CN105301136B - 一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法包括：取九味熄风颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，梯度洗脱；根据HPLC检测结果，获得九味熄风颗粒成分及其含量。本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映九味熄风颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

Description

一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法。
背景技术
多发性抽动症又称为抽动秽语综合征，Tourette综合征，是一种以慢性、波动性、多发性运动性抽动，伴有不自主发声为特征的遗传性神经精神疾病。多发性抽动症已经比较常见，仅在基层医院每年就有不少患儿前来就诊，近年来，多发性抽动症的发病有明显增多的趋势。流行病学调查显示，多发性抽动症的年发病率一般为0.5～1/10万(每10万中每年发生新病人的数目)。多发性抽动症在男性的发病明显多于女性，文献报告的结果差异较大，男女之比从1.6：1到10：1，患病率至少为0.5‰以上。
九味熄风颗粒具有很好的滋阴补肾、平肝熄风、化痰宁神作用，主治小儿多发性抽动症，证属肾阴亏损，肝风内动型，喉中发出异常声音，神思涣散，注意力欠集中，小动作多，性情急躁等。其由熟地黄、龙骨、龟甲、天麻、龙胆、钩藤、僵蚕、青礞石、法半夏等制成，九味熄风颗粒中的主要成分有生物碱、环烯醚萜类等成分。具有以下疗效：
1、九味熄风颗粒可以滋阴补肾：瞄准病源，补肾阴，清神志，迅速缓解抽动多动症状，提升注意力集中程度。
2、九味熄风颗粒可以化痰宁神：调和阴阳，化痰湿，又治标，由内而外，焕然一新，增强体质祛除兼症，彻底康复。
3、九味熄风颗粒可以平肝熄风：深度濡养，熄肝风，固本元，平息抽动多动症状，走出病患心理，重享金色童年。
随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要包括：
1、原药材的质量
中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的限制许多地方采取用种植的药材来代替这种家种的药材会严重影响药剂的质量，使药材的质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升家中药材的产量，从而导致这与野生药材的气味发生了改变，从而影响了中药的疗效。
2、生产过程
在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细的按照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。此外，还要注意中药制剂的粉碎、浓缩、干燥、精制和提取等方面的工序，这对中药成品的成分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量。
3、工艺用水、洁净区环境、工艺卫生
在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品。
4、包装材料及现代包装技术
现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性，它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解，使用劣质的保障袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因为受潮变质等问题的出现，这严重影响制剂的质量。
因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。目前关于九味熄风颗粒的质量控制方法尚无明确报道，因此提供一种九味熄风颗粒的质量控制方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映九味熄风颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种九味熄风颗粒成分定量检测方法，包括如下步骤：
取九味熄风颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A为40％；5～30min，流动相A从40％升至60％；30～50min，流动相A从60％升至75％；50～60min，流动相A为75％；
根据HPLC检测结果，获得九味熄风颗粒成分及其含量。
本发明采用上述检测方法对九味熄风颗粒成分进行定量检测时，能较全面的反映九味熄风颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
作为优选，HPLC检测的波长为230～260nm。
优选地，HPLC检测的波长为246nm。
作为优选，三乙胺的质量百分含量为0.05％～0.15％。
优选地，三乙胺的质量百分含量为0.1％。
作为优选，HPLC检测的流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，HPLC检测的流速为1.0mL/min。
作为优选，HPLC检测的柱温为30～40℃。
优选地，HPLC检测的柱温为35℃。
作为优选，C18色谱柱为Phenomenex GeminiC18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC-C18色谱柱、Kromasil 100-5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。
作为优选，C18色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
作为优选，九味熄风颗粒供试品的制备方法为：取九味熄风颗粒与氨水、水、氯仿混合，回流提取，分出氯仿层，去除氯仿，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液过滤膜，得到九味熄风颗粒供试品。
作为优选，以g/mL/mL/mL计，九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为(1～5)：(1～10)：(20～30)：(15～25)。
优选地，以g/mL/mL/mL计，九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为3：5：25：20。
作为优选，回流提取的时间为80～100min。
优选地，回流提取的时间为90min。
作为优选，标准品为钩藤碱标准品、异钩藤碱标准品、去氢钩藤碱标准品或异去氢钩藤碱标准品中的一种或两者以上的混合物。
在本发明提供的一些实施例中，钩藤碱对照品的浓度为45.05μg/mL，异钩藤碱对照品的浓度为45.06μg/mL，去氢钩藤碱对照品的浓度为50.18μg/mL，异去氢钩藤碱对照品的浓度为50.29μg/mL。
本发明还提供了一种九味熄风颗粒指纹图谱构建方法，包括：取九味熄风颗粒供试品进行HPLC检测，获得九味熄风颗粒指纹图谱；
HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A为40％；5～30min，流动相A从40％升至60％；30～50min，流动相A从60％升至75％；50～60min，流动相A为75％。
作为优选，HPLC检测的波长为230～260nm。
优选地，HPLC检测的波长为246nm。
作为优选，三乙胺的质量百分含量为0.05％～0.15％。
优选地，三乙胺的质量百分含量为0.1％。
作为优选，HPLC检测的流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，HPLC检测的流速为1.0mL/min。
作为优选，HPLC检测的柱温为30～40℃。
优选地，HPLC检测的柱温为35℃。
作为优选，C18色谱柱为Phenomenex GeminiC18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC-C18色谱柱、Kromasil 100-5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。
作为优选，C18色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
作为优选，九味熄风颗粒供试品的制备方法为：取九味熄风颗粒与氨水、水、氯仿混合，回流提取，分出氯仿层，去除氯仿，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液过滤膜，得到九味熄风颗粒供试品。
作为优选，以g/mL/mL/mL计，九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为(1～5)：(1～10)：(20～30)：(15～25)。
优选地，以g/mL/mL/mL计，九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为3：5：25：20。
作为优选，回流提取的时间为80～100min。
优选地，回流提取的时间为90min。
本发明提供了一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法包括：取九味熄风颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A为40％；5～30min，流动相A从40％升至60％；30～50min，流动相A从60％升至75％；50～60min，流动相A为75％；根据HPLC检测结果，获得九味熄风颗粒成分及其含量。
本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映九味熄风颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
附图说明
图1示钩藤碱标准曲线；
图2示异钩藤碱标准曲线；
图3示去氢钩藤碱标准曲线；
图4示异去氢钩藤碱标准曲线；
图5示九味熄风颗粒对照指纹图谱；
图6示九味熄风颗粒指纹图谱中色谱峰来源指认；
图7示专属性试验图谱(A-混合对照品，B-不含钩藤的阴性样品，C-供试品)。
具体实施方式
本发明公开了一种九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的九味熄风颗粒成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法中所用药品、试剂、仪器均可由市场购得：
仪器与试药：
Ultimate 3000HPLC，DAD紫外检测器(美国赛默飞世尔科技公司)；Mettler AE240电子分析天平(德国梅特勒公司)；BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Centrifuge 5415D高速离心机(德国Eeppendorf公司)；Milli-Q Academic纯水机(美国密理博公司)；KQ-250DB型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。
对照品钩藤碱(批号140404，纯度≥98.0％)，异钩藤碱(批号140203，纯度≥98.0％)，去氢钩藤碱(批号141124，纯度≥98.0％)，异去氢钩藤碱(批号140305，纯度≥98.0％)购自成都普菲德生物科技有限公司；甲醇(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯(南京化学试剂公司)。
药品来源：本研究用九味熄风颗粒由江苏康缘药业股份有限公司生产。
参照物的选择：九味熄风颗粒指纹图谱为针对处方中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱建立的指纹图谱，因此选择保留时间适中、分离较好的异去氢钩藤碱作为参照物。在以下实施例中与参照物峰相应的峰为S峰。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1九味熄风颗粒成分定量检测方法
1、色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Phenomenex GeminiC18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％三乙胺为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为246nm；柱温35℃；理论板数按钩藤碱峰计算不低于5000。
表1梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 40 60
5～30 40→60 60→40
30～50 60→75 40→25
50～60 75 25
2、对照品溶液的制备：精密称定对照品钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱适量，加80％乙醇制成含钩藤碱45.05μg/mL，异钩藤碱45.06μg/mL，去氢钩藤碱50.18μg/mL，异去氢钩藤碱50.29μg/mL的混合对照品溶液，即得。
3、供试品溶液的制备：取装量差异项下本品，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取90min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。
4、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按照第一部分中色谱条件进行测定，即得。
注：九味熄风颗粒每袋含钩藤碱(C22H28N2O4)不得少于0.41mg，异钩藤碱(C22H28N2O4)不得少于0.25mg，去氢钩藤碱(C22H26N2O4)不得少于0.33mg，异去氢钩藤碱(C22H26N2O4)不得少于0.45mg。
实施例2九味熄风颗粒成分定量检测方法
1、色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Thermo syncronis C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.05％三乙胺为流动相B，按实施例1表1中的规定进行梯度洗脱；流速为1.2mL/min；检测波长为230nm；柱温30℃；理论板数按钩藤碱峰计算不低于5000。
2、对照品溶液的制备：精密称定对照品钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱适量，加80％乙醇制成含钩藤碱45.05μg/mL，异钩藤碱45.06μg/mL，去氢钩藤碱50.18μg/mL，异去氢钩藤碱50.29μg/mL的混合对照品溶液，即得。
3、供试品溶液的制备：取装量差异项下本品，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取100min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。
4、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按照第一部分中色谱条件进行测定，即得。
实施例3九味熄风颗粒成分定量检测方法
1、色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent 5TC-C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.15％三乙胺为流动相B，按实施例1表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min；检测波长为260nm；柱温40℃；理论板数按钩藤碱峰计算不低于5000。
2、对照品溶液的制备：精密称定对照品钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱适量，加80％乙醇制成含钩藤碱45.05μg/mL，异钩藤碱45.06μg/mL，去氢钩藤碱50.18μg/mL，异去氢钩藤碱50.29μg/mL的混合对照品溶液，即得。
3、供试品溶液的制备：取装量差异项下本品，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取80min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。
4、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按照第一部分中色谱条件进行测定，即得。
实施例4线性关系考察
精密称取去氢钩藤碱、异钩藤碱、异去氢钩藤碱、钩藤碱适量，加80％乙醇制成含钩藤碱270.30μg/mL，异钩藤碱270.36μg/mL，去氢钩藤碱301.08μg/mL，异去氢钩藤碱301.74μg/mL的混合对照品溶液，将其作为母液用80％乙醇等比稀释，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，按实施例1方法测定，结果见表2-5。以对照品的峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)进行线性拟合，绘制标准曲线，结果图1-4。各对照品线性范围、回归方程和相关系数见表6。
表2钩藤碱线性关系考察结果
序号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/mL) 8.45 16.89 33.79 67.58 135.15 270.30
峰面积 4.89 9.73 19.09 38.45 78.07 153.50
表3异钩藤碱线性关系考察结果
序号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/mL) 8.45 16.90 33.80 67.59 135.18 270.36
峰面积 5.14 10.28 20.54 41.11 81.54 164.36
表4去氢钩藤碱线性关系考察结果
序号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/mL) 9.41 18.82 37.64 75.27 150.54 301.08
峰面积 5.06 10.13 19.92 40.99 80.84 162.09
表5异去氢钩藤碱线性关系考察结果
序号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/mL) 9.43 18.86 37.72 75.44 150.87 301.74
峰面积 5.83 11.69 23.39 46.59 93.83 187.09
表6各对照品线性范围、回归方程和相关系数
对照品 线性范围(μg/mL) 回归方程 相关系数
钩藤碱 8.45～270.30 Y＝0.5688X+0.1691 r＝1
异钩藤碱 8.45～270.36 Y＝0.6073X-0.0495 r＝1
去氢钩藤碱 9.41～301.08 Y＝0.5384X-0.0151 r＝1
异去氢钩藤碱 9.43～301.74 Y＝0.6204X-0.0195 r＝1
实施例5精密度试验
(1)对照品溶液精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液(钩藤碱浓度为67.58μg/mL，异钩藤碱浓度为67.59μg/mL，去氢钩藤碱浓度为75.27μg/mL，异去氢钩藤碱浓度为75.44μg/mL)注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明精密度良好，见表7。
表7对照品溶液精密度考察结果
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤
1 38.45 41.11 40.99 46.59
2 38.34 41.20 41.07 46.52
3 38.39 41.03 40.89 46.64
4 38.52 41.09 40.92 46.71
5 38.37 41.27 41.01 46.56
6 38.49 41.18 40.98 46.63
Ave 38.43 41.15 40.98 46.61
RSD 0.19％ 0.21％ 0.16％ 0.14％
(2)样品精密度试验
取批号为130701的九味熄风颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取90min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，连续进样6次，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积结果见表8和表9，4个指标成分峰面积结果见表10。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法精密度良好。
表8样品精密度考察结果(共有峰的相对保留时间)
峰号 1 2 3 4 5 6 Ave RSD
1 0.119 0.117 0.115 0.118 0.117 0.114 0.117 1.60％
2 0.152 0.155 0.154 0.156 0.153 0.157 0.155 1.21％
3 0.189 0.185 0.187 0.188 0.186 0.187 0.187 0.76％
4 0.279 0.281 0.274 0.277 0.280 0.276 0.278 0.95％
5 0.333 0.335 0.331 0.330 0.334 0.330 0.332 0.64％
6(去氢钩藤碱) 0.875 0.891 0.887 0.870 0.886 0.902 0.885 1.29％
7(异钩藤碱) 0.893 0.899 0.894 0.901 0.896 0.905 0.898 0.51％
8(异去氢钩藤碱)S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00％
9 1.023 1.025 1.019 1.020 1.024 1.023 1.022 0.23％
10(钩藤碱) 1.081 1.089 1.082 1.088 1.090 1.086 1.086 0.34％
11 1.111 1.113 1.109 1.112 1.117 1.113 1.113 0.24％
12 1.191 1.187 1.201 1.190 1.189 1.192 1.192 0.41％
13 1.226 1.231 1.220 1.235 1.223 1.229 1.220 0.45％
表9样品精密度考察结果(主要色谱峰的相对峰面积)
峰号 1 2 3 4 5 6 Ave RSD
1 0.21 0.22 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 1.93％
2 0.48 0.47 0.47 0.48 0.47 0.47 0.47 1.09％
6(去氢钩藤碱) 0.70 0.70 0.72 0.70 0.70 0.71 0.71 1.19％
7(异钩藤碱) 0.56 0.54 0.54 0.54 0.55 0.54 0.55 1.54％
8(异去氢钩藤碱)S 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00％
10(钩藤碱) 0.87 0.88 0.90 0.87 0.88 0.87 0.88 1.33％
11 0.30 0.29 0.30 0.30 0.29 0.30 0.30 1.74％
12 0.27 0.27 0.27 0.28 0.27 0.27 0.27 1.50％
表10钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱精密度考察结果
上述结果表明实施例1方法精密度良好。
实施例6稳定性试验
(1)对照品溶液稳定性试验
精密吸取同一混合对照品溶液(钩藤碱浓度为67.58μg/mL，异钩藤碱浓度为67.59μg/mL，去氢钩藤碱浓度为75.27μg/mL，异去氢钩藤碱浓度为75.44μg/mL)，分别于0h、3h、6h、10h、16h、20h和24h注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，记录其峰面积，结果表明对照品溶液室温放置24h内稳定性良好，见表11。
表11对照品溶液稳定性考察结果
时间 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤
0h 38.49 41.19 41.08 46.62
3h 38.42 41.14 41.13 46.52
6h 38.35 41.03 40.89 46.59
10h 38.52 41.10 40.97 46.65
16h 38.47 41.22 41.06 46.56
20h 38.49 41.07 40.98 46.60
24h 38.42 41.01 40.85 46.49
Ave 38.45 41.11 40.99 46.58
RSD 0.15％ 0.19％ 0.25％ 0.12％
(2)供试品溶液稳定性试验
取批号为130701的九味熄风颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取90min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，分别于0h、3h、6h、10h、16h、20h和24h注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，记录其峰面积，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积结果见表12和表13，4个指标成分峰面积结果见表14。又以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均大于0.99，表明供试品溶液室温24小时内稳定性良好。
表12样品稳定性考察结果(各共有峰的相对保留时间)
表13样品稳定性考察结果(主要色谱峰的相对峰面积)
表14钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱稳定性考察结果
时间 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤
0h 16.59 10.20 12.93 19.35
3h 16.37 10.22 12.87 19.22
6h 16.46 10.17 12.91 19.26
10h 16.55 10.15 12.78 19.34
16h 16.54 10.24 12.94 19.30
20h 16.47 10.19 12.93 19.29
24h 16.57 10.26 12.90 19.32
Ave 16.51 10.20 12.89 19.30
RSD 0.47％ 0.38％ 0.43％ 0.24％
实施例7重复性试验
取批号为130701的九味熄风颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，按实施例1方法测定，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积结果见表15和表16，4个指标成分含量结果见表17。又以第1份样品所得指纹图谱做为对照计算另5份样品所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法重复性良好。
表15样品重复性考察结果(各共有峰的相对保留时间)
表16样品重复性考察结果(主要色谱峰的相对峰面积)
表17重复性考察结果(mg/g)
时间 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤
1 0.073 0.044 0.058 0.077
2 0.073 0.043 0.057 0.076
3 0.075 0.042 0.056 0.079
4 0.072 0.044 0.056 0.078
5 0.075 0.043 0.057 0.077
6 0.072 0.043 0.058 0.076
Ave 0.073 0.043 0.057 0.077
RSD 1.86％ 1.74％ 1.57％ 1.51％
根据以上方法学考察结果，九味熄风颗粒指纹图谱及含量测定方法精密度、重复性、稳定性均较好。
实施例8加样回收率试验
取同一供试品(批号130701)，研细，取约1.5g，取9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，3份一组，分别精密加入混合对照品溶液(含钩藤碱121.0μg/mL、异钩藤碱65.33μg/mL、去氢钩藤碱90.02μg/mL、异去氢钩藤碱120.4μg/mL)0.8mL、1.0mL、1.2mL，加入氨水5mL，纯化水25mL，氯仿20mL，回流提取90min，放冷，置分液漏斗中，分出氯仿层，水层用氯仿20mL振摇提取一次，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液3次，每次30mL，氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，计算回收率。结果表明该方法能准确测定样品中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的含量，见表18-21。
表18钩藤碱加样回收率试验结果
表19异钩藤碱加样回收率试验结果
表20去氢钩藤碱加样回收率试验结果
表21异去氢钩藤碱加样回收率试验结果
实施例9样品含量测定及含量限度确定
根据实施例1方法测定10批九味熄风颗粒中上述4个成分的含量，结果见表22。
表22 10批九味熄风颗粒含量测定结果(mg·g-1)
批号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤
130501 0.077 0.046 0.063 0.080
130701 0.072 0.043 0.058 0.076
130702 0.078 0.051 0.062 0.083
130703 0.084 0.055 0.069 0.088
130801 0.069 0.042 0.055 0.075
130901 0.071 0.055 0.070 0.076
130902 0.088 0.049 0.071 0.083
131101 0.072 0.047 0.069 0.079
131102 0.079 0.051 0.061 0.084
131103 0.082 0.053 0.073 0.085
根据上述10批九味熄风颗粒含量测定结果，暂定本品每袋含钩藤碱(C22H28N2O4)不得少于0.41mg，异钩藤碱(C22H28N2O4)不得少于0.25mg，去氢钩藤碱(C22H26N2O4)不得少于0.33mg，异去氢钩藤碱(C22H26N2O4)不得少于0.45mg。
实施例10九味熄风颗粒指纹图谱检测及对照指纹图谱的获得
收集十批九味熄风颗粒样品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1方法测定，计算各共有峰的相对保留时间、主要峰的相对峰面积和相似度，结果见表23-25，用相似度软件以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，见图5。
表23九味熄风颗粒指纹图谱样品测定结果(共有峰的相对保留时间)
表24九味熄风颗粒指纹图谱样品测定结果(主要色谱峰的相对峰面积)
表25九味熄风颗粒指纹图谱样品测定结果(相似度)
批号 相似度
130501 0.986
130701 0.972
130702 0.977
130703 0.984
130801 0.989
130901 0.966
130902 0.970
131101 0.978
131102 0.985
131103 0.996
十批九味熄风颗粒指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，暂定九味熄风颗粒用九味熄风颗粒指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.90。根据十批指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间，暂定本品指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间应符合表26的限度范围。
表26各共有峰相对峰面积和相对保留时间限度范围
峰号 相对保留时间 相对峰面积
1 0.105～0.123 0.19～0.23
2 0.138～0.163 0.43～0.52
3 0.165～0.193 ——
4 0.256～0.300 ——
5 0.308～0.362 ——
6 0.803～0.943 0.63～0.77
7 0.859～1.009 0.48～0.59
S 1.00 1.00
9 0.951～1.116 ——
10 1.004～1.179 0.79～0.96
11 1.024～1.202 0.27～0.32
12 1.096～1.287 0.24～0.30
13 1.127～1.323 ——
考察实施例2、3提供的检测方法的线性关系、精密度、稳定性、回收率，采用实施例2、3提供的检测方法检测同一批九味熄风颗粒的成分含量，构建指纹图谱，其试验结果与上述检测结果相近，表明实施例2、3提供的检测方法同样具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
注：计算软件为国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统。
实施例11相关性研究
将钩藤、法半夏、龙胆、龙骨、青礞石、天麻、僵蚕、熟地黄、龟甲药材分别按实施例1制备方法制备供试品溶液，按其色谱条件进行分析，通过保留时间和DAD扫描分析，指纹图谱中标定的13个共有峰分别来自钩藤、龙胆、天麻、僵蚕、龟甲药材，其中1、2、3号峰来源于龙胆，4号峰来源于龟甲与龙胆，5号峰来源于钩藤与僵蚕，6、7、8、10、11、12号峰来源于钩藤，9号峰来源于钩藤和龟甲，13号峰来源于钩藤和天麻，结果见图6。
实施例12专属性试验
由实施例11可知4个指标成分来自于钩藤，故取缺钩藤的阴性样品按供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液，按上述方法进行测定。结果阴性样品对本品中上述4个指标成分的含量测定无干扰，结果见图7。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种九味熄风颗粒中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱或异去氢钩藤碱含量的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取九味熄风颗粒与氨水、水、氯仿混合，以g/mL/mL/mL计，所述九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为(1～5)：(1～10)：(20～30)：(15～25)，回流提取，分出氯仿层，去除氯仿，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液过滤膜，得到九味熄风颗粒供试品；
取九味熄风颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，所述三乙胺的质量百分含量为0.05％～0.15％，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A为40％；5～30min，流动相A从40％升至60％；30～50min，流动相A从60％升至75％；50～60min，流动相A为75％；检测波长为246nm；
根据HPLC检测结果，获得九味熄风颗粒成分及其含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的流速为0.8～1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的柱温为30～40℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Phenomenex GeminiC18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent5TC-C18色谱柱、Kromasil 100-5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准品为钩藤碱标准品、异钩藤碱标准品、去氢钩藤碱标准品或异去氢钩藤碱标准品中的一种或两者以上的混合物。
6.一种九味熄风颗粒指纹图谱构建方法，其特征在于，取九味熄风颗粒与氨水、水、氯仿混合，以g/mL/mL/mL计，所述九味熄风颗粒、氨水、水与氯仿的比例为(1～5)：(1～10)：(20～30)：(15～25)，回流提取，分出氯仿层，去除氯仿，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液过滤膜，得到九味熄风颗粒供试品；
取九味熄风颗粒供试品进行HPLC检测，获得九味熄风颗粒指纹图谱；
所述HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、三乙胺为流动相B，所述三乙胺的质量百分含量为0.05％～0.15％，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A为40％；5～30min，流动相A从40％升至60％；30～50min，流动相A从60％升至75％；50～60min，流动相A为75％；检测波长为246nm。
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