CN104165959A - 一种治疗小儿发热药物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗小儿发热药物的检测方法,包括如下步骤:1)取盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品,以醇类为溶剂,配制混合对照品溶液;取羚黄宝儿丸粉碎后与醇类水溶液混合,获得供试品溶液;2)分别取不同浓度的混合对照品溶液,经HPLC检测,分别获得峰面积,制作标准曲线,得到标准曲线;3)取供试品溶液经HPLC检测,获得供试品溶液的峰面积,与标准曲线比较,获得供试品溶液中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷、甘草酸铵的含量。本发明能够避免仅靠测定单一成分而定夺药品质量好坏的片面性,具有更全面、可靠、准确度、精密度高,稳定性、重复性较好的特点。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域,涉及一种治疗小儿发热药物的检测方法,具体涉及一种使用HPLC法同时检测药物中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵四种成分含量的方法,所述药物是指羚黄宝儿丸。
背景技术
羚黄宝儿丸为中药复方制剂,具有清热熄风,除痰定惊,开窍醒神之功效,用于小儿发热,惊哭夜啼,痰热咳嗽,泄泻,脾胃虚弱及消化不良等症。但目前羚黄宝儿丸的质量标准尚未收录有关含量测定的方法。
现有技术1:羚黄宝儿丸质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第14册,但标准中无含量测定方法,不利于该制剂的质量控制。
现有技术2:黄俊忠等.HPLC法测定羚黄宝儿丸中盐酸小檗碱的含量.中国药师,2012,15(3):430-431.只测定单个成分的含量。
现有技术3:钟文山.HPLC法测定羚黄宝儿丸中盐酸小檗碱含量.今日药学,2012,22(2):100-102.只测定单个成分的含量。
现有技术4:黎美芬等.高效液相色谱法测定羚黄宝儿丸中甘草酸的含量.中国现代药物应用,2014,2,8(3):100-102.只测定单个成分的含量。
综上可以看出,中药复方制剂通常以“君、臣、佐、使”相互制约和协调,强调从整体上发挥作用,多半不是针对某个靶点,也不是若干成分的简单加合,仅靠单一成分的检测缺乏全面性,不能反映药品内在质量。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的旨在提供一种更全面、可靠的治疗小儿发热药物的检测方法。在该方法提供的色谱条件下,供试品溶液的盐酸巴马汀色谱峰、盐酸小檗碱色谱峰、甘草苷色谱峰和甘草酸铵色谱峰能得到有效基线分离,避免仅靠测定单一成分而定夺药品质量好坏的片面性。该检测方法同时还具有准确度、精密度高,稳定性、重复性较好的特点。
一种治疗小儿发热药物的检测方法,包括如下步骤:
步骤1):取盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品,以醇类为溶剂,配制含有盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品的混合对照品溶液;取羚黄宝儿丸粉碎后与醇类水溶液混合,经超声提取、冷却补液、过滤,获得供试品溶液;
步骤2):分别取不同浓度的混合对照品溶液,经高效液相色谱法(HPLC)检测,分别获得混合对照品溶液的峰面积,以所述混合对照品溶液的浓度为横坐标,以所述混合对照品溶液的峰面积为纵坐标,制作标准曲线,得到混合对照品溶液的标准曲线;
步骤3):取供试品溶液经高效液相色谱法(HPLC)检测,获得供试品溶液的峰面积,与混合对照品溶液的标准曲线比较,根据标准曲线获得供试品溶液中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷、甘草酸铵的含量;
在步骤2)和/或步骤3)中,高效液相色谱法(HPLC)检测的色谱条件为:采用C18色谱柱,柱温26~38℃,检测波长为240nm~245nm,以乙腈为流动相A、以酸水-磷酸二氢钾溶液混合液为流动相B,流动相流速为1mL/min;梯度洗脱程序为:0~7min,乙腈体积百分数由27%至29%;7~13min,乙腈体积百分数为29%;13~30min,乙腈体积百分数由29%至42%;30~40min,乙腈体积百分数由42%至27%。具体如表1所示。其中,酸水是指酸的水溶液,酸水-磷酸二氢钾溶液混合液是指由酸的水溶液与磷酸二氢钾缓冲盐溶液混合配制成的混合液。
表1梯度洗脱程序
时间(min) | 乙腈(A)% | 酸水-磷酸二氢钾溶液混合液(B)% |
0 | 27 | 73 |
7 | 29 | 71 |
13 | 29 | 71 |
30 | 42 | 58 |
40 | 27 | 73 |
实现本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到:
作为优选,所述流动相B中的酸水为磷酸水溶液,所述磷酸水溶液中磷酸的体积百分数为0.1%~0.5%;所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L~0.05mol/L。选用磷酸的基础上再加磷酸二氢钾缓冲盐配制成流动相B,可使四种有效成分的峰型更对称,可消除待测成分吸收峰的拖尾现象。
外标法是仪器分析常用的方法之一,比较法的一种。外标法在与被测样品相同的色谱条件下单独测定,把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
作为优选,所述磷酸水溶液中磷酸的体积百分数为0.1%。
作为优选,所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02mol/L。
作为优选,检测波长的范围为240nm~245nm。结合盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵的紫外吸收图谱,经比较确定检测波长的范围为240nm~245nm,在此范围内,240nm波长下检测各成分峰面积均较大。
作为优选,柱温为35℃。
作为优选,在步骤1)中,所述醇类为甲醇或乙醇。更佳的优选,所述醇类为甲醇。
作为优选,在步骤1)中,所述混合对照品溶液的制备方法为称取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵,加甲醇制得浓度为20μg/mL~302μg/mL的混合对照品溶液。
作为优选,在步骤1)中,所述供试品溶液的制备方法为取羚黄宝儿丸,加入甲醇后超声提取,制得供试品溶液,以mg/mL计,所述羚黄宝儿丸与所述甲醇的质量体积比为100:5~6。
作为优选,所述超声提取的时间为15~45min。
本发明的有益效果在于:
1、在本发明提供的高效液相色谱条件下,分别检测不同浓度的对照品溶液和供试品溶液的峰面积,以对照品溶液的浓度和峰面积制作标准曲线,用供试品溶液的峰面积与标准曲线作比较,同时获得供试品溶液中四个有效成分的浓度。因此,与现有技术比较,本发明测定方法有显著的技术进步。第一、测定有效成分指标更全面,即同时测定产品中的4种有效成分,可更全面地控制羚黄宝儿丸的产品质量,更有效地保障产品的质量;第二、检测效率有显著的提高,本发明是在同一个色谱条件下同时测定产品中的4种有效成分,而现有技术只是检测一种有效成分。第三、本发明用同一方法测定四种成分,可显著缩短产品的检验周期,显著减少有机溶剂的使用,显著减少检测时间和成本,既高效又环保。
2、羚黄宝儿丸是中药复方制剂,其成分复杂,发明人通过大量研究得到本发明所述的甘草苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草酸铵的含量测定方法,并进行了系列的方法学验证,实验结果表明本发明的检测方法准确度好、精密度高、重复性好、专属性强,符合中药质量标准研究的技术要求。
附图说明
图1a为实施例1混合对照品溶液色谱图;
图1b为实施例1供试品溶液色谱图;
图1c为实施例10的阴性对照HPLC图谱;
图2a为实施例5所述甘草苷的标准曲线图;
图2b为实施例5所述盐酸巴的标准曲线图;
图2c为实施例5所述盐酸小檗碱的标准曲线图;
图2d为实施例5所述甘草酸铵的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做具体说明。
本发明提供的检测方法中所用试剂均可由市场购得。其中,羚黄宝儿丸为广州白云山敬修堂药业股份有限公司生产,盐酸巴马汀购自中国食品药品检定研究院(含量:86.2%,批号为110732-201108),盐酸小檗碱购自中国食品药品检定研究院(含量:86.8%,批号为110713-200911),甘草苷购自中国食品药品检定研究院(批号为111610-200604),甘草酸铵购自中国食品药品检定研究院(批号为110731-200511)。
实施例1-4:
实施例1-4采用不同色谱条件对盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵进行检测;
分别取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵4种对照品适量,置50mL容量瓶中,加甲醇制成每1mL含盐酸巴马汀60μg、盐酸小檗碱80μg、甘草苷70μg和甘草酸铵200μg的混合溶液,作为混合对照品溶液。
羚黄宝儿丸粉碎后过四号筛,取细粉0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声(480W,40KHz)处理30min,放冷,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
梯度洗脱程序:0~7min,A相体积百分数由27%至29%;7~13min,A相体积百分数为29%;13~30min,A相体积百分数由29%至42%;30~40min,A相体积百分数由42%至27%;
流速:1mL/min;
进样量:5μL;
其他色谱条件如表1所示:
表2本发明实施例1~4不同的色谱条件
按照表2所示色谱条件,采用本发明提供的梯度洗脱程序,分别对混合对照品溶液和供试品溶液进行色谱分析。
其中,采用实施例1中提供的色谱条件对混合对照品溶液和供试品溶液进行分析所得色谱图如图1a、图1b所示;
图1a示混合对照品溶液色谱图,其中保留时间为5.346min的峰为甘草苷峰,保留时间为12.507min的峰为盐酸巴马汀峰,保留时间为13.238min的峰为盐酸小檗碱峰,保留时间为31.073min的峰为甘草酸铵峰;
图1b示供试品溶液色谱图,其中保留时间为5.296min的峰为甘草苷峰,保留时间为12.453min的峰为盐酸巴马汀峰,保留时间为13.035min的峰为盐酸小檗碱峰,保留时间为31.095min的峰为甘草酸铵峰。
实施例5:
本实施例提供方法的线性范围考察。
取甘草苷10mg、盐酸巴马汀10mg、盐酸小檗碱12mg、和甘草酸铵10mg中对照品,精密称定,置同一50ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度。分别精密吸取对照品溶液1ml、2ml、3ml、5ml、8ml、10ml至10ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度并摇匀,按本发明实施例1提供的方法,依次进样测定。以测定峰面积为纵坐标,对照品溶液浓度为横坐标(μg/ml)绘制标准曲线,其结果见表3、图2a、2b、2c、2d。
表3四种对照品的回归方程、相关系数和线性范围
实施例6
本实施例提供方法的精密度试验:
羚黄宝儿丸粉碎后过四号筛,取细粉0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇30mL,称定重量,超声(480W,40KHz)处理15min,放冷,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
取待测溶液,按照本发明实施例1提供的方法,连续进样6次,每次5μL,记录盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵的峰面积,计算相对标准偏差,结果如表4所示,结果显示,采用本发明提供的方法连续6次检测羚黄宝儿丸中的盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵,其峰面积相对标准偏差(RSD%)不超过1%,表明本发明提供的方法具有良好的精密度。
表4精密度试验结果
实施例7
本实施例提供方法的稳定性试验
超声提取时间为45min,制备待测溶液的其它操作同实施例6。取待测溶液及上述四种对照品混合溶液,分别于放置0、2、4、6、8、12、24小时后进样,每次5μL,按照本发明实施例1提供的方法测定,记录盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵的峰面积,计算相对标准偏差,结果如表5a、表5b所示,结果显示,采用本发明提供的方法,连续检测放置24小时的羚黄宝儿丸待测溶液和四种对照品混合溶液,盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵峰面积相对标准偏差(RSD%)不超过1.5%,表明本发明提供的方法具有良好的稳定性。
表5a待测溶液稳定性试验结果
表5b对照品混合溶液稳定性试验结果
实施例8
本实施例提供方法的加样回收试验:
通过加样回收的方法,对本发明提供的方法的准确度进行分析。羚黄宝儿丸粉碎后过四号筛,取两份细粉各0.25g,精密称定,取其中一份测定其盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵的含量,另外一份准确加入盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵,这4种对照品加入量如表6所示。置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声(480W,40KHz)处理30min,放冷,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,作为供试品溶液。按本发明实施例1提供的方法,检测4种成分的平均加样回收率,试验重复6次。结果见表6,结果显示,甘草苷的回收率为98.97%~99.40%,盐酸巴马汀的回收率为98.35%~99.86%,盐酸小檗碱的回收率为97.10%~99.56%,甘草酸铵的回收率为97.27%~100.11%。表明本发明提供的方法具有良好的准确度。
表6加样回收结果
实施例9
本实施例提供方法的重复性试验:
按实施例1的方法制备6份待测溶液,采用实施例1提供的方法,检测其中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵的含量,表7结果显示,采用本发明提供的方法,连续检测6份羚黄宝儿丸待测溶液,其盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵含量的相对标准偏差(RSD%)不超过1%,表明本发明提供的方法具有良好的重复性。
表7重复性试验结果
实施例10
本实施例提供方法的专属性试验:
按羚黄宝儿丸的处方比例制备分别缺黄连和甘草的阴性对照溶液,按本发明实施例1测定方法测定,精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5μl,分别注入液相色谱仪,结果在甘草苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和甘草酸铵对照品峰相同保留时间位置上未见有峰,说明羚黄宝儿丸中其它组分对本方法测定供试品中甘草苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和甘草酸铵的含量无干扰。说明本发明用于测定羚黄宝儿丸中甘草苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和甘草酸铵含量的专属性强。阴性对照溶液图谱见图1c。
实施例11,按现有技术2操作,只能测定羚黄宝儿丸中盐酸小檗碱含量,而其它三种有效成分甘草苷、盐酸巴马汀和甘草酸铵的吸收峰均无法有效分离,即无法检测此三种有效成分。
实施例12,按现有技术3操作,只能测定羚黄宝儿丸中盐酸小檗碱含量,而其它三种有效成分甘草苷、盐酸巴马汀和甘草酸铵的吸收峰均无法有效分离,即无法检测此三种有效成分。
实施例13,按现有技术4操作,只能测定羚黄宝儿丸中甘草酸含量,而其它三种有效成分甘草苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的吸收峰均无法有效分离,即无法检测此三种有效成分。
实施例14,梯度洗脱程序如表8,其它按实施例1操作,结果表明甘草酸铵吸收峰无法分离。
表8梯度洗脱程序
时间(min) | 乙腈(A)% | 酸水-磷酸二氢钾溶液混合液 |
0 | 22.5 | 77.5 |
26 | 22.5 | 77.5 |
33 | 37 | 63 |
45 | 42 | 58 |
50 | 22.5 | 77.5 |
实施例15,梯度洗脱程序如表9,其它按实施例1操作,结果表明在甘草酸铵吸收峰前有肩峰,还是不符合要求。
表9梯度洗脱程序
时间(min) | 乙腈(A)% | 酸水-磷酸二氢钾溶液混合液 |
0 | 22.5 | 77.5 |
25 | 22.5 | 77.5 |
32 | 39.5 | 60.5 |
45 | 39.5 | 60.5 |
50 | 22.5 | 77.5 |
实施例16,梯度洗脱程序如表10,其它按实施例1操作,结果表明盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的吸收峰无法有效分离。
表10梯度洗脱程序
时间(min) | 乙腈(A)% | 酸水-磷酸二氢钾溶液混合液 |
0 | 30 | 70 |
15 | 30 | 70 |
35 | 45 | 55 |
45 | 30 | 70 |
实施例17,梯度洗脱程序如表11,其它按实施例1操作,结果表明盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的吸收峰无法有效分离。
表11梯度洗脱程序
0 | 27.5 | 72.5 |
15 | 27.5 | 72.5 |
30 | 42 | 58 |
38 | 27.5 | 72.5 |
上述实施例仅为本发明优选的实施案例,不能以此来限定本发明所要求保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的及替换均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1):取盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品,以醇类为溶剂,配制含有盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品的混合对照品溶液;取羚黄宝儿丸粉碎后与醇类水溶液混合,经超声提取、冷却补液、过滤,获得供试品溶液;
步骤2):分别取不同浓度的混合对照品溶液,经高效液相色谱法检测,分别获得混合对照品溶液的峰面积,以所述混合对照品溶液的浓度为横坐标,以所述混合对照品溶液的峰面积为纵坐标,制作标准曲线,得到混合对照品溶液的标准曲线;
步骤3):取供试品溶液经高效液相色谱法检测,获得供试品溶液的峰面积,与混合对照品溶液的标准曲线比较,根据标准曲线获得供试品溶液中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷、甘草酸铵的含量;
在步骤2)和/或步骤3)中,高效液相色谱法检测的色谱条件为:采用C18色谱柱,柱温26~38℃,检测波长为240nm~245nm,以乙腈为流动相A、以酸水-磷酸二氢钾溶液混合液为流动相B,流动相流速为1mL/min;梯度洗脱程序为:0~7min,乙腈体积百分数由27%至29%;7~13min,乙腈体积百分数为29%;13~30min,乙腈体积百分数由29%至42%;30~40min,乙腈体积百分数由42%至27%。
2.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:所述流动相B中的酸水为磷酸水溶液,所述磷酸水溶液中磷酸的体积百分数为0.1%~0.5%;所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L~0.05mol/L。
3.根据权利要求2所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:所述磷酸水溶液中磷酸的体积百分数为0.1%。
4.根据权利要求2所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02mol/L。
5.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:检测波长的范围为240nm~245nm。
6.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:柱温为35℃。
7.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:在步骤1)中,所述醇类为甲醇或乙醇。
8.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:在步骤1)中,所述混合对照品溶液的制备方法为称取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草苷和甘草酸铵,加甲醇制得浓度为20μg/mL~302μg/mL的混合对照品溶液。
9.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:在步骤1)中,所述供试品溶液的制备方法为取羚黄宝儿丸,加入甲醇后超声提取,制得供试品溶液,以mg/mL计,所述羚黄宝儿丸与所述甲醇的质量体积比为100:5~6。
10.根据权利要求1所述的治疗小儿发热药物的检测方法,其特征在于:在步骤1)中,所述超声提取的时间为15~45min。
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