CN103897072A - 一种金刚藤多糖提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金刚藤多糖提取物，该提取物中多糖含量大于20%w/w。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明研究发现，金刚藤多糖具有良好的抗炎、活血化瘀、增强免疫的作用，对盆腔炎具有较好的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种金刚藤多糖提取物及其制备方法。
背景技术
随着人们生活节奏的加快，经济水平的提高，人们对生活质量的要求也越来越高。某些慢性疾病不会直接导致生命危险，但由于病情长时间的缠绵不愈、反复发作，也会给人们的生活带来不便和不适，慢性盆腔炎就是这类疾病之一，慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)是指女性生殖器官、周围结缔组织及盆腔腹膜所发生的慢性炎症，是育龄期妇女最常见的生殖器宫炎症之一，具有病程长、病情复杂、复发率高等特点。慢性盆腔炎会导致不孕、宫外孕、异位妊娠、其它妇科炎症，并影响家庭生活。
金刚藤Smilax scobinicaulis C.H.Wright(《西藏常用中草药》)，始载于《名医别录》，云:“菝葜，生山野，二月，八月采根，暴干”，“主腰背寒痛，风痹，益血气，止小便利。“《本草纲目》："治消渴，血崩，下利”。
目前研究者均认为，金刚藤治疗妇科炎症有效成分主要集中在皂苷类和黄酮类两大部位，治疗的病症主要为妇科炎症、附件炎、炎性包块。而现代金刚藤药材的研究也局限于将已有的两种有效成分加工为不同的制剂，在金刚藤相关专利中不难发现各种制剂的物质基础仅有皂苷类和黄酮类两类(如专利申请：200610020853.7、200810030463.7等)，制剂却千变万化，现已有胶囊剂、软胶囊剂、片剂、缓释片、咀嚼片等。
目前还未见对金刚藤多糖类成分的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金刚藤多糖提取物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种金刚藤多糖提取物，该提取物中多糖含量大于20%w/w；
其中，所述金刚藤多糖提取物中，多糖含量为40～95%w/w。
进一步地，金刚藤多糖提取物中，多糖含量为40～60%w/w。
本发明还提供了上述金刚藤多糖提取物的制备方法，它包括如下操作步骤：
（1）取金刚藤，脱脂处理；
（2）脱脂后的金刚藤经水提醇沉，沉淀干燥，即得金刚藤多糖提取物。
其中，步骤（1）中，所述脱脂处理操作为：取金刚藤，采用有机溶剂提取即可；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、氯仿中的一种或两种以上的混合溶剂。
进一步地，所述有机溶剂为乙醇，乙醇浓度为70-95%v/v，优选为75～80%v/v乙醇。
其中，步骤（2）具体操作如下：取药渣，挥干溶剂，加水提取，合并提取液，离心，取上清液，浓缩后，加入乙醇至含醇量为70～80%v/v，低温静置，离心，收集沉淀，干燥，即得金刚藤多糖提取物。
进一步地，步骤（2）中，上清液浓缩至0.3～0.5g生药/ml；95%乙醇加入体积为浓缩液体积的4倍以上。
优选地，步骤（1）的具体操作为：称取金刚藤药材100g，加入8倍量的75%v/v乙醇回流提取3次，提取时间分别为2h、2h、1h，滤过，将药渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃提取2次，每次提取2，合并水提液，离心，将上清液减压浓缩至药液浓度为0.4g生药/ml；
步骤（2）的具体操作为：浓缩液中加入4倍量95%v/v乙醇，充分混合，4℃静置过夜，4000r/min离心10min，收集沉淀，50℃减压干燥，即得金刚藤多糖提取物。
本发明还提供了上述金刚藤多糖提取物在制备抗炎、增强免疫、活血化瘀的药物中的用途。
本发明还提供了上述金刚藤多糖提取物在制备治疗盆腔炎的药物中的用途。
其中，所述盆腔炎包括急性或慢性盆腔炎。
本发明研究发现，金刚藤多糖具有良好的抗炎、活血化瘀、增强免疫活性，对盆腔炎具有较好的治疗作用。
附图说明
图1提取时间对出膏率及提取液中多糖浓度的影响
图2提取次数对出膏率及多糖浓度的影响
图3固液比对出膏率及提取液中多糖总量的影响
图4提取温度对出膏率及多糖含量的影响
图5正常大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图6正常大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
图7模型组大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图8模型组大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
图9阳性组大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图10阳性组大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
图11多糖组大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图12多糖组大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
图13黄酮组大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图14黄酮组大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
图15混合物组大鼠子宫病理形态(HE染色，200×)
图16混合物组大鼠子宫病理形态(HE染色，100×)
具体实施方式
实施例1金刚藤多糖提取物的制备
称取金刚藤药材100g，置于2000ml圆底烧瓶中，加入8倍量的75%乙醇溶液，浸泡过夜，水浴加热回流提取2h，滤过，再加入8倍量75%乙醇回流提取2h，滤过，再加入8倍量的75%乙醇回流提取1h，滤过，将残渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃水浴加热回流提取2h，滤过，再加入12倍量的水，加热回流提取2h，再重复一次，滤过，合并提取液，离心，将上清液减压浓缩至250ml（即药液浓度为0.4g生药材/ml）。
将浓缩液中加入4倍量的95%乙醇，充分混合，4℃静置过夜，离心（4000r/min，10min），收集沉淀，50℃减压干燥，研磨成粉末，即得金刚藤多糖提取物。经测定，该提取物中，多糖含量为41%。
实施例2金刚藤多糖提取物的制备
称取金刚藤药材，粉碎得40-80目金刚藤粗粉，用去离子水浸泡，金刚藤粗粉与去离子水的质量比为1：10-30，加碱调节ｐＨ值至7-10，再于微波条件下提取3-10min，微波功率300-800Ｗ，过滤收集滤液，滤饼重复提取，共提取2-5次，合并每次的滤液收集为提取液；所得的提取液，加酸调节ｐＨ值至2-5，再加入1:2-4乙酸乙酯萃取，搅拌后静置、分层，保留收集下层，重复用乙酸乙酯萃取2-5次，合并所有的下层，收集为保留液；保留液用三氯乙酸溶液调节ｐＨ值至2-3，降低温度至4-10℃，搅拌、静置8-12ｈ后，离心，除去沉淀物，收集上清液；上清液超滤，至浓缩液中多糖质量浓度为5％-15％，超滤膜截留分子量为5000-10000Ｄ，浓缩液中加入体积浓度为95％-100％乙醇水溶液至乙醇体积分数为70％-80％，降温至4-10℃，搅拌、静置12-18ｈ后，离心，收集沉淀物；沉淀物，经减压低温干燥、粉碎，即得金刚藤多糖提取物。经测定，该提取物中，多糖含量为95%。
实施例3金刚藤总黄酮提取物的制备
称取100g金刚藤药材，加入8倍量75%乙醇浸泡过夜，水浴加热回流提取3次，时间为2h、2h、1h，合并提取液，过滤，减压回收乙醇，至无醇味，用纯净水定容至250ml（即0.4g生药材/ml）；上D101大孔吸附树脂，柱体积为250cm3,径高比为1:3，先用2BV的蒸馏水洗脱，再用3BV的70%乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，50℃减压回收乙醇，至一定体积后，转入蒸发皿中，在水浴锅上将溶液挥发至近干，转入50℃减压干燥箱中干燥，干燥后，即得金刚藤总黄酮提取物。经测定，该提取物中黄酮含量为58.7%。
上述总黄酮提取物方法也可参见“金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究，尹玲，湖北中医药大学，2010年”，该类金刚藤总黄酮提取物中除含有黄酮外，还含有公认的金刚藤活性成分——皂苷类。
实施例4金刚藤多糖部位提取的方法学考察
1.1仪器和试剂
紫外-可见分光光度计，型号：UV-1700，SHIMADZU COPORATION公司生产。
葡萄糖标准品(100mg，≥99%)，生产批号：P-012-110821，成都瑞芬思生物科技有限公司生产。
苯酚(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂。
浓硫酸(98.8%，分析纯）：成都市科龙化工试剂厂生产。
1.2方法与结果
1.2.1供试品溶液的配置
精密称取金刚藤药材30g，加入10倍80%乙醇水浴加热回流1.5h，滤过，滤渣挥干，加入10倍水加热回流1.5h，滤过将提取液减压回收溶剂至60ml，加入4倍量95%乙醇4℃沉淀过夜，离心，收集沉淀，50℃减压干燥，研磨成粉，精密称取该多糖粗粉30.22mg，用水溶解，定容至50ml，混匀，作为供试品溶液备用。
1.2.2对照品溶液的配置
精密称取葡萄糖对照品溶液10.34mg，置100ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，配置成0.1034mg/ml葡萄糖对照品溶液配用。
1.2.3显色方法
取一定体积待测样品溶液，加水至2ml，加入1ml5%苯酚溶液，混匀，再迅速加入5ml浓硫酸，混匀，静置10min，在40℃水浴加热15min，冰水浴冷却5min，取出，在490nm处测定吸光度。
1.2.4标准曲线的绘制
分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0.50ml、060ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml置于10ml具塞试管中，用水定容至2ml，按2.2.3显色方法显色，测定吸光度，以对照品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。C标＝10.34/100=0.1034mg/ml
表1葡萄糖对照品标准曲线
线性回归方程为：y=14.89x–0.029，R2=0.999，r=0.999表明葡萄糖在0.026mg·ml-1—0.052mg·ml-1内样品量与吸光度线性关系良好。
1.2.5重复性测定
取同一批号金刚藤粗多糖提取物，照供试品溶液的制备方法制备6份样品，同2.2.3项下显色方法处理，测定，将所测吸光度值带入标准曲线中计算含量。
结果分析：根据标准曲线计算，金刚藤粗多糖样品含量为25.98%，且重复性试验RSD%值为0.73%，说明重复性良好。
1.2.6精密度测定
由同一批药材配置的供试品溶液，精密量取同一供试品溶液0.50ml供试品溶液6份，加入10ml据塞试管中，加水至2ml，按2.2.3方法显色，在490nm处，分别测定吸光度，计算RSD%值。
结果分析：精密度RSD%值为0.44%，说明精密度良好。
1.2.7稳定性测定
精密吸取供试品溶液0.50ml，操作方法同上，分别在0min、15min、30min、45min、60min测定吸光度，计算RSD（%）。
结果分析：稳定性RSD%值为0.15%，说明稳定性良好。
1.2.8回收率试验
加样法：根据以上样品测定结果分析，加入1:1的葡萄糖对照品，即加入5.04mg葡萄对照品，与样品配置成混合溶液50ml，混合均匀后，分别吸取0.25ml溶液6份，操作方法同2.2.3，显色后，在490nm波长处测定吸光度，计算回收率，平均加样回收率为98%，RSD为1.6%。
2金刚藤多糖部位提取工艺研究
2.1仪器与试剂
紫外-可见分光光度计，型号：UV-1700，SHIMADZU COPORATION公司生产。
减压干燥箱，型号：DZF-6020，上海乔跃电子有限公司生产。
大容量离心机，型号：SIGMA4-15，南京菲奇工贸有限公司生产。
苯酚(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂生产。
浓硫酸（98.8%，分析纯）：成都市科龙化工试剂厂生产。
2.2方法与结果
2.2.1提取多糖前处理考察
为了考察金刚藤药材的多糖提取是否需要进行脱脂处理，进行了以下对比试验。
分别称取相同质量的药材，至圆底烧瓶中，一份加入10倍的水，加热回流提取3次，每次1.5h；另一份先加入10倍的80%乙醇，水浴加热回流提取3次，每次1.5h，滤过，烘干滤渣再加入10倍的水加热回流提取3次，每次1.5h。将两份提取液均减压浓缩至相同体积，加入4倍体积的乙醇，醇沉24h，离心，收集沉淀，低温减压干燥，制的各样品粉末，备用。
分别称取两份样品粉末各16mg，置50ml容量瓶中，加入一定量水，超声30分钟，用水定容至刻度，摇匀，滤过，分别取续滤液0.50ml置10ml据塞试管中，加水至2ml，加入1ml5%苯酚（现配），混匀，迅速加入5ml浓硫酸，混匀，在490nm处测定其吸光度，计算多糖含量。
表2乙醇预处理药材对粗多糖含量的影响
由表2可以看出，水提取前使用80%乙醇处理后多糖样品中含量可增加10%因此，在采用水提取前很有必要采用乙醇处理。
2.2.2提取的单因素考察
2.2.2.1提取时间
精密称取相同质量的药材，均加入10倍的水，分别提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，提取完成后，滤过，离心（4000r，5min），冷却，定容至加入水体积。2.2.2.1.1出膏率
将定容后的提取液，分别吸取25ml置恒中的蒸发皿中。水浴将溶液挥至近干，105℃干燥3h，取出，在干燥器中冷却，称重，计算出膏率，进行比较分析。
表3提取时间对出膏率的影响
由表3可知，0.5h提取液出膏率最低，2h提取液出膏率最大。
2.2.2.1.2多糖含量
将定容后的提取液，分别吸取0.5ml，转至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，分别吸取2ml稀释液，置10ml据塞试管中，加入1ml5%苯酚（现配），摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，摇匀，静置10min，4℃水浴加热15min，冰水浴冷却5min，取出，在490nm处测定吸光度，将测定结果带入标准曲线线性方程计算提取液中多糖含量。
表4提取时间对提取液中多糖浓度的影响
由上表可知，1.5h提取液中多糖含量最高，0.5h提取液中多糖含量最低。
结合出膏率和提取液中多糖浓度两指标分析（见图1），不难看出时间为1.5h时两指标综合结果最好，因此，提取时间因素的三水平选为1h、1.5h、2h。
2.2.2.2提取次数
精密称定药材5份，均加入10倍水，加热回流提取1.5h，分别提取1次、2次、3次、4次、5次，合并提取液，过滤，离心，浓缩至相同体积，备用。
2.2.2.2.1出膏率
将定容后的提取液，分别吸取25ml置恒中的蒸发皿中。水浴将溶液挥至近干，105℃干燥3h，取出，在干燥器中冷却，称重，计算出膏率，进行比较分析。
表5提取次数对出膏率的影响
由表5可知，随着提取次数的增加，出膏率有所增加，但提取次数超过3次以后，出膏率增长不明显。
2.2.2.2.2多糖提取量
将第1、2、3、4、5次的提取液定容后，分别吸取0.5ml，转入50ml容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。分别吸取2ml置10ml据塞试管中，加入1ml5%苯酚（现配），摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，摇匀，静置10min，4℃水浴加热15min，冰水浴冷却5min，取出，在490nm处测定吸光度，将测定结果带入标准曲线线性方程计算提取液中多糖含量。
表6提取次数对提取液中多糖浓度的影响
由表6可知，多糖浓度随着提取次数增加而增加，但提取次数超过3次以后，多糖提取量增加不明显。
由图2不难看出，随着提取次数的增加出膏率及提取液中多糖浓度均增加，但当提取次数达到3次后增加趋势不再明显，结合实际生产中的提取成本及提取效率综合考虑，该影响因素的三水平为2次、3次、4次。
2.2.2.3提取溶剂用量
分别称取5份相同质量的药材，置于圆底烧瓶中，分别加入比例为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14的提取溶剂（即纯净水），加热回流提取1.5h后，滤过，离心，取上清液，冷却，定容至加入溶剂体积。
2.2.2.3.1出膏率
将定容后的提取液，分别吸取25ml，置恒重蒸发皿中。水浴将溶液挥至近干，105℃干燥3h，取出，在干燥器中冷却，称重，计算出膏率，进行比较分析。
表7固液比对出膏率的影响
由表7可知，固液比为1:10时，出膏率达最大值。当固液比小于1:10时，出膏率随比例增加而增加；当固液比大于1:10时，出膏率有所下降，但下降幅度不大。
2.2.2.3.2多糖含量
将不同溶剂用量的提取液分别定容至加入体积，分别吸取0.5ml，转入25ml容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。分别吸取2ml置10ml据塞试管中，加入1ml5%苯酚（现配），摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，摇匀，静置10min，40℃水浴加热15min，冰水浴冷却5min，取出，在490nm处测定吸光度，将测定结果带入标准曲线线性方程计算提取液中多糖含量。
表8固液比对多糖提取量的影响
由表8可知，溶剂用量<10倍时，多糖提取量是随着溶剂用量增加呈上升趋势，溶剂用量>10倍时，多糖提取量随着溶剂用量增加，在一定范围内波动。
因此，结合出膏率和多糖量两指标结果分析（图3），固液比的三水平选为1:8、1:10、1:12。
2.2.2.4提取温度
称取相同质量的药材6份，置于圆底烧瓶内，每份加入10倍水，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中加热浸提1.5h，提取后，滤过，离心（4000r、5min），取上清液，定容至加入溶剂体积，混匀，备用。
2.2.2.4.1出膏率
将定容后的提取液，分别吸取25ml至恒重蒸发皿中，水浴上将溶剂挥至近干，105℃烘箱干燥3h，置干燥器中冷却，称重，计算出膏率。
表9提取温度对出膏率的影响
由表9可以看出，提取温度<70℃时，出膏率上下波动，提取温度>70℃后，出膏率随着温度升高而增加。
2.2.2.4.2多糖提取量
将定容后的提取液，分别吸取0.5ml置25ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，吸取2ml置10ml据塞试管中，加入1ml5%苯酚（现配），迅速加入5ml浓硫酸，混匀，静置10min，40℃水浴加热15min，冰水浴冷却5min，取出，在490nm处测定吸光度，将测定结果带入标准曲线线性方程计算提取液中多糖含量。
表10提取温度对多糖含量的影响
由上表可以看出，浸提温度对金刚藤多糖的提取具有明显的影响，温度增加，溶解度增大，有利于多糖的溶出，但随着温度的升高，部分多糖水解为单糖或低聚糖，并且易使蛋白质变性，在采用Sevag法脱蛋白的过程中发现有机层中蛋白沉淀明显且量多，说明金刚藤中多糖有以糖蛋白的形式存在，随着温度的升高，破坏蛋白质后，就可能导致多糖提取率下降，在试验中也显示高于80℃的提取液在脱蛋白的过程中沉淀明显增多且沉淀上出现一些黄色胶状物质，由此推断金刚藤多糖有以糖蛋白形式存在，且该糖蛋白可能具有一定生物活性。
由图4可以看出，综合考虑对出膏率及多糖含量的影响，提取温度的三水平应该选为70℃、80℃、90℃。
2.2.3正交试验
2.2.3.1正交试验设计
根据以上单因素考察结果，确定了金刚藤多糖提取的影响因素有提取时间、提取次数、提取温度、固液比，并通过实验确定了该四因素各自的水平。现根据实验结果拟定正交实验设计。
表11正交试验因素表水平表
表12L9（34）正交实验表
按照上表设计，进行正交试验，每组实验重复3次。以多糖提取量为评价指标。
2.2.3.2实验结果
表13正交试验结果
将结果输入SPSS17.0软件，进行统计学分析，分析结果如下：
表14SPSS输出正交试验方差分析表主体间效应的检验
因变量:多糖提取量
a.R方=.985（调整R方=.976）
由方差分析表表可以看出，重复试验的P值为0.377，无统计学意义，可以认为重复试验间无差异。提取时间、提取次数、固液比、提取温度的P值都<0.05，有统计学意义，均为主要因素。
表15SPSS输出提取时间该因素的三个水平均数估计
因变量:多糖提取量
因表产率越大越好，水平3的均数值0.217最大，故提取时间取水平3即2h好。
表16SPSS输出提取次数该因素的三个水平均数估计
因变量:多糖提取量
同法分析，提取次数取水平2即3次好。
表17SPSS输出固液比该因素的三个水平均数估计
因变量:多糖提取量
同法分析，固液比取水平3即1:12好。
表18SPSS输出提取温度该因素的三个水平均数估计
因变量:多糖提取量
同法分析，提取温度取水平2即80℃好。
综合以上结果，金刚藤中多糖部位的最佳提取工艺为80℃水浴提取，固液比为1:12提取3次，每次2h。
2.2.3.3最佳提取工艺验证
分别称取三个批号的药材，采用正交实验得到的最佳提取工艺进行提取，以提取液中多糖总量为测定指标，以此验证最佳提取工艺的合理性，实验结果如下表：
表19最佳提取工艺验证试验结果
由上表可以看出，正交实验结果的最佳提取工艺合理可行。
3金刚藤多糖部位分离纯化
3.1仪器与试药
3.1.1实验仪器
紫外-可见分光光度计，型号：UV-1700，SHIMADZU COPORATION。
旋转蒸发仪，型号：DE-2000B，上海亚荣生化仪器厂生产。
3.1.2实验试剂
HP-20、AB-8、D101、DA201、LSA-10、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、苯酚、浓硫酸
3.2方法与结果
3.2.1醇沉
3.2.1.1加入乙醇的比例不同对醇沉样品的影响
3.2.1.1.1沉淀量
称取一定质量药材，加入12倍水，80℃热浸提取3次，每次2h，合并提取液，滤过，离心，将上清液60℃减压浓缩至浓度为0.4g生药材/ml。
将浓缩后的提取液平均分成5份，分别加入1:1、1:2、1:3、1:4、1:5比例的乙醇，沉淀24h，离心（4000r，5min），收集沉淀置恒重的蒸发皿中，低温减压干燥，干燥器中冷却，称重。
表20乙醇用量对醇沉沉淀量的影响
由表20可以看出，随着乙醇加入体积增加，沉淀量也随之增加。
3.2.1.1.2沉淀中多糖含量
将5份沉淀分别称取30mg，置50ml容量瓶中，加入一定水，超声30min，充分溶解，加水定容至刻度，滤纸过滤，取续滤液0.50ml置10ml据塞试管中，按上述显色方法显色，在490nm处测定吸光度，计算各沉淀中多糖含量。
表21乙醇用量对醇沉沉淀中多糖含量的影响
由上表可以看出，乙醇体积与提取液体积为1:4时，沉淀中多糖含量最高。
由上述结果分析可以看出乙醇用量为1:4和1:5时沉淀量及多糖含量较为相近，说明乙醇用量为1:4时就可将提取液中多糖沉淀完全，结合工业生产及成本因素，选择醇沉最佳比例为1:4。
在实验过程中还发现，体积比为1:4时醇沉的沉淀最易溶于水，且完全溶解，最不易溶于水的体积比为1:1,且有部分沉淀不溶于水。
3.2.2脱蛋白
3.2.2.1金刚藤粗多糖中蛋白质的含量测定
蛋白质为多糖中常除去的杂质，但是由于在除去蛋白质的各种方法过程都会造成多糖或多或少的损失，在预实验中我们也发现，采用Sevage法脱蛋白后，水层用乙醇沉淀后无沉淀产生，说明在脱蛋白的过程中，多糖也存在大量损失的情况，因此，为了研究金刚藤多糖中蛋白质是否有除去的必要，测定了金刚藤粗多糖中蛋白质的含量。
3.2.2.1.1蛋白质标准溶液的配置
精密称取10.95mg牛血清蛋白，用少量水溶解，定容至100ml，使标准溶液蛋白质浓度为0.1095mg/ml.
3.2.2.1.2考马斯亮蓝G-250溶液的配置
精密称取50.00mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇25ml，再加入85%磷酸50ml，最后用蒸馏水定容至500ml，置于棕色瓶中备用。
3.2.2.1.3供试品溶液的配置
精密称取金刚藤药材10g，加入12倍水溶液，80℃水浴加热提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，离心，将合并后的提取液减压浓缩至0.5g生药材/ml，加入4倍体积的95%乙醇，混合均匀，4℃静置过夜，离心，取沉淀，常温干燥，精密称取干燥后的样品5.69mg，加入适量水超声充分溶解，定容至10ml，过滤，取续滤液备用。
3.2.2.1.4标准曲线的绘制
精密吸取蛋白质标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置10ml据塞试管中，加水至1ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合显色，静置10min，在595nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，标准溶液蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。结果见下表。
表22考马斯亮蓝标准曲线
如图，标准曲线的线性方程为y=5.671x+0.073，R2=0.998，R=0.999该标准曲线符合标准，在0.021mg/ml～0.110mg/ml具有良好的线性关系。
3.2.2.1.5供试品溶液中蛋白质含量测定
精密吸取3份供试品溶液，每份1.00ml，置10ml具塞试管中，按照标准溶液显色方法显色，在595nm处测定其吸光度，带入标准曲线中计算蛋白质含量。结果如下表：
表23供试品溶液中蛋白质含量测定结果
由上表可以得出，粗多糖中蛋白质含量为5.5%，综合考虑，除去这5.5%蛋白质，损失大量的多糖是没有必要的，且在对提取温度单因素的考察时发现，当温度高于80℃的时候多糖含量反而降低，理论应该多糖随着温度升高溶解度也升高含量也应该增加，但实验中却非如此，查阅文献资料后分析，可能由于多糖是以糖蛋白的形式存在，当温度达到一定程度会对糖蛋白造成破坏，从而使多糖含量降低，在脱蛋白过程也很好的验证了这个观点，当蛋白除尽后，水层液醇沉不出任何沉淀，并且，目前无法判定这些蛋白质是否就是无效成分，因此，综上所述，在分离纯化过程中，就不采用脱蛋白提高多糖纯度。
3.2.3大孔吸附树脂纯化金刚藤粗多糖工艺研究
为了使实验室的研究与工业生产最为接近，综合了多糖的分离纯化方法，选择了采用大孔吸附树脂对多糖进行分离纯化，且考察过脱蛋白、透析、双氧水脱色、冷冻干燥一系列操作对多糖进行分离纯化，结果发现收率极低，不适合金刚藤多糖的分离纯化，综上考虑，选择大孔吸附树脂为多糖分离纯化手段。
根据多糖采用大孔吸附树脂分离纯化的文献及资料，拟定了一下的初步研究方案。
3.2.3.1上样样品制备
称取金刚藤药材100g，置于2000ml圆底烧瓶中，加入8倍量的75%乙醇溶液，浸泡过夜，水浴加热回流提取2h，滤过，再加入8倍量75%乙醇回流提取2h，滤过，再加入8倍量的75%乙醇回流提取1h，滤过，将残渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃水浴加热回流提取2h，滤过，再加入12倍量的水，加热回流提取2h，再重复一次，滤过，合并提取液，离心，将上清液减压浓缩至250ml（即药液浓度为0.4g生药材/ml）。向浓缩液中缓缓加入4倍量的95%乙醇，充分混合，4℃沉淀过夜，离心（4000r/min，10min），收集沉淀，50℃减压干燥，研磨成粉末，上样前用在粉末中加入100ml水，超声30min，充分溶解，过滤，将不溶的沉淀，再加入100ml水，超声30min，充分溶解后，过滤，合并两次的滤液。
3.2.3.2大孔树脂的预处理及装柱
根据文献选择了分离纯化多糖较为常用的AB-8大孔吸附树脂，以药材：树脂=0.6:1的比例，称取166gAB-8大孔树脂，加入适量的95%乙醇充分浸泡过夜，湿法装柱，继续用95%乙醇冲洗，直到洗脱液与水混合不再浑浊，再用水冲洗，直到无醇味。
3.2.3.3上样及纯化
将配置好的样品溶液缓缓加入大孔树脂内，以2BV/h的流速上样，上样后，用3BV水洗脱，收集洗脱液，再用3BV50%乙醇洗脱，收集洗脱液，将两部分洗脱液分别减压浓缩至一定体积后，加入4倍量的95%乙醇，4℃沉淀过夜，离心，收集沉淀，干燥，分别得到沉淀A和沉淀B。
3.2.3.4精制多糖收率及多糖含量测定
分别称量沉淀A和沉淀B计算收率，再分别称取量沉淀各16.01mg和16.40mg，置50ml容量瓶中，加入适量水，超声30min，使其充分溶解，再加水定容至刻度，分别精密吸取0.50ml，置10ml具塞试管中，加水至2ml，再加入1ml5%苯酚溶液，混匀，迅速加入5ml浓硫酸，静置10min，在40℃水浴加热15min，冰水浴5min，取出，在490nm处测其吸光度，以水为空白对照，带入标准曲线中，计算含量，结果如下表
表24沉淀A和沉淀B的收率及多糖含量
由表24测定结果可以看出，通过AB-8大孔吸附树脂分离纯化以后，水洗脱液中多糖含量的确有明显提高，但50%乙醇洗脱液中多糖含量与纯化之前几乎没有变化，且在沉淀溶解过程中发现，沉淀A的水溶液呈白色浑浊液，且沉淀完全溶解，为了避免浑浊影响显色测定，对其溶液进行过滤，却发现滤液几乎无多糖检出，而未过滤的溶液显色后呈透明，且多糖含量达56.65%；而沉淀B溶液呈黄色，且沉淀溶解不完全，多糖含量也与纯化前的样品几乎没有变化。因此，说明采用AB-8吸附，用水洗脱能够达到分离纯化多糖的目的，但是收率太低，不利于以后的药效研究。
综合考虑，选择用2.2.1项下采用乙醇前处理的方法制备的多糖样品（含量达到41%且不含黄酮）进行以后的药效学研究。
4.金刚藤药材中多糖含量测定及多糖样品中多糖和黄酮含量测定
4.1试验仪器和试剂
紫外-可见分光光度计：型号UV-1700，SHIMADZU COPORATION公司生产。
大容量离心机：型号SIGMA4-15，南京菲奇工贸有限公司生产。
苯酚(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂生产。
浓硫酸（98.8%，分析纯）：成都市科龙化工试剂厂生产。
4.2方法与结果
4.2.1待测样品的制备
称取金刚藤药材100g，置于2000ml圆底烧瓶中，加入8倍量的75%乙醇溶液，浸泡过夜，水浴加热回流提取2h，滤过，再加入8倍量75%乙醇回流提取2h，滤过，再加入8倍量的75%乙醇回流提取1h，滤过，将残渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃水浴加热回流提取2h，滤过，再加入12倍量的水，加热回流提取2h，再重复一次，滤过，合并提取液，离心，将上清液减压浓缩至250ml（即药液浓度为0.4g生药材/ml）。
将浓缩液充分混合，精密吸取5.00ml，转入50ml容量瓶中，加水定容至刻度线，混合均匀，制成样品1。
将剩余的浓缩液中缓缓加入4倍量的95%乙醇，充分混合，4℃沉淀过夜，离心（4000r/min，10min），收集沉淀，50℃减压干燥，研磨成粉末，制成样品2。4.2.2金刚藤药材中多糖的含量测定
精密吸取样品1中的溶液3份，每份0.50ml，置10ml具塞试管中，加水至2ml，再加入1ml5%苯酚溶液，混匀，迅速加入5ml浓硫酸，静置10min，在40℃水浴加热15min，冰水浴5min，取出，在490nm处测其吸光度，以水为空白对照，带入标准曲线中，计算含量，结果如下表
表25金刚藤药材中多糖含量测定
由表25可知，金刚藤药材中，多糖的含量为0.46%。
4.2.3多糖样品中多糖含量的测定
4.2.3.1测定样品2的质量，计算多糖样品得率。再精密称取样品16.01mg，置于50ml容量瓶中，加入适量的水，超声30min，使其充分溶解，再加水定容至刻度，混匀，精密吸取溶液0.50ml置10ml具塞试管中，按照2.2中的显色方法显色，并测定吸光度，计算其含量，结果如下：
多糖样品得率计算：0.53g/100g×100%=0.53%即多糖样品得率为0.53%
表26样品中多糖含量
由表26可以得出，多糖样品中多糖含量为40.80%。
4.2.3.2多糖样品中黄酮含量的测定
将样品2精密称取16.50mg，置于25ml容量瓶中，加入95%乙醇适量，超声30min使其充分溶解，再加入95%乙醇定容至刻度，混匀，精密吸取3份，每份6ml，置于25ml容量瓶中，加入1ml5%亚硝酸钠，摇匀，静置6min，再加入1ml10%硝酸铝，摇匀，静置6min，最后加入4.3%氢氧化钠10ml，摇匀，用水定容至刻度，静置30min，在500nm处测其吸光度，带入标准曲线计算其含量。以95%乙醇作为空白对照组。测定结果如下：
表27多糖样品中黄酮含量测定
由表27中的测定结果可以看出，可视为多糖样品中不含有黄酮，考虑到操作手段的差异和检测结果的误差，本发明限定多糖提取物中黄酮含量低于1%，即可视为多糖提取物中不含有黄酮成分。
为了最大限度的测定样品中黄酮含量，直接测定用乙醇溶解后的产品，并用已知含量的样品考察了溶剂对其测定结果的影响，结果表明，用水或95%乙醇测定结果并无差异。
综上所述，本发明最终确定的金刚藤多糖提取方法为：
称取金刚藤药材100g，置于2000ml圆底烧瓶中，加入8倍量的75%乙醇溶液，浸泡过夜，水浴加热回流提取2h，滤过，再加入8倍量75%乙醇回流提取2h，滤过，再加入8倍量的75%乙醇回流提取1h，滤过，将残渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃水浴加热回流提取2h，滤过，再加入12倍量的水，加热回流提取2h，再重复一次，滤过，合并提取液，离心，将上清液减压浓缩至250ml（即药液浓度为0.4g生药材/ml）。
将剩余的浓缩液中缓缓加入4倍量的95%乙醇，充分混合，4℃静置过夜，离心（4000r/min，10min），收集沉淀，50℃减压干燥，即得金刚藤多糖提取物。
实施例5脱脂处理的考察
分别称取相同质量的药材，至圆底烧瓶中，分别加入10倍量的甲醇、80%乙醇、石油醚（60～90℃）、丙酮、正己烷、石油醚（60～90℃）-丙酮（1:1，V/V）以及氯仿-甲醇（2:1，V/V），分别加热回流提取3次，每次1.5h，滤过，烘干滤渣再分别加入10倍的水加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，分别收集提取液，均减压浓缩至相同体积，加入4倍体积的95%乙醇，醇沉24h，离心，收集沉淀，低温减压干燥，制得各样品粉末，备用。
分别称取各组样品粉末16mg，置50ml容量瓶中，加入一定量水，超声30分钟，用水定容至刻度，摇匀，滤过，分别取续滤液0.50ml置10ml据塞试管中，加水至2ml，加入1ml5%苯酚（现配），混匀，迅速加入5ml浓硫酸，混匀，在490nm处测定其吸光度，计算多糖纯度。
表28不同脱脂剂预处理药材对粗多糖纯度的影响
由上表可以看出，水提取前使用不同的有机溶剂脱脂处理，对多糖的纯度具有不同的影响，其中氯仿-甲醇（2:1，V/V）对多糖纯度提高最为明显，但氯仿毒性极大，不适宜推广应用；与其他有机溶剂相比，80%乙醇脱脂效果较好，毒性较小，成本低廉，因此本实验中可以优先选择将80%乙醇作为脱脂剂。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1金刚藤有效部位治疗大鼠盆腔炎的药效学研究
盆腔炎是由诱发感染的因素使病原微生物乘虚而入，上行感染所致，临床上分为急性和慢性两类，以慢性居多。急性盆腔炎的主要是由病原体如沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌、人型支原体、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌以及厌氧菌等感染引起。慢性盆腔炎是由于急性盆腔炎治疗不及时、不彻底所致，急性期经用抗生素后细菌已被杀死，因此，慢性盆腔炎患者组织中已经没有病原菌的感染，仅仅表现为慢性炎症形成的瘢痕粘连以及盆腔充血，也就是说盆腔局部已由有菌性炎症转变为无菌性炎症，故大部分患者用抗生素无效。长期以来，对于盆腔炎的治疗，西医药物主要是根据药敏实验选用抗生素为主，对病原体的杀灭疗效确切，但对细菌和病原体所导致的一系列病理损害的改善作用不明显，因而对于盆腔炎所导致的远期后遗症疗效不理想。目前，盆腔炎的治疗仅能消除急性感染的症状，对盆腔炎相关的并发症后遗症作用不大，因此，盆腔炎的药物治疗，尤其是慢性盆腔炎的药物治疗乏善可陈。
基于上述现状，依据急、慢性盆腔炎的发病特点、发病机理、治疗原则，结合中医药对盆腔炎的辨证施治，本研究拟以金刚藤多糖和黄酮两种部位对实验型大鼠盆腔炎进行干预，以慢性盆腔炎炎症和免疫指标为依据，从抗炎和增强机体免疫角度探索金刚藤多糖和黄酮对慢性盆腔炎的治疗效果。
1实验材料、仪器
1.1受试药物
①金刚藤多糖：金刚藤总多糖部位干膏粉末（实施例1制备）：按生药材给药量折算等效剂量，根据预试测定药材中总多糖含量为0.46%，金刚藤多糖部位干膏粉末中总多糖含量为44%。折算结果：（3g/Kg）*0.0046/0.44=0.03g/kg，即多糖部位样品灌胃剂量为0.03g/kg。
②金刚藤总黄酮；据《中国2010版药典》中菝葜日用量为10g～15g/d，按重量折算等效剂量为：15g*12/60Kg=3g/kg，金刚藤黄酮部位干膏粉末（实施例3制备）：按生药材给药量折算等效剂量，根据药材中黄酮含量为2.9%，金刚藤黄酮部位干膏粉末中总黄酮含量为57%。折算结果:（3g/Kg）*0.029/0.57=0.15g/kg，即黄酮部位样品灌胃剂量为0.15g/kg。
③金刚藤多糖+黄酮：0.15g/kg(黄酮部位)+0.03g/kg(多糖部位)=0.18g/kg。
④阳性药：金刚藤胶囊。功能主治：清热解毒、化湿消肿。用于湿热下注所致的带下量多、黄稠，经期腹痛；慢性盆腔炎、附件炎和附件炎性包块见上述症候者。生产厂家：四川科伦药业股份有限公司。生产批号：20120613。
1.2工具药
(1)苯酚胶浆：成都市科龙化工试剂公司，生产批号：20120605。
(2)戊巴比妥：成都格雷西亚化学技术有限公司，生产批号：20120116。
1.3试剂
(1)生理盐水：四川科伦药业股份有限公司。生产批号：20120321。
(2)甲醛：成都市科龙化工试剂公司公司，生产批号：20090816。
1.4检测试剂盒
(1)TNF-αElisa试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，生产批号：E-30125。(2)IL-2Elisa试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，生产批号：E-30646。(3)IgAElisa试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，生产批号：E-30439。(4)IgG Elisa试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，生产批号：E-30442。(5)IgM Elisa试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，生产批号：E-30442。
实验动物
未交配SD雌性大鼠，SPF级，体重180～220g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证号：scxkc(111)2008-24。
1.6实验仪器
(1)紫外分光光度计：SHIMADZU，UV1700，上海锐翔仪器公司。
(2)Thermo全功能酶标仪，BIS-2113，美国Thermo Fisher Scientific仪器有限公司生产。
(3)切片机：徕卡-2015，德国克林蓝公司。
(4)TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机：常州市中威医疗仪器有限公司。
(5)BMJ-Ⅲ型包埋机：常州市中威医疗仪器有限公司。
(6)PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪：常州市中威医疗仪器有限公司。
(7)图像分析软件Motic Images Advanced。
2统计方法
用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差
表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane’sT2检验。
3实验内容与方法
3.1大鼠盆腔炎模型复制方法
实验第1d，除空白组外，其余各组大鼠用戊巴比妥麻醉，仰卧固定于操作台上，在无菌操作下，于下腹部正中切口，长约0.8cm～1cm，暴露双侧输卵管，用1ml注射器-7号针头于输卵管中间部位沿卵巢方向注入30%苯酚胶浆生理盐水溶液0.2ml(两侧输卵管均注)，注射完之后用碘伏和70%酒精消毒所有伤口和创面，手术针线缝合肌肉和皮肤，等待大鼠自然苏醒。
3.2实验分组及给药
取存活的SD大鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别作为：①模型对照组：等体积纯净水；②阳性对照组(金刚藤胶囊组)：540mg·kg-1；③多糖组：30mg·kg-1；④黄酮组：150mg·kg-1；⑤多糖+黄酮组：180mg·kg-1。另按体重随机称取10只正常大鼠作为正常对照组⑥：等体积纯净水。造模当天下午各组大鼠按剂量灌胃给药，每天1次，连续14天。实验第15天，股动脉放血处死各组大鼠，用1.5ml EP管(加肝素钠)和10ml EP管(不加肝素钠)收集血液，剖取全子宫。
3.3检测指标
①血液流变学检测：应用全自动血液流变仪对各实验组大鼠进行全血黏度三个不同切变率及血浆粘度的检测分析。
②血浆TNF-α(肿瘤坏死因子)、IL-2(白细胞介素-2)、IgA(免疫球蛋白A)、IgG(免疫球蛋白G)和IgM(免疫球蛋白M)含量测定：大鼠血液收集完毕后，立即置于4℃低温离心机中，以4000r·min-1离心10min，收集上清液，采用全自动酶标仪、Elisa法严格按照操作流程分别测定各实验组大鼠血浆TNF-α、IL-2、IgA、IgG和IgM的含量。
③子宫重量系数：剖取大鼠全子宫，剪去双侧卵巢，用电子天平称重，计算各实验组大鼠子宫重量系数：
子宫重量系数(mg/g)=子宫重(mg)/体重(g)
④子宫织病理学观察：剪取病变明显的子宫组织，用10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜观察子宫组织病理变化。
子宫病理损伤指数：对各实验组大鼠子宫组织显微观察情况进行病理评分，
评分结果以病理损伤指数计。病理评分标准如下：
病理评分标准
4实验结果
4.1对大鼠血液流变的影响
4.1.1对大鼠全血粘度的影响结果见表29。
表29金刚藤有效部位对大鼠全血黏度的影响
注：与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01。
由表29可知，与正常组比较，模型组大鼠全血黏度三个切变率均有显著性增大(P<0.05)；与模型组比较，金刚藤多糖组、黄酮组以及多糖+黄酮组大鼠全血黏度三个切变率均有显著性减小(P<0.05)，且金刚藤两种有效部位配伍的药理作用呈现出协同性，效价强度略优于二者单用。阳性药金刚藤胶囊也能显著减小大鼠全血黏度三个切变率(P<0.05)。
4.1.2对大鼠血浆黏度的影响结果见表30。
表30金刚藤有效部位对大鼠血浆黏度的影响
由表30可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆黏度有显著性增大(P<0.05)；与模型组比较，金刚藤多糖组、黄酮组以及多糖+黄酮组大鼠血浆黏度均有显著性减小(P<0.05)，药理活性强弱顺序为：多糖>多糖+黄酮>黄酮。阳性药金刚藤胶囊也能显著减小大鼠血浆黏度(P<0.05)。
4.2对大鼠血浆TNF-α、IL-2、IgA、IgG和IgM含量的影响
4.2.1对大鼠血浆TNF-α含量的影响结果见表31。
表31金刚藤有效部位对大鼠血浆TNF-α含量的影响
由表31可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆TNF-α含量极显著性增大(P<0.01)。与模型组比较，金刚藤多糖组和黄酮组大鼠血浆TNF-α含量均有显著性降低(P<0.05)；多糖+黄酮组大鼠血浆TNF-α含量有极显著性降低(P<0.01)，效价强度优越于多糖和黄酮单用。阳性药金刚藤胶囊也能显著降低大鼠血浆TNF-α含量(P<0.05)。
4.2.2对大鼠血浆IL-2的含量的影响结果见表32。
表32金刚藤有效部位对大鼠血浆IL-2含量的影响
由表32可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆IL-2含量极显著降低(P<0.01)。与模型组比较，金刚藤多糖、黄酮以及黄酮+多糖组大鼠血浆IL-2含量均有显著升高(P<0.05)。阳性药金刚藤胶囊也能显著升高大鼠血浆IL-2含量(P<0.05)。
4.2.3对大鼠血浆IgA的含量的影响结果见表33。
表33金刚藤有效部位对大鼠血浆IgA含量的影响
由表33可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆IgA含量显著减少(P<0.05)。与模型组比较，金刚藤多糖、黄酮以及黄酮+多糖组大鼠血浆IgA含量均有显著升高(P<0.05)。阳性药金刚藤胶囊也能显著升高大鼠血浆IgA含量(P<0.05)。
4.2.4对大鼠血浆IgG的含量的影响结果见表34。
表34金刚藤有效部位对大鼠血浆IgG含量的影响
由表34可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆IgG含量显著降低(P<0.05)。与模型组比较，金刚藤多糖、黄酮以及黄酮+多糖组大鼠血浆IgG含量均有显著升高(P<0.05)。阳性药金刚藤胶囊也能显著升高大鼠血浆IgG含量(P<0.05)。
4.2.5对大鼠血浆IgM的含量的影响结果见表35。
表35金刚藤有效部位对大鼠血浆IgM含量的影响
由表35可知，与正常组比较，模型组大鼠血浆IgM含量极显著减少(P<0.01)。与模型组比较，金刚藤多糖、黄酮以及黄酮+多糖组大鼠血浆IgA含量均有显著升高(P<0.05)。阳性药金刚藤胶囊也能显著升高大鼠血浆IgA含量(P<0.05)。
4.3对大鼠子宫病理形态的影响
4.3.1病理切片制作
病理切片的制作主要包括以下环节：组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。
4.3.2大鼠子宫病理形态观察
显微镜观察显示，正常组大鼠子宫壁完好，粘膜结构完整，粘膜上皮细胞形态未见异常，皱襞和管腔无异常改变；固有层可见子宫内膜腺体，血管未见扩张充血，未见炎细胞浸润和纤维结缔组织增生，见图5和图6。
模型组大鼠子宫粘膜上皮明显坏死变性，肌层和固有层均有明显结缔组织增生和炎细胞浸润，肌层排列紊乱，管腔有一定粘连阻塞，浆膜层有散在炎细胞浸润，见图7和图8。
阳性组大鼠子宫粘膜上皮坏死病变明显减少，肌层和固有层结缔组织增生和炎细胞浸润也明显减少，肌层排列整齐，见图9和图10。
多糖组大鼠子宫粘膜上皮坏死病变明显减少，肌层和固有层结缔组织增生和炎细胞浸润、淋巴滤泡增生也明显减少，肌层溃疡性损伤明显减小，层次排列整齐，见图11和图12。
黄酮组大鼠子宫粘膜上皮可见少量坏死病变，肌层和固有层可见结缔组织增生和炎细胞浸润、淋巴滤泡增生，肌层溃疡性损伤明显减少，见图13和图14。
多糖+黄酮组大鼠子宫粘膜上皮坏死性病变明显减少，肌层和固有层结缔组织增生和炎细胞浸润、淋巴滤泡增生也明显减少，肌层溃疡性损伤减轻，见图15和图16。
4.4对大鼠子宫病理损伤指数的影响
结果见表36。
表36金刚藤有效部位对大鼠子宫损伤指数的影响
由表36可知，与正常组比较，模型组大鼠子宫组织损伤指数极显著升高(P<0.01)，表明苯酚胶浆所致大鼠子宫炎症病理状态下，子宫组织水肿、糜烂、淋巴滤泡增生等病变较严重。与模型组比较，金刚藤多糖、多糖+黄酮组大鼠子宫组织损伤指数极显著性降低(P<0.05)；金刚藤黄酮组大鼠子宫损伤指数与模型组比较无统计学意义。阳性药金刚藤胶囊也能显著减小苯酚胶浆所致大鼠子宫损伤指数(P<0.05)，与组织形态学显微镜检查一致。
5实验结论与讨论
本实验采用苯酚胶浆致大鼠子宫内膜验证模拟人类盆腔炎发病，以大鼠血液流变、血浆炎症指标TNF-α、IL-2、血浆免疫指标IgA、IgG和IgM的含量、子宫重量系数、子宫显微病理形态以及子宫病理损伤指数为综合评价指标，研究了金刚藤多糖、黄酮以及二者配伍组合物的药效作用。实验数据显示：
(1)金刚藤多糖和金刚藤总黄酮提取物具有良好的活血化瘀作用。主要体现在金刚藤多糖和总黄酮提取物均可明显改善苯酚胶浆所致盆腔炎大鼠血液的浓、粘、凝、聚状态，且二者配伍的药理效价强度优越于二者单行。主要表现在：①金刚藤多糖和黄酮均可显著减小大鼠全血黏度高、中、低三个切变率(P<0.05)；②对大鼠血浆黏度也有显著减小(P<0.05)。
血液流变学主要研究的是血液及其成分的流动性和变形性规律的科学，它与临床多种疾病有关。血液流变学各项指标就是描述血液各种流变性质的定量，半定量参数，这些指标的异常改变及其改变程度，对疾病的病因，诊断，预防，治疗，疗效观察及病情监测都有重要的临床意义。
血液粘度是血液最基本的流变特性，是血液流变学研究的核心，它的重要性在伯肃叶(poiseuille)定律中已经体现出来。血液粘度测量包括全血粘度和血浆粘度测量，是反映血液“浓、粘、聚、凝”的一项重要指标。血液粘度的高与低能反映血液循环的优与劣或血液供应的多与少，是血液流变学的基本参数。测定血液粘度，研究血液粘度的特点，掌握血液粘度变化规律，对于了解血液的流动性质和凝固性质，尤其是对于揭示血液流变学的改变与某些疾病的发生和发展关系，具有重要意义。
本实验研究数据显示，金刚藤总黄酮提取物和多糖均可显著减小模型大鼠血液粘度，具有良好的活血化瘀功效，是金刚藤活血化瘀的物质基础所在。
(2)金刚藤多糖和总黄酮提取物具有良好的抗炎作用。主要体现在金刚藤多糖和总黄酮提取物均可显著下调苯酚胶浆所致盆腔炎大鼠血浆异常升高的TNF-α含量，显著上调异常降低的IL-2含量。
TNF-α是影响炎症进程中的主要细胞因子之一，是炎症细胞因子网络的关键部分，在炎症反应中起核心作用。它能刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质，如一氧化氮(NO)、氧自由基等，在炎症病理性损害和感染性休克中起重要作用。TNF-α具有调节多种免疫因子作用，产生对机体有利和有害的双重作用。一般来说，适度反应产生适量的TNF-α，有增进机体免疫的作用；过量的TNF-α，则呈现其毒性作用，如：诱导过多的细胞凋亡及坏死，对机体造成损害。在炎症反应中，TNF-α主要由单核-巨噬细胞合成及分泌。反过来又以自分泌和旁分泌的方式激活单核-巨噬细胞，使其产生释放大量包括白介素在内的多种炎性介质，激发炎症的连锁反应，从而加重机体的损伤。另外，TNF-α还能损伤内皮细胞、增加血管通透性；刺激血管内皮细胞产生炎性介质如IL-1、IL-8等；TNF-α还能与血管内皮细胞相互作用，从而导致内皮细胞表面凝血与抗凝机制之间失衡，引起血液动力学紊乱。此外，TNF-α能诱导自由基产生和脂质过氧化，加重细胞损伤及炎症过程。
IL-2是慢性炎症中最活跃的一种细胞因子，也是T细胞最重要的生长因子，主要由CD4+及CD8+T细胞产生。IL-2可作用于产生IL-2的细胞本身(自分泌)，也可作用于临近的CD4+T细胞、CD8+T细胞及其他免疫细胞(旁分泌)。随着新分裂的辅助型T细胞(Th)继续增殖，产生更多的IL-2，作用于Th细胞及其亚群，使T细胞不断增殖、分化和成熟。许多学者认为炎症时，IL-2可减少自身免疫抗体产生，从而减少自身免疫反应，减轻组织损伤而趋向愈合。IL-2产生或表达异常，与疾病有密切相关性。国内外研究显示，盆腔炎与机体异常减少IL-2有关。
本实验研究数据显示，金刚藤多糖和总黄酮提取物可明显对抗苯酚胶浆所致大鼠子宫内膜炎症，提示二者的抗炎作用与下调机体异常升高的促炎因子TNF-α和上调机体异常减少的IL-2含量有关。
(3)金刚藤多糖和总黄酮提取物具有良好的免疫增强作用。主要体现在金刚藤多糖和总黄酮提取物均可显著升高苯酚胶浆所致盆腔炎大鼠血浆IgA、IgG和IgM的含量。
免疫球蛋白(Ig)是一类存在于动物体血液和体液中有抗体活性的蛋白质，主要是丙种球蛋白。具有抗菌、抗病毒作用，并能在补体作用下杀死或溶解病原微生物，是机体抗感染免疫中的重要防御机制。抗原侵入机体后，引起机体产生各种具有特异性的免疫球蛋白，称为抗体。由骨髓中B淋巴细胞在抗原刺激下转化为原浆细胞，原浆细胞分化、繁殖并通过幼浆细胞细胞阶段，进化为成熟浆细胞。成熟浆细胞产生免疫球蛋白，按结构不同可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五类，发挥体液免疫作用。在感染、炎症反应中，IgG、IgA和IgM含量增高。
本实验研究数据显示，金刚藤多糖和总黄酮提取物均可升高盆腔炎大鼠血浆IgG、IgA以及IgM含量，提示金刚藤多糖和总黄酮提取物对免疫球蛋白具有调节作用，可促进机体免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的产生，从而提高机体免疫能力，增强机体抗菌、抗炎作用。
(4)金刚藤多糖和总黄酮提取物具有良好的子宫炎症性损伤修复作用。主要体现在金刚藤多糖和总黄酮提取物可显著修复苯酚胶浆所致大鼠子宫炎症性创面，降低子宫内粘膜肌纤维增生、炎细胞浸润、淋巴滤泡增生等炎性病变。
正常大鼠子宫平滑肌层较薄，平滑肌细胞细长，内环外纵，规则排列。内膜腺体形态规则，圆形或椭圆形，腺体上皮细胞均为单层立方或柱状。子宫内膜未见或偶见中性粒细胞浸润。盆腔炎病理状态下大鼠子宫肌纤维呈明显的增生肥大，肌层明显增厚，肌纤维排列紊乱，呈轻微编织状，出现穿插现象。内膜腺体数量增多，部分腺体形态不规则，有扩张或扭曲现象。腺体上皮细胞呈单层或复层立方状或柱状。金刚藤多糖组、多糖+黄酮组大鼠子宫平滑肌较模型组明显变薄，肌纤维增生肥大、排列紊乱、穿插现象均较模型组减轻，内膜腺体数量较模型组减少，形态规则，腺上皮细胞呈单层或假复层，子宫内膜有少量中性粒细胞散在浸润。
病理形态结果显示，金刚藤有效部位，尤其是多糖，对大鼠子宫炎症性损伤具有良好的修复作用。
Claims (10)
1.一种金刚藤多糖提取物，其特征在于：该提取物中多糖含量大于20%w/w。
2.根据权利要求1所述的金刚藤多糖提取物，其特征在于：所述金刚藤多糖提取物中，多糖含量为40～95%w/w。
3.根据权利要求2所述的金刚藤多糖提取物，其特征在于：所述金刚藤多糖提取物中，多糖含量为40～60%w/w。
4.权利要求1～3任意一项所述金刚藤多糖提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
（1）取金刚藤，脱脂处理；
（2）脱脂后的金刚藤经水提醇沉，沉淀干燥，即得金刚藤多糖提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述脱脂处理操作为：取金刚藤，采用有机溶剂提取即可；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、氯仿中的一种或两种以上的混合溶剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙醇，乙醇浓度为70-95%v/v，优选为75～80%v/v乙醇。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）具体操作如下：取药渣，挥干溶剂，加水提取，合并提取液，离心，取上清液，浓缩后，加入乙醇至含醇量为70～80%v/v，低温静置，离心，收集沉淀，干燥，即得金刚藤多糖提取物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，上清液浓缩至0.3～0.5g生药/ml；95%乙醇加入体积为浓缩液体积的4倍以上。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作为：称取金刚藤药材100g，加入8倍量的75%v/v乙醇回流提取3次，提取时间分别为2h、2h、1h，滤过，将药渣挥干溶剂，再加入12倍量的水，80℃提取2次，每次提取2，合并水提液，离心，将上清液减压浓缩至药液浓度为0.4g生药/ml；
步骤（2）的具体操作为：浓缩液中加入4倍量95%v/v乙醇，充分混合，4℃静置过夜，4000r/min离心10min，收集沉淀，50℃减压干燥，即得金刚藤多糖提取物。
10.权利要求1～3任意一项所述的金刚藤多糖提取物在制备治疗盆腔炎或抗炎、增强免疫、活血化瘀的药物中的用途。
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