CN102323123A - 一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法 - Google Patents

一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法 Download PDF

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时文春
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Abstract

本发明是一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，以鲤鱼为研究对象，用添加目标药物饲养方式，研制出同时含有一定浓度环丙沙星和恩诺沙星的鲤鱼肌肉实物标准样品。掌握本实物标准样品的生产关键控制技术，包括含量水平、均匀性、稳定性及定值等的控制，实现该标准样品的规范化、规模化生产制备。该标准样品用于动物源食品兽药残留检测质量控制和检测能力评价，对食品安全检测具有重要意义。

Description

一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法
技术领域
本发明属于兽药残留检测的动物性食品基体标准物质技术领域，具体是涉及一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留基体冻干粉标准样品的制备方法。
标准物质是具有准确量值的测量标准，是研究与评价测量方法、保证测量结果的一致性和可比性，保证国家之间、部门之间、商品交换或技术交流之间、生产过程控制的不同时间之间的分析结果的可比性和一致性的重要物质。
标准物质(ReferenceMaterial，简称RM)包括纯的化学物质和具有一定理化特性的实物标准样品
背景技术
环丙沙星和恩诺沙星是典型的喹诺酮类药物，喹诺酮类药物是一种人工合成的广谱抗生素，很多国家都禁止使用喹诺酮类药物用作兽药，在我国环丙沙星是禁止用于动物的，恩诺沙星是限制使用的兽药，但一些养殖企业盲目追求治疗效果，大量滥用喹诺酮类药物，致使一些动物产品中存在一定喹诺酮类药物残留，日本、美国等发达国家经常以此为技术壁垒限制中国动物源食品特别是水产品的出口。
在食品安全检测体系中，标准物质对整个检测质量控制体系起到核心作用。欧盟对兽药残留分析方法与结果表达的法规(2002/657/EC)中明确指出了需要采用实物标准样品进行检测过程控制，可见实物标准样品在兽药残留检测中的具有十分重要的意义。目前用于喹诺酮类药物残留检测的标准物质主要是各种纯品标准样品，检测质量控制主要是通过向样品中添加纯的各种标准品后进行检测分析，这种分析方法无法代表目标分析物在活体内真正存在的状态，即无法代表目标分析物在动物的体内“内化”状态。这样方式得到的标准样品并非真正意义上的实物标准样品，由于目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异，从而影响结果的可靠性和有效性。
发明内容
本发明是国内首次获得鲤鱼肌肉实物环丙沙星、恩诺沙星标准样品，且两种药物同时存在。
本发明的目的是提供一种鲤鱼肌肉中环丙沙星和恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，通过添加环丙沙星和恩诺沙星养殖鲤鱼，获得样品材料，并制备成一种均匀性好、稳定性好、易保存且目标物和基体结合情形与真实检测样品一致的标准样品；该标准样品可用于环丙沙星、恩诺沙星等喹诺酮类药物残留检测质量控制、检测方法评价、检测能力评价。
本发明鲤鱼肌肉中环丙沙星和恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法：采用环丙沙星和恩诺沙星对活鲤鱼进行添加养殖，使鲤鱼体内含有环丙沙星和恩诺沙星，在不含药物水中饲养待鲤鱼肌肉药物分布达到均匀状态后，将鲤鱼捕捞快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，取肌肉部分匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，装瓶，真空封装，制备得到鲤鱼肌肉中环丙沙星和恩诺沙星残留冻干粉标准样品；制备的标准样品中的环丙沙星和恩诺沙星浓度约为100ug/kg。
本发明的显著优点是：采用模拟养殖条件下对生长的活鲤鱼药物养殖添加后选择适当时机，将鲤鱼捕捞快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，取肌肉部分匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，分装密封包装、均匀性检验、稳定性研究和协作实验检测，通过给药控制和采集时机的选择可获得预期含量的目标物结合状态与实际检测样品一致的含环丙沙星和恩诺沙星鲤鱼基体阳性材料，采用搅碎和匀化介质相结合的工艺可以保证材料的均匀性，冷冻干燥、分装密封可以保证样品的稳定性，便于标准样品的常温传递。本发明的产品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定，运输方便，使用可靠，产品具有显著的经济价值和市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例1对本发明作进一步详细的说明。
实施例1，一种鲤鱼肌肉中环丙沙星和恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，本实施例以控制目标含量水平100ug/kg为例，其具体步骤如下：
(1)实验动物的选择：市购活体鲤鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，应先确认样品中不含环丙沙星和恩诺沙星，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养。阴性样品在20℃-25℃环境下饲养2天后，剔除受伤不健康的鲤鱼；
(2)药物养殖添加：向鱼池中添加的医用环丙沙星和恩诺沙星片剂，先将两种药片分别粉碎、水溶解，根据养殖水量，添加药物使水中环丙沙星浓度约为500ug/L，喂养24小时后再添加恩诺沙星药液，浓度控制约为250ug/L，实时监控检测水体中和鱼体内药物浓度，在此条件下继续养殖18-24小时后，鲤鱼肌肉内药物浓度约为环丙沙星和恩诺沙星浓度分别约为20ug/kg和25ug/kg，将鲤鱼捞至不含环丙沙星和恩诺沙星的养殖池中继续养殖12小时，使鲤鱼肌肉内药物分布均匀；此时两种药物在鲤鱼体内浓度约为20ug/kg。
(3)捞出步骤(2)中饲养完成后的鲤鱼快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，去鳞、去皮、去头、去刺、去内脏，留取肌肉部分；
(3)搅碎匀浆：将鱼肉混合搅碎，10kg搅碎鱼肉中加2kg稀释剂(水+乙醇，95+5，)混匀制成鱼糜：
(4)冷冻干燥：将鱼糜放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥条件：-60℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥；
(5)粉碎均质：将冷冻干燥的鱼糜用中药粉碎机粉碎，以搅拌锅混匀。
(6)过筛：匀质后的鱼粉过0.6mm孔筛，弃去筛余；
(7)包装：快速用聚乙烯瓶分装(聚乙烯瓶提前45℃烘干)，每个瓶内鱼粉重量10g，再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装；
以下是本发明的具体实施实验和效果数据，以进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。
1、均匀性检验
采用单因素方差分析进行均匀性检验，随机抽取10个样品，每个样品平行测定2次，进行单因素方差分析，分析结果表明，环丙沙星F值为0.74；恩诺沙星F值为0.88，均小于F临界值3.02，样品是均匀的。
称取0.5g样品，加2.0ml水还原15min，按GB/T20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定液相色谱-串联质谱法》方法进行检测，结果如下：
表1 环丙沙星均匀性检测结果
Figure BSA00000544088600041
表2 环丙沙星均匀性单因素方差分析结果
Figure BSA00000544088600042
表3 恩诺沙星均匀性检测结果
Figure BSA00000544088600051
表4 恩诺沙星均匀性方差分析结果
Figure BSA00000544088600052
2、稳定性研究
采用t检验法。按0、3、7、13个月每个时间点随机抽取6个样品，每个样品重复测定2次，测定结果与均匀性检测结果比较判断稳定性，t值＜t临界值1.76，表明样品是稳定的.
表5 稳定性检验结果
Figure BSA00000544088600061
3、定值技术
以多个试验室协作检测作为定值方式，环丙沙星有8个实验室定值，恩诺沙星有7个实验室定值，定值检测方法为按GB/T20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中液相色谱串联质谱法进行定值检测，内标法定量，每个样品平行检测3次，以总平均值为定值结果，环丙沙星含量为98.8ug/kg，以2倍标准偏差为不确定度±9.0ug/kg；结果表示为98.8±9.0ug/kg；恩诺沙星含量为97.4ug/kg，以2倍标准偏差为不确定度±5.0ug/kg；结果表示为97.4±5.0ug/kg。
不确定度评估说明：本发明的定值采用统一的国标方法，总体上可以忽略测定方法差异产生的不确定度；具体定量采用同位素内标法，不确定度的来源包括人员操作差异、设备重现性差异、实验室环境差以及重复测量差异引起的不确定度，采用内标法定量可以消除人员和实验室环境差异产生的不确定度对定值结果的影响，采用多点线性回归可以消除仪器重复性差异产生不确定度对定值结果的影响，综上所述，不确定度主要由不同实验室重复测量产生，可以用全部定值结果的标准偏差表示，重复测定结果符合正态分布，取置信度95％水平，自由度为2，则合成不确定度可以用2倍标准偏差表示；即环丙沙星含量表示为98.8±9.0ug/kg；恩诺沙星含量表示为97.4±5.0ug/kg。
表6 环丙沙星实验室间定值测定数据
表7 恩诺沙星实验室间定值测定数据
Figure BSA00000544088600081

Claims (4)

1.一种鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：采用环丙沙星、恩诺沙星对活鲤鱼进行添加养殖并控制添加时间，使鲤鱼体内含有环丙沙星、恩诺沙星，在不含药物水中饲养待鲤鱼肌肉中药物分布达到均匀状态后，取鱼肉匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，装瓶，真空封装，制备得到鲤鱼肌肉中同时含有环丙沙星、恩诺沙星冻干粉标准样品。
2.一种鲤鱼肌肉中同时含有环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：所述制备的冻干粉标准样品中的环丙沙星、恩诺沙星浓度约为100ug/kg。
3.根据权利要求1所述的鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：采用内外包装，内包装使用聚乙烯瓶，外包装使用铝箔袋真空封装。
4.根据权利要求1或2所述的鲤鱼肌肉中环丙沙星、恩诺沙星残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)实验动物的选择：市购活体鲤鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，应先确认样品中不含环丙沙星、恩诺沙星，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养，阴性样品在20℃-25℃环境下饲养2天后，剔除受伤不健康的鲤鱼；
(2)药物养殖添加：向鱼池中添加的医用环丙沙星和恩诺沙星片剂，先将两种药片分别粉碎、水溶解，根据养殖水量，添加药物使水中环丙沙星浓度约为500ug/L，喂养24小时后再添加恩诺沙星药液，浓度控制约为250ug/L，实时监控检测水体中和鱼体内药物浓度，在此条件下继续养殖18-24小时后，鲤鱼肌肉内药物浓度约为环丙沙星和恩诺沙星浓度分别约为20ug/kg和25ug/kg，将鲤鱼捞至不含环丙沙星和恩诺沙星的养殖池中继续养殖12小时，使鲤鱼肌肉内药物分布均匀，此时鲤鱼肌肉内药物浓度约为环丙沙星和恩诺沙星浓度分别约为20ug/kg和20ug/kg；
(3)捞出步骤(2)中饲养完成后的鲤鱼快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，去鳞、去皮、去头、去刺、去内脏，留取肌肉部分；
(3)搅碎匀浆：将鱼肉混合搅碎，10kg搅碎鱼肉中加2kg稀释剂，即5％的乙醇溶液，v/v，混匀制成鱼糜；
(4)冷冻干燥：冷冻干燥条件：-60℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥；
(5)粉碎匀质：将冷冻干燥的鱼糜用中药粉碎机粉碎，以搅拌锅混匀；
(6)过筛：匀质后的鱼粉过0.6mm孔筛，弃去筛余；
(7)包装：快速用聚乙烯瓶分装，再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装。
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