CN113533571A - 一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法及其应用。该构建方法包括制备溶液、实施检测、生成指纹图谱和共有峰的标定及指纹图谱相似度确认，通过优化指纹图谱的色谱条件、开展方法学研究、特征共有峰的标定及10批小试和3批中试产品指纹图谱的验证，确定了标准指纹图谱及其检测方法。本发明提供的指纹图谱，是采用高效液相色谱条件进行分析检测的，所得到的色谱图中，标定的共有峰的峰面积总和占总峰面积的90％以上，峰数量较多，灵敏度高，基线平稳、分离度好和专属性强。而且方法的精密度、稳定性和重现性良好。本发明提供的指纹图谱，应用于胆酸钠片质量评价，提高了胆酸钠片质量控制标准，保证了临床用药的稳定性、安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
动物胆汁作为药物使用在中国已经有上千年历史，具有清热解毒、止咳平喘等功效。胆汁酸是动物胆汁的主要有效成分，其主要结构是以环戊烷多氢菲为核心的二十四碳胆烷羧酸，不同动物分泌不同类型胆汁酸的临床功效也不尽相同。胆酸钠系自牛或猪胆中提取的胆汁酸盐的混合物。临床上作为利胆药，用于胆汁缺乏及胆囊炎等。胆酸钠片是胆酸钠制成的糖衣片，其不良反应主要为胃肠道反应和皮疹，药理作用过程为胆酸钠分子的立体构象具有亲水和疏水两个侧面，能降低油/水两相之间的表面张力，是较强的乳化剂。使疏水的脂类在水中乳化成细小的微团，既增加脂肪在小肠中与脂肪酶的接触面积，有利于消化酶的作用，又可使高度乳化的脂肪微粒直接由肠黏膜吸收，促进脂类的利用。国家药品审评中心官网上查询，目前获得胆酸钠片生产批件的有12家企业，已进行胆酸钠原料登记备案的企业有2家。
药品的质量是保证临床用药安全有效的前提，胆酸钠片的现行标准为中华人民共和国卫生部药品标准二部六册(生化药品第一分册)，该标准中收载了化学与薄层色谱鉴别，崩解时限及含量测定(乙醚萃取称重法)。但这种方法不能从整体上反映胆酸钠片用药的整体疗效。为了弥补现有胆酸钠片的质量控制方法的缺陷，有必要构建该产品的标准指纹图谱，以便于更好地进行该产品的质量控制。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，方法包括以下步骤：
S1、制备溶液：
供试品溶液：取胆酸钠片细粉，加甲醇适量溶解，用稀释剂稀释制，摇匀，过滤取其续滤液，得到的续滤液作为供试品溶液；
S2、实施检测：
将步骤S1中制备的供试品溶液注入到高效液相色谱仪，记录色谱图；
S3、生成指纹图谱：
基于供试品色谱图生成指纹图谱，选择胆酸钠片中峰面积大且分离度好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，共有峰峰面积总和占总峰面积90％以上；
S4、共有峰的标定及相似度确认：
对胆酸钠片指纹图谱中的共有峰进行标定及相似度确认。
进一步的，步骤S1中，所述供试品溶液和对照品溶液的浓度为2mg/mL。
进一步的，步骤S2中，在所述高效液相色谱仪上设置的色谱参数如下：
色谱柱是填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；
洗脱液包括流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为磷酸盐缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱流速为0.8～1.2mL/min，洗脱温度为20℃～40℃；
进样量为10～100μL；
检测波长为205～210nm。
进一步的，所述色谱柱为Outstand C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm。
进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液为0.2％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.5～3.0)。
进一步的，所述洗脱液以1.0mL/min的流速流经温度为40℃的所述色谱柱，在60min内完成色谱分离。
进一步的，所述梯度洗脱程序为0-30min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为25：75改变为40：60；30-40min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为40：60；40-50min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为40：60改变为25：75；50-60min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为25：75。
进一步的，所述胆酸钠片指纹图谱包括7个共有峰，分别为：相对保留时间为0.399的1号峰、相对保留时间为0.548的2号峰、相对保留时间为0.638的3号峰、相对保留时间为0.682的4号峰、相对保留时间为0.729的5号峰、相对保留时间为0.785的6号峰和相对保留时间为1.000的7号峰，所述7号峰为所述胆酸钠片指纹图谱的参照物S峰。
本发明还提供上述方法所得到的指纹图谱。
另外，本发明还提供一种胆酸钠片质量评价的方法，将所得胆酸钠片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，以相似度大于0.9作为胆酸钠片的质控标准。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供了胆酸钠片指纹图谱的构建方法及其应用。该构建方法包括制备溶液、实施检测、生成指纹图谱和共有峰的标定及归属，通过优化指纹图谱的色谱条件、开展方法学研究、特征共有峰的标定及10批小试和3批中试产品指纹图谱的验证，确定了标准指纹图谱及其检测方法。本发明提供的指纹图谱，是采用高效液相色谱条件进行分析检测的，所得到的色谱图中，标定的共有峰的峰面积总和占总峰面积的90％以上，峰数量较多，灵敏度高，基线平稳、分离度好和专属性强。而且方法的精密度、稳定性和重现性良好。
(2)本发明提供的指纹图谱，应用于胆酸钠片质量评价，提高了胆酸钠片质量控制标准，保证了临床用药的稳定性、安全性和有效性。
附图说明
图1为本发明的胆酸钠片标准指纹图谱；
图2为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0001的指纹图谱；
图3为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0002的指纹图谱；
图4为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0003的指纹图谱；
图5为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0004的指纹图谱；
图6为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0005的指纹图谱；
图7为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0007的指纹图谱；
图8为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0008的指纹图谱；
图9为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0011的指纹图谱；
图10为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0012的指纹图谱；
图11为具体实施例中胆酸钠片产品批号为0013的指纹图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
本发明提供的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，方法包括以下步骤：
步骤S1：制备溶液：
供试品溶液：取胆酸钠片细粉，加甲醇适量溶解，用稀释剂稀释制，摇匀，过滤取其续滤液，得到的续滤液作为供试品溶液；
步骤S2：实施检测：
将步骤S1中制备的供试品溶液注入到高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤S3：生成指纹图谱：
基于供试品色谱图生成指纹图谱，选择胆酸钠片中峰面积大且分离度好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，共有峰峰面积总和占总峰面积90％以上；
步骤S4：共有峰的标定及相似度确认：
对胆酸钠片指纹图谱中的共有峰进行标定及相似度确认。
在步骤S1中，样品制备的方法有多种，在这里不做限定，本实施例中，溶液制备方法如下：
供试品溶液的制备：取胆酸钠片细分适量(约相当于胆酸钠100mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。其中，稀释剂为乙腈：0.2％磷酸二氢钾溶液(pH2.5)＝1：3的混合溶液。
在步骤S2中，本发明在开发胆酸钠片指纹图谱的方法过程中，采用高效液相色谱法进行胆酸钠片指纹图谱的摸索和优化，为了获得可靠稳定和重现性好的分析方法，包括对高效液相色谱仪的色谱条件：色谱柱、流动相、洗脱程序、柱温和检测波长等进行了筛选。
本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，筛选实验结果表明，由于胆酸钠片化学成分复杂，选用Outstand C18，规格为250mm×4.6mm，5μm的色谱柱，色谱峰分离良好，重现性最好。
本发明参照有关文献，采用乙腈-0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调PH值至2.5)(50:50)为流动相，进行等度洗脱，实验结果发现：样品分离效果不好，峰型较差，改变乙腈的比例，分离效果也不好。后改用表1所示的条件进行梯度洗脱，结果样品分离效果较好，峰型对称，图谱的重现性较好，系统较稳定。因此选择乙腈-0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至2.5)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为。
表1：梯度洗脱程序
本发明通过DAD检测器三维扫描优选波长，确定205nm～210nm为最佳波长范围，为保证化学成分信息量最大，故选择205nm为最佳检测波长。
本发明分别在25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析胆酸钠，实验结果表明，在40℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，重现性好，因此，将40℃为最佳柱温条件。
为了确保本发明实施对胆酸钠片指纹图谱检测的方法的可靠性和准确性，在本实施例中，对实施检测的方法进行了方法学考察，验证了本实施例采用的胆酸钠片指纹图谱检测的方法准确可靠，具体如下：
(1)精密度考察
取供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，检测指纹图谱。数据和结果如表2所示，结果表明，色谱图中各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.5％；相对峰面积的RSD小于1.0％，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。
表2：精密度考察结果
(2)重复性考察
制备5份不同的供试品溶液，分别检测指纹图谱，数据和结果如表3所示。结果表明：各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.5％；相对峰面积的RSD小于5.0％，表明方法的重复性良好。
表3：重复性考察结果
(3)稳定性考察
取供试品溶液，分别在0，2，4，8，12h检测指纹图谱，数据和结果如表4所示。结果表明：各主要色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.5％，相对峰面积比值的RSD小于5.0％，表明供试品溶液在12h内稳定。
表4：稳定性考察结果表
在步骤S3中，将按照步骤S1方法制备得到的10个批次的胆酸钠片供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，照步骤S2中实施对胆酸钠片指纹图谱检测的方法，进行测定指纹图谱，其中典型的指纹图谱如图1所示，其色谱图显示有7个主要的共有特征峰(占总峰面积的90％以上)。10批样品中，单峰面积与总峰面积的比值大于20％的共有峰有4号峰和7号峰，大于10％的共有峰有2号峰和6号峰，大于4％的共有峰有1号、3号和5号峰。结果表明1～7号峰在10批样品的色谱图中均出现。其中以10号峰的分离度最大，峰型最佳。选择以7号峰(S峰)为参照物，计算各共有特征指纹峰的相对保留时间，数据和结果见表5。相对保留时间的RSD均小于1.0％。因此标定此7个峰为共有指纹峰，并据此建立胆酸钠片的指纹图谱。
以7号峰(S峰)为参照物，计算10批样品共有指纹峰的峰面积比值，各批供试品指纹图谱的重现性较好，10批胆酸钠片产品的指纹图谱如图2-图11所示，相对峰面积比值的RSD小于10.0％(n＝10)，且7个主要的共有特征峰面积占总峰面积的90％以上。数据和结果见表5。
表5:10批次胆酸钠片指纹图谱结果
上述的10批次样品共有指纹峰面积之和占总峰面积比值平均为93.29％，则非共有峰面积占总峰面积的比值平均为6.71％，数据和结果见表6。符合指纹图谱的技术要求。
表6:10批次胆酸钠片指纹图谱结果
在步骤S4中，对上述10批样品的数据进行分析，通过对共有峰进行标定及相似度确认，我们初步建立胆酸钠片指纹图谱的标准。本发明的指纹图谱中应出现7个共有特征峰(占总峰面积的90％以上)。以7号峰(S峰)为参照物，相对保留时间为0.399的1号峰、相对保留时间为0.548的2号峰、相对保留时间为0.638的3号峰、相对保留时间为0.682的4号峰、相对保留时间为0.729的5号峰、相对保留时间为0.785的6号峰和相对保留时间为1.000的7号峰，其差值不得过±10％。单峰面积与总峰面积的比值大于20％的共有峰有4号峰和7号峰(S峰)，其差值不得过±20％。其他共有特征峰单峰面积与总峰面积的比值均大于4％。其差值不得过±30％。以S峰的峰面积为1,各特征峰面积与S峰面积的平均比值及标准见表7。非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。
表7:胆酸钠片指纹图谱共有特征峰标准实验结果
为了提高胆酸钠片质控标准，本发明还提供了评价胆酸钠片质量方法，将所得胆酸钠片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，以相似度大于0.9作为胆酸钠片的质控标准。
(1)评价胆酸钠片小试样品质量：
取10批胆酸钠片小试样品，按照步骤S1中供试品溶液制备方法制备，分别取各批样品的供试品溶液，按步骤S2中的方法进行检测，并与标准指纹图谱相比较，结果表明：各批样品指纹图谱相似度较好，均大于0.9，共有7个共有峰，共有特征峰面积之和占总峰面积的90％以上,非共有特征峰面积之和小于总峰面积的10％。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积均在起草标准规定之内,而且各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.5％。相对峰面积比值的RSD小于10.0％，数据如表8所示。
表8:10批胆酸钠片小试样品指纹图谱检测结果
(2)评价胆酸钠片中试样品质量
取3批胆酸钠片中试样品，按照步骤S1中供试品溶液制备方法制备，分别取各批样品的供试品溶液，按步骤S2中的方法进行检测，并与标准指纹图谱相比较，结果表明：各批样品指纹图谱相似度较好，均大于0.9，共有7个共有峰，共有特征峰面积之和占总峰面积的90％以上,非共有特征峰面积之和小于总峰面积的10％。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积均在起草标准规定之内，而且各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.5％。三批中试样品相对峰面积比值的RSD小于10.0％，数据如表9所示。
表9:10批胆酸钠片中试样品指纹图谱检测结果
本发明用指纹图谱技术构建了胆酸钠片的HPLC指纹图谱，对胆酸钠片的指纹图谱进行数字化评价，分别从分离度、信号强度、化学信息量、相似度等多方面反映了胆酸钠片样品指纹图谱的信息，完整且科学，采用该方法构建的标准指纹图谱中的7个特征峰的分离度高，为后续胆酸钠片产品的质量检测有效地提供了数据基础，进而为胆酸钠片今后的标准化生产提供一种可行的质量控制方法。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：构建所述方法包括以下步骤：
S1、制备溶液：
供试品溶液：取胆酸钠片细粉，加甲醇适量溶解，用稀释剂稀释，摇匀，过滤，取其续滤液，作为供试品溶液；
S2、实施检测：
将步骤S1中制备的供试品溶液分别注入到高效液相色谱仪，记录色谱图；
S3、生成指纹图谱：
基于供试品色谱图生成指纹图谱，选择胆酸钠片中峰面积大且分离度好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，共有峰峰面积总和占总峰面积90％以上；
S4、共有峰的标定及相似度确认：
对胆酸钠片指纹图谱中的共有峰进行标定及相似度确认。
2.如权利要求1所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述供试品溶液的浓度为2mg/mL。
3.如权利要求1所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S2中，在所述高效液相色谱仪上设置的色谱参数如下：
色谱柱是填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；
洗脱液包括流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为磷酸盐缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱流速为0.8～1.2mL/min，洗脱温度为20℃～40℃；
进样量为10～100μL；
检测波长为205～210nm。
4.如权利要求3所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述色谱柱为Outstand C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm。
5.如权利要求4所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液为0.2％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.5～3.0)。
6.如权利要求5所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述洗脱液以1.0mL/min的流速流经温度为40℃的所述色谱柱，在60min内完成色谱分离。
7.如权利要求6所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序为0-30min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为25：75改变为40：60；30-40min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为40：60；40-50min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为40：60改变为25：75；50-60min，流速为1.0mL/min，流动相A：流动相B体积比为25：75。
8.如权利要求7所述的一种胆酸钠片指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述胆酸钠片指纹图谱包括7个共有峰，分别为：相对保留时间为0.399的1号峰、相对保留时间为0.548的2号峰、相对保留时间为0.638的3号峰、相对保留时间为0.682的4号峰、相对保留时间为0.729的5号峰、相对保留时间为0.785的6号峰和相对保留时间为1.000的7号峰，所述7号峰为所述胆酸钠片指纹图谱的参照物S峰。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的方法所得到的指纹图谱。
10.一种胆酸钠片产品质量评价的方法，其特征在于：将所得胆酸钠片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，以相似度大于0.9作为胆酸钠片质控标准。
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