CN110118837A - 食用蚂蚁的质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食用蚂蚁的质量评价方法，包括以下步骤：步骤1，制备实验用标准样品，步骤2，配置梯度洗脱的流动相，步骤3，对标准样品进行梯度洗脱，以分离标准样品中的非挥发性成分，对非挥发性成分进行超高效液相色谱检测，步骤4，对标准样品中的挥发性成分进行气相色谱‑质谱检测，步骤5，根据检测结果建立标准样品的标准图谱数据库，步骤6，检测获得待测样品的图谱与标准图谱进行比较，获得待测样品的质量情况；本发明通过准确检测食用蚂蚁的挥发性成分和非挥发性成分，建立完整的图谱数据库，根据待测样品的图谱与图谱数据库之间的相似程度，合理评价食用蚂蚁的质量，有利于标准化评价食用蚂蚁的质量，缩小了食用蚂蚁批次间的差异。
Description
技术领域
本发明属于质量检测技术领域，特别是涉及一种食用蚂蚁的质量评价方法。
背景技术
蚂蚁作为人们最熟悉和常见的昆虫之一，品种繁多、数量庞大、分布广泛；全世界有15000种蚂蚁，国内大约有2000种蚂蚁，具有较大食用、药用价值的蚂蚁有：拟黑多刺蚁、双齿多刺蚁、黄猄蚁、黄蚁、日本木工蚁、北方蚁、横纹猛蚁、巨头切叶蚁、红尾猛蚁、双隆骨铺道蚁等，大部分属蚁亚科种类。
研究资料表明，蚂蚁体内含有大量氨基酸、蛋白质、维生素和微量元素，其中异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸等含量较高，蚂蚁中还含有铁、钙、锌、锰、硒、铜等十几种微量元素，其中锌、锰、硒的含量合理，极易被人体吸收，营养价值很高；且具有多种保健功能，如抗炎、平喘、护肝、增强人体免疫力等，食用蚂蚁的研究正蓬勃发展，但是不同产地的食用蚂蚁，其组成成分间存在差异性，无法对蚂蚁的质量进行系统评价和控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食用蚂蚁的质量评价方法，将食用蚂蚁指纹图谱作为蚂蚁质量评价的指标，通过指纹图谱比对保障食用蚂蚁质量标准化水平，缩小产品批次间的感官差异，适用于食用蚂蚁的质量评价与种类鉴别。
本发明所采用的技术方案是，食用蚂蚁的质量评价方法，具体包括以下步骤：
步骤1，制备实验用标准样品，
制备液体标准样品：称取5.00g食用蚂蚁样品充分研磨后，转移至250mL烧瓶中，加入100mL75%的提取试剂加热回流2h，待溶液冷却后过滤、浓缩，然后用提取试剂定容至5mL，用0.45µm的有机滤膜过滤备用；
所述提取试剂为甲醇或乙醇；
制备固体标准样品：称取2.00g食用蚂蚁样品置于顶空进样瓶中备用；
步骤2，配置梯度洗脱的流动相，
A液：将1000mL的甲醇或乙腈过滤后置于超声波清洗仪中脱气20min；
B液：量取0.2mL磷酸于1000mL容量瓶中定容，过滤后使用超声波清洗仪脱气20min；
步骤3，检测标准样品中的非挥发性成分，
使用梯度洗脱分离标准样品中的非挥发性成分，使用超高效液相色谱仪和紫外检测器，对液体标准样品中的非挥发性成分进行检测；
梯度洗脱的过程为：0~10min，98%~95%A液2%～5%B液，10~15min，95%~85%A液5%～15%B液，15~30min，85%~65%A液15%～35%B液，30~45min，65%~0%A液A液35%～100%B液；
步骤4，检测标准样品中的挥发性成分，
使用静态顶空进样将食用蚂蚁标准样品中的挥发性成分，置于气相色谱-质谱仪中进行检测；
步骤5，根据食用蚂蚁非挥发性成分和挥发性成分检测结果，分别建立食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱和挥发性标准指纹图谱数据库；
步骤6，使用步骤1～4建立待测食用蚂蚁的指纹图谱，将待测蚂蚁的指纹图谱与食用蚂蚁的标准图谱、标准指纹图谱进行比较；
当待测食用蚂蚁的任一图谱与步骤5的食用蚂蚁指纹图谱库中的食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱或挥发性标准指纹图谱，相似度差值小于等于0.3，则认为该食用蚂蚁质量合格，否则质量不合格。
进一步的，步骤1中使用的提取溶剂优选为甲醇。
进一步的，步骤2中流动相的A液优选为甲醇。
进一步的，步骤3中超高效液相色谱仪检测时液相的流速为0.2mL/min，分析时间为45min，色谱柱的温度为35℃，紫外检测器的流动池温度为40℃，检测波长为210～295nm，进样量为10µL。
进一步的，步骤3中紫外检测器的检测波长为254nm。
进一步的，步骤4中静态顶空进样的振荡箱温度为120℃，振荡时间30min，振荡速度250rpm，进样速度为500µL/s；气相色谱-质谱仪的柱箱温度为50℃，进样口温度为250℃，载气为纯度≥99.999%的He，色谱柱选用的是Rtx-5MS，规格为30.0m×0.25mm×0.25µm，检测时50℃保持10min，然后以8℃/min的速度升至250℃保持10min，检测的总运行时间为45min。
本发明的有益效果是：本发明通过超高效液相色谱检测和气相色谱-质谱检测对食用蚂蚁的挥发性成分和非挥发性成分进行准确检测，并根据检测结果建立完整的图谱数据库，根据待测样品的图谱与图谱数据库之间的相似程度，合理评价食用蚂蚁的质量，适用于食用蚂蚁质量标准化评价，缩小了食用蚂蚁批次间的差异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的流程图。
图2是实施例1的检测结果图。
图3是实施例2的检测结果图。
图4是实施例3的检测结果图。
图5是实施例4的检测结果图。
图6是实施例5的检测结果图。
图7是实施例6的非挥发性成分检测图谱。
图8是实施例6的挥发性成分检测图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
食用蚂蚁的质量评价方法流程如图1所示，具体包括以下步骤：
步骤1，制备实验用标准样品，
制备液体标准样品：称取5.00g蚂蚁样品置于研钵中，充分研磨后转移至250mL长颈圆底烧瓶中，加入100mL75%的提取溶剂，加热回流提取2h，待液体冷却后过滤，使用旋蒸仪浓缩，将所得滤液用提取溶剂定容至5mL，用0.45µm有机滤膜过滤，备用；
制备固体标准样品：称取2.00g食用蚂蚁样品置于顶空进样瓶中，密封备用；
步骤2，配置梯度洗脱的流动相，
A液：将1000mL甲醇或乙腈过滤后置于超声波清洗仪中脱气20min；
B液：量取0.2mL磷酸置于1000mL容量瓶中定容，过滤后于超声波清洗仪中脱气20min；
使用超声波清洗仪对流动相进行脱气处理，以除去液相中溶解的气体，防止在梯度洗脱过程中流动相由色谱柱流经检测器时产生气泡，增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析的状况；
步骤3，样品中非挥发性成分的检测，
采用梯度洗脱的方法分离食用蚂蚁中的非挥发性成分，使用超高效液相色谱仪，配合紫外检测器对食用蚂蚁液体标准样品中的非挥发性成分进行检测；
梯度洗脱的过程为：0~10min，98%~95%A液2%～5%B液，10~15min，95%~85%A液5%～15%B液，15~30min，85%~65%A液15%～35%B液，30~45min，65%~0%A液A液35%～100%B液；
检测时液相的流速为0.2mL/min，超高效液相色谱仪的分析时间为45min，色谱柱温度为35℃，紫外检测器的流动池温度为40℃，紫外光束的波长为210～295nm，进样量为10µL；
步骤4，样品中挥发性成分的检测，
使用静态顶空进样将食用蚂蚁固相标准样品中的挥发性成分，置于气相色谱-质谱仪中进行检测，静态顶空进样的振荡箱温度为120℃，振荡时间30min，振荡速度250rpm，进样速度为500µL/s；
气相色谱-质谱仪的柱箱温度为50℃，进样口温度为250℃，载气为纯度≥99.999%的He，色谱柱选用的是Rtx-5MS，规格为30.0m×0.25mm×0.25µm，检测时50℃保持10min，然后以8℃/min的速度升至250℃保持10min，检测的总运行时间为45min；
步骤5，根据食用蚂蚁非挥发性成分和挥发性成分检测结果，分别建立食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱和挥发性标准指纹图谱数据库；
步骤6，使用步骤1～4建立待测食用蚂蚁的指纹图谱，将待测蚂蚁的指纹图谱与食用蚂蚁的标准图谱、标准指纹图谱进行比较；
当待测食用蚂蚁的任一图谱与步骤5的食用蚂蚁指纹图谱库中的食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱或挥发性标准指纹图谱，相似度差值小于等于0.3，则认为该食用蚂蚁质量合格，否则质量不合格。
本发明步骤1使用的提取溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇，甲醇为大极性溶剂，能提取较多的不可挥发性成分，用甲醇作提取溶剂时基线稳定、指纹图谱的峰型好，出峰效果好；本发明步骤4中采用顶空进样减少了样品的前处理步骤，节约了检测时间、降低了提取操作的误差，使检测结果更为准确；本发明用于食用蚂蚁食用或是入药时的质量检测，能够对食用蚂蚁建立统一的质量检测标准，保证食用蚂蚁的食用或药用等的质量，提高安全性。
实施例1
利用以下步骤建立食用蚂蚁的非挥发性成分标准图谱：
步骤1，制备实验用液相标准样品，
称取5.00g蚂蚁样品置于研钵中，充分研磨后转移至250mL长颈圆底烧瓶中，加入100mL75%的甲醇提取溶剂，加热回流提取2h，待液体冷却后过滤，使用旋蒸仪浓缩所得滤液，用75%甲醇定容至5mL，用0.45µm有机滤膜过滤，备用；
步骤2，配置梯度洗脱的流动相，
A液：将1000mL色谱纯甲醇过滤后置于超声波清洗仪中脱气20min；
B液：量取0.2mL色谱纯磷酸置于1000mL容量瓶中定容获得体积百分比为0.02%的磷酸溶液，过滤后于超声波清洗仪中脱气20min；
步骤3，样品中非挥发性成分的检测，
采用梯度洗脱的方法分离食用蚂蚁中的非挥发性成分，然后使用超高效液相色谱仪，配合紫外检测器对食用蚂蚁液体样品中的非挥发性成分进行检测；
梯度洗脱的过程为：0~10min，98%~95%A液2%～5%B液，10~15min，95%~85%A液5%～15%B液，15~30min，85%~65%A液15%～35%B液，30~45min，65%~0%A液A液35%～100%B液；
检测时流动相的流速为0.2mL/min，超高效液相色谱仪的分析时间为45min，色谱柱温度为35℃，紫外检测器检测波长为254nm，进样量为10µL；
步骤4，根据超高效液相色谱仪检测结果，建立食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱如图2所示。
实施例2
在实施例1其他检测条件不变的情况下，将步骤1中的提取溶剂换作乙醇，对食用蚂蚁的非挥发性成分进行检测，制得食用蚂蚁非挥发性成分的标准图谱，如图3所示；
甲醇和乙醇均为大极性溶剂，可以提取出食用蚂蚁中较多的不可挥发性物质，由图2和图3可知，使用乙醇作为实验用液相的提取溶剂时，获得的食用蚂蚁非挥发性成分标准图谱中，图谱背景干扰较大，峰型不明显、出峰效果较差；使用甲醇作为提取溶剂时，HPLC检测的基线较稳，出峰效果良好、峰型好，所以选用甲醇作为食用蚂蚁的提取溶剂。
实施例3
在实施例1其他检测条件不变的情况下，将步骤2中的流动相修改为乙腈-磷酸，对食用蚂蚁的非挥发性成分进行检测，制得食用蚂蚁非挥发性成分的标准图谱，如图4所示；
对比图2和图4可知，采用磷酸-甲醇流动体系比磷酸-乙腈流动相体系出峰多，峰型好、基线稳定，所以本发明采用甲醇-0.02%磷酸作为流动相。
实施例4
在实施例1其他检测条件不变的情况下，将步骤3中超高效液相色谱仪的检测波长修改为210nm，对食用蚂蚁的非挥发性成分进行检测，制得食用蚂蚁非挥发性成分的标准图谱，如图5所示；
实施例5
在实施例1其他检测条件不变的情况下，将步骤3中超高效液相色谱仪的检测波长修改为295nm，对食用蚂蚁的非挥发性成分进行检测，制得食用蚂蚁非挥发性成分的标准图谱，如图6所示；
由图2、图5和图6可知，在254nm波长下的超高效液相色谱图基线稳定，出峰效果较好，在210nm波长下的超高效液相色谱背景干扰较大，出峰效果差，在295nm波长下的超高效液相色谱的出峰较多，但是峰高较低、峰型差，不利于分析，所以本文选用超高效液相色谱的检测波长为254nm。
实施例6
利用实施例1的超高效液相色谱检测条件对东北黑蚂蚁、长白山红蚂蚁和永德黄蚂蚁建立非挥发性成分标准图谱如图7所示，由图7可知东北黑蚂蚁主要色谱峰保留时间为：1.9min，2.5min，4.5min，35.3min，37.8min；长白山红蚂蚁主要色谱峰保留时间为：3.6min，5.9min，6.9min，32min，44.5min；永德黄蚂蚁主要色谱峰保留时间为：5.9min，14.8min，17.5min，20.9min，26.3min，经过相似度分析，东北黑蚂蚁、长白山红蚂蚁和永德黄蚂蚁对照指纹图谱相似度在0.0257～0.899之间，三种蚂蚁非挥发性成分差异明显、能够有效鉴别。
称取2.00g食用蚂蚁样品置于顶空进样瓶中，使用气相色谱-质谱仪检测食用蚂蚁的挥发性成分，静态顶空进样的振荡箱温度为120℃，振荡时间30min，振荡速度250rpm，进样速度为500µL/s；气相色谱-质谱仪的柱箱温度为50℃，进样口温度为250℃，载气为纯度≥99.999%的He，色谱柱选用的是Rtx-5MS，规格为30.0m×0.25mm×0.25µm，检测时50℃保持10min，然后以8℃/min的速度升至250℃保持10min，检测的总运行时间为45min；构建食用蚂蚁挥发性成分标准指纹图谱如图8所示，由图8可知东北黑蚂蚁主要色谱峰保留时间为：1.6min，2min，3.1min，12.1min，15.1min，19.1min，22.3min；长白山红蚂蚁主要色谱峰保留时间为：1.6min，2.2min，3min，15.1min，19.2min；永德黄蚂蚁主要色谱峰保留时间为：1.6min，2.2min，3.1min，14.1min，15.2min，19.2min，经过相似度分析，东北黑蚂蚁、长白山红蚂蚁和永德黄蚂蚁对照指纹图谱相似度在0.843～0.937之间，三种食用蚂蚁挥发性成分差异不大，但其主要成分含量不一致，使用气相色谱-质谱方法能有效区分这三种蚂蚁。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，制备实验用标准样品，
制备液体标准样品：称取5.00g食用蚂蚁样品充分研磨后，转移至250mL烧瓶中，加入100mL75%的提取试剂加热回流2h，待溶液冷却后过滤、浓缩，然后提取试剂定容至5mL，用0.45µm的有机滤膜过滤备用；
所述提取试剂为甲醇或乙醇；
制备固体标准样品：称取2.00g食用蚂蚁样品置于顶空进样瓶中备用；
步骤2，配置梯度洗脱的流动相，
A液：将1000mL的甲醇或乙腈过滤后置于超声波清洗仪中脱气20min；
B液：量取0.2mL磷酸于1000mL容量瓶中定容，过滤后使用超声波清洗仪脱气20min；
步骤3，检测标准样品中的非挥发性成分，
使用梯度洗脱分离标准样品中的非挥发性成分，使用超高效液相色谱仪和紫外检测器，对液体标准样品中的非挥发性成分进行检测；
梯度洗脱的过程为：0~10min，98%~95%A液2%～5%B液，10~15min，95%~85%A液5%～15%B液，15~30min，85%~65%A液15%～35%B液，30~45min，65%~0%A液A液35%～100%B液；
步骤4，检测标准样品中的挥发性成分，
使用静态顶空进样将食用蚂蚁标准样品中的挥发性成分，置于气相色谱-质谱仪中进行检测；
步骤5，根据食用蚂蚁非挥发性成分和挥发性成分检测结果，分别建立食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱和挥发性标准指纹图谱数据库；
步骤6，使用步骤1～4建立待测食用蚂蚁的指纹图谱，将待测蚂蚁的指纹图谱与食用蚂蚁的标准图谱、标准指纹图谱进行比较；
当待测食用蚂蚁的任一图谱与步骤5的食用蚂蚁指纹图谱库中的食用蚂蚁的非挥发成分标准图谱或挥发性标准指纹图谱，相似度差值小于等于0.3，则认为该食用蚂蚁质量合格，否则质量不合格。
2.根据权利要求1所述的食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，所述步骤1中使用的提取溶剂优选为甲醇。
3.根据权利要求1所述的食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，所述步骤2中流动相的A液优选为甲醇。
4.根据权利要求1所述的食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，所述步骤3中超高效液相色谱仪检测时液相的流速为0.2mL/min，分析时间为45min，色谱柱的温度为35℃，紫外检测器的流动池温度为40℃，检测波长为210～295nm，进样量为10µL。
5.根据权利要求4所述的食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，所述步骤3中紫外检测器的检测波长为254nm。
6.根据权利要求1所述的食用蚂蚁的质量评价方法，其特征在于，所述步骤4中静态顶空进样的振荡箱温度为120℃，振荡时间30min，振荡速度250rpm，进样速度为500µL/s；气相色谱-质谱仪的柱箱温度为50℃，进样口温度为250℃，载气为纯度≥99.999%的He，色谱柱选用的是Rtx-5MS，规格为30.0m×0.25mm×0.25µm，检测时50℃保持10min，然后以8℃/min的速度升至250℃保持10min，检测的总运行时间为45min。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190813 |
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