CN101401896B

CN101401896B - 菝葜有效成分的提取方法

Info

Publication number: CN101401896B
Application number: CN2008101688263A
Authority: CN
Inventors: 刘焱文; 干国平; 孙进
Original assignee: FUREN PHARMACEUTICAL Co Ltd HUBEI
Current assignee: FUREN PHARMACEUTICAL Co Ltd HUBEI
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2028-09-28
Also published as: CN101401896A

Abstract

本发明涉及菝葜有效成分及其提取方法，具体步骤包括：菝葜的乙醇提取液浓缩后，加水至一定体积，滤过，滤液过大孔吸附树脂，先用水洗脱，继用乙醇洗脱，浓缩乙醇洗脱液，上清液经喷雾干燥，沉淀经减压干燥，混匀，得提取物。

Description

菝葜有效成分的提取方法

技术领域

本发明涉及一种药用植物有效成分的提取纯化方法，具体涉及一种菝葜有效成分的提取纯化方法及其提取物产品。

背景技术

菝葜为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎。又名金刚藤，为传统中药，《中国药典》2005年版一部收载菝葜具有祛风利湿，解毒散瘀的功效，用于筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多、疔疮痈肿。中医临床除用于治疗妇科疾病外，还用于治疗肿瘤，并取得了很好的疗效。

菝葜属植物化学成分的研究较多，至今已从该属植物中分离得到80余种化合物，其中主要有黄酮类、甾体皂苷类、氨基酸类、鞣质等类型化合物。其中黄酮类化合物和甾体皂苷类化合物是具有明显抗炎药理活性的物质。

菝葜属植物普遍含有黄酮类化合物，现已从该属植物中分离并鉴定了20余种黄酮类化合物，这些黄酮类化合物的基本母核为：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、查尔酮类、儿茶素类。

迄今为止，从菝葜属植物中分离得到30多种甾体皂苷化合物。这些甾体皂苷类化合物，按皂苷元结构不同，可分为三种类型：螺甾烷醇型(spirostanols)、异螺甾烷型(isospirostanols)和呋喃甾烷醇型(furostanols)，主要是螺甾烷醇型化合物。皂苷中所含的糖主要有4种：D—葡萄糖、D—半乳糖、L—鼠李糖、L—阿拉伯糖，它们以不同的方式与皂苷元结合构成种类繁多的皂苷。

菝葜中的黄酮类、皂苷类和鞣质类成分具有良好的抗炎活性，而现有的菝葜有效成分提取纯化方法都存在过程繁琐、成本高、有效成分含量低等弊端。而且同时得到高含量的黄酮类、皂苷类和鞣质类成分的技术也没有报道，因此，现有菝葜有效成分提取纯化技术很难适应产业化的生产工艺要求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种菝葜有效成分的提取纯化方法以及由这种方法获得菝葜有效成分提取物产品。

本发明的菝葜有效成分提取物，经过含量测定，其中总黄酮占35～43％，总皂苷占20～26％，总鞣质占20～26％，三者含量之和为75～95％。测定方法属于现有常规技术。

本发明的菝葜有效成分提取物，若不计算总鞣质，其中总黄酮，总皂苷的含量之和为40～90％。优选50～80％，更优选55～69％，以上所述百分含量为重量/重量百分比，即总黄酮重量占提取物重量的百分比。

本发明的菝葜有效成分提取物，其制备方法为：菝葜用乙醇提取，提取液浓缩后加水，过滤，滤液通过大孔吸附树脂吸附，先用水洗脱，继用乙醇洗脱，浓缩乙醇洗脱液，即得。

优选的制备方法，步骤如下：

a.取菝葜饮片，加6～10倍药材量的40～95％的乙醇提取1～3次，每次60～120分钟，合并乙醇提取液；

b.将乙醇提取液浓缩至无醇味，加蒸馏水使药液体积为2.5～10倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

c.滤液以每小时0.5～3倍柱床体积的流速通过大孔吸附树脂柱，先用2～4倍树脂量的水洗脱除去杂质，再用3～7倍药材量的40～95％的乙醇以每小时0.5～3倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；

d.将洗脱液浓缩至相对密度为1.05，上清液喷雾干燥，沉淀减压干燥，两部分混匀得到菝葜抗炎有效成分提取物。

其中，

步骤a中乙醇浓度优选为60％，其用量为药材的8倍量，提取次数为三次，第一次为2小时，后两次分别为1小时；

步骤b中，加蒸馏水后，药液体积经优选确定为药材量的5倍；

步骤c中，首先优选出滤液以每小时1倍柱床体积的流速通过D101大孔树脂柱进行吸附，然后用3倍树脂量的水洗除杂质，继用5倍药材量的70％的乙醇以每小时1倍柱床体积的流速洗脱树脂上的有效物质。

本发明还包括含有本发明的提取物的药物组合物。以及本发明的提取物在制备一种抗炎药物中的应用。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，软胶囊剂、胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂。

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体可以是：淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素类及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的药物组合物，含0.1-99.9％重量百分比的本发明的提取物，其余为药物可接受的载体。

在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-10片/或粒。

和现有的菝葜提取纯化技术相比，本发明具有以下优势：

1.本发明选择合适浓度的乙醇特别是最优选的浓度进行回流提取，总黄酮和总皂苷的转移率和含量大大提高。

2.本发明选择大孔吸附树脂技术特别是最优选的大孔吸附树脂提取纯化本发明的提取物，具有工艺简单，成本较低，树脂可反复使用，适合工业生产。而且本发明对相应的技术参数进行了细致周密的考察，优选出最佳条件，大大的提高了有效成分的纯度，提取物中总黄酮、总皂苷含量可以达到40％-90％。提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量可以达到75％-95％。

附图说明：

图1 菝葜样品溶液上D101大孔树脂柱吸附总黄酮的泄露曲线

图2 70％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总黄酮的洗脱曲线

图3 70％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总皂苷的洗脱曲线

图4 70％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总鞣质的洗脱曲线

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明方法作进一步的说明。

实施例1 金刚藤有效部位群的提取工艺试验

(1)使用乙醇回流提取法进行实验，采用L₉(3⁴)正交实验法考察乙醇回流提取菝葜总黄酮、总皂苷中乙醇浓度、乙醇用量(菝葜重量的倍数)及提取时间次数等因素的工艺参数，并采用紫外-可见分光光度法对提取物中总黄酮、总皂苷的含量进行测定，并以总黄酮、总皂苷含量及干膏得率为指标进行比较分析。结果见表1，表2，表3。

表1 试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果分析

表3 总黄酮量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00

表4 总皂苷量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00

表5 干膏得率的方差分析

正交试验结果表明(见表1～5)，影响因素最大的为乙醇浓度，其次为提取时间次数，乙醇用量无显著影响，直观分析出最佳工艺为A₁B₂D₃。综上所述，选定最佳工艺条件为：8倍量60％的乙醇提取3次，提取时间分别为2小时，1小时，1小时。

(2)验证试验：取菝葜饮片，共3份，按照优选提取工艺进行验证试验。试验结果见表6。

表6 菝葜总皂苷提取验证试验结果

验证结果表明优选的提取工艺稳定可行。

实施例2 金刚藤有效部位群的大孔树脂纯化工艺实验

用前述优选提取条件提取得到的菝葜提取液进行如下实验：

(1)大孔树脂的筛选实验

树脂来源：D101树脂(天津市海光化工有限公司)，AB-8、HPD100树脂(河北宝沧有限责任公司)。

树脂的筛选结果见表7，表8。

表7 三种树脂静态饱和吸附与解吸附测定结果

表8 三种大孔树脂动态筛选结果

试验结果表明：D101、HPD100两种型号大孔树脂对菝葜总黄酮、总皂苷和总鞣质的比吸附量和洗脱率均较好。但是D101型大孔树脂价格较低，效果较好，而且安全性较高，故本研究选用D101型大孔树脂同时纯化菝葜总黄酮、总皂苷和总鞣质。

(2)D101大孔树脂纯化工艺实验

①吸附条件优选实验

采用正交试验方法以上样流速、药液的浓度(以样品中所含有的原药材量计)及上样药液的pH值作为考察因数，应用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素及水平安排见表9。对以上9组试验分别测定总黄酮含量，并进行评价。分析结果见表9～13。

表9 因素水平表

表10 正交试验结果

表11 菝葜总黄酮量的方差分析

F0.05(2，2)＝19，F0.01(2，2)＝99.00

表12 菝葜总皂苷量的方差分析

F0.05(2，2)＝19，F0.01(2，2)＝99.00

表13 菝葜总鞣质量的方差分析

F0.05(2，2)＝19，F0.01(2，2)＝99.00

方差分析表明，在菝葜总黄酮、总皂苷吸附过程中上样浓度和吸附速度有显著影响，在菝葜总鞣质吸附过程中吸附速度有显著影响，结合直观分析，优选最佳总黄酮、总皂苷和总鞣质的最佳吸附条件为：上样浓度0.2g/ml，吸附流速2BV/H，径比1:8。

②上样量考察

取0.2克/毫升样品溶液，加于20克D101树脂柱上(20毫米×400毫米)，以2倍柱体积/小时的流速通过。每个流分收集10毫升，测定并计算流分中总黄酮的浓度。测定结果见图2。图中可以看出当上样量为80毫升时(约为4倍柱体积)开始泄漏，上样量为400毫升时(约为20倍柱体积)达到吸附饱和状态。

③水洗条件考察

按上述最佳吸附条件进行上样吸附，上样量为80ml，再用水冲洗，每10ml下柱液为1流份，用F_eCL₃反应、Liebermann反应检识，同时测定干膏重，水洗60ml后F_eCL₃反应、Liebermann反应均呈阴性，干膏重量不再变化，结果表明，用60ml水洗(约3倍柱体积)后树脂柱上的糖可以基本除去。

③乙醇洗脱浓度考察

另取20g树脂四份上柱，按上述吸附条件和水洗条件进行吸附和去杂，再各用30％，50％，70％，90％的乙醇100ml，以相同的流速进行洗脱，测定含量及洗脱率，结果见表14、15、16。

表14 菝葜总黄酮乙醇洗脱浓度考察结果

表15 菝葜总皂苷乙醇洗脱浓度考察结果

表16 菝葜总鞣质乙醇洗脱浓度考察结果

以上实验结果表明，采用70％乙醇洗脱时，菝葜总黄酮，总皂苷，总鞣质的解吸率和纯度均较高，本试验选70％乙醇为洗脱溶剂。

④洗脱速率考察

按上述条件进行动态吸附，以70％乙醇为洗脱剂，分别以1，2，4，6倍柱体积/小时的速度洗脱，测定乙醇洗脱物中总黄酮、总皂苷和总鞣质量并计算洗脱率，结果表明洗脱速率为1倍柱体积/小时和2倍柱体积/小时时相差不大，考虑生产效率，选用洗脱速率为2倍柱体积/小时。

⑤乙醇洗脱量考察

按上述条件进行动态吸附，以70％乙醇为洗脱剂进行洗脱，定量收集流出液并测定其中总黄酮、总皂苷和总鞣质的浓度。结果见图3，图4。

结果表明：用100毫升(约5倍树脂量)70％乙醇以2倍柱体积/小时流速可以完全洗脱20g树脂所吸附的黄酮类成分，用80毫升(约5倍树脂量)70％乙醇可以完全洗脱20g树脂所吸附的皂苷类成分，用80毫升(约5倍树脂量)70％乙醇可以完全洗脱20g树脂所吸附的皂苷类和鞣质类成分，因此采用100毫升(约5倍树脂量)70％乙醇以2倍柱体积/小时流速可以完全洗脱20g树脂所吸附的黄酮类、皂苷类及鞣质类成分。

实施例3 中试放大实验

取菝葜饮片，加8倍量60％乙醇加热回流提取3次，第一次2h，第二、三次各1h，合并滤液，减压回收乙醇至一定体积，抽滤得上样药液。

将20kg药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法装柱，处理后备用。

以2BV/h的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以2BV/h的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5倍树脂柱体积的70％乙醇，以2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。

采用紫外—可见分光光度法测量提取物中总黄酮的含量，计算转移率(转移率＝提取物中总黄酮的含量/原药材中总黄酮的含量×100％)和收膏率(收膏率＝提取物总重量/原药材总重量×100％)。

表17 中试实验结果

第一批、第二批、第三批中试分别采用每小时2倍柱体积、每小时1倍柱体积和每小时0.8倍柱体积流速上样，水洗及醇洗脱，结果表明：流速为每小时1倍柱体积时，总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量纯度较高。采用调整后的工艺进行的四批、第五批、第六批中试实验，提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量之和达到75％以上。表明本研究的工艺参数可行，工艺条件经中试进一步调整，可过渡到产业化生产。

实施例4

将15kg药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法装柱，处理后备用。

以2倍柱体积/小时的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以2倍柱体积/小时的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5BV树脂柱体积的60％乙醇，以2倍柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。其中总黄酮占35％，总皂苷20％，总鞣质20％，三者含量之和为75％。

实施例5

将20千克药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法装柱，处理后备用。

以1倍柱体积/小时的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以1倍柱体积/小时的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5BV树脂柱体积的70％乙醇，以1倍柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。其中总黄酮占38％，总皂苷20％，总鞣质20％，三者含量之和为78％。

实施例6

取15千克菝葜饮片，加8倍量60％乙醇加热回流提取3次，第一次2h，第二、三次各1h，合并滤液，减压回收乙醇，加蒸馏水使药液体积为5倍药材量，抽滤得上样药液。

以5倍树脂柱体积/小时的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以5倍树脂柱体积/小时的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5倍树脂柱体积的70％乙醇，以5倍树脂柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。其中总黄酮占40％，总皂苷22％，总鞣质23％，三者含量之和为90％。

实施例7

以5倍树脂柱体积/小时的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以5倍树脂柱体积/小时的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5倍树脂柱体积的70％乙醇，以5倍树脂柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。其中的总黄酮、总皂苷和总鞣质成分的含量之和为85％。

实施例8

以5倍树脂柱体积/小时的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1：8，吸附完毕后，用3BV的蒸馏水，以5倍树脂柱体积/小时的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以5倍树脂柱体积的70％乙醇，以5倍树脂柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液浓缩到相对密度为1.05，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。其中总黄酮占43％，总皂苷26％，总鞣质26％，三者含量之和为95％。

实施例9

菝葜(金刚藤)总黄酮和总皂苷的提取分离纯化工艺

取16kg菝葜药材，用60％的乙醇提取三次(2h、1h、1h)，每次用量128L，提取液回收乙醇至80L，加入4％的明胶溶液11.2L，静置一夜，滤过，滤液以30L/H的速度上D101柱吸附，用纯净水60L洗脱除杂，再用50％的乙醇120L洗脱，流速为60L/H。对洗脱液中总黄酮和总皂苷的量进行测定，将洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10，喷雾干燥，得粉末260g，对粉末进行含量测定，其中总黄酮占35％，总皂苷25％，两者含量之和为60％。

实施例10

菝葜(金刚藤)总黄酮和总皂苷的提取分离纯化工艺

取16kg菝葜药材，用60％的乙醇提取三次(2h、1h、1h)，每次用量128L，提取液回收乙醇至80L，加入4％的明胶溶液11.2L，静置一夜，滤过，滤液以30L/H的速度上D101柱吸附，用纯净水60L洗脱除杂，再用50％的乙醇120L洗脱，流速为60L/H。对洗脱液中总黄酮和总皂苷的量进行测定，将洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10，喷雾干燥，得粉末260g，对粉末进行含量测定，其中总黄酮占40％，总皂苷25％，两者含量之和为55％。

实施例11

菝葜(金刚藤)总黄酮和总皂苷的提取分离纯化工艺

取16kg菝葜药材，用60％的乙醇提取三次(2h、1h、1h)，每次用量128L，提取液回收乙醇至80L，加入4％的明胶溶液11.2L，静置一夜，滤过，滤液以30L/H的速度上D101柱吸附，用纯净水60L洗脱除杂，再用50％的乙醇120L洗脱，流速为60L/H。对洗脱液中总黄酮和总皂苷的量进行测定，将洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10，喷雾干燥，得粉末260g，对粉末进行含量测定，其中总黄酮占43％，总皂苷26％，两者含量之和为69％。

Claims

1.一种菝葜有效成分提取物的制备方法，其中菝葜有效成分提取物的总黄酮，总皂苷和总鞣质的含量之和为75～95％，其特征在于，经过以下步骤，

a.取菝葜饮片，加8倍药材量的60％的乙醇提取3次，第一次2小时，后两次分别为1小时，合并乙醇提取液；

b.将乙醇提取液浓缩至无醇味，加蒸馏水使药液体积为5倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

c.滤液以每小时1倍柱床体积的流速通过D101型大孔树脂柱，然后用3倍树脂量的水洗脱，最后用5倍树脂量的70％的乙醇以每小时1倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；

d.将洗脱液浓缩至相对密度为1.05，上清液浓缩液经喷雾干燥，沉淀减压干燥，两部分混合得到提取物。