CN117092263A - 游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒、测定方法和应用 - Google Patents
游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒、测定方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医学检测技术领域，涉及游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒、测定方法和应用。针对现有技术检测游离型儿茶酚胺及代谢产物前处理时，由于其含量极低、稳定性极差且极易氧化，还存在各种结构相似或带有相同化学基团的内源性化学干扰物，导致检测精确度不高的技术问题，本申请提供的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，包括释放液，释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇，pH值为4.0～5.0，检测结果精确，且具有高选择性、高灵敏度、简单易行、经济适用等优点。本申请还提供了游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，可用于8种儿茶酚胺及其代谢产物的同时检测。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体地，涉及游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒、测定方法和应用。
背景技术
儿茶酚胺类化合物是肾上腺髓质分泌的激素，可引起人或动物血压升高、心跳加快、血管紧张、代谢率提高、耗氧量增加等。儿茶酚胺类化合物通常指去甲肾上腺素、肾上腺和多巴胺，以及它们的衍生物：变肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-甲氧基酪胺。其衍生物会在单胺氧化酶的作用下转换成终端产物：高香草酸和香草扁桃酸。临床上可以用于辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤等内分泌相关疾病，在区分嗜铬细胞瘤和儿童最常见的颅外实体瘤神经母细胞瘤方面也很重要。尿液甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素浓度测试是诊断嗜铬细胞瘤的实验室检查首选，建议可同时检测尿液中去甲肾上腺素、肾上腺、多巴胺及其他代谢产物3-甲氧基酪胺、高香草酸和香草扁桃酸以帮助诊断。
尿儿茶酚胺的测定是嗜铬细胞瘤的重要诊断依据，与血浆儿茶酚胺检测相比，尿儿茶酚胺测定无创伤，仅与临床用药和特定饮食有关，而血浆容易受如噪音、应激刺激、咖啡因、吸烟及某些食物等诸多生理及病理因素影响。循环中的儿茶酚胺在邻苯二酚-O-甲基转移酶的作用下生成其中间代谢产物，后者经消化道、脾、胰脏的相关酶修饰为硫化结合物，指南建议检测尿分馏MNs，即需要经过理化处理将结合型解离为游离型，所测结果包含游离型及原键合解离部分，解离完全性及样本间解离率的均一性不能保证，此外，消化系统本身可产生一定量的结合状态的儿茶酚胺，故特异性可能稍差。而相对于尿分馏儿茶酚胺及其代谢产物的检测所需方法灵敏度要求更高。
目前尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的前处理方式包括固相萃取法、磁性固相萃取法和化学衍生法。固相萃取原理是样品基质各组分在萃取小柱或萃取板上的保留能力不同，使目标标分析物保留并洗脱下来，同时去除样品基质中的杂质(干扰物)，分析物被浓缩。由于是特定性的选择对应的固相萃取小柱或萃取板，其净化程度非常之高，且减少了基质效应。但是这种方法前处理操作也比较复杂，且固相萃取板成本较高，另外通常需要借助于正压或负压以及氮吹装置，较难实现自动化。
如中国专利申请公布号CN107462647A，申请日为2017年08月21日，发明名称为：嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法，采用固相萃取法测定随机尿液中的3种儿茶酚胺代谢产物及肌酐，但固相萃取法操作步骤繁琐、耗时较长，包括活化、上样、淋洗、洗脱、旋干等步骤，又未使用内标物质进行定量，这对稳定性较差的儿茶酚胺物质检测结果有较大影响，且液相色谱法检测通量及定性能力相比三重四级杆质谱均较差。磁珠法是近几年较为热门的前处理方法，其原理是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良修饰后，制备成超顺磁性微球，该微球表面加以修饰的相应功能基团能与目标分析物特异性地识别和高效结合。但磁珠法有着试剂盒在使用前，磁珠需要先活化、平衡，导致样本前处理周期长的缺点，且前处理淋洗过程中有机试剂的加入与残留的样本有发生蛋白沉淀的风险。如中国专利申请公布号CN116399971A，申请日为2023年04月19日，发明名称为：提供了儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法，公开的方案对磁性固相萃取流程进行了改进，不需要进行活化、平衡，但仍需要进行洗涤、淋洗和洗脱等步骤，且仅能用于碱性儿茶酚胺及其代谢产物的检测。
现有技术中，如想实现8种儿茶酚胺及其代谢产物的同时检测，需使用衍生化法，如中国专利申请公布号CN116148387A，申请日为2023年04月19日，发明名称为：一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒，衍生化法耗时长，所需试剂组分复杂，丹磺酰氯剧毒，不易存储，过程需要60℃高温孵育，需要配备恒温震荡设备。
综上，现有技术在检测游离儿茶酚胺及其代谢产物存在以下不足：对于尿液中儿茶酚胺及其代谢产物，固相萃取法操作繁琐，耗时长，成本高；衍生化法：试剂种类繁多，非常规试剂，毒性大且耗时长，操作复杂；儿茶酚胺及其代谢物半衰期短，稳定性差，易氧化，如不对样本收集和样本前处理过程加以控制，繁杂的处理流程会导致假阴性结果；分馏型儿茶酚胺及其代谢产物易受患者饮食情况影响，对嗜铬细胞瘤造成假阳性诊断。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有技术检测游离儿茶酚胺及其代谢产物前处理时，由于其含量极低、稳定性极差且极易氧化，还存在各种结构相似或带有相同化学基团的内源性化学干扰物，导致的检测精确度不高的技术问题，若采用衍生化法，则耗时长，所需试剂组分复杂，剧毒；若采用固相萃取法或磁珠法，操作步骤繁琐、耗时较长，仅能用于碱性儿茶酚胺及其代谢产物的检测。本申请提供的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，检测结果精确，且具有高选择性、高灵敏度、简单易行、经济适用等优点。本申请还提供了游离儿茶酚胺及其代谢产物测定方法，可用于8种儿茶酚胺及其代谢产物的同时检测。
2、技术方案
为达到上述目的，提供的技术方案为：
本发明的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，包括释放液；所述释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇；所述释放液的pH值为4.0～5.0。
释放液一方面酸化样本，使碱性儿茶酚胺及其代谢产物以离子的形式解离出来，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺，另一方面使用有机相提取出酸性的终端产物-高香草酸和香草扁桃酸。
优选的，所述甲酸的体积分数为1％，所述乙醇的体积分数为85％、90％和100％；所述释放液的pH值为4.0～5.0。
进一步的，还包括保存液；所述保存液为盐酸和联合抗氧化剂混合溶液；所述盐酸的浓度为0.02～0.2mol/L；所述保存液的pH值为0.7～1.7。
保存液主要用于缓解儿茶酚胺及其代谢产物在尿液样本中氧化降解，控制结合型向游离型的转化。
进一步的，所述联合抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇，含量均为1～5mg/mL。
优选的，所述盐酸的浓度为0.2mol/L；所述联合抗氧化剂中抗环血酸∶柠檬酸∶二硫苏糖醇的比例为0.2∶1∶1，浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、5mg/mL。
进一步的，还包括复溶液；所述复溶液为0.05～0.2v/v％的甲酸水溶液。
复溶液用于将经氮吹后的待分析物复溶或者对样本释放后的上清液进行稀释，以达到溶剂替换的作用。
优选的，所述复溶液为0.1v/v％甲酸水溶液。
进一步的，还包括校准品、质控品、内标品、流动相添加剂A、流动相添加剂B。
进一步的，所述校准品为含有E、NE、DA、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA和Cre的混合溶液；所述质控品为含有E、NE、DA、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA和Cre的去儿茶酚胺尿液；所述内标包括E-d6、NE-d5、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4、HVA-d5、VMA-d3和Cre-d3；所述流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为0.1～0.2mol/L的氟化铵水溶液。
优选的，所述混合液溶剂为1％(体积分数)的PBS溶液；所述校准品工作时各物质的目标浓度范围如下:E：2～200ng/mL、NE：4～400ng/mL、DA：5～500ng/mL、MN：5～500ng/mL、NMN：5～500ng/mL、3-MT：2～200ng/mL、HVA：0.5～50μg/mL、VMA：0.2～20μg/mL和肌酐：0.03～3mg/mL；
所述质控品低质控浓度：E：8ng/mL、NE：40ng/mL、DA：150ng/mL、MN：100ng/mL、NMN：200ng/mL、3-MT：40ng/mL、HVA：10μg/mL、VMA：2μg/mL和Cre：0.6mg/mL；
高质控浓度：E：80ng/mL、NE：160ng/mL、DA：200ng/mL、MN：200ng/mL、NMN：400ng/mL、3-MT：80ng/mL、HVA：20μg/mL、VMA：15μg/mL和Cre：1.2mg/mL；
所述内标为E-d6：0.5μg/mL、NE-d5：1μg/mL、DA-d4：1.25μg/mL、MN-d3：1.25μg/mL、NMN-d3：2.5μg/mL、3-MT-d4：0.5μg/mL、HVA-d5：125μg/mL、VMA-d3：50μg/mL和Cre-d3：0.5mg/mL。
游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒的应用，将所述试剂盒应用于高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤的诊断中。
优选的，采集的样本为随机尿样；诊断的指标为游离型E、NE、DA、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA的含量。
游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，包括在尿液样本前处理中加入释放液提取游离儿茶酚胺及其代谢产物的步骤；所述释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇；所述释放液体的pH值为4.0～5.0。
优选的，所述尿液样本为新鲜的中段随机尿液样本。
进一步的，所述前处理步骤中还包括在提取前使用保存液保存尿液样本，在提取后用复溶液复溶所述尿液样本的步骤；所述保存液为盐酸和联合抗氧化剂混合溶液；所述盐酸的浓度为0.02～0.2mol/L；所述保存液的pH值为0.7～1.7。
进一步的，还包括在所述前处理步骤后使用高效液相色谱串联质谱测定的步骤；使用流动相A和流动相B；所述流动相A：每毫升纯化水加入1～2μL流动相添加剂A；所述流动相B：每毫升体积分数90％的乙腈水溶液加入1～2μL流动相添加剂B；所述流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为0.1～0.2mol/L的氟化铵水溶液。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，包括释放液，释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇，pH值为4.0～5.0。利用儿茶酚胺及其代谢产物的碱性和极性，酸解中和，以及相似相容原理，能有效解离出儿茶酚胺及其代谢产物，提升提取效率，降低基质的干扰，同时也降低了儿茶酚胺及其代谢产物降解的可能性，避免临床假阴性结果。可用于8种儿茶酚胺及其代谢产物的同时检测。
试剂盒组分简单，易获取且试剂用量较小，所用试剂沸点低蒸发速度快。试剂盒操作便捷，除振荡、离心等通用设备外，不需要其他辅助设备，有效缩短了前处理的时间。
(2)本发明的游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，包括在尿液样本前处理中加入释放液提取游离儿茶酚胺及其代谢产物的步骤，没有衍生化法耗时长，试剂组分复杂，剧毒的缺点，也没有固相萃取法或磁珠法操作步骤繁琐、耗时较长，仅能用于碱性儿茶酚胺及其代谢产物的检测的缺陷。具有高选择性、高灵敏度、简单易行、经济适用等优点。
本发明的游离型儿茶酚胺及代谢产物测定方法，还把包括复溶步骤和前处理步骤后使用高效液相色谱串联质谱测定的步骤；由于8项指标酸碱差异和极性差异大，E、NE、DA、MN、NMN、3-MT等化合物极性大不易被色谱柱保留且呈碱性，在正离子模式下进行检测；VMA和HVA等化合物极性小且呈酸性，需在负离子模式下进行检测；流动相添加剂分别使用酸性物质和碱性物质，目的在于随着色谱梯度的改变除流动相体系极性不断增加，洗脱能力不断增加，使化合物达到分离外；随着水相和有机相比例的改变，流动相体系的pH值也在不断变化，与化合物的酸碱解离常数相匹配，进一步提升化合物在色谱柱上的保留和化合物间的分离；此外，氟化铵添加至有机相中，鉴于氟的电负性，其争夺电子的能力较强，对于出峰较晚的VMA和HVA可以在离子源除的提升其离子化效率，以达到提升灵敏度的作用；复溶液与初始流动相比例越接近越有利于消除在色谱柱上保留较弱的溶剂效应。
(3)本发明的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒的应用，将所述试剂盒应用于高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤的诊断中，可检测随机尿中完整代谢通路中的指标：8项游离型儿茶酚胺及其代谢产物，并用肌酐予以校正，能解决24小时尿收集周期长导致假阴性结果和因患者不当饮食导致的假阳性结果，检测方法和试剂盒的使用有助于提升嗜铬细胞瘤的辅助诊断的准确性。
4、附图说明
图1是实施例1中尿液样本中8种儿茶酚胺及其代谢产物和肌酐的离子流图；
图2是实施例1中去甲肾上腺素工标准曲线图；
图3是实施例1中肾上腺素工标准曲线图；
图4是实施例1中多巴胺工标准曲线图；
图5是实施例1中去甲变肾上腺素工标准曲线图；
图6是实施例1中变肾上腺素工标准曲线工标准曲线图；
图7是实施例1中3-甲氧基酪胺工标准曲线图；
图8是实施例1中香草扁桃酸工标准曲线图。
5、具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
缩略词
CA，catecholamine，儿茶酚胺；
NE，Norepinephrine，去甲肾上腺素；
E，Epinephrine，肾上腺；
DA，Dopamine，多巴胺；
MN，Metanephrine，变肾上腺素；
NMN，Normetanephrine，去甲变肾上腺素；
3-MT，3-Methoxytyramine，3-甲氧基酪胺；
HVA，Homovanillic acid，高香草酸；
VMA，Vanillymandelic acid，香草扁桃酸；
PPGLs，嗜铬细胞瘤；
COMT，catechol-Omethyl transferase，邻苯二酚-O-甲基转移酶；
Cre，creatinine，肌酐。
实施例1
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，包括以下组分和规格：
保存液：本实施例的保存液为盐酸和联合抗氧化剂混合溶液，盐酸的浓度为0.2mol/L；联合抗氧化剂中抗环血酸∶柠檬酸∶二硫苏糖醇的比例为0.2∶1∶1，浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、5mg/mL。保存液的pH值为0.7。
在另一些实施例中，盐酸的浓度还可以为0.02～0.2mol/L；联合抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇，含量均为1～5mg/mL，联合抗氧化剂但不限于三者的任意组合；保存液的pH值还可以为0.7～1.7。
释放液：含体积分数1％甲酸的体积分数为90％乙醇的水溶液。本实施例的释放液的pH值为4.5。在另一些实施例中，释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇。
复溶液：0.2v/v％甲酸水溶液。在另一些实施例中，还可以是所述浓度为0.05～0.2v/v％的甲酸水溶液。
校准品：混合液溶剂为1％(体积分数)的PBS溶液；校准品工作时各物质的目标浓度范围如下:E：2～200ng/mL、NE：4～400ng/mL、DA：5～500ng/mL、MN：5～500ng/mL、NMN：5～500ng/mL、3-MT：2～200ng/mL、HVA：0.5～50μg/mL、VMA：0.2～20μg/mL和肌酐：0.03～3mg/mL。
质控品：低质控浓度：E：8ng/mL、NE：40ng/mL、DA：150ng/mL、MN：100ng/mL、NMN：200ng/mL、3-MT：40ng/mL、HVA：10μg/mL、VMA：2μg/mL和Cre：0.6mg/mL。
高质控浓度：E：80ng/mL、NE：160ng/mL、DA：200ng/mL、MN：200ng/mL、NMN：400ng/mL、3-MT：80ng/mL、HVA：20μg/mL、VMA：15μg/mL和Cre：1.2mg/mL。
内标品：为含E-d6：0.5μg/mL、NE-d5：1μg/mL、DA-d4：1.25μg/mL、MN-d3：1.25μg/mL、NMN-d3：2.5μg/mL、3-MT-d4：0.5μg/mL、HVA-d5：125μg/mL、VMA-d3：50μg/mL和Cre-d3：0.5mg/mL的甲醇溶液。
流动相添加剂A：甲酸。
流动相添加剂B：所述流动相添加剂B为0.1～0.2mol/L的氟化铵水溶液。
本实施例的游离儿茶酚胺及其代谢产物测定方法，具体包括如下步骤：
1.校准品的配制
按照表1称取儿茶酚胺及其代谢产物和肌酐及其同位素内标的固体标准品分别放入溶液量瓶中，用含1mg/mL柠檬酸+二硫苏糖醇的0.1N盐酸溶解后定容至10mL，混匀。制得各标准品及其同位素内标母液。使用含100μg/mL柠檬酸+二硫苏糖醇的1％PBS水配制成表3的混合标准曲线，-80～-10℃低温保存。
表1系列浓度校准品
| 化合物 | 校准品S1 | 校准品S2 | 校准品S3 | 校准品S4 | 校准品S5 | 校准品S6 | 单位 |
| E | 2 | 4 | 10 | 40 | 100 | 200 | ng/mL |
| NE | 4 | 8 | 20 | 80 | 200 | 400 | ng/mL |
| DA | 5 | 10 | 25 | 100 | 250 | 500 | ng/mL |
| MN | 5 | 10 | 25 | 100 | 250 | 500 | ng/mL |
| NMN | 5 | 10 | 25 | 100 | 250 | 500 | ng/mL |
| 3-MT | 2 | 4 | 10 | 40 | 100 | 200 | ng/mL |
| HVA | 0.5 | 1 | 2.5 | 10 | 25 | 50 | μg/mL |
| VMA | 0.2 | 0.4 | 1 | 4 | 10 | 20 | μg/mL |
| Cre | 0.03 | 0.06 | 0.15 | 0.6 | 1.5 | 3 | mg/mL |
2.质控品的配制
采购商品化的去儿茶酚胺及其代谢产物的尿液，每mL尿液加入样本保存液10μL，混匀后作为质控基质，加入儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合标准品，配制低、高浓度质控品，-20℃低温保存。
3.内标品的配制
将儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物内标母液用1mg/mL柠檬酸+二硫苏糖醇甲醇溶液配制成儿茶酚胺及儿茶酚胺混合内标液，-20℃低温保存。使用时使用释放液稀释50倍使用，得到内标工作液。
4.流动相添加剂的配制
流动相添加剂A直接采购商品化的色谱级甲酸；使用时稀释1000倍
流动相添加剂B：称取74.08mg的氟化铵溶于10mL纯化水中，混匀；使用时用90％乙腈水稀释1000倍。
5.前处理试剂配制
样本保存液：使用纯化水对2mol/L盐酸标准溶液进行10倍稀释成10mL 0.2mol/L盐酸溶液，再称取10mg抗坏血酸、50mg柠檬酸、50mg二硫苏糖醇，混匀；
释放液：含体积分数1％甲酸的体积分数90％乙醇水溶液；
复溶液：体积分数0.2％甲酸水溶液。
6.样本检测
6.1.样本收集：使用采尿管收集4mL中段尿液，再加入40μL样本保存液，上下颠倒混匀。
6.2.提取：分别准确移取50μL的儿茶酚胺及其代谢产物和肌酐的校准品、质控品、尿液样本置于96孔板中，再加入300μL内标工作液设置振荡频率70rpm提取5min；
6.3.将上述96孔板置于低速离心机中，3000rpm离心10min；
6.4.取30μL上清液置新的96孔板中，加入90μL 0.2％甲酸水至96孔板中，70rpm振荡混匀3min，上机检测。
6.5.液相色谱串联质谱检测。
基于waters I-Class LC-XevoTQ-S，仪器参数如下：
色谱柱：Thermofisher aQ(2.1×100mm，1.9μm)；流动相A：0.1％甲酸水；流动相B：0.02mM氟化铵+90％乙腈水，柱温：35℃。
表2色谱梯度
| 序号 | 时间(min) | 流速(mL/min) | ％A |
| 1 | 0.00 | 0.25 | 99.9 |
| 2 | 1.20 | 0.35 | 99.9 |
| 3 | 1.80 | 0.35 | 85.0 |
| 4 | 2.50 | 0.40 | 10.0 |
| 5 | 3.50 | 0.40 | 10.0 |
| 6 | 3.80 | 0.25 | 99.9 |
| 7 | 5.00 | 0.25 | 99.9 |
质谱参数：毛细管电压：1.5kV，去溶剂气温度：600℃，电喷雾离子源，正负切换模式。
表3 MRM参数
7.结果
7.1.线性验证
分别检测6个校准品，采用同位素内标法定量，1/x2为权重，以各化合物与其同位素内标峰面积之比为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标绘制校准工作曲线，线性相关系数r>0.99。
7.2.精密度
分别检测低、高2个浓度水平质控样品，每天各进行6次重复，连续测3天，记录实验结果并进行统计分析低、高2个浓度水平的精密度情况，变异系数(CV,％)≤15％；
7.3.正确度验证
选择实际尿液作为回收实验基础样品，按照5μL低、高标准样品分别与45μL的基础样品混合，如表7所示，要求：低浓度为线性范围下限的3倍；高浓度为线性范围上限的70％。将上述“基础样品”和“实验样品”重复平行测定6次，记录实验结果并进行统计分析低、高2个浓度水平的加标回收情况，回收率＝(检测值-基础样品值)/理论值×100％，85％＜回收率＜115％。
8种儿茶酚胺及其代谢产物和内标色谱图如图1所示。
标准工作曲线如图2-8所示。
表4精密度、加标回收率
7.4.实际样本测试
表5正常人随机尿中测定值
| NE | E | DA | NMN | MN | 3-MT | VMA | HVA | |
| 1 | 27.37 | 16.96 | 159.38 | 32.98 | 39.01 | 22.91 | 4.99 | 3.95 |
| 2 | 105.25 | 12.75 | 155.17 | 32.50 | 16.92 | 17.97 | 3.72 | 6.14 |
| 3 | 37.87 | 36.61 | 173.92 | 24.57 | 45.51 | 35.39 | 3.48 | 4.22 |
| 4 | 17.03 | 4.41 | 48.68 | 18.80 | 8.31 | 13.68 | 1.76 | 1.96 |
| 5 | 9.94 | 2.90 | 145.74 | 17.59 | 8.20 | 21.88 | 2.04 | 2.76 |
实施例2
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，基本同实施1，不同的是：
释放液：含体积分数1％甲酸的体积分数100％乙醇溶液。本实施例的释放液的pH值为4.6。
本实施例的游离型儿茶酚胺其代谢产物测定方法，检测的样本同实施例1，线性相关系数＞0.99；质控精密度≤12.71％。样本检测与实施例1偏差在15％以内。
表6实施例2测定结果
| 项目 | 线性方程 | 2 | 低质控精密度 | 高质控精密度 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 |
| 3-MT | y＝1.155x+0.6473 | 0.9952 | 9.26％ | 10.16％ | 24.13 | 15.56 | 28.96 | 12.41 | 16.93 |
| NE | y＝0.2294x+0.3466 | 0.9912 | 3.64％ | 2.70％ | 31.25 | 118.33 | 40.73 | 14.76 | 10.64 |
| DA | y＝0.2237x+0.1067 | 0.9926 | 7.13％ | 12.36％ | 160.96 | 182.81 | 140.8 | 49.94 | 142.22 |
| E | y＝0.5581x+0.6819 | 0.9944 | 8.14％ | 9.57％ | 16.18 | 15.5 | 32.6 | 3.97 | 2.84 |
| NMN | y＝0.0957x+0.0291 | 0.9926 | 7.47％ | 7.61％ | 38.6 | 29.4 | 22.3 | 20.01 | 21.53 |
| MN | y＝0.2364x+0.5513 | 0.9911 | 5.77％ | 9.95％ | 39.22 | 20.02 | 45.87 | 8.63 | 9.77 |
| HVA | y＝0.1027x+0.0116 | 0.9903 | 12.64％ | 10.85％ | 3.9 | 6.21 | 3.96 | 1.81 | 2.36 |
| VMA | y＝0.5570x+0.0220 | 0.9942 | 3.00％ | 12.71％ | 6 | 3.26 | 4.09 | 1.51 | 1.72 |
实施例3
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，基本同实施1，不同的是：
释放液：含体积分数2％甲酸的100％乙醇溶液。本实施例的释放液的pH值为4.3。
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物测定方法，检测的样本同实施例1，线性相关系数＞0.99；质控精密度≤12.77％。样本检测与实施例1偏差在15％以内。
表7实施例3测定结果
| 项目 | 线性方程 | 2 | 低质控精密度 | 高质控精密度 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 |
| 3-MT | y＝0.6077x+4.5126 | 0.9981 | 6.02％ | 6.21％ | 24.06 | 18.56 | 27.58 | 10.8 | 16.88 |
| NE | y＝0.1743x+2.1781 | 0.9967 | 11.07％ | 12.48％ | 33.74 | 126.48 | 42.58 | 13.41 | 10.01 |
| DA | y＝0.2158x+0.3086 | 0.9935 | 9.24％ | 5.10％ | 131.59 | 172.13 | 140.75 | 41.43 | 150.8 |
| E | y＝0.6076x+0.7185 | 0.9970 | 3.44％ | 8.50％ | 14.23 | 17.58 | 29.92 | 3.25 | 3.05 |
| NMN | y＝0.01015x+0.0105 | 0.9948 | 11.34％ | 11.19％ | 37.46 | 37.95 | 27.73 | 19.25 | 20.72 |
| MN | y＝0.2322x+0.0516 | 0.9921 | 4.59％ | 3.10％ | 35.85 | 17.94 | 41.98 | 8.8 | 7.87 |
| HVA | y＝0.0998x+0.0043 | 0.9917 | 1.94％ | 6.95％ | 3.72 | 4.67 | 3.38 | 2.38 | 2.26 |
| VMA | y＝0.5475x+0.0034 | 0.9947 | 12.77％ | 1.44％ | 5.16 | 3.56 | 3.53 | 1.7 | 2.04 |
实施例4
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，基本同实施1，不同的是：
释放液：含体积分数3％甲酸的90％乙醇水溶液。本实施例的释放液的pH值为4.1。
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物测定方法，检测的样本同实施例1，线性相关系数＞0.99；质控精密度≤12.66％。样本检测与实施例1偏差在15％以内。
表8实施例4测定结果
| 项目 | 线性方程 | 2 | 低质控精密度 | 高质控精密度 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 |
| 3-MT | y＝1.0401x+0.4902 | 0.9941 | 2.14％ | 6.78％ | 28.47 | 15.23 | 33.87 | 13.26 | 16.19 |
| NE | y＝0.2531x+0.3105 | 0.9946 | 4.83％ | 9.87％ | 29.69 | 138.24 | 44.36 | 12.84 | 12.9 |
| DA | y＝0.2228x+0.1091 | 0.99358 | 9.72％ | 4.97％ | 156.01 | 167.86 | 155.06 | 43.93 | 155.47 |
| E | y＝0.6369x+0.2041 | 0.9951 | 7.74％ | 12.66％ | 18.09 | 14.16 | 35.41 | 4.2 | 2.96 |
| NMN | y＝0.1119x+0.02202 | 0.9912 | 11.61％ | 3.25％ | 32.69 | 30.09 | 23.08 | 20.81 | 22.52 |
| MN | y＝0.2460x+0.0193 | 0.9960 | 5.28％ | 6.24％ | 36.66 | 17.84 | 45.2 | 7.05 | 8.36 |
| HVA | y＝0.1072x+0.0145 | 0.9993 | 5.21％ | 2.65％ | 3.26 | 5.26 | 4.47 | 2.36 | 2.83 |
| VMA | y＝0.6871x+0.07933 | 0.9926 | 8.25％ | 6.34％ | 5.18 | 3.53 | 3.01 | 1.68 | 1.62 |
实施例5
本实施例的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，基本同实施1，不同的是：
释放液：含体积分数2％甲酸的体积分数为85％乙醇的水溶液。本实施例的释放液的pH值为4.3。
本实施例的游离儿茶酚胺及其代谢产物测定方法，检测的样本同实施例1，线性相关系数＞0.99；质控精密度≤13.23％。样本检测与实施例1偏差在15％以内。
表9实施例5测定结果
| 项目 | 线性方程 | 2 | 低质控精密度 | 高质控精密度 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 |
| 3-MT | y＝0.69357x+0.0630 | 0.9942 | 7.99％ | 5.23％ | 23.39 | 15.29 | 32.98 | 10.83 | 17.04 |
| NE | y＝0.2004x+0.1148 | 0.9964 | 5.22％ | 9.08％ | 34.24 | 123.9 | 39.35 | 14.95 | 11.92 |
| DA | y＝0.241x+0.2417 | 0.9941 | 2.78％ | 7.65％ | 136.46 | 177.49 | 175.88 | 46.14 | 131.35 |
| E | y＝0.5699x+0.1246 | 0.9963 | 3.55％ | 6.90％ | 17.66 | 16.17 | 37.26 | 4.11 | 2.93 |
| NMN | y＝0.1138x+0.6192 | 0.9905 | 6.94％ | 9.92％ | 37.9 | 36.59 | 24.34 | 16.67 | 22.45 |
| MN | y＝0.22317x+0.1236 | 0.9928 | 6.08％ | 13.04％ | 33.37 | 18.9 | 48.08 | 7.02 | 8 |
| HVA | y＝0.1165x+0.0170 | 0.9901 | 5.67％ | 13.23％ | 4.04 | 5.91 | 4.41 | 2.26 | 2.28 |
| VMA | y＝0.5120x+0.0036 | 0.9940 | 3.44％ | 1.96％ | 5.04 | 3.28 | 3.49 | 1.52 | 2.14 |
对比例1
本对比例的游离型儿茶酚胺及代谢产物测定方法，采用的方法为固相萃取法，检测的具体步骤为：
(1)样本预处理：移取5μL尿液样本至1.5mL EP管中，再加入495μL纯化水，涡旋混匀30s，再加入50μL内标工作液和300μL 20mM乙酸铵，涡旋混匀3min；
(2)活化与平衡：取WCX96孔固相萃取板，分别使用300μL甲醇进行活化，300μL20mM乙酸铵进行平衡；
(3)上样：取步骤(1)中的700μL样本加入至96孔固相萃取板中上样；
(4)淋洗：取300μL纯化水、300μL甲醇依次进行淋洗；
(5)洗脱：150μL含2％甲酸的98％的乙腈水分两次进行洗脱；
(5)氮吹与复溶：步骤(5)中的样本室温下氮吹干，加入100μL 0.1％甲酸水，振荡复溶，上机检测。
检测的样本同实施例1，检测的结果如下：
表10对比例1测定结果
从结果可知，实施例1的结果与固相萃取法的结果基本一致，即线性相关系数＞0.99；质控精密度≤12.18％，均小于15％。样本检测与实施例1偏差在15％以内，表明本方案可以替代固相萃取法用于尿液中儿茶酚胺及代谢产物的检测。
对比例2
本对比例的游离型儿茶酚胺及其代谢产物测定方法，基本同实施1，不同的是：流动相A添加剂为乙酸，即复溶液与流动相初始状态不一致。
检测的样本同实施例1中样本1，检测的结果如下：
表11对比例1测定结果
| 项目 | 实施例1峰面积 | 对比例2峰面积 | 偏差，％ |
| 3-MT | 3750.4 | 2237.5 | -25.3 |
| NE | 109414.3 | 54586.4 | -33.4 |
| DA | 115464.2 | 129585.1 | 5.8 |
| E | 120201.1 | 158066.7 | 13.6 |
| NMN | 304444.9 | 341440.1 | 5.7 |
| MN | 2059781.3 | 2154277.0 | 2.2 |
| HVA | 5357.9 | 1735.4 | -51.1 |
| VMA | 2140.3 | 1650.1 | -12.9 |
对比同一样本在不同流动相体系中峰面积，从结果可知，对于3-MT、NE、HVA而言，实施例1中响应值由于对比例2，其偏差大于25％以上；其他指标基本无差异，偏差在15％以内。
Claims (10)
1.游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：包括释放液；所述释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇；所述释放液的pH值为4.0～5.0。
2.根据权利要求1所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：还包括保存液；所述保存液为盐酸和联合抗氧化剂混合溶液；所述盐酸的浓度为0.02～0.2mol/L；所述保存液的pH值为0.7～1.7。
3.根据权利要求2所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：所述联合抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇，含量均为1～5mg/mL。
4.根据权利要求2所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：还包括复溶液；所述复溶液为0.05～0.2v/v％的甲酸水溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：还包括校准品、质控品、内标品、流动相添加剂A、流动相添加剂B。
6.根据权利要求5所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒，其特征在于：所述校准品为含有E、NE、DA、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA和Cre的混合溶液；所述质控品为含有E、NE、DA、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA和Cre的去儿茶酚胺尿液；所述内标包括E-d6、NE-d5、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4、HVA-d5、VMA-d3和Cre-d3；所述流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为0.1～0.2mol/L的氟化铵水溶液。
7.游离型儿茶酚胺及代谢产物检测试剂盒的应用，其特征在于：将权利要求1-6所述试剂盒应用于高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤的诊断中。
8.游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，其特征在于：包括在尿液样本前处理中加入释放液提取游离儿茶酚胺及其代谢产物的步骤；所述释放液为体积分数1～3％的甲酸和体积分数85～100％的乙醇；所述释放液体的pH值为4.0～5.0。
9.根据权利要求8所述游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，其特征在于：所述前处理步骤中还包括在提取前使用保存液保存尿液样本，在提取后用复溶液复溶所述尿液样本的步骤；所述保存液为盐酸和联合抗氧化剂混合溶液；所述盐酸的浓度为0.02～0.2mol/L；所述保存液的pH值为0.7～1.7。
10.根据权利要求8或9任一项所述的游离型儿茶酚胺及代谢产物的测定方法，其特征在于：还包括在所述前处理步骤后使用高效液相色谱串联质谱测定的步骤；使用流动相A和流动相B；所述流动相A：每毫升纯化水加入1～2μL流动相添加剂A；所述流动相B：每毫升体积分数90％的乙腈水加入1～2μL流动相添加剂B；所述流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为0.1～0.2mol/L的氟化铵水溶液。
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