CN114184691B - 一种检测九味熄风颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测九味熄风颗粒的方法，该方法包括：取九味熄风颗粒制得的供试品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件包括：采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，所述HPLC检测的色谱条件中的洗脱为梯度洗脱，该梯度洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A。利用本发明方法对所含化学成分进行全面的检测，据此建立九味熄风颗粒指纹图谱，能全面地反映其中所含化学成分，对制剂质量进行整体描述和评价。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种检测九味熄风颗粒的方法。
背景技术
多发性抽动症又称为抽动秽语综合征，Tourette综合征，是一种以慢性、波动性、多发性运动性抽动，伴有不自主发声为特征的遗传性神经精神疾病。多发性抽动症已经比较常见，仅在基层医院每年就有不少患儿前来就诊，近年来，多发性抽动症的发病有明显增多的趋势。流行病学调查显示，多发性抽动症的年发病率一般为0.5～1/10万(每10万中每年发生新病人的数目)。多发性抽动症在男性的发病明显多于女性，文献报告的结果差异较大，男女之比从1.6：1到10：1，患病率至少为0.5‰以上。
九味熄风颗粒具有很好的滋阴补肾、平肝熄风、化痰宁神作用，主治小儿多发性抽动症，证属肾阴亏损，肝风内动型，喉中发出异常声音，神思涣散，注意力欠集中，小动作多，性情急躁等。其由熟地黄、龙骨、龟甲、天麻、龙胆、钩藤、僵蚕、青礞石、法半夏等制成。具有以下疗效：
1、九味熄风颗粒可以滋阴补肾：瞄准病源，补肾阴，清神志，迅速缓解抽动多动症状，提升注意力集中程度。
2、九味熄风颗粒可以化痰宁神：调和阴阳，化痰湿，又治标，由内而外，焕然一新，增强体质祛除兼症，彻底康复。
3、九味熄风颗粒可以平肝熄风：深度濡养，熄肝风，固本元，平息抽动多动症状，走出病患心理，重享金色童年。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的方法。中药指纹图谱是一种综合可量化的鉴定手段，主要用于评价中药以及其制剂质量的真实性、优良性与稳定性。能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对制剂质量进行整体描述和评价。为了更好地对制剂质量进行控制，保证其临床疗效，建立其成分检测方法全面评价该制剂质量。
因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测九味熄风颗粒HPLC指纹图谱或化学成分归属的方法，取九味熄风颗粒供试品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件包括：
采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，所述HPLC检测的色谱条件中的洗脱为梯度洗脱，该梯度洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A。
可选地，所述九味熄风颗粒供试品溶液的制备为，取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心即得。
进一步地，所述色谱条件包括：流速为0.45～0.55mL/min，柱温为25～32℃，检测波长222～228nm。
更进一步地，所述色谱条件包括：流速为0.5mL/min，柱温为30℃，检测波长225nm。
具体地，所述C18色谱柱选自Waters Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent TC C18(4.6×250mm，5μm)或KromasilC18(4.6×250mm，5μm)。
进一步地，上述检测方法还包括对照品的检测，所述对照品包括天麻素和/或龙胆苦苷。
具体地，所述对照品被制备成溶液的方法包括：取天麻素和/或龙胆苦苷，加50％甲醇制成每1mL含300μg的单标或混标溶液。
进一步地，所述对照品的检测的色谱条件可包括：
采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，所述HPLC检测的色谱条件中的洗脱为梯度洗脱，该梯度洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A。
利用上述条件得到的HPLC检测结果，可最终获得九味熄风颗粒图谱。
本发明还提供了一种利用上述任意方式获得的九味熄风颗粒指纹图谱。
可选地，上述方法所得图谱可以包括如下峰：
进一步地，上述峰的峰面积可以为：
本发明提供了一种对九味熄风颗粒HPLC指纹图谱或化学成分归属检测的方法，可利用该方法对所含化学成分的种类与数量进行全面的检测，据此建立九味熄风颗粒指纹图谱，该指纹图谱方法专属性强，各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，能全面地反映其中所含化学成分的种类与数量，实现对复方制剂的质量控制和评价。
附图说明
图1为全波长下3D色谱图；
图2为指纹图谱流动相考察色谱图；
图3为洗脱梯度考察色谱图；
图4为滞后峰考察色谱图；
图5为指纹图谱供试品制备方法考察色谱图；
图6为指纹图谱耐用性考察；
图7为色谱峰指认；
图8为药材的相关性指纹图谱；
图9为多批次指纹图谱及对照指纹图谱。
具体实施方式
目前关于九味熄风颗粒的质量控制方法主要集中在天麻素含量测定、生物碱类成分、重金属及微量元素的研究方面，为全面控制九味熄风颗粒质量，在原有研究基础上增加其他类成分指纹图谱研究，以更好地实现对复方制剂的质量控制和评价。有鉴于此，本发明提出了一种对九味熄风颗粒HPLC指纹图谱及化学成分归属的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
如没有特别指明，本发明提供的九味熄风颗粒检测方法中所用药品、试剂、仪器均可由市场购得：
仪器与试药
Mettler Toledo AL204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)
Mettler Toledo XP6电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)
Mettler Toledo MS204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)
KQ-500DB数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)
DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)
Waters2998-2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)
Shimadu LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)
Agilent1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)
Milli-Q(IQ-7000)纯水仪(美国密理博公司)
样品：九味熄风颗粒(江苏康缘药业股份有限公司生产，批号为190801、190802、190903、191001、191004、191101、191201、191202、191203、200601和200602)。
对照品：天麻素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110807-201306，纯度96.8％)
龙胆苦苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110770-201716，纯度97.6％)
试剂：乙腈为色谱纯(美国天地公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯
实施例1
1色谱条件选择
1.1检测波长的选择
取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心后，取上清液进行全波长扫描，经过多个波长的对比分析，最终选择检测波长为225nm。见附图1。
1.2流动相的选择
分别选用乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％甲酸为洗脱系统进行考察，结果见如附图2，根据呈现的色谱峰个数及基线情况，确定乙腈-0.1％磷酸溶液为检测的流动相。
1.3洗脱程序的选择
以乙腈-0.1％磷酸为流动相，选取3种洗脱程序进行指纹图谱测定，综合根据峰的分离情况，洗脱程序Ⅱ色谱峰个数多、色谱峰保留时间适中，且分离效果好，最终确定洗脱程序Ⅱ为本品指纹图谱的梯度洗脱条件，见表1-3、附图3。
表1梯度洗脱表Ⅰ
表2梯度洗脱表Ⅱ
表3梯度洗脱表Ⅲ
1.4滞后峰测试
测试时间延长至120min，结果65min后无色谱峰，因此在九味熄风颗粒指纹图谱测定时，色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定，结果见附图4。
2供试品制备方法选择
为优选合理、简便的供试品溶液制备方法，对提取溶剂考察。
取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共计5份，分别精密加水、甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇各25mL，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心即得。
取上述供试品溶液，采用Kromasil C18色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，检测波长为225nm，结果显示通过50％甲醇制备的供试品溶液色谱峰数量及响应优于其他溶剂，故选择：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心即得。见附图5。
3耐用性考察
以上述优选制备方法获得的样品作为检测对象，采用Kromasil C18色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A，分别考察了不同仪器、不同色谱柱及色谱条件(流速，检测波长、柱温)的耐用性。
色谱柱分别考察了规格为4.6×250mm，5μm的Waters Symmetry C18、PhenomenexLuna C18、Agilent TC C18和Kromasil C18四种品牌色谱柱。其中Kromasil C18分离效果最好，为保证重现性综合考虑固定色谱柱型号，考察不同批号的Kromasil C18指纹相似度大于0.90，因此九味熄风颗粒指纹图谱方法学色谱柱优选为Kromasil C18。
照选定的条件，仪器分别考察了Waters2998-2695、Agilent 1200和Shimadu LC-20AD三种品牌仪器，结果表明，三种品牌仪器测得的指纹相似度均大于0.90，仪器耐用性较好。
照所选定的条件，还分别考察了流速，检测波长和柱温对方法的耐用性，结果表明不同条件下供试品溶液与流速为0.5mL/min，柱温为30℃，检测波长为225nm比较，相似度均大于0.90，表明该方法耐用性良好。见附图6。
最终确立的优选检测条件为：
采用Kromasil C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，所述HPLC检测的色谱条件中的洗脱为梯度洗脱，该梯度洗脱程序为：0～10min，流动相为2％～10％A，10～20min，流动相为10％～15％A，20～30min，流动相为15％～25％A，30～40min，流动相为25％～35％A，40～55min，流动相为35％～90％A，55～65min，流动相为90％A。所述HPLC检测的流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样量10μl，检测波长为225nm。
4色谱峰指认
用对照品进行对比，指认出6号峰为天麻素，12号峰为龙胆苦苷。见附图7。所述对照品被制备成溶液的方法包括：取天麻素和龙胆苦苷，加50％甲醇制成每1mL含300μg的混标溶液。
5方法验证
对建立的指纹图谱条件进行了精密度、稳定性、重复性的方法验证。
取九味熄风颗粒按所选的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，依法测定，以第一份样品为参照计算相似度结果，结果供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差均小于3％，供试品溶液相似度均不小于0.9，表明该方法重复性良好。见表4、5。
取其中一份供试品溶液，连续进样6次进行测定。结果表明，供试品溶液，相似度均不小于0.9，表明该方法精密度良好。
取其中一份供试品溶液，每隔一定时间测定一次其指纹图谱，共测24小时，以0h为参照计算相似度，结果供试品溶液相似度均不小于0.9，表明该方法稳定性良好。
表4九味熄风颗粒指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)
表5九味熄风颗粒指纹图谱重复性考察结果(相对峰面积)
综合考虑，确定指纹图谱相对保留时间和相对峰面积如下：
6药材的相关性
取九味熄风颗粒、钩藤、法半夏、龙胆、龙骨、青礞石、天麻、僵蚕、熟地黄、龟甲药材各2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心即得供试品溶液，照九味熄风颗粒指纹图谱方法测定，结果药材、九味熄风颗粒相关性见附图8，其中1号色谱峰来源于熟地黄和僵蚕，2号色谱峰来源于天麻、龙胆、钩藤、熟地黄、法半夏和僵蚕，3号色谱峰来源于熟地黄，4号色谱峰来源于僵蚕，5号、6号、9号、11号、13号和14号色谱峰来源于天麻，7号、10号和16号色谱峰来源于钩藤，8号峰来源于龙胆和钩藤，12号、15号和17号色谱峰来源于龙胆。
7指纹图谱检测及对照指纹图谱的获得
收集十批九味熄风颗粒样品，分别研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，超声处理(500W，40KHz)30min，取出，放冷，离心即得各供试品溶液，依法测定，采用国家药典颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行分析，以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱。见附图9。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测九味熄风颗粒的方法，其特征在于，该方法包括取九味熄风颗粒制得的供试品进行HPLC检测，其中，所述HPLC检测的色谱条件包括：
采用Kromasil C18色谱柱，对照品包括天麻素和/或龙胆苦苷；以乙腈为流动相A，含有0.1％浓度的磷酸水溶液为流动相B，所述HPLC检测的色谱条件中的洗脱为梯度洗脱，该梯度洗脱程序为：
流速为0.45～0.55mL/min，柱温为25～32℃，检测波长为222～228nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述九味熄风颗粒的供试品的制备包括：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理30min，取出，放冷，离心即得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件包括：所述流速为0.5mL/min，柱温为30℃，检测波长为225nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品被制备成溶液的方法包括：取天麻素和/或龙胆苦苷，加50％甲醇制成每1mL含300μg的单标或混标溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法所得指纹图谱包括如下峰：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述峰的峰面积为：
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