CN105021564A - 基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法 - Google Patents
基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，步骤包括收集烟叶样品、采集近红外光谱、选择校正样品集和验证样品集、测定麦角甾醇含量参考值、预处理光谱、建立PLS校正模型、模型验证、测定待测烟叶样品麦角甾醇含量。本发明方法检测速度快、操作简单方便、预测结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及烟叶检测技术领域，具体为测定烟叶中麦角甾醇含量的方法。
背景技术
麦角甾醇存在于各种真菌中，是真菌中主要的甾醇类化合物，同时也是真菌细胞膜的重要组成部分，可作为霉变检测的化学标志物。菲莫(Phillips Morris)公司的Bindler、国标方法GB/T 25221-2010《粮油检验粮食中麦角甾醇的测定正相高效液相色谱法》等均以麦角甾醇作为霉菌污染的化学标志物。因此，测定烟叶中麦角甾醇的含量对于判定烟叶霉变污染状况具有一定的指导作用。
目前，关于麦角甾醇的常用分析方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等。这些分析方法需要进行提取分离、衍生化等复杂的样品前处理，耗时较长，很难满足现场快速的进行烟叶中麦角甾醇测定以判定烟叶霉变污染状况的要求。因此，开发一种新的快速的测定烟叶中麦角甾醇的含量的方法，为霉变污染程度的判定提供数据支持是非常有必要的。
近红外光谱含有丰富的理化信息，并可表征样品整体品质特征，将其与化学计量学相结合建立校正模型可快速预测样品中多个组分的含量。目前，近红外光谱法作为一种环境友好的绿色快检技术，在石化、农业、烟草、食品和医药领域已经获得了广泛的应用。但用于烟叶中麦角甾醇含量测定的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测速度快、操作简单方便、预测结果准确的能够对烟叶中麦角甾醇的含量进行快速测定的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
基于近红外光谱分析技术的烟叶中麦角甾醇的含量的快速检测方法，方法步骤如下：
(1)收集烟叶样品：选取具有代表性的不同产地、不同品种、不同等级的初烤烟叶，在高湿度环境下存贮加速霉菌生长，制备不同霉变程度的烟叶样品；
(2)采集近红外光谱：将霉变的烟叶样品粉碎过筛后，采用近红外光谱漫反射方式对过筛的各烟叶样品逐个进行近红外光谱扫描，作为各烟叶样品的基础光谱；
(3)选择校正样品集和验证样品集：将上述步骤(2)获得的基础光谱采用标准GB/T29858-2013的方法选出校正样品集和验证样品集；
(4)测定麦角甾醇含量参考值：应用气相色谱质谱法测定步骤(1)所得各烟叶样品中麦角甾醇的含量；
(5)预处理光谱：将上述步骤(3)选出的校正样品集和验证样品集的光谱进行预处理，消除噪声和基线漂移的影响；
(6)建立PLS校正模型：将上述步骤(5)预处理后的校正样品集光谱和步骤(4)所得校正样品的麦角甾醇参考值进行校正模型的建立，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应麦角甾醇含量参考值进行拟合，同时结合交互验证方法剔除光谱或参考值数据异常的样品，优化模型，确定适宜的主成分数，得到PLS校正模型；
(7)模型验证：应用上述步骤(5)预处理后的验证样品集对步骤(6)建立的烟叶中麦角甾醇的PLS校正模型进行外部预测，验证校正模型的有效性；
(8)测定待测烟叶样品麦角甾醇含量：将待测烟叶样品进行近红外光谱的采集，将原始光谱输入建立的烟叶中麦角甾醇的PLS校正模型，即可测定得到待测烟叶样品中的麦角甾醇含量。
本发明步骤(1)所述在高湿度环境下存贮烟叶，是指将烟叶在相对湿度80％条件下存储15天。
本发明步骤(2)所述采集近红外光谱，采集仪器的主要工作参数为：光谱扫描范围10000～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数64次。步骤(2)所述基础光谱的采集条件为：将收集的烟叶样品，每个样品取两个平行样，将每个平行样混匀的固体粉末放入样品杯中，轻压平整，厚度≥10mm，放在光谱仪旋转台上，采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每个平行样扫两次光谱，每个样品对应4个平行光谱，再将4个平行光谱求平均，得到一个原始光谱；依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到每个样品对应的基础光谱。
本发明步骤(4)所述麦角甾醇含量参考值的测定方法为：将烟叶样品用NaOH溶液水解，水解液经正己烷涡旋提取后，经BSTFA衍生，气相色谱质谱法分析，用麦角甾醇标准品峰面积进行定量，得出烟叶样品中麦角甾醇含量参考值；所述NaOH溶液的配比为5g NaOH、5mL水、95mL甲醇。
本发明步骤(5)所述预处理光谱的方法为：对基础光谱进行多元散射校正和二阶求导以及平滑预处理。
本发明步骤(6)所述剔除异常样品是指采用学生化残差剔除异常值，具体方法采用DB/T 53497-2013中13.4异常样品的统计与识别。
本发明步骤(7)所述模型验证，是采用配对t检验方法，将验证集样品输入PLS校正模型所得的麦角甾醇含量预测值与步骤(4)通过气相色谱质谱法测定的麦角甾醇含量参考值以及自由度dv-1的临界值t(a，dv-1)进行比较，取显著性水平α＝0.05，当│t│＜t(a，dv-1)，概率P＞0.05时，表明预测值与实测值在α＝0.05显著水平下无显著性差异，可确定模型验证成功，模型有效，可将该模型用于烟叶中的麦角甾醇含量的测定。
本发明方法所建立的模型能够快速、准确的对烟叶中麦角甾醇含量进行预测。与现有技术相比，样本无需复杂的前处理、检测速度快、操作简单方便、预测结果准确。
附图说明
图1是本发明的实施例的基于近红外漫反射光谱技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明书所述基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，具体步骤如下：
(1)制备不同霉变程度的烟叶样品：将具有代表性的来源于五个产地、三个品种、三个等级的初烤烟叶样品30个(每份样品质量大约5kg)，在相对湿度80％的环境条件下存贮以加速霉菌生长；以每个样品分别存贮0、1、3、5、7、9、11、13、15天为时间段，在每个时间段取样一次，每份样品取约200g，取出后密封于聚乙烯保鲜袋并于-20℃冷冻保存。共计获得不同霉变程度的烟叶样品270个；
(2)应用近红外光谱仪对270个不同霉变程度的烟叶样品进行扫描，光谱扫描范围10000～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数64次。每个样品取两个平行样，将每个平行样混匀的固体粉末放入样品杯中，轻压平整，厚度≥10mm，放在光谱仪旋转台上，采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每个平行样扫两次光谱，每个样品对应4个平行光谱，再将4个平行光谱(用近红外光谱仪的自带软件)进行求平均，得到一个原始光谱，依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到270个烟叶样品对应的基础光谱；
(3)在步骤(2)所得270个基础光谱中采用标准GB/T 29858-2013的方法选出校正样品集(包括240个烟叶样品)和验证样品集(包括30个烟叶样品)。校正样品集是建立校正模型的一组代表性样品，其主要化学成分含量或参考值为已知。验证样品集是验证校正模型的一组代表性样品，不包括在校正样品集中，其主要化学成分含量或参考值为已知，且成分含量或参考值分布范围接近校正样品集；
(4)应用气相色谱质谱法进行步骤(1)得到的270个烟叶样品中麦角甾醇含量参考值的测定，测定方法是，将烟叶样品用NaOH溶液(5g NaOH+5mL水+95mL甲醇)水解，水解液经正己烷涡旋提取后，经BSTFA衍生，气相色谱质谱法分析。用麦角甾醇标准品峰面积进行定量，得出每个烟叶样品中麦角甾醇含量参考值，烟叶样品中麦角甾醇的含量范围在0.658～298.5mg/kg；
(5)对步骤(3)得到的校正样品集的240个烟叶样品和校正样品集的30个烟叶样品的基础光谱都预处理。处理方法为多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)+二阶求导+Norris(7，5)平滑预处理，以消除噪声和基线漂移的影响；
(6)建立PLS校正模型：选择全光谱范围内对校正集样品进行PLS回归并全交叉验证。当模型的主成分数达到7，模型的均方根交叉验证误差RMSECV最小。本实施例选择模型的最适宜主成分数为7。将上述步骤(5)预处理后的校正样品集光谱和步骤(4)所得校正样品的麦角甾醇参考值进行校正模型的建立，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应麦角甾醇含量参考值进行拟合，同时结合交互验证方法剔除光谱或参考值数据异常的样品，优化模型，确定适宜的主成分数，得到PLS校正模型；剔除光谱或参考值数据异常的样品是指采用学生化残差剔除异常值，具体方法参考DB/T 53 497-2013中13.4异常样品的统计与识别；所述主成分是将量测矩阵中的各个变量进行线性组合产生的新变量，是包含信息量最多的量，主成分数的确定方法参考DB/T 53 497-2013中13.3优化模型主成分数；
(7)模型验证：应用上述步骤(5)预处理后的验证样品集对步骤(6)建立的烟叶中麦角甾醇的PLS校正模型进行外部预测，验证校正模型的有效性；
模型验证具体为采用配对t检验方法，将验证集样品输入PLS校正模型所得的麦角甾醇含量预测值与步骤(4)通过气相色谱质谱法测定的麦角甾醇含量参考值以及自由度dv-1的临界值t(a，dv-1)进行比较，取显著性水平α＝0.05，当│t│＜t(a，dv-1)，概率P＞0.05时，表明预测值与实测值在α＝0.05显著水平下无显著性差异，可确定模型验证成功，模型有效，可将该模型用于烟叶中的麦角甾醇含量的测定；
按下列公式计算均方根预测误差RMSEP：
其中：是由第i个验证样品光谱得到的预测值，vi是对应的参考数据，验证平均误差按下式进行计算：
式中：dv——v个验证样品所用的参考数据的总数。
本实施例通过公式计算得到均方根误差RMSEP为1.46，表1为PLS模型预测集预测结果，结果表明预测值与实测值在α＝0.05显著性水平下无显著性差异。
表1麦角甾醇近红外校正模型外部验证结果单位：mg/kg
(8)测定待测烟叶样品麦角甾醇含量：应用本实施例建立的校正模型，对待测烟叶样品中麦角甾醇的含量进行测定。将待测烟叶样品进行近红外光谱采集，将原始光谱输入建立的PLS校正模型，测定得到待测烟叶样品中的麦角甾醇含量，并与气相色谱质谱法测定结果进行比较，结果见表2。由表2可以看出，相对偏差＜15％，由此可见，应用近红外漫反射光谱法对烟叶样品中麦角甾醇含量的测定是完全可行的。
表2实际样品测定结果单位：mg/kg
| 序号 | 实测值 | 预测值 | 相对偏差 | 序号 | 实测值 | 预测值 | 相对偏差 |
| 1 | 21.32 | 18.11 | 8.14 | 12 | 24.59 | 30.03 | 9.96 |
| 2 | 21.45 | 29.22 | 1.62 | 13 | 20.19 | 17.15 | 8.14 |
| 3 | 21.54 | 28.59 | 11.19 | 14 | 24.74 | 28.21 | 6.55 |
| 4 | 21.69 | 24.19 | 5.45 | 15 | 24.75 | 25.28 | 1.06 |
| 5 | 21.85 | 20.58 | 2.99 | 16 | 51.68 | 50.58 | 1.08 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质和原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于，方法步骤如下：
(1)收集烟叶样品：选取具有代表性的不同产地、不同品种、不同等级的初烤烟叶，在高湿度环境下存贮加速霉菌生长，制备不同霉变程度的烟叶样品；
(2)采集近红外光谱：将霉变的烟叶样品粉碎过筛后，采用近红外光谱漫反射方式对过筛的各烟叶样品逐个进行近红外光谱扫描，作为各烟叶样品的基础光谱；
(3)选择校正样品集和验证样品集：将上述步骤(2)获得的基础光谱采用标准GB/T29858-2013的方法选出校正样品集和验证样品集；
(4)测定麦角甾醇含量参考值：应用气相色谱质谱法测定步骤(1)所得各烟叶样品中麦角甾醇的含量；
(5)预处理光谱：将上述步骤(3)选出的校正样品集和验证样品集的光谱进行预处理，消除噪声和基线漂移的影响；
(6)建立PLS校正模型：将上述步骤(5)预处理后的校正样品集光谱和步骤(4)所得校正样品的麦角甾醇参考值进行校正模型的建立：首先应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应麦角甾醇含量参考值进行拟合，同时结合交互验证方法剔除光谱或参考值数据异常的样品，优化模型，确定适宜的主成分数，得到PLS校正模型；
(7)模型验证：应用上述步骤(5)预处理后的验证样品集对步骤(6)建立的烟叶中麦角甾醇的PLS校正模型进行外部验证，验证校正模型的有效性；
(8)测定待测烟叶样品麦角甾醇含量：将待测烟叶样品进行近红外光谱的采集，将原始光谱输入建立的烟叶中麦角甾醇的PLS校正模型，即可测定得到待测烟叶样品中的麦角甾醇含量。
2.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：上述步骤(1)所述在高湿度环境下存贮烟叶，是指将烟叶在相对湿度80％条件下存储15天。
3.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：上述步骤(2)所述采集近红外光谱，采集仪器的主要工作参数为：光谱扫描范围10000～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数64次。
4.根据权利要求1或3所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：步骤(2)所述基础光谱的采集条件为：将收集的烟叶样品，每个样品取两个平行样，将每个平行样混匀的固体粉末放入样品杯中，轻压平整，厚度≥10mm，放在光谱仪旋转台上，采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每个平行样扫两次光谱，每个样品对应4个平行光谱，再将4个平行光谱求平均，得到一个原始光谱；依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到每个样品对应的基础光谱。
5.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：步骤(4)所述麦角甾醇含量参考值的测定方法为：将烟叶样品用NaOH溶液水解，水解液经正己烷涡旋提取后，经BSTFA衍生，气相色谱质谱法分析，用麦角甾醇标准品峰面积进行定量，得出烟叶样品中麦角甾醇含量参考值；所述NaOH溶液的配比为5g NaOH、5mL水、95mL甲醇。
6.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：步骤(5)所述预处理光谱的方法为：对基础光谱进行多元散射校正和二阶求导以及平滑预处理。
7.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：步骤(6)所述剔除异常样品是指采用学生化残差剔除异常值，具体方法采用DB/T53497-2013中13.4异常样品的统计与识别。
8.根据权利要求1所述的基于近红外光谱分析技术测定烟叶中麦角甾醇含量的方法，其特征在于：步骤(7)所述模型验证，是采用配对t检验方法，将验证集样品输入PLS校正模型所得的麦角甾醇含量预测值与步骤(4)通过气相色谱质谱法测定的麦角甾醇含量参考值以及自由度dv-1的临界值t(a，dv-1)进行比较，取显著性水平α＝0.05，当│t│＜t(a，dv-1)，概率P＞0.05时，表明预测值与实测值在α＝0.05显著水平下无显著性差异，可确定模型验证成功，模型有效，可将该模型用于烟叶中的麦角甾醇含量的测定。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151104 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |