CN101696918A - 鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，属于兽药残留检测的动物性食品基体标准物质技术领域。解决了合适浓度的自然基体动植物阳性候选材料难以自由获取、动物肌肉原酱基体标准样品容易腐败变质的问题。本发明采用氟甲喹对活鳗鱼进行药浴，使鳗鱼体内含有氟甲喹，将活鳗鱼进行宰杀后，取鱼肉捣碎匀浆，过筛，装袋，封口后辐照灭菌，制备得到种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品；制备的自然基体标准样品的中氟甲喹的浓度为5～10μg/kg。本发明制备出的鳗鲡自然污染基体实物标样，避免冻干粉和加料自然基体标准物质的缺陷和问题。可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定，运输方便，使用可靠。

Description

鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测的动物性食品基体标准物质技术领域，更具体涉及一种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法。

背景技术

氟甲喹(Flumequine)，CAS：42835-25-6。化学名：9-氟-6，7-二氢-5-甲基-1-氧代-1H，5H-苯并(i，j)喹嗪-2-羧酸。分子式：C₁₄H₁₂NO₃F，分子量：261.25，结构式如下

氟甲喹结构式

氟甲喹为白色粉末，无臭、无味，不溶于水能在有机溶剂中互溶；用途：对革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性，抗菌作用机制为抑制DNA回旋酶，使细菌细胞不再分裂，对细菌显示选择性毒性，抗菌作用为杀菌性，主要用于鱼、虾、蟹、鳖由气单胞菌引起的多种细菌性疾病。如出血病、烂腮病、肠炎等。是目前唯一的不与人类共用的一种广谱型的抗菌兽药，也是喹诺酮类产品的第二代抗菌剂，有很强的杀菌活力，对动物细菌性的疾病有很好疗效。

水产品主要进口国对水产品中氟甲喹限量要求各不相同，如日本鱼片中40μg/kg、鳗鱼中600μg/kg，韩国水产品中500μg/kg，欧盟有鳍的200μg/kg、无鳍的600μg/kg，美国则不得检出，输美控制2μg/kg，各国限量要求差别很大，该氟甲喹基体标准物拟以接近输美控制限考虑；而对于用于氟甲喹残留检测的动物性食品基体标准物质包括冻干粉样、加料自然基体标样、自然(污染)基体标样等。冻干粉作为质量控制的标准样品有其优越性，即均匀性好、稳定性好、易保存，但由于冻干粉同实验室日常分析检测的样品形态不同，虽然可采用复水或其它手段使得冻干粉尽可能与日常分析基体相似，但使用冻干粉进行方法验证与质量控制时常遇到取样量及提取、净化行为与日常分析样品有所不同等缺陷。采用加料(加标)法制备的基体标准物质虽制备简便，但存在目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致导致提取、净化行为与日常分析样本有所不同等问题的可能。

发明目的

本发明的目的是提供一种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，该方法针对上述冻干粉样、加料自然基体标样等的问题和缺陷，采用模拟养殖条件下对生长的活鳗鱼给药后选择适当时机捕捞、宰杀、匀浆，经均质、阻隔性材料包装和辐照灭菌、均匀性检验、稳定性检验和实验室网络协同定值，制备出含合适浓度氟甲喹残留的鳗鲡自然污染基体(非加料、目标物结合状态与实际检样完全一致)、自然原酱状态(非冻干粉、外观状态与实际检样完全一致)的实物标样，避免冻干粉和加料自然基体标准物质的缺陷和问题。可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定，运输方便，使用可靠。

本发明鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法：采用氟甲喹对活鳗鱼进行药浴，使鳗鱼体内含有氟甲喹，将活鳗鱼进行宰杀后，取鱼肉捣碎匀浆，过筛，装袋，封口后辐照灭菌，制备得到种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品；制备的自然基体标准样品的中氟甲喹的浓度为5～10μg/kg。

本发明的显著优点是：采用模拟养殖条件下对生长的活鳗鱼给药后选择适当时机捕捞、宰杀、匀浆，经均质、阻隔性材料包装和辐照灭菌、均匀性检验、稳定性检验和实验室网络协同定值，通过给药控制和合适采集时机的选择可获得预期含量的目标物结合状态以及外观状态与实际检测样品一致的含氟甲喹鳗鱼自然(污染)基体阳性材料，采用捣碎搅匀、拍击均质和人工全量搅拌相结合的工艺可以保证材料的均匀性，所用包装材料和灭菌方法可以防止常温时鱼酱基体腐败便于实验室间常温传递，本发明的产品可以在常温下运输传递，保质期长，该标样形态及其目标物与基体结合的情形都与真实检测样品完全一致，避免了冻干粉和加料自然基体标准物质的缺陷和问题，可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定，运输方便，使用可靠，产品具有显著的经济价值和市场竞争力。

附图说明

图1是鳗鱼中氟甲喹含量随施药后时间的变化趋势图。

具体实施方式

制备方法的具体步骤如下：

(1)在成鳗的水池中加入氟甲喹药剂溶液后进行药浴饲养，饲养条件为：空气泵24h増氧；水温23℃；每立方米水中饲养375条鳗鱼，鳗鱼大小约为4条/kg；换水率：加入氟甲喹药剂溶液后24小时整100％换清水，此后每天换清水1次，换清水时均不再加入氟甲喹药剂溶液；饲养时间为：投药后3-6天；所述氟甲喹药剂溶液的配制为：在20mL碳酸氢钠饱和水溶液中加入0.0420g的纯度为99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀释至200mL；所述氟甲喹药剂溶液的投放量：按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹药剂溶液；

(2)捞出步骤(1)捕捞饲养时间完成后的鳗鱼，立即冷冻处死，宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段，

(3)捣碎匀浆；将切段后的鱼肉置于匀浆机中，3000rpm转速搅成酱样并匀浆3min，混合所有鱼酱；人工搅拌30min混匀；然后进行第二轮的匀浆机3000rpm转速下3min匀浆；

(4)再采用拍击式均质器进行均质：将步骤(3)匀浆后的鱼酱装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率，每次拍击2min后取下揉混袋中酱样，再拍击，如此反复拍击三次；拍击后酱样混置于大桶中，再次人工搅拌混合30min；

(5)过筛：均质后鱼酱挤压通过10目网筛，弃去筛余；

(6)将步骤(5)过筛后的鱼酱装入内袋中，再套上外袋；用真空封口机，对装好酱样的外袋热封口；

(7)辐照灭菌：将包装好的酱样辐照灭菌，辐照剂量为12kGy。

所述步骤(2)的阶段的长度为每段长3cm。

所述步骤(6)的每袋中装鱼酱25g。

所述步骤(7)灭菌后样本置于20℃冰箱中贮存。

所述装袋的包装材料采用内袋和外包装袋；所述外包装袋采用耐蒸煮复合膜袋；所述内袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮复合膜袋为尼龙-聚丙烯耐蒸煮复合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋为4号聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。

实施例

实施例1

制备方法的具体步骤如下：

(1)在成鳗的水池中加入氟甲喹药剂溶液后进行药浴饲养，饲养条件为：空气泵24h増氧；水温23℃；每立方米水中饲养375条鳗鱼，鳗鱼大小约为4条/kg；换水率：加入氟甲喹药剂溶液后24小时整100％换清水，此后每天换清水1次，换清水时均不再加入氟甲喹药剂溶液；饲养时间为：投药后3天；所述氟甲喹药剂溶液的配制为：在20mL碳酸氢钠饱和水溶液中加入0.0420g的纯度为99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀释至200mL；所述氟甲喹药剂溶液的投放量：按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹药剂溶液；

(2)捞出步骤(1)捕捞饲养时间完成后的鳗鱼，立即冷冻处死，宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段，

(3)捣碎匀浆；将切段后的鱼肉置于匀浆机中，3000rpm转速搅成酱样并匀浆3min，混合所有鱼酱；人工搅拌30min混匀；然后进行第二轮的匀浆机3000rpm转速下3min匀浆；

(4)再采用拍击式均质器进行均质：将步骤(3)匀浆后的鱼酱装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率，每次拍击2min后取下揉混袋中酱样，再拍击，如此反复拍击三次；拍击后酱样混置于大桶中，再次人工搅拌混合30min；

(5)过筛：均质后鱼酱挤压通过10目网筛，弃去筛余；

(6)将步骤(5)过筛后的鱼酱装入内袋中，再套上外袋；用真空封口机，对装好酱样的外袋热封口；

(7)辐照灭菌与微生物检测：将包装好的酱样辐照灭菌，辐照剂量为12kGy。

所述步骤(2)的阶段的长度为每段长3cm。

所述步骤(6)的每袋中装鱼酱25g。

所述步骤(7)灭菌后样本置于20℃冰箱中贮存。

所述装袋的包装材料采用内袋和外包装袋；所述外包装袋采用耐蒸煮复合膜袋；所述内袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮复合膜袋为尼龙-聚丙烯耐蒸煮复合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋为4号聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。

实施例2

制备方法的具体步骤如下：

(1)在成鳗的水池中加入氟甲喹药剂溶液后进行药浴饲养，饲养条件为：空气泵24h増氧；水温23℃；每立方米水中饲养375条鳗鱼，鳗鱼大小约为4条/kg；换水率：加入氟甲喹药剂溶液后24小时整100％换清水，此后每天换清水1次，换清水时均不再加入氟甲喹药剂溶液；饲养时间为：投药后6天；所述氟甲喹药剂溶液的配制为：在20mL碳酸氢钠饱和水溶液中加入0.0420g的纯度为99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀释至200mL；所述氟甲喹药剂溶液的投放量：按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹药剂溶液；

(2)捞出步骤(1)捕捞饲养时间完成后的鳗鱼，立即冷冻处死，宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段，

(3)捣碎匀浆；将切段后的鱼肉置于匀浆机中，3000rpm转速搅成酱样并匀浆3min，混合所有鱼酱；人工搅拌30min混匀；然后进行第二轮的匀浆机3000rpm转速下3min匀浆；

(4)再采用拍击式均质器进行均质：将步骤(3)匀浆后的鱼酱装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率，每次拍击2min后取下揉混袋中酱样，再拍击，如此反复拍击三次；拍击后酱样混置于大桶中，再次人工搅拌混合30min；

(5)过筛：均质后鱼酱挤压通过10目网筛，弃去筛余；

(6)将步骤(5)过筛后的鱼酱装入内袋中，再套上外袋；用真空封口机，对装好酱样的外袋热封口；

(7)辐照灭菌：将包装好的酱样辐照灭菌，辐照剂量为12kGy。

所述步骤(2)的阶段的长度为每段长3cm。

所述步骤(6)的每袋中装鱼酱25g。

所述步骤(7)灭菌后样本置于-20℃冰箱中贮存。

所述装袋的包装材料采用内袋和外包装袋；所述外包装袋采用耐蒸煮复合膜袋；所述内袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮复合膜袋为尼龙-聚丙烯耐蒸煮复合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋为4号聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。

以下是本发明的具体实施实验和效果数据，以进一步充分说明本发明，但是本发明不仅限于此。

1材料与方法

1.1材料

实验用鳗鱼，福建省长乐海林水产养殖场人工条件下饲养的成鳗(约4条/kg)，人工转移至给药实验池；实验用药为氟甲喹粉，纯度99％，杭州久恒生物化学科技有限公司；饱和碳酸氢钠溶液：适量(稍过量)碳酸氢钠(AR)加水溶解配制饱和溶液。

包装材料为：尼龙/聚丙烯(PA/CPP)耐蒸煮复合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm，为外包装袋；4号聚乙烯(PE)膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口用作内袋。

1.2仪器设备

高效液相液相色谱仪，Agillent 1100型；液相色谱串联质谱仪，WatersUPLC/Premier，带电喷雾电离(ESI)源；涡旋振荡器，德国IKA；离心机，ANKE TDL-5，5000r/min，上海安亭科学仪器厂；5000r/min；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；搅拌型匀浆机，丹麦FOSS 2094型；拍击均质器，stomacher3500型，英国Seward；真空包装机，SC-300A型，安溪县三和茶叶机械厂；培养箱，KB720型，德国Binder；Co60-γ射线辐照装置，设计容量50万居里，福建省康普顿辐照技术有限公司；冰柜，BC/BD-718A，青岛海尔特种电冰柜有限公司。给药实验用空气泵，渔亭牌ACO-002型，浙江森森实业有限公司。不锈钢网筛：10目。

1.3给药实验

给药实验条件：小实验池，0.67m×0.47m，注水深0.10m。空气泵24h増氧；水温23℃；每池12条鳗鱼(4条/kg)；换水率：施药24小时后100％换水；此后每天换水1次，换清水时均不再加入氟甲喹药剂溶液。

给药方式：药浴。称取0.0210g氟甲喹粉，加10mL饱和碳酸氢钠溶液溶解，加水稀释至100mL。分别取该溶液4.00mL、10.0mL泼洒于不同小实验池中。

监控样品：给药后2.5h、5h、10h、24h、29h、34h、48h、58h、72h、96h、120h各取一条鳗鱼，立即冷冻处死。宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段(每段长约3cm)，捣碎匀浆，装入PE自封袋中，置于20℃冰箱保存。检测时于4℃冰箱解冻后取出回温。

1.4鳗鱼中氟甲喹检测

1.4.1提取与净化

称取5g(精确到0.01g)均质好的试样于50mL具塞塑料离心管，加入15mL样品提取剂，于涡旋振荡器振荡提取1min，然后超声10min，振摇5min，4500r/min离心5min，移出上清液。在残渣中再加入10mL提取液，重复以上步骤。合并上清液并定容至25mL。取10mL于氮吹管，40℃下氮吹至近干，加入2mL 0.1％甲酸水溶液，涡旋振荡30s，为待净化提取液。

待净化提取液以约1mL/min的流速全部过已经用甲醇(3mL)和水(3mL)活化、平衡过的Oasis HLB固相萃取小柱，再以2×3mL的5％甲醇水溶液洗涤氮吹管(盛待净化提取液的容器)后淋洗固相萃取小柱，继续抽干约10min，以3mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于40℃下氮吹至近干，以乙腈+0.1％甲酸水溶液(2+8，v/v)定容至2mL，涡旋振荡2min，3500r/min离心5min，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱进行上机测定分析。

1.4.2仪器参数及测定条件

1.4.2.1色谱测定条件

1)色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱，55mm×2.1mm×1.7μm；

2)色谱柱温度：35℃；

3)流动相：A：5mmol/L乙酸铵+0.2％甲酸溶液，B：甲醇；

4)流速：0.2mL/min；

5)进样量：10μL。流动相梯度见表1。

表1喹诺酮类药物色谱分离梯度洗脱条件

时间(min)	流速(mL/min)	A	B	梯度变化曲线
					0	0.200	85.0	15.0	0
1.00	0.200	80.0	20.0	6
					1.80	0.200	75.0	25.0	9

时间(min)	流速(mL/min)	A	B	梯度变化曲线
					2.00	0.200	70.0	30.0	6
2.60	0.200	55.0	45.0	6
					3.00	0.200	60.0	40.0	6
3.20	0.200	85.0	15.0	1
					5.00	0.200	85.0	15.0	6

1.4.2.2质谱条件

根据喹诺酮类药物的分子结构，选择ESI(+)作为电离模式，将标准品配成浓度为100ng/mL的乙腈-水溶液(1∶1)，分别对电离电压、锥孔电压、源温度、脱溶剂温度、碰撞能量等条件进行了优化，采用全扫描方式。其质谱条件参数为：

电离方式：ESI正离子模式；电离电压(Capillary)：3.50kV；锥孔电压(Cone)：35V；离子源温度(Source Temperature)：120℃；锥孔反吹气流量(Cone Gas Flow)：45L/h；脱溶剂气温度(Desolvation Temperature)：350℃；脱溶剂气流量(Desolvatipn Gas Flow)：852L/h。

监测离子对见表2

表2监测离子对

1.4.3定性和定量分析

1.4.3.1定性测定

进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，误差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差

相对离子丰度	＞50％	＞20％至50％	＞10％至20％	≤10％
					允许的相对误差	±20％	±25％	±30％	±50

1.4.3.2定量分析

以0.00、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00ng/mL标准溶液进样绘制标准工作曲线。进样等体积的试剂空白，阴性控制样、待测样(不超过20个)、阳性控制样，记录峰面积或峰高，外标法定量。

仅在满足以下条件时定量是有效的：

1)标准溶液的保留时间与未知物的保留时间相差不超过0.15min；

2)未知物响应信号的信噪比大于10；

3)标准曲线的相关系数大于0.9900。

1.5候选阳性材料的采集、均质

采集5μg/kg-10μg/kg氟甲喹含量水平的鳗鱼，冷冻处死。宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段(每段长约3cm)，-20℃冷冻保存，作为候选阳性材料。

将冷冻状态鳗鱼样本转移至4℃冰箱解冻后置于匀浆机中，转速3000rpm搅成酱样并匀浆3min，混合所有酱样。人工搅拌约30min混匀。然后进行第二轮的匀浆机3min匀浆。

取适量酱样装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率，每次拍击2min后取下揉混袋中酱样，再拍击，如此反复拍击三次。拍击后酱样混置于大桶中，再次人工搅拌混合30min。

过筛，均质后样本挤压通过10目网筛。弃去筛余。

1.6均匀性材料的装袋、封口、上签

取均质过筛后酱样装入内袋中，每袋中装25g，再套上外袋。用真空封口机，对装好酱样的外袋热封口。贴上带编号的样品标签。

1.7辐照灭菌与微生物检测

将包装好的酱样辐照灭菌，辐照剂量为12kGy。灭菌后样本置于-20℃冰箱中贮存。包装好样品在辐照前后取样进行微生物学检测以评价灭菌与包装防菌效果。

1.8均匀性检验

按总样本单元数N的2×N^1/3随机抽取样本，按1.4进行样品前处理和液相色谱-串联质谱检测，每个样品重复测试三次。

将测试结果进行均匀性统计，采用方差分析法(F-检验)检验样品的均匀性。

1.9稳定性检验

稳定性实验设计为经典稳定性研究，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。

在没有严格确定的动力学机理时，采用线性拟合作为稳定性稳定性研究的基本模型：Y＝β₀+β₁X+ε，其中β₀和β₁为回归系数，ε为随机误差分量；X为时间变量，Y为AOZ含量。按照GB 15000.3给出第一种方法：可以计算可以回归参数b₁(斜率)和b₀(截距)，通过误差分析计算b₁的标准偏差s(b₁)。用s(b₁)和t_0.95，n-2检验b₁的显著性以判断样品稳定性。即|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)时斜率是不显著的，判为未观测到不稳定性，反之亦然。第二种方法：采用F检验法检验一元线性回归模型的显著性。通过评估最后的回归方差分析表，对于95％置信水平，当Significance F≥0.05时表示回归是不显著的，判为未观测到不稳定性。如第一部分1.9所述，此时计算s(b₁)所用的直线上点的标准偏差s可以方便地从线性回归方差分析表所给出的残差MS开平方得到。因此，我们采用了第二种方法进行稳定性研究的分析计算以判断样品的稳定性。同时也可以计算s(b₁)。

1.10定值与不确定度评估

按上述研制的技术路线制得一批鳗鲡肌肉原酱样，根据中华人民共和国国家标准GB/T15000.3-2008“标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法”中有关技术及要求，对氟甲喹残留质量控制样品进行定值。

广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室等12个实验室认证认可实验室参加了协同定值。均采用LC-MSMS方法检测。检测结果经过经柯克伦检验、格拉布斯检验后取平均结果定值。特性值不确定度(U_CRM)由测定值标准不确定度(u_char)、瓶间标准不确定度(u_bb)、长期稳定性标准不确定度(u_lis)和短期稳定性标准不确定度(u_sts)合成并扩展(包含因子k＝2)而得。

2结果与分析

2.1给药实验

按表4进行了给药实验。给药后按1.3取监控样、按1.4检测，绘制不同给药量试验的鳗鱼肌肉中氟甲喹含量，检测结果随施药后时间的变化趋势线见图1。

表4给药实验

图1显示，施药后，鳗鱼体内氟甲喹浓度随时间推移而升高，24h后鱼池全量换新鲜水(不含氟甲喹)，之后鳗鱼体内氟甲喹浓度随时间推移而降低。约50h后鳗鱼体内氟甲喹浓度降至较低浓度，基本降至拐点，此后鱼体内氟甲喹浓度变化缓慢。

希望所制样品中氟甲喹含量落在5～10μg/kg范围的预期值。根据以上试验，试验号1(水体中氟甲喹初始浓度65.2μg/kg)施药2天后(50h后)至药后第6天，鳗鱼体内氟甲喹浓度仍达20μg/kg以上，不适宜于用作候选阳性材料；实验号1(水体中氟甲喹初始浓度26.2μg/kg)施药2天后(50h后)至药后第6天，鳗鱼体内氟甲喹浓度基本维持在10μg/kg以下，均适于采集阳性材料，尤其是施药3天后。

在鳗鱼养殖过程中，用药方式主要有全池泼洒与混入饵料投喂两种。为便于观测与实验，我们原计划在福州附近的长乐海林养鳗场进行施药实验，然而，一个大池中的养殖鳗鱼以数吨计，由于成本因素显然不宜为获取本项目所需的一定量的候选阳性材料对大池施药。为此改用塑料箱作实验池，由大池移取12条左右成鳗于小实验池中进行施药实验。由于鳗鱼转移至实验池后拒绝进食，因此不能采取混入饵料投喂的方式施药；曾采取口灌方式用药，结果口灌的每只鳗鱼由于回吐、挣扎、滑溜等实际上难以在有限的口灌时间内使之摄入基本等量的药物，致使后续的监测数据波动太大而无法评估实验结果；最后选择泼洒药浴的给药方式进行给药试验。由于小池试验投鱼量及成本限制，药浴后每次只取单条鳗鱼作为检测样品，鳗鱼的个体差异也会使监测结果有所波动。试验发现，初始施药浓度越高监测结果波动幅度越大。然而在本发明适配的初始施药浓度水平下，鳗鱼的个体差异导致监测结果波动的幅度是可以接受的(参见图1)。

2.2辐照与包装阻隔性效果

按1.7所述述取样进行微生物学检验以考察辐照灭菌和包装防菌效果，检验结果见表5。

表5辐照前、后及保温后微生物检验结果

从上述检验结果看，样品经一系列制备操作步骤后，菌落总数达到10⁸cfu/g，须经12kGy辐照后才能达到＜10cfu/g的理想灭菌效果。对12kGy辐照后已完全灭菌的成品进行保温试验，按商业无菌保温试验时间10天后菌检结果＜10cfu/g，为保险起见加做了37℃37天的保温试验菌检结果仍＜10cfu/g，可见本发明采用的包装的阻隔性可以满足防菌要求。

常用灭菌方法有加热灭菌和辐照灭菌等方法，考虑到加热灭菌有容易引起基体物质变性、热涨压力导致包装物破损等缺点(如对热敏感物质也不适用)，本发明选用辐照灭菌的工艺。

由于当地能提供辐照服务的辐照公司以3kGy整数倍的剂量提供辐照服务，从辐照结果数据(表3)可知，每3kGy剂量的辐照大约可使菌落总数下降2个数量级。辐照前应先检测样品中菌落总数含量，并以每3kGy剂量的辐照使菌落总数下降2个数量级推算合适的辐照剂量。

2.3均匀性研究

按1.8所述随机抽取均匀性检验样本，均匀性实验的总样本数共436个，顺序编号后利用随机数表随机抽取16个样本进行均匀性实验。均匀性检验数据见表6，按F检验法进行均匀性统计分析，统计汇总数据见表7，方差分析结果见表8。

表6均匀性检验结果

表7每瓶样品的统计汇总数据

表8鳗鱼中氟甲喹的瓶间均匀性研究方差分析

表8方差分析结果表明F＝1.382＜1.992＝F_0.05(15，30)，P-value＝0.215＞0.05。结果表明瓶间差异不显著。即氟甲喹含量瓶间均匀性符合要求。

由于机械匀浆受到容器容量的限制，无法全量一次匀浆，因此需要在各轮机械匀浆后增加人工全量搅拌操作以保证整体均匀。同时由于鳗鱼肉酱中小骨刺和小部分未搅碎鳗鱼皮片的存在影响样品均匀性，同时小骨刺是导致包装物破损的潜在威胁，应当将小骨刺和小部分未搅碎鳗鱼皮片从酱样中剔除，本项目遂采用过筛办法予以解决，即均质后样本挤压通过10目网筛，弃去筛余。

2.4稳定性研究

2.4.1短期稳定性

安排了两次短期稳定性试验。第一次为冬天2月份由出差赴京人员来回全程(2月23日、24日，福州-北京飞机来回，两城市中心-机场分别来回两次汽车运输)携带样品，样品(标记为“京来回”)回福州后与正常冻藏样同条件保管，5月份同时检测。第二次为夏季7月7日将样品交由“中铁快运”发送至海南省海口市，海南检验检疫局技术中心于7月14日收到后再交由“申通快递”发回福建省福州市，福建检验检疫局技术中心于7月17日收到抵达福州的样品，样品(标记为琼来回)收到后置于储存正常冻藏样品的冰箱中至8月份检测。两次短期稳定性试验样品在传递途中均未采取任何降温和保温措施，第二次短期稳定性运输试验时值7月份，南方气温高，短期稳定性试验样品来回福州-海口间样品运输时间长达整整10天。测试时每个样品均进行三平行测定。测定数据见表9。第一次、第二次短期稳定性试验检测数据单因素统计分析结果分别见表10、表11。在α＝0.05显著性水平下，“京来回”样与“冻藏样”的结果比较、“琼来回”样与“冻藏样”比较，均无显著性差异。

表9两次短期稳定性试验检测结果

表10第一次短期稳定性单因素方差分析

表11第二次短期稳定性单因素方差分析

此外因协同定值和组织能力验证及实验室检测质量控制技术培训需要在常温条件下给19个实验室共29次传递了本文研制样品(其中省外4家，省内15家)从反馈的样品接收状态看，所有实验室均未有诸如胀包、样品变质等不正常样品状态的报告。14个省内外认可实验室参加了协同定值实验，定值检测检测结果均通过了科克伦检验和格拉布斯检验，均为正确值；15个省内实验室参加了能力验证计划，其中一个实验室结果为可疑值，其余均为满意值。从保温试验结果看也没有微生物腐败情况出现。综合评估认为所制样品可以常温传递。

2.4.2长期稳定性

样品长期冻藏于20℃冰箱中。每月取样一次进行检测。从1月份就已开始稳定性研究，其中5月份测定样品为实际经过运输过程的“京来回”样品。8月份测定样品是夏季邮寄到海南海口后再回寄到福建福州的“琼来回”样品。另外，由于测量是在(实验室内)再现性条件下进行的，其中也包括了测量的不稳定性。

稳定性研究的测量数据见表12，由于定值(7月份定值)之前已经开始了稳定性研究，因此以定值时间X值为0，则之前时间的X值为负值。回归系统R、R平方、修正R平方、标准误差、观测值个数等分析结果摘要见表13；根据表13的汇总数据，进行方差分析，结果见表14。

表12鳗鱼中氟甲喹稳定性研究的测量数据

表13鳗鱼中氟甲喹的稳定性研究的分析结果摘要

表14鳗鱼中氟甲喹的稳定性研究方差分析

Significance F＝0.556＞0.05，表示回归是不显著的，认为未观测到不稳定(对于95％置信水平，Significance F＜0.05就成为显著的)。

2.4.3稳定性不确定度

长期稳定性试验中在第5个月和第8个月测定时样品分别为冬天北方、夏天南方运输条件的实际运输样。另外，由于测量是在(实验室内)再现性条件下进行的，其中也包括了测量的不稳定性。

应用GB/T 15000.3-2008标准8.5方法，即稳定性不确定度

u_lts＝s(b₁)×t

然而，

$s\left(b_1\right)=\sqrt{{\mathrm{MS}}_{\mathrm{res}}/\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}$

$\stackrel{i=1}{\mathrm{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2=60$

由表14得到残差的MS_res值，因此s(b₁)可以计算出。结果如表15。

表15s(b₁)计算结果

2.5定值与不确定度评定

2.5.1定值

有广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室等共12个认可实验室为本残留质量控制样品协同定值。本项目向每一个参加协同定值的实验室发放实验样品、结果报告单，参与定值的实验室虽然检测环境不同、检测仪器条件不同、检测人员不同，但均采用LC-MSMS进行测定(n＝3)，具体数据见附件2。定值结果汇总于表16。

表16定值结果

对所得数据进行检验分析，包括的步骤有：(1)检验实验室平均值之间显著性差异以此来决定是否应该求出单个数值的平均值或实验室平均值的均值；(2)检验根据(1)中决定选取的数据组的正态性并找出异常值；(3)检验全部数据组中异常的实验室的方差。检验过程如下：

(1)先对所有数据进行柯克伦(Cochran)检验。

给定p个由相同的n次重复测试结果计算的标准偏差Si，柯克伦(Cochran)检验的定义为

柯克伦的结果判定规则为：

在p＝12，n＝3时，柯克伦的临界值为C_0(1％)＝0.475，C_0(5％)＝0.392，12个实验室的柯克伦(Cochran)检验的结果为0.3358，即C＝0.3358＜0.392＝C_0(5％)。则12个实验室结果通过了科克伦检验。

(2)对12个实验室的均值进行单值格拉布斯(Grubbs)检验

将p个数据由小到大排列为x₁、x₂、……x_p-1、x_p，用下列公式计算统计量G₁：

在n＝p＝12时，单值格拉布斯(Grubbs)的临界值G_1(1％，12)＝2.636，G_1(5％，12)＝2.412，而单值格拉布斯(Grubbs)检验结果G₁₁＝1.518，G_1p＝1.326，均＜G_1(5％，n)。即各实验室的均值均可保留以参加下一步双值格拉布斯(Grubbs)检验。

(3)对12个单元的均值进行双值格拉布斯(Grubbs)检验

双值格拉布斯(Grubbs)统计量G_2p用于检验最大的两个值是否为离群值，

其中S₀ ²是原数组的方差，S_(p-1，p) ²是p个数据去除最大两值后的方差。统计量G₂₁用于检验最小两值是否为离群值，

其中S_(1，2) ²是p个数据去除最小两值后方差。双值格拉布斯检验结果判定如下：

在n＝12时，双值格拉布斯(Grubbs)的临界值G_0(1％)＝0.1738，G_0(5％)＝0.2537，而双值格拉布斯(Grubbs)结果G₂₁＝44.17，G_2p＝39.20，因此所有单元的数据均为正确值，均可以保留并参与定值。

本项目定值最终是协同定值实验室提供结果的平均值。见表16。

2.5.2不确定度评定

特性值不确定度的评定按照GB/T 15000.3-2008，考虑了测定、均匀性、稳定性对特性值总不确定度的贡献，即通过测定值标准不确定度(u_char)、瓶间标准不确定度(u_bb)、长期稳定性标准不确定度(u_lts)和短期稳定性标准不确定度(u_stsk)的合成并扩展(包含因子k＝2)来评定特性值不确定度(U_CRM)。用下式表示：

$U_{\mathrm{CRM}}=k\sqrt{{u_{\mathrm{char}}}^2+{u_{\mathrm{bb}}}^2+{u_{\mathrm{lts}}}^2+{u_{\mathrm{sts}}}^2}$

式中各不确定度分量及其合成计算如下：

2.5.2.1由协同定值实验室所带来的批测定的不确定度u_char的计算：

实验室数p＝12，检测结果总平均值即：

与平均值的总均值有关的合成标准不确定度的主要分量是标准偏差：而合成不确度为

计算结果s为1.011，u_char＝0.292。

2.5.2.2由瓶间均匀性所带来的不确定度u_bb的计算：

在均匀性研究中，瓶间均匀性已被验证(见表6～表8)。

表8显示，MS_among＝0.587，MS_within＝0.425，

瓶间方差用的计算： $s_A^2=\frac{{\mathrm{MS}}_{\mathrm{among}}-{\mathrm{MS}}_{\mathrm{within}}}{n_0}=\frac{0.587-0.425}{3}=0.054$

瓶间标准偏差是该方差的平方根： $s_{\mathrm{bb}}=\sqrt{0.054}=0.23$

重复性标准偏差： $s_r=\sqrt{{\mathrm{MS}}_{\mathrm{within}}}=\sqrt{0.425}=0.652$

由瓶间均匀性所带来的不确定度 $u_{\mathrm{bb}}=\sqrt{\frac{s_{\mathrm{bb}}^2}{p}+\frac{s_r^2}{n_0\·p}}=\sqrt{\frac{0.054}{12}+\frac{0.425}{36}}=0.128$

2.5.2.3由稳定性所带来的不确定度u_lts的计算：

如在稳定性数据中无显著趋势，假设特性值Y从初始值Y₀以一个常数b₁线性降解，b₁是相对降解速率，为时间X的函数：Y(b₀，b₁，X)＝Y₀(1+b₁X)。特性值的不确定度可通过将自变量Y₀、X和b₁的不确定度传播给因变量Y得到。在给定的有效期X没有显著降解的情况下，参考Thomas P.J.Linsinger等人的报道，稳定性不确定度u_lts＝X×u(b₁)。

表15已给出S(b₁)＝0.1364，有效期X＝6(月)(即t＝6)的长期稳定性的不确定度为：u_lts＝s_b·t＝s_b×6＝0.1364×6＝0.8184。

2.5.2.4特性值不确定度的合成与扩展

综上，由于采用协同定值，通过邮政网络将候选标准样品分发给各参加协同定值的实验室，所得到的一系列测量值已包含了运输不稳定性造成的附加不确定度，另外，在进行稳定性实验时，第5个月和第8个月测定时样品已是实际传递后样品，在稳定性不确定度中也包括了运输不稳定性造成的不确定度，即u_lts的计算已经包含了u_sts，这里不再单独考虑u_sts。

合成不确定度：由上述各不确定度分量计算合成不确定度：

$u_{\mathrm{CRM}}=\sqrt{{0.292}^2+{0.128}^2+{0.842}^2}=0.638$

在置信水平为95％时，k＝2。特性值扩展不确定度为：U_CRM＝2×0.638＝1.28。

该不确定度是根据6个月的有效期确定的。如果材料的稳定性得到进一步证明，则有效期还可延长。

本候选标准样品特性值为：(7.08±1.28)μg/kg。

2.6实际应用

已有2个实验室试用本文研制的标准物质进行检测质量控制，绘制质量控制图。福建检验检疫局技术中心应用本标准物质成功组织了省域相关实验室的鳗鱼中氟甲喹检测能力验证，参考英国中央实验室(FAPAS)方法，以Michael Thompson提出的再现性标准偏差方程抓本含量水平为σ_p＝0.22C(式中：C抓中位置)计算的标准偏差靶值σ_p代替标准四分位距，按稳健统计技术统计得Z比分数分布图(直方图)见图2。实际应用时样品均为常温传递。结果表明，样品应用有效，比同类酱样使用更加方便。

3小结

通过给药控制和合适采集时机的选择可获得预期含量的代表实际样品原状态的原浆态含氟甲喹鳗鱼自然(污染)基体阳性材料，采用捣碎搅匀、拍击均质和人工全量搅拌相结合的工艺可以保证材料的均匀性，所用包装材料和灭菌方法可以防止常温时酱样腐败便于实验室间常温传递。

Claims (8)

1.一种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：采用氟甲喹对活鳗鱼进行药浴，使鳗鱼体内含有氟甲喹，将活鳗鱼进行宰杀后，取鱼肉捣碎匀浆，过筛，装袋，封口后辐照灭菌，制备得到种鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品。

2.鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述方法制备的自然基体标准样品的中氟甲喹的浓度为5～10μg/kg。

3.根据权利要求1所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述装袋的包装材料采用内袋和外包装袋；所述外包装袋采用耐蒸煮复合膜袋；所述内袋采用聚乙烯袋。

4.根据权利要求2所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述耐蒸煮复合膜袋为尼龙-聚丙烯耐蒸煮复合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋为4号聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：(1)在成鳗的水池中加入氟甲喹药剂溶液进行药浴饲养，饲养条件为：空气泵24h增氧；水温23℃；每立方米水中饲养375条鳗鱼，鳗鱼大小为4条/kg；换水率：加入氟甲喹药剂溶液后24小时整100％换清水，此后每天换清水1次，换清水时均不再加入氟甲喹药剂溶液；饲养时间为：投药后饲养3-6天；所述氟甲喹药剂溶液的配制为：在20mL碳酸氢钠饱和水溶液中加入0.0420g的纯度为99％以上的氟甲喹粉，溶解，加水稀释至200mL；所述氟甲喹药剂溶液的投放量：按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹药剂溶液；

(2)捞出步骤(1)饲养时间完成后的鳗鱼立即冷冻处死，宰杀去内脏、去头、去尾、去骨，切段，

(3)捣碎匀浆；将切段后的鱼肉置于匀浆机中，3000rpm转速搅成鱼酱并匀浆3min，混合所有鱼酱；人工搅拌30min混匀；然后进行第二轮的匀浆机3000rpm转速下3min匀浆；

(4)再采用拍击式均质器进行均质：将步骤(3)匀浆后的鱼酱装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率，每次拍击2min后取下揉混袋中鱼酱，再拍击，如此反复拍击三次；拍击后鱼酱混置于大桶中，再次人工搅拌混合30min；

(5)过筛：均质后鱼酱挤压通过10目网筛，弃去筛余；

(6)将步骤(5)过筛后的鱼酱装入内袋中，再套上外袋；用真空封口机，对装好鱼酱的外袋热封口；

(7)辐照灭菌：将包装好的鱼酱辐照灭菌，辐照剂量为12kGy。

6.根据权利要求5所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的阶段的长度为每段长3cm。

7.根据权利要求5所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)的每袋中装鱼酱25g。

8.根据权利要求5所述的鳗鲡肌肉原酱中氟甲喹残留自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)灭菌后样本置于-20℃冰箱中贮存。

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