CN110568093A - 定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法 - Google Patents

定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，能够快速有效的检测出生物样本中的变肾上腺素、变去甲肾上腺素和3‑甲氧酪胺的含量；不仅可以检测出和协会指南中首推的指标，还可以有效地检测和起辅助诊断作用，而且本发明的检测方法还扩展了的检测范围，即可以用于各种类型的PPGL进行诊断，可有效避免漏诊；此外，本发明的检测方法在用于诊断时具有非常高的灵敏度和特异性，灵敏度和特异性可分别达到98.7％和97.3％。

Description

定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法
技术领域
本发明涉及微量化合物检测领域技术，具体涉及一种定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法。
背景技术
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)属于神经内分泌肿瘤，分别起源于肾上腺髓质和肾上腺外的交感或副交感神经节细胞。肿瘤通常阵发性或持续性分泌大量的儿茶酚胺，引起患者血压呈阵发性或持续性升高。嗜铬细胞瘤和副神经节瘤临床表现异质性极大，尽管患者只占成人高血压患者的0.05％-0.2％，但是这些患者如未能及时检测并得到针对性治疗，长期的高血压将造成患者的心、脑、肾等器官的严重损害。如果能早期准确检测诊断，通过手术切除肿瘤，高血压可得到治愈。传统的生化检查是检测血或尿中的肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度，但是该类方法缺乏灵敏度和特异性。中华医学会内分泌协会和美国内分泌协会推荐试用儿茶酚胺的代谢产物变肾上腺素和变去甲肾上腺素作为诊断的首选指标。目前临床中用于检测变肾上腺素和变去甲肾上腺素浓度的方法有酶联免疫法、液相色谱串联质谱法、液相色谱电化学法，其中酶联免疫法存在交叉干扰及灵敏度较低，电化学法不能彻底消除药物对目标峰的干扰。
由于儿茶酚胺代谢产物变肾上腺素(MN)、变去甲肾上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)的极性较高，而且分子结构相似，这就要求对上述化合物有较的色谱分离。尽管现有技术采用不同的液相色谱串联质谱法的组合检测这类物质，但是这导致了检测时间的过度延长，很大程度上抑制了其在临床上的应用。因此，目前迫切需要一种能够高效快速地从生物样本中一次性检测出上述儿茶酚胺代谢产物的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，能够快速检测生物样本中的变肾上腺素、变去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺的含量，可以用于诊断和排查临床各种类型的PPGL。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，包括以下步骤，
S1、取400-500μL磷酸铵溶液、20-25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液和450-500μL血浆，混合后充分涡旋混匀制成待测样本溶液以备用；
S2、取N个浓度不同的450-500μL儿茶酚胺代谢产物的标准品溶液，然后加入400-500μL磷酸铵溶液和20-25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液混合均匀后制成N个标准品混合溶液以备用；
S3、将弱阳离子交换96孔固相萃取板分别用甲醇和磷酸铵溶液进行预处理；
S4、将步骤S1中制得的待测样本溶液和步骤S2中制得的标准品混合溶液分别加入到经过预处理的孔中，待样品添加完成后，使用正压装置使待测样本溶液和标准品溶液缓慢流过柱芯；
S5、然后分别用水和甲醇依次清洗样品孔，然后用低浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗涤样品孔，最后用高浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗脱，并将洗脱液收集在接收板中，采用氮气吹干，加入100μL流动相A溶液复溶，混合均匀后取用20μL放入系统分析。
S6、经过系统分析后，将标准品出峰面积同同位素内标出峰面积的比值与标准品溶液浓度做线性回归得到3种化合物的标准曲线；再根据待测样本中的3种化合物的出峰面积同同位素内标出峰面积的比值，通过标准曲线计算待测样本中3种目标化合物的浓度。
作为优选，所述步骤S2中所述儿茶酚胺代谢产物的标准品溶液包括：变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧酪胺；所述步骤S6中所述的3中化合物分别是变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧酪胺。
作为优选，进行系统分析时，系统的色谱条件如下，色谱柱为3μm HILIC，柱温22℃，流动相A含0.1％甲酸的1mM甲酸铵水溶液；流动相B含0.1％甲酸的1mM甲酸铵的甲醇溶液；流速0.4mL/分钟；梯度洗脱；质谱条件为电喷雾离子源，正离子扫描，离子源喷雾电压：1250V，雾化温度450℃。
本发明采用上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明能够快速有效的检测出生物样本中的变肾上腺素、变去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺的含量；不仅可以检测出和协会指南中首推的指标，还可以有效地检测和起辅助诊断作用，而且本发明的检测方法还扩展了的检测范围，即可以用于各种类型的PPGL进行诊断，可有效避免漏诊；此外，本发明的检测方法在用于诊断时具有非常高的灵敏度和特异性，灵敏度和特异性可分别达到98.7％和97.3％。
附图说明
图1是变肾上腺素的标准曲线图。
图2是去甲变肾上腺素的标准曲线图。
图3是3-甲氧酪胺的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例
将500μL磷酸铵溶液(25mmol/L)，25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液(MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4，浓度为3ng/mL)混匀,500μL生物样本，充分涡旋混匀后形成待测样本溶液待用；将5个梯度浓度的500μL儿茶酚胺代谢产物其代谢产物(MN、NMN、3-MT)的标准品溶液分别与500μL磷酸铵溶液(25mmol/L)、25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液(MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4，浓度为3ng/mL)混匀，分别形成5个标准品混合溶液待用；儿茶酚胺代谢产物其代谢产物(MN、NMN、3-MT)5个梯度浓度分别为：50、100、200、500、800pg/mL，将弱阳离子交换96孔固相萃取板分别用甲醇和磷酸铵溶液进行预处理，然后分别将以上混匀的样品溶液和标准品溶液加入到经过预处理的各孔中，待样品加载完成后，使用正压装置让样品溶液和标准品溶液缓慢流过柱芯；分别用水和甲醇清洗样品孔，然后用低浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗涤样品孔，最后用高浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗脱，并将洗脱液收集在接收板中，氮气吹干，加入100μL流动相A溶液复溶，混合均匀后20μL进入系统分析；系统的色谱条件为：色谱柱为3μm HILIC，柱温22℃，流动相A含0.1％甲酸的1mM甲酸铵的水溶液；流动相B含0.1％甲酸的1mM甲酸铵的甲醇溶液；流速0.4mL/分钟；梯度洗脱；质谱条件为电喷雾离子源，正离子扫描，离子源喷雾电压：1250V，雾化温度450℃。
将N个含有同位素内标的儿茶酚胺代谢物的标准品混合溶液通过固相萃取处理，进入LC-MS/MS分析后，将标准品出峰面积同同位素内标出峰面积的比值与标准品溶液浓度做线性回归得到3种化合物的标准曲线；再根据待测样本中的3种化合物的出峰面积同同位素内标出峰面积的比值，根据标准曲线计算生物样本中3种目标化合物的浓度，所述3种化合物分别是变肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-甲氧酪胺。
如图1所示，MN的线性方程：Y＝4.691E-4X+9.053E-3；R2＝0.9988
如图2所示，NMN的线性方程：Y＝1.120E-3X+8.297E-3；R2＝0.9998
如图3所示，3-MT的线性方程：Y＝6.286E-4x+4.917E-3；R2＝0.9997
MN、NMN、3-MT可报告范围为：7.81pg/mL-4000gp/mL
精密度由含有不同浓度的3个化合物的样本的检测浓度计算得到的变异系数(％CV)进行评估，变异系数不得超过15.0％。
1、批内精密度评估(n＝20)
评估了3个化合物的3个不同浓度的检测数据，每个化合物的各个浓度平行检20次，数据如下：
2、批间精密度评估(n＝20)
评估了3个指标化合物的3个不同浓度的检测数据，每个指标化合物的各个浓度每天进行4次平行检测，连续5天，共计20次，数据如下：
3、回收率实验：
在被检测的生物样本中，添加已知浓度的标准品(MN、NMN、3-MT使用了低中高3个不同的浓度)，每个浓度平行检测6次，将测定值减去样本中内源性分析物浓度后的差值与加入的标准品样本浓度之比用于评价回收率，数据如下，并且每种化合物的各个浓度的回收率的变异系数(CV)小于15％。
以上本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，其特征在于：包括以下步骤，
S1、取400-500μL磷酸铵溶液、20-25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液和450-500μL血浆，混合后充分涡旋混匀制成待测样本溶液以备用；
S2、取N个浓度不同的450-500μL儿茶酚胺代谢产物的标准品溶液，然后加入400-500μL磷酸铵溶液和20-25μL儿茶酚胺代谢产物的内标溶液混合均匀后制成N个标准品混合溶液以备用；
S3、将弱阳离子交换96孔固相萃取板分别用甲醇和磷酸铵溶液进行预处理；
S4、将步骤S1中制得的待测样本溶液和步骤S2中制得的标准品混合溶液分别加入到经过预处理的孔中，待样品添加完成后，使用正压装置使待测样本溶液和标准品溶液缓慢流过柱芯；
S5、然后分别用水和甲醇依次清洗样品孔，然后用低浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗涤样品孔，最后用高浓度的含有甲酸的乙腈水溶液洗脱，并将洗脱液收集在接收板中，采用氮气吹干，加入100μL流动相A溶液复溶，混合均匀后取用20μL放入系统分析。
S6、经过系统分析后，将标准品出峰面积同同位素内标出峰面积的比值与标准品溶液浓度做线性回归得到3种化合物的标准曲线；再根据待测样本中的3种化合物的出峰面积同同位素内标出峰面积的比值，通过标准曲线计算待测样本中3种目标化合物的浓度。
2.根据权利要求1所述的定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述步骤S2中所述儿茶酚胺代谢产物的标准品溶液包括：变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧酪胺；所述步骤S6中所述的3中化合物分别是变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧酪胺。
3.根据权利要求1所述的定量检测儿茶酚胺代谢产物的液相色谱串联质谱法，其特征在于：进行系统分析时，系统的色谱条件如下，色谱柱为3μm HILIC，柱温22℃，流动相A含0.1％甲酸的1mM甲酸铵水溶液；流动相B含0.1％甲酸的1mM甲酸铵的甲醇溶液；流速0.4mL/分钟；梯度洗脱；质谱条件为电喷雾离子源，正离子扫描，离子源喷雾电压：1250V，雾化温度450℃。
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