CN102288464B - 一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留基体冻干粉标准样品的制备方法，属于兽药残留检测的动物性食品基体标准物质技术领域。解决目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异的问题。采用氯霉素对活鲤鱼进行养殖添加，使鲤鱼体内含有氯霉素，在不含药物水中饲养待体内药物浓度达到稳定代谢状态后，将鲤鱼捕捞快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，取肌肉部分匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，装瓶，真空封装，制备得到鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品；制备的标准样品中的氯霉素浓度为1.0-10.0ug/kg。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留检测的动物性食品基体标准物质技术领域，具体是涉及一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留基体冻干粉标准样品的制备方法。
背景技术
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，化学名：D-(-)-苏阿型-1-对硝基苯基-2-二氯乙酰氨基-1，3-丙二醇。分子式C11H12O5N2Cl2，分子量：322.0124。
氯霉素是一种人工合成的广谱抗生素，能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿灰色综合症等疾病，尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。氯霉素的残留不但对人体造成危害，而且严重影响我国动物性食品的出口。水产品主要进口国对水产品中氯霉素限量要求各不相同，如欧盟规定的水产品中氯霉素残留检测的最低极限值(MRPL)为0.3μg/kg，日本规定不得检出，0.1μg/kg的残留也可被检出。在食品安全检测体系中，标准物质对整个检测质量控制体系起到核心作用。欧盟对兽药残留分析方法与结果表达的法规(2002/657/EC)中明确指出了需要采用实物标准样品进行检测过程控制，可见实物标准样品在兽药残留检测中的具有十分重要的意义。目前用于氯霉素残留检测的标准物质主要是纯品氯霉素标准样品，检测质量控制主要是通过向样品中添加纯的氯霉素标准品后进行检测分析，这种分析方法无法代表目标分析物在活体内真正存在的状态，即无法代表目标分析物的“内化”状态。这样方式得到的标准样品并非真正意义上的实物标准样品，由于目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异，从而影响结果的可靠性和有效性。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品得制备方法，通过添加氯霉素养殖鲤鱼，获得样品材料，并制备成一种均匀性好、稳定 性好、易保存且目标物和基体结合情形与真实检测样品一致的标准样品，该标准样品可用于氯霉素残留检测质量控制、检测方法评价、检测能力评价。
本发明鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法：采用氯霉素对活鲤鱼进行养殖添加，使鲤鱼体内含有氯霉素，在不含药物水中饲养待体内药物浓度达到稳定代谢状态后，将鲤鱼捕捞快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，取肌肉部分匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，装瓶，真空封装，制备得到鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品；制备的标准样品中的氯霉素浓度为1.0-10.0ug/kg。
本发明的显著优点是：采用模拟养殖条件下对生长的活鲤鱼药物养殖添加后选择适当时机，将鲤鱼捕捞快速冷冻至-18℃以下，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，取肌肉部分匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，分装密封包装；均匀性检验、稳定性研究和协作实验检测，通过给药控制和采集时机的选择可获得预期含量的目标物结合状态与实际检测样品一致的含氯霉素鲤鱼基体阳性材料，采用搅碎和匀化介质相结合的工艺可以保证材料的均匀性，冷冻干燥、分装密封可以保证样品的稳定性，便于标准样品的常温传递。本发明的产品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀稳定，运输方便，使用可靠，产品具有显著的经济价值和市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
对水中、鲤鱼肌肉中氯霉素浓度进行实时监控检测，以确定制备不同浓度水平的标准样品时养殖添加持续时间，测定结果如表1所示：
表1水中、鲤鱼肌肉中氯霉素浓度实时监控检测结果
实施例1，一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法，本实施例以控制目标含量水平5.0ug/kg为例，其具体步骤如下：
(1)实验动物的选择：市购活体鲤鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，应先确认样品中不含氯霉素，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养。阴性样品在20℃-25℃环境下饲养2天后，剔除受伤不健康的鲤鱼；
(2)药物养殖添加：向鱼池中添加医用氯霉素片剂，根据养殖水量，添加药物使氯霉素水中浓度为200ug/L，实时监控检测水体中和鱼体内药物浓度，在此条件下养殖18-24小时后，鲤鱼肌肉内药物浓度约为1.0ug/kg，将鲤鱼捞至不含氯霉素的养殖池中继续养殖24小时，使鲤鱼肌肉内药物浓度达到稳定代谢状态；
(3)捞出步骤(2)中饲养完成后的鲤鱼快速冷冻至-18℃以下处死，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，去鳞、去皮、去头、去刺、去内脏，留取肌肉部分；
(3)搅碎匀浆：将鱼肉混合搅碎，10kg搅碎鱼肉中加2kg稀释剂(5％的乙醇溶液，v/v)混匀制成鱼糜；
(4)冷冻干燥：将鱼糜放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥条件： -60℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥；
(5)粉碎匀质：将冷冻干燥的鱼糜用中药粉碎机粉碎，以搅拌锅混匀；
(6)过筛：匀质后的鱼粉过0.6mm孔筛，弃去筛余；
(7)包装：快速用聚乙烯瓶分装(聚乙烯瓶提前45℃烘干)，每个瓶内鱼粉重量10g，再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装；
(8)冷藏保存：2-8℃冷藏保存。
以下是本发明的具体实施实验和效果数据，以进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。
1、均匀性检验
采用单因素方差分析进行均匀性检验，随机抽取10个样品，每个样品平行测定2次，进行单因素方差分析，分析结果表明，F值为2.57小于F临界值3.02，表明样品是均匀的。
称取0.5g样品，加2.0ml水还原15min，按GB-T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》方法进行检测，结果如下：
表2均匀性单因素方差分析
表3均匀性方差分析
2、稳定性研究
2.1长期稳定性研究
采用t检验法。将样品长期2-8℃冷藏保存，按1、3、6、12个月每个时间点随机抽取6个样品，每个样品重复测定2次，测定结果与均匀性检测结果比较判断稳定性，t值小于t临界值1.76，表明样品是稳定的。
表4长期稳定性检测结果
2.2短期稳定性研究
进行与样品存储、运输条件相接近的样品稳定性检验，测定结果与均匀性检测结果比较判断稳定性，t值小于t临界值1.76，表明样品是稳定的。
2.2.132℃连续保存稳定性研究
将样品在32℃连续保存72小时，随机抽取6个样品，每个样品重复测定2次，测定结果与均匀性检测结果比较判断稳定性。
表5 32℃连续保存检测结果
2.2.2运输稳定性研究
将样品于7月从威海快递至广州再快递至威海，往返2次共需运输13天，在运输途中试验样品未采取任何降温和保温措施，运回样品在2-8℃冷藏保存，待测。
表6运输稳定性检测结果
3、定值技术
以8个认可实验室为本残留质量控制样品协同定值。向每个参加协同定值的实验室发放2个试验样品，检测方法为《GB-T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中液相色谱串联质谱法进行定值检测，内标法定量，每个样品平行检测3次，以总平均值为定值结果5.28ug/kg，以2倍标准偏差为不确定度±0.58ug/kg；结果表示为5.28±0.58ug/kg。
不确定度评估说明：本发明的定值采用统一的国标方法，可以忽略测定方法差异产生的不确定度；具体定量采用同位素内标法，不确定度的来源包括人员操作差异、设备重现性差异、实验室环境差异以及重复测量差异引起的不确定度，采用内标法定量可以消除人员和实验室环境差异产生的不确定度对定值结果的影响，采用多点线性回归可以消除仪器重复性差异产生的不确定度对定 值结果的影响，综上所述，不确定度主要由不同实验室重复测量产生，可以用全部定值结果的标准偏差表示，重复测定结果符合正态分布，取置信度95％水平，自由度为2，则合成不确定度可以用2倍标准偏差表示，即结果表示为5.28±0.58ug/kg。
表7氯霉素实验室间研究的结果
Claims (3)
1.一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：
采用氯霉素对活鲤鱼进行养殖添加，使鲤鱼体内含有氯霉素，在不含药物水中饲养待体内药物浓度达到稳定代谢状态后，取鱼肉匀浆制成鱼糜，冷冻干燥，过筛，装瓶，真空封装，制备得到鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品，包括以下步骤：
(1)实验动物的选择：市购活体鲤鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，应先确认样品中不含氯霉素，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养，阴性样品在20℃-25℃环境下饲养2天后，剔除受伤不健康的鲤鱼；
(2)药物养殖添加：向鱼池中添加医用氯霉素片剂，根据养殖水量，添加药物使氯霉素水中浓度为200ug/L，实时监控检测水体中和鱼体内药物浓度，在此条件下养殖18-24小时后，鲤鱼肌肉内药物浓度约为1.0ug/kg，将鲤鱼捞至不含氯霉素的养殖池中继续养殖24小时，使鲤鱼肌肉内药物浓度达到稳定代谢状态；
(3)捞出步骤(2)中饲养完成后的鲤鱼快速冷冻至-18℃以下处死，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，去鳞、去皮、去头、去刺、去内脏，留取肌肉部分；
(4)搅碎匀浆：将鱼肉混合搅碎，10kg搅碎鱼肉中加2kg稀释剂，即5％的乙醇溶液，v/v，混匀制成鱼糜；
(5)冷冻干燥：冷冻干燥条件：-60℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥；
(6)粉碎匀质：将冷冻干燥的鱼糜用中药粉碎机粉碎，以搅拌锅混匀；
(7)过筛：匀质后的鱼粉过0.6mm孔筛，弃去筛余；
(8)包装：快速用聚乙烯瓶分装，再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装；
(9)冷藏保存：2-8℃冷藏保存。
2.一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：
所述制备的冻干粉标准样品中的氯霉素浓度为1.0-10.0ug/kg，包括以下步骤：
(1)实验动物的选择：市购活体鲤鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，应先确认样品中不含氯霉素，随机取样，检测确认为阴性样品后进行喂养，阴性样品在20℃-25℃环境下饲养2天后，剔除受伤不健康的鲤鱼；
(2)药物养殖添加：向鱼池中添加医用氯霉素片剂，根据养殖水量，添加药物使氯霉素水中浓度为200ug/L，实时监控检测水体中和鱼体内药物浓度，在此条件下养殖18-24小时后，鲤鱼肌肉内药物浓度约为1.0ug/kg，将鲤鱼捞至不含氯霉素的养殖池中继续养殖24小时，使鲤鱼肌肉内药物浓度达到稳定代谢状态；
(3)捞出步骤(2)中饲养完成后的鲤鱼快速冷冻至-18℃以下处死，将冷冻的鲤鱼室温下解冻，去鳞、去皮、去头、去刺、去内脏，留取肌肉部分；
(4)搅碎匀浆：将鱼肉混合搅碎，10kg搅碎鱼肉中加2kg稀释剂，即5％的乙醇溶液，v/v，混匀制成鱼糜；
(5)冷冻干燥：冷冻干燥条件：-60℃速冻成厚度不超过2cm的冻块，置于真空干燥仓中，快速升温至60℃，保持48小时，直至冻块干燥；
(6)粉碎匀质：将冷冻干燥的鱼糜用中药粉碎机粉碎，以搅拌锅混匀；
(7)过筛：匀质后的鱼粉过0.6mm孔筛，弃去筛余；
(8)包装：快速用聚乙烯瓶分装，再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装；
(9)冷藏保存：2-8℃冷藏保存。
3.根据权利要求1或2所述的鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(8)中每个瓶内装鱼粉10g。
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