CN101229308B

CN101229308B - 六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN101229308B
Application number: CN2008100520462A
Authority: CN
Inventors: 罗国安; 孟宪生; 程奕; 赵洪芝; 叶挺祥; 刘征辉; 王勇; 黎莉
Original assignee: TIANJIN HIGH-STANDARD QUALITY TESTING LAB
Current assignee: TIANJIN HIGH-STANDARD QUALITY TESTING LAB
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: CN101229308A

Abstract

本发明公开了六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的质量控制方法，它是将指纹图谱技术，结合被检测组分的特点，利用不同化合物最大紫外吸收波长产生的吸收峰覆盖融合的检测方法，可消除不同波长产生吸收峰的干扰，确保所检测成分准确、可靠。双波长覆盖融合的应用，更加准确地把握有关药品的质量，从而有效确保了六味地黄丸的安全、均一、稳定、有效、可控。本发明的质量控制方法简便、结果准确、重现性较好，可用于中药质量评价、中药质量控制和中药新药研发中。特别是可将其作为六味地黄丸质量控制及真伪鉴别的指标之一。

Description

六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的检测方法

发明领域

本发明属于采用现代分析检测仪器检测中药制剂技术领域，涉及一种中药质量的控制方法，更具体的说是一种六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的质量控制方法。

背景技术

六味地黄丸是中医补益剂中滋补肾阴的代表方剂。其配方源自经典古方，由熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、泽泻、山药、茯苓6味药材组成，具有滋阴补肾的主要功能。其立法以肾、肝、脾三阴并补，补肾为主。熟地黄滋补肾阴、填精益髓为主药；山茱萸药性酸温，可补益肝肾，涩精敛汗；山药味甘性平，健脾补肺，固肾益精。而泽泻配熟地黄则泻肾降浊；牡丹皮配山茱萸以清泻肝火；茯苓配山药渗水利湿。配伍组方以补为主，并将补虚与去邪结合，形成“三补三泻”，相反相成之势，适合于肝肾阴虚之症。主治由肾阴亏虚引起的腰膝酸软、头晕目眩、耳鸣耳聋、潮热盗汗、口燥咽干、骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴等症状。近年来研究发现六味地黄丸还有许多新功效。如提高实验动物降低的脾脏白细胞介素2活性，拮抗使用醋酸可的松造成的脾脏重量减轻。进一步研究还发现，六味地黄丸对多形核白细胞的免疫功能有明显的双向调节作用，且具有一定的防癌作用；对肾功能的影响研究发现，服用六味地黄丸的大鼠其细胞生成溶酶体的速度明显加快，从而提高了细胞的解毒能力而改善肾功能；延缓衰老，六味地黄丸能明显增加阴虚动物体重，增强其抗疲劳、耐低温和耐缺氧能力。有明显的抗氧化作用，对老年性痴呆有一定治疗作用。

随着科学技术的发展，现代分析检测仪器的普及应用，使中药检测分析水平有了显著提高，药品质量控制方法不断完善。其中指纹图谱技术在中药质量控制中发挥越来越重要作用。它是采用光谱、色谱等分析手段对中药材(或中成药)的成分进行检测，形成特有的专属化学图谱，该图谱能全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，具有相对唯一性，故称之为中药材(或中成药)的指纹图谱。中药指纹图谱由于体现了中医药的整体、宏观、复杂的特点很快成为国内外广泛接受的中药质量控制方法。

六味地黄丸在中药制剂中占有很重要的地位。目前，市场销售有很多厂家生产的六味地黄丸，其质量良莠不齐，因而六味地黄丸的稳定性难以保证。2005版中国药典规定的含量测定：牡丹皮中含丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，水蜜丸每1g不得少于1.0mg；小蜜丸每1g不得少于0.70mg；大蜜丸每丸不得少于6.3mg。含山茱萸以马钱苷(C₁₇H₂₆O₁₀)计，水蜜丸每1g不得少于0.70mg；小蜜丸每1g不得少于0.5mg；大蜜丸每丸不得少于4.5mg。采用此标准测定牡丹皮中的丹皮酚和山茱萸中马钱苷作为含量质量控制标准是在两个不同波长下，使用不同的前处理方法分别进行测定；此方法不能从整体上评价和控制的中药质量，且药典中马钱苷测定方法流动相体系和前处理均较复杂。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种六味地黄的新指纹图谱，及基于其指纹图谱的双波长覆盖融合的含量测定方法，以保证六味地黄药物的质量更加安全、可靠。

本发明是通过以下技术方案实现的：

六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的质量控制方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

(1)供试品溶液的制备：取本品六味地黄丸切碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取60～120分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品、丹皮酚对照品适量，加甲醇分别制成每1mL含马钱苷对照品14μg、丹皮酚对照品18μg的溶液，即得；

(3)测定方法：照高效液相色谱条件(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件和系统适用性试验，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：Agilent SB C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长236 nm、274nm；进样量10μL，理论塔板数计算，应不低于3000；

表1流动相梯度洗脱表

时间(min)	流速(mL/min)	水％	乙腈％
				08214050	1.01.01.01.01.0	9988881010	112129090

(4)双波长覆盖融合：将双波长下的色谱图中相同组分按最大峰面积覆盖融合，使其成为一张能够同时反映两个波长的信息的色谱图，达到定量的目的。

(5)对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、测定范围以及耐用性。

本发明所述六味地黄丸指纹图谱检测的质量控制方法，优选的供试品溶液的制备：该方法供试品溶液的制备：取本品水蜜丸切碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

本发明所述六味地黄丸指纹图谱检测的质量控制方法中，超声处理，超声60分钟。

本发明所述六味地黄丸指纹图谱检测的质量控制方法，优选的测定方法：照高效液相色谱条件(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件和系统适用性试验：色谱柱：Agilent SB C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长236nm、274nm；进样量10μL。理论塔板数计算，应不低于3000。

本发明所述的质量控制方法，其中优选的双波长融合为：在236nm波长下测得以马钱苷为对照的色谱图的保留时间与峰面积；与在274nm波长下丹皮酚为对照的色谱图的保留时间与峰面积，再使用Matlab 7.1进行编程，将不同波长下的色谱图中相同组分按最大峰面积覆盖融合，使其成为一张能够同时反映两个波长信息的色谱图。覆盖后的指纹图谱特征参数为：有七个共有峰，见图8，各特征峰以7号峰为参照峰，相对保留时间分别为：0.26，0.36，0.50，0.68，0.82，0.91，1。

更加优选的双波长覆盖融合，指的是：将236nm波长下测得马钱苷的保留时间与峰面积分别17.423min和600062，在274nm波长下丹皮酚的保留时间与峰面积为34.517min和3396812，使用Matlab 7.1进行编程，计算指纹峰的相对保留时间，其中马钱苷的相对保留时间为0.45-0.55，丹皮酚的保留时间为1。

本发明所述六味地黄丸指纹图谱的检测标准是：牡丹皮中含丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，水蜜丸每1g不得少于1.0mg；小蜜丸每1g不得少于0.70mg；大蜜丸每丸不得少于6.3mg。含山茱萸以马钱苷(C₁₇H₂₆O₁₀)计，水蜜丸每1g不得少于0.70mg；小蜜丸每1g不得少于0.5mg；大蜜丸每丸不得少于4.5mg。

本发明所述的质量控制方法，可检测提取方法相同或相近含有六味地黄组成的任何一种剂型。包括水蜜丸、大蜜丸、浓缩丸、颗粒或胶囊。优选六味地黄丸的质量控制方法为丸剂。

本发明的六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱质量控制方法与现有的中国药典规定的测定方法相比所具有的积极效果在于：

(1)本发明首次公开双波长覆盖融合指纹图谱用于含量测定的方法，通过指纹图谱中主要特征峰面积或峰面积的比值的测定，能有效的检测和控制六味地黄丸的质量，融合后的特征，反映两个吸收波长的峰面积，解决了同一张色谱图，两个最大吸收波长反映不同的两个待测组分的峰面积。

(2)本发明的质量控制方法，其优点是简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握六味地黄丸的品种和质量情况。

(3)本发明是将指纹图谱技术，结合被检测组分的特点，利用不同化合物最大紫外吸收波长产生的吸收峰覆盖融合，可消除不同波长产生吸收峰的干扰，确保所检测成分准确、可靠。双波长覆盖融合检测方法的应用，提供了一个适合中药特点的多组分含量测定方法，为中药质量控制提供全新的分析方法。

(4)本发明采用双波长覆盖融合指纹图谱用于六味地黄丸含量测定，提高了六味地黄丸的质量控制标准，从而有效确保了六味地黄丸的安全、均一、稳定、有效、可控，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。

附图说明

图1、236nm波长下对照品马钱苷与丹皮酚的色图谱。

图2、274nm波长下对照品马钱苷与丹皮酚的色图谱。

图3、马钱苷的紫外扫描图。

图4、丹皮酚的紫外扫描图。

图5、六味地黄丸236nm波长下HPLC指纹图谱。

图6、六味地黄丸274nm波长下HPLC指纹图谱。

图7为Matlab 7.1编程的两个波长覆盖融合的色谱图。

其中1-5图中的1为马钱苷(Loganin)，2为丹皮酚(Paeonol)。

两个波长覆盖融合的色谱特征数据是为：马钱苷的相对保留时间为0.50，覆盖后的峰面积为600062，丹皮酚的相对保留时间为1，覆盖后的峰面积为3396812；其他特征峰的相对保留时间为：0.26，0.36，0.68，0.82，0.91。

图8为覆盖融合后指纹图谱各共有指纹峰。

图9阴性样品的HPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详细说明如下；同时为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。

实施例1

取六味地黄丸水蜜丸切碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品、丹皮酚对照品适量，加甲醇分别制成每1mL含马钱苷对照品14μg、丹皮酚对照品18μg的溶液，即得。

测定方法：照高效液相色谱条件(中国药典2005版一部附录VID)测定。色谱条件和系统适用性试验：色谱柱：Agilent SB C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长236nm、274nm；进样量10μL。理论塔板数计算，应不低于3000。

表1流动相梯度洗脱表

以上六味地黄丸的指纹图谱所用的仪器试剂：

Waters 2695高效液相色谱仪，配置自动进样器、2996二极管阵列检测器、柱温箱。乙腈(色谱纯，美国Fisher)，超纯水(millipore)；其它试剂为分析纯。

双波长覆盖融合方法：

在236nm波长下测得马钱苷的保留时间与峰面积分别17.423min和600062，在274nm波长下丹皮酚的保留时间与峰面积为34.517min和3396812。再使用Matlab 7.1进行编程，将不同波长下的色谱图进行覆盖融合，使其成为一张能够同时反映两个波长信息的色谱图，达到定量的目的，覆盖后的指纹图谱特征参数为：有七个共有峰，见图8。各特征峰以7号峰为参照峰，相对保留时间分别为：0.26，0.36， 0.50，0.68，0.82，0.91，1。其中马钱苷的相对保留时间为0.5，丹皮酚的保留时间为1。

实施例2

取六味地黄浓缩丸切碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取是超声处理120分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表1流动相梯度洗脱表

以上六味地黄丸的指纹图谱所用的仪器试剂：

双波长覆盖融合方法：在236nm波长下测得马钱苷的保留时间与峰面积分别17.423min和600062，在274nm波长下丹皮酚的保留时间与峰面积为34.517min和3396812。再使用Matlab 7.1进行编程，将不同波长下的色谱图进行覆盖融合，使其成为一张能够同时反映两个波长信息的色谱图，达到定量的目的。覆盖后的指纹图谱特征参数为：有七个共有峰，各特征峰以7号峰为参照峰，相对保留时间分别为：0.26，0.36，0.50，0.68，0.82，0.91，1(祥见见图8)。其中马钱苷的相对保留时间为0.5，丹皮酚的保留时间为1。

实施例3

采用常规方法与双波长覆盖融合方法测定同一批号的六味地黄丸的比较实验：

常规方法：

取六味地黄丸样品×××药业公司(批号为B058220)按照按药典方法，分别测定马钱苷和丹皮酚。

马钱苷测定方法为：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以四氢呋喃-乙腈一甲醇一0.05％磷酸溶液(1∶8∶4∶87)为流动相；检测波长为236nm；柱温40℃，理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取马钱苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含20mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品水蜜丸或小蜜丸，切碎，取约0.712g，0.7029g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，功率33kHz)15分钟使溶散，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重童，摇匀.滤过.精密称取续滤液10mL，置中性氧化铝柱(100～200目，4g，内径1cm，干法装柱)上，用40％甲醇50mL洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇适量便溶解，并转移至10mL量瓶中，加50％甲醇适量使溶解，并转移至10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，即得。

经计算得，两个平行样含量分别：0.8892mg/g，0.8818mg/g，平均值：0.8855mg/g。即：×××药业公司(批号B058220)中，马钱苷的含量为0.8855mg/g。

丹皮酚测定方法为：

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(70∶30)为流动相；检测波长为274nm。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3500。对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醉制成每1mL含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品，切碎，分别精密称取0.3038g，0.3005g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

经计算得：两个平行样中丹皮酚的含量分别为：1.6360mg/g，1.6795mg/g，平均值为：1.6578mg/g。即：×××药业公司(批号B058220)中，丹皮酚的含量为1.6578mg/g。

按照本专利所述的检测方法：

色谱条件，色谱柱：Agilent SB C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长236nm、274nm；进样量10μL，理论塔板数计算，应不低于3000。

表1流动相梯度洗脱表

供试品溶液的制备：取六味地黄浓缩丸切碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

经计算得，六味地黄丸样品×××药业公司(批号B058220)中马钱苷的含量为0.8789g，0.8836g，平均值为0.8812mg/g。计算得丹皮酚的含量为：1.6708mg/g，1.6576mg/g，平均值为1.6642mg/g。

本发明进一步对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性及线形范围。

①精密度考察：

取同一供试品溶液在上述条件下连续进样6次，分别对2种物质进行定量测定，考察方法的精密度，结果表明，马钱苷为0.75％，丹皮酚为0.99％。

②重复性实验：

平行制备6份供试品溶液，在上述条件下分别对2种物质进行定量测定，考察方法的重复性，结果表明马钱苷为1.94％，丹皮酚为2.71％。

③稳定性实验：

同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、16、24 h对2种物质进行定量测定，考察方法的样品稳定性，结果表明马钱苷为1.42％，丹皮酚为1.14％。

④线形范围：

在上述条件下，2个成分分别在9个浓度点，用峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，结果马钱苷、丹皮酚的回归方程分别为：Y＝17191X-1517.5(r＝0.9998)，Y＝51101X+24480(r＝0.9998)。马钱苷在3.62～108.6μg/ml、丹皮酚在4.505～135.15μg/ml的范围内线性关系良好。

⑤专属性：

按处方配置不含牡丹皮与山茱萸的空白样品，再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定结果见图9；阴性样品溶液对含量测定无干扰。

测定结果：

由市场直接购买的六味地黄丸(水蜜丸)，按专利所述方法，测定其中的马钱苷、丹皮酚2种成分。结果见表2。

表2 3批六味地黄丸中各成分的含量(n＝2)

批号(Lot No.)	马钱苷(Loganin)mg/g	丹皮酚(Paeonol)mg/g
			B058220B058207B058227	0.88120.87540.7606	1.66421.22961.1657

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims

1.六味地黄丸双波长覆盖融合指纹图谱的检测方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

(3)测定方法：照高效液相色谱条件，按照中国药典2005版一部附录VID测定，色谱条件和系统适用性试验，色谱柱：用4.6mm×250mm，5μm十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长236nm、274nm；进样量10μL，理论塔板数计算，应不低于3000；

表1流动相梯度洗脱表

(4)双波长覆盖融合：在236nm波长下测得供试品以马钱苷为对照的色谱图的保留时间与峰面积；与在274nm波长下测得供试品以丹皮酚为对照的色谱图的保留时间与峰面积，使用Matlab 7.1进行编程；覆盖后的指纹图谱特征参数为：有七个共有峰，各特征峰以7号峰为参照峰，相对保留时间分别为：0.26，0.36，0.50，0.68，0.82，0.91，1min；

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法供试品溶液的制备：取本品水蜜丸切碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.如权利要求1所述的检测方法，其中的双波长覆盖融合，指的是：将236nm波长下测得六味地黄丸的HPLC色谱图及在274nm波长下测得六味地黄丸的HPLC色谱图，使用Matlab 7.1进行编程覆盖融合；计算指纹峰的相对保留时间，其中马钱苷的相对保留时间为0.45-0.55min，丹皮酚的保留时间为1min。