR buffer(Promega公司)，1.5mM的MgCl₂(Promega公司)。PCR反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，扩增程序为：95℃预变性5min，随后45个循环：95℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，最后延伸7min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行4％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，步骤如下：取15μl扩增产物，加入3μl变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，94℃变性7min后，立即放入冰水混合物中冷却10min；每份变性的扩增样品5μl，在浓度为4％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果表明：在1711对RGA引物组合中，116对在抗、感池间，抗、感亲本间有一致差异，其中清晰、稳定可重复的引物对40个，全部表现为显性遗传。

用选出的40对引物分别检测60个F₂抗病株(IT＝2)和60个F₂感病株(IT＝4)，交换率在1％以下的仅有1对引物，表现出与抗病基因紧密连锁。该引物对序列如下：

上游引物(NLRR For)：5’-TAGGGCCTCTTGCATCGT-3’(序列表的序列1)；

下游引物(NBS-F1)：5’-GGAATGGGNGGNGTNGGNAARAC-3’(序列表的序列2)。

将该引物对命名为Xrga-1。

二、rga-1的发现

将抗病亲本(周8425B)、感病亲本(中国春)、F₁单株(周8425B/中国春)、抗池、感池、作为样本。分别以各个样本的基因组DNA为模板用引物对Xrga-1进行PCR扩增(PCR扩增体系与扩增程序同步骤一)。将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺电泳，银染显色(具体操作同步骤一)。

样本的检测结果见图1。图1中，P_R为抗病亲本；P_S为感病亲本；F₁为F₁单株；B_R为抗池；B_S为感池；R为抗病的F₂单株；S为感病的F₂单株。结果表明：出现了2种电泳带型；周8425B、抗病池和抗病单株可扩增出343bp的DNA片段；中国春、感病池和感病单株则没有扩增出343bp的DNA片段。

三、rgga-1的鉴定

分别提取522个F₂单株的基因组DNA。分别以各个基因组DNA为模板用Xrga-1进行PCR扩增(PCR扩增体系与扩增程序同步骤一)。将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺电泳，银染显色(具体操作同步骤一)。

结果见表1。

表1 rga-1标记在周8425B/中国春F₂群体中的分离

用软件Mapmaker 3.0b对rga-1和7个SSR标记进行连锁分析，构建连锁图谱，获得一个较高密度的连锁图谱(见图2)。该连锁群位于7BL染色体，抗条锈病基因YrZH84位于RGAP标记rga-1和SSR标记Xcfa2040-7B之间，与这两个标记的遗传距离分别为0.8cM和1.4cM，较原来这一侧最近的SSR标记Xbarc32的4.8cM，相对缩近了4.0cM。

从变性聚丙烯酰胺凝胶上回收343bp的条带，进行PCR扩增(PCR扩增体系与扩增程序同步骤一)，扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶回收后得到大小为343bp的条带，经克隆后，在4％的变性聚丙烯酰胺凝胶上鉴定阳性克隆。随机选取3个阳性克隆进行测序，测序结果表明，3个阳性克隆均含有序列表的序列3所示的核苷酸序列。将序列3所示的核苷酸序列命名为rga-1。

在NCBI上，进行BLAST，结果见图3。结果显示，rga-1与已克隆的大麦抗秆锈病基因Rpg1(GenBank登记号：DQ469713)核苷酸序列一致性为93％，与大麦抗白粉病基因Mla(GenBank登记号：AF427791)同源家族的核苷酸序列相似性为92％。大麦抗秆锈病基因Rpg1，属于丝氨酸/苏氨酸激酶类(STK)的抗病基因，推测与抗条锈病新基因YrZH84紧密连锁的rga-1属于STK类的RGA。

实施例2、Xrga-1和rga-1的应用

周麦11、周麦12、周麦13、周麦16、周麦17、周麦22、矮抗58、04-中36、阜98-46、洛麦22均是周8425B的后代品种(庄巧生主编，中国小麦品种改良及系谱分析，北京/中国农业出版社，2003.1)。

一、检测不同品种小麦是否携带rga-1

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用Xrga-1进行PCR扩增。

15μl PCR反应体系为：20ng的模板DNA，150μM的dNTPs(TaKaRa公司)，0.25U Taq DNA polymerase(Promega公司)，上、下游引物各7pmol，1.5μl的10×PCR buffer(Promega公司)，1.5mM的MgCl₂(Promega公司)。

PCR反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，扩增程序为：95℃预变性5min，随后45个循环：95℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，最后延伸7min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行4％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体操作为：取15μl扩增产物，加入3μl变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，94℃变性7min后，立即放入冰水混合物中冷却10min，每份变性的扩增样品5μl在浓度为4％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果见表3。

二、检测不同品种的小麦的条锈病抗性

小麦品种抗条锈病鉴定于2007年冬在中国农业科学院作物科学研究所温室进行。条锈菌小种(条中32号)(中国农业科学院植物保护研究所)。

以铭贤169为感病对照品种，将供试小麦材料经1％(V/V)H₂O₂浸种催芽24小时，待其萌芽后播种在花盆中，每盆种植10株待测小麦和3株铭贤169。当幼苗一叶一心时，用扫抹法接种繁殖好的小麦条锈菌新鲜菌种。在接种后15天左右，当感病对照铭贤169发病充分时，调查发病情况。各供试材料对条锈病的抗病性以侵染型表示，侵染型采用6级标准(见表2)，即0、0；、1、2、3、4，并以“+”和“-”表示强弱分级标准。0-2⁺型为抗病，3^--4型为感病。检测结果见表3。

表2 小麦条锈病苗期侵染型分级标准

表3 用rga-1分子标记对20个小麦品种的检测结果

注：+表示含有YrZH84基因，-表示不含YrZH84基因。

结果表明：含有抗条锈病基因YrZH84的现有小麦品种都抗条锈病，且都能扩增出343bp的条带。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物

<130>CGGNARY92094

<160>3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(9，12，15，18)

<223>n＝a或c或g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)

<223>r＝a或g

<400>2

<210>3

<211>343

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L)

<400>3

Claims (10)

1、辅助筛选抗条锈病小麦的引物对，是由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

2、一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有343bp条带的待测小麦为候选的抗条锈病小麦。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，每15μl的PCR反应体系如下：20ng的模板DNA，150μM的dNTPs，0.25U Taq DNA polymerase，序列1所示的引物7pmol、序列2所示的引物7pmol，1.5μl的10×PC Rbuffer，1.5mM的MgCl₂，用无菌蒸馏水补充反应体系至15μl；

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；随后45个循环：95℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min；最后延伸7min。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述检测扩增产物是对扩增产物进行4％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。

5、权利要求1所述引物对在制备辅助筛选抗条锈病小麦的试剂盒中的应用。

6、一种辅助筛选抗条锈病小麦的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物对。

7、权利要求1所述引物对、权利要求2至4中任一所述方法、权利要求6所述试剂盒在小麦育种中的应用。

8、抗条锈病基因YrZH8的分子标记，是序列表的序列3所示的DNA。

9、权利要求8所述分子标记在辅助筛选抗条锈病小麦和/或小麦育种中的应用。

10、一种辅助检测待测小麦是否为携带抗条锈病基因YrZH8的小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示的DNA和序列表的序列2所示的DNA作为引物对进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有343bp条带；扩增产物中有343bp条带的待测小麦为候选的携带抗条锈病基因YrZH84的小麦，扩增产物中没有343bp条带的待测小麦为候选的不携带抗条锈病基因YrZH84的小麦。

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