CN104764835B - 含氟吗啉残留的马铃薯粉基体标准样品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农药残留检测的植物源性食品基质标准物质技术领域，更具体涉及一种含氟吗啉残留的马铃薯粉基体标准样品及其制备方法。具体制备方法为：将高纯度氟吗啉样品配制成溶液，向其中添加马铃薯粉，使马铃薯粉全部浸润，经过200 h密封浸泡使氟吗啉与马铃薯粉充分融合；然后将其放置在通风橱中，敞开瓶塞使有机溶剂挥发至干；基质标准样品的混匀与分包：对形成的稳定均一基质样品进行干燥、混匀、分包制得基质标准样品；基质样品的检验与定值：对所获得的基质标准品进行均匀性、稳定性检验和协同定值。

Description

含氟吗啉残留的马铃薯粉基体标准样品及其制备方法

技术领域

本发明属于农药残留检测的植物源性食品基质标准物质技术领域，更具体涉及一种含氟吗啉残留的马铃薯粉基体标准样品及其制备方法。

背景技术

氟吗啉(Flumorph)，无色晶体，CAS:211867-47-9。化学名为：(E,Z)-4-[3-(4-氟苯基)-3-（3,4-二甲氧基苯基）丙烯酰]吗啉。分子式为：C₂₁H₂₂FNO₄，分子量为：371.406，结构式如下：

氟吗啉属于羧酸酰胺类(Carboxylicacidamides,CAAs)真菌杀菌剂，是我国第一个自主创制、具有自主知识产权且商品化的杀菌剂，其在农业生产中主要用于防治卵菌病害，对霜霉属、疫霉素病菌也特别有效，对葡萄、马铃薯和番茄上的卵菌纲，尤其是霜霉科和疫霉属菌具有杀菌效力。由于氟吗啉是我国自主创制的新开发农药，各国尚未对其设定食品中的最大残留限量值(MRL)。

毒性研究显示该农药属于中低毒性杀菌剂，但对人畜仍具有一定的毒性危害，其中大鼠的毒性为急性经口LD50：>2700毫克/公斤（雄）。可见，从维护食品安全的角度来看，监测控制食品中氟吗啉残留量具有重大意义。

欧盟委员会有关农兽药残留检测分析方法的指令（2002/657/EC）中要求采用标准物质作为检测质量控制的手段，并要求采用实物样品对检测过程进行控制。当前，氟吗啉的标准品只有纯品的固体标准样品，检测过程中的质量控制是通过向空白基质中添加配制好的一定浓度氟吗啉标准溶液后分析添加样品来实现的。这种质量控制方式的缺点在于无法实现氟吗啉与样品基质的充分融合，使得氟吗啉不能充分与基质结合，造成目标物与基质结合状况与实际样品不完全一致。这将导致评判检测方法性能的“回收率”指标无法正确指示分析检测过程的质量控制是否得到了有效保障，从而造成检测过程中出现“假阴性”的情况。

由于基质标准物质是目标物与基质充分有效融合的产物，可以代表实物样品用于检测定性、定量和质量控制。因此，研制含有氟吗啉基质标准样品，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品及其制备方法。该制备方法科学合理、可操作性强，所制备得到的基质标准品具有均匀性好、稳定性高、易保存的优点，可用于日常检查的质量控制、方法和能力评价，正确指示分析检测过程的质量控制是否得到了有效保障。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的制备方法，包括以下步骤：

1）高纯度氟吗啉样品的制备：对市售的氟吗啉可湿性粉剂进行提取、分离、纯化得到高纯度结晶氟吗啉样品；

2）马铃薯基质标准样品的制备：以丙酮为溶剂，将步骤1）制得的氟吗啉样品配制成浓度为0.40~0.60mg/L的氟吗啉溶液，然后将氟吗啉溶液与正己烷混合均匀后，向其中添加马铃薯粉，使马铃薯粉全部浸润，经过200h密封浸泡使氟吗啉与马铃薯粉充分融合；然后将其放置在通风橱中，敞开瓶塞使有机溶剂挥发至干；氟吗啉溶液与正己烷的体积比为1000mL:500mL；

3）基质标准样品的混匀与分包：对步骤2）形成的稳定均一基质样品进行干燥、混匀、分包制得基质标准样品；

4）基质样品的检验与定值：对所获得的基质标准品进行前处理后，再进行均匀性、稳定性检验和协同定值。

步骤2）中马铃薯粉是过200目筛的，每千克马铃薯粉中加入0.25mg氟吗啉。

步骤3）具体步骤为：将步骤2）得到的粉状基质标准样品于35℃下真空干燥24h，压强保持1000Pa；研磨、过100目筛，分装至铝箔袋中，每袋10g，密封，常温保存。

步骤4）中前处理包括以下步骤：

1）提取与净化

于50mL的离心管中称取样品1.000g（精确至0.001g），加入0.5mL蒸馏水，静置10min，添加2.0gNaCl和8.0gNa₂SO₄，20mL二氯甲烷/正己烷(v/v=1/1)混合液，以11000rpm高速匀浆1min，振荡20min，以4500rpm离心5min，收集全部上清液；按照上述步骤重新提取一次，合并提取液，40℃下旋转蒸发至干，添加2.00mL丙酮定容，过0.22μm滤膜，待分析。

2）气相色谱-质谱条件

气相色谱色谱柱：DB-5MS毛细管(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：高纯氦气(99.999%)，恒流模式，柱流速：1.1mL/min；进样量：1.00μL，不分流进样；进样口温度：280℃；柱升温程序：初始温度70℃，保持1min，以20℃/min升至260℃，保持12min，以30℃/min升至300℃，保持3min。

质谱条件电子轰击(EI)离子源，电子轰击能量70eV，单四极质量分析器；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；全扫描(SCAN)模式：扫描范围m/z50～550，确定待测物扫描离子、保留时间和检查有无杂质干扰；溶剂延迟：17min；选择离子(SIM)模式：氟吗啉定量离子m/z285，定性离子m/z371、165，驻留时间100ms。

3）定量分析

基质标准曲线的制定：

称取氟吗啉标准品，配制成11.25mg/L的标准储备液，使用时以储备液配制浓度为1.125mg/L的标准使用液。

在6个50mL的具塞离心管中分别称取1.000g空白马铃薯粉，分别向其中添加0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60mL的标准使用液，按照1.2和1.3节进行前处理及定容，得到浓度分别为0.00、0.05625、0.1125、0.2250、0.4500、0.9000mg/L的基质标准曲线，以此曲线进行校正定量。

进样顺序及定量限制条件:

分析测试时依次进样等体积的标准使用液、溶剂空白（丙酮）、样品空白、基质标准曲线、待测试样品，记录峰面积，外标法定量。

在满足以下条件时定量是有效的：（1）标准溶液的保留时间与未知物的保留时间相差不超过±0.25min；（2）未知物响应信号的信噪比大于10；（3）标准曲线的相关系数大于0.99。

一种如上所述的制备方法制得的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品，所制得的基质标准样品中氟吗啉的含量为（0.244±0.023）mg/kg。

本发明的优点在于：

1）从市售的商品农药分离、纯化获取高纯度氟吗啉样品，使得氟吗啉样品来源广泛，价格低廉；

2）选取马铃薯粉作为基质样品，契合该农药日常使用对象和残留检测监控对象的实际情况；

3）采用溶剂全部侵润的方式制备基质样品，使得氟吗啉与样品基质能充分融合；均匀性、稳定性检验表明，该标准品均匀性好、保质期长，稳定性高，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1制得的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1、氟吗啉高纯度样品的制备：

1）重结晶：

于200mL蒸馏瓶中称取20g市售农药氟吗啉可湿性粉剂（含量为20wt％），加入120mL的丙酮，在55℃下回流45min，趁热过滤并收集全部滤液，40℃下浓缩近干，并在室温下放置晾干得到固体物(约4g)；向得到的固体物中加入100mL的乙酸乙酯，加热至70℃至固态物全部溶解，加入0.2g的活性炭，70℃下保持10min，热滤，40℃下浓缩滤液得到浆状物；向浆状物中逐次少量地加入乙酸乙酯并摇振得到均一透明溶液，之后逐次少量加入石油醚直至透明溶液浑浊，并且该浑浊适当加热后可以变成透明状，表明该溶液已经达到饱和状态，过滤，40℃下静置滤液，使之结晶，对所得到结晶重新加入乙酸乙酯和石油醚并重结晶，真空抽滤得到淡黄色晶体，待使用柱层析精制；

2）柱层析：

将上述制备的结晶物用少量丙酮溶解，并按照质量比为结晶物/硅胶=1/3向其中添加100—200目的粗硅胶，充分搅拌均匀，静置24h；取底部具有烧结砂芯并有聚四氟乙烯塞的玻璃层析柱，柱长为35cm，内径为3.0cm；向其中致密填装200-300目的层析硅胶约25cm柱高，将吸附样品的粗硅胶填装至层析硅胶顶部，之后在吸附样品的硅胶上端填充3cm的层析硅胶，使之形成均一致密的硅胶柱体；在该硅胶柱体上面加少量脱脂棉以保护硅胶柱柱体，层析柱上连接储液球。

使用200mL的石油醚洗脱柱体，弃去全部洗脱液，接着使用100mL的乙酸乙酯洗脱柱体，弃去全部洗脱液，之后使用200mL的二氯甲烷/丙酮=1/1（V/V）溶液洗脱柱体，收集滤液，每瓶约5mL，待进行薄层层析分析。

）薄层层析分析及结晶：

以硅胶薄层层析板为薄层层析载体，氯仿/丙酮=8/2（V/V）为展开剂，10%硫酸-乙醇溶液为显色剂，电热平板加热显色，以此为条件判断上述收集的滤液。对上述收集的每瓶滤液进行点板、展开和显色分析，收集含有呈黄色点的全部滤液，并在40℃下浓缩至溶液浑浊，将此溶液放置通风橱中室温下挥发有机溶剂并得到无色结晶体。

至此，得到含量为98.5%的高纯度氟吗啉样品。

2、马铃薯基质样品的制备

将上述制备得到的氟吗啉样品，以丙酮为溶剂配制得到浓度为0.50mg/L的氟吗啉溶液1000mL；于5000mL的具塞磨口容量瓶中，加入过经200目筛的马铃薯粉2000g，将配制的氟吗啉溶液与500mL正己烷混合后倒入容量瓶中，搅拌至全部马铃薯粉浸润，密封浸泡200h，然后将该样品放置在通风橱中，敞开瓶塞任有机溶剂挥发至干，得到浓度约为0.25mg/kg的基质样品。

3、基质样品的混匀、分包与保存

将上述基质样品研磨并过100目筛，所得到的粉状基质样品于35℃下真空干燥24h（压强保持1000Pa）；之后将该粉末基质样品分装至铝箔袋中，每袋10g，密封；将该200袋样品进行编号，常温保存。

4、基质样品的检验与定值

1）马铃薯粉基质中氟吗啉残留量的测定

1.1）仪器与试剂

Agilent6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司；IKAT-25高速分散器,德国IKA公司；RV10旋转蒸发仪，德国IKA公司；ZM200超离心研磨仪，德国Retsch公司；3K-15冷冻离心机，德国Sigma公司；SartoriusBS1100S型分析天平（十万分之一，德国）。

氟吗啉标准品(纯度99.0%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2）提取与净化

于50mL的离心管中称取样品1.000g（精确至0.001g），加入0.5mL蒸馏水，静置10min，添加2.0gNaCl和8.0gNa₂SO₄，20mL二氯甲烷/正己烷(V/V=1/1)混合液，以11000rpm高速匀浆1min，振荡20min，以4500rpm离心5min，收集全部上清液；按照上述步骤重新提取一次，合并提取液，40℃下旋转蒸发至干，添加2.00mL丙酮定容，过0.22μm滤膜，待分析。

1.3）气相色谱-质谱条件

气相色谱条件色谱柱：DB-5MS毛细管(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：高纯氦气(99.999%)，恒流模式，柱流速：1.1mL/min；进样量：1.00μL，不分流进样；进样口温度：280℃；柱升温程序：初始温度70℃，保持1min，以20℃/min升至260℃，保持12min，以30℃/min升至300℃，保持3min。

质谱条件电子轰击(EI)离子源，电子轰击能量70eV，单四极质量分析器；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；全扫描(SCAN)模式：扫描范围m/z50～550，确定待测物扫描离子、保留时间和检查有无杂质干扰；溶剂延迟：17min；选择离子(SIM)模式：氟吗啉定量离子m/z285，定性离子m/z371、165，驻留时间100ms。

1.4）定量分析

1.4.1基质标准曲线：

称取氟吗啉标准品，配制成11.25mg/L的标准储备液，使用时以储备液配制浓度为1.125mg/L的标准使用液。

在6个50mL的具塞离心管中分别称取1.000g空白马铃薯粉，分别向其中添加0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60mL的标准使用液，按照1.2和1.3节进行前处理及定容，得到浓度分别为0.00、0.05625、0.1125、0.2250、0.4500、0.9000mg/L的基质标准曲线，以此曲线进行校正定量。

1.4.2进样顺序及定量限制条件

分析测试时依次进样等体积的标准使用液、溶剂空白（丙酮）、样品空白、基质标准曲线、待测试样品，记录峰面积，外标法定量。

在满足以下条件时定量是有效的：（1）标准溶液的保留时间与未知物的保留时间相差不超过±0.25min；（2）未知物响应信号的信噪比大于10；（3）标准曲线的相关系数大于0.99。

2）、均匀性检验

本发明采用单因素方差分析进行均匀性试验。按照总样本单元数2×N^1/3随机抽取12个样品，每个样品平行测定3次，进行单因素分析。计算每组内的均方差和组间的均方差，各自的自由度，显著性水平，按照方差检验给定的方法进行计算统计量F。查F分布表，找到F临界值，与计算得到的F值进行比较，判定是否均匀。

均匀性检验结果见表1，均匀性方差分析见表2：

表1马铃薯基质中氟吗啉标准品的均匀性检验结果

表2马铃薯基质中氟吗啉标准品的均匀性检验方差分析

均匀性检验结论：

分析结果表明，F值=2.054<F_0.05(11,24)=2.216临界值，表明样品的均匀性好。

3）、稳定性检验

本发明中的稳定性检验采用经典的稳定性研究，即同时制备样品在相同条件下随着时间的推移进行测量；采用线性拟合作为稳定性研究的基本模型：

其中，为β₀和β₁回归系数，为ε随机误差分量，X为时间变量，Y为氟吗啉含量。

按照《GB/T15000.3-2008标准样品定值的一般原则和统计方法》中稳定性检验第二法要求采用F检验法检验一元线性回归模型的显著性，即通过评估最后的回归方差分析表，对于95%置信度水平，当显著因子F≥0.05时表示回归是不显著的，以此来判断未观测到不稳定性。同时，以线性回归方差分析表所给出的残差MS开平方得到直线上点的标准偏差S(b₁)，藉此来计算由稳定性带来的定值不确定度。

由于本发明中选择了常温为存储条件，在第0个月和1个月时从中随机抽取12个样品进行均匀性检验，并以此进行短期稳定性检验；分别在0、1、2、4、6个月时对制备的基质标准品随机抽取样品进行稳定性测试。可见，在为期6个月的长期稳定性检验中包括了在1个月内的短期稳定性检验数据，因此，本项目中为避免重复计算，将采用长期稳定性检验数据对基质标准品进行稳定性研究，并以长期稳定性所带来的不确定度作为分量来合成特性值不确定度。

马铃薯粉中氟吗啉基质标准品稳定性检验的测量数据见表3，回归统计及方差分析结果分别将表4和表5。

表3马铃薯粉中氟吗啉基质标准品稳定性检验的测量数据

表4马铃薯粉中氟吗啉基质标准品稳定性检验的回归分析结果

表5马铃薯粉中氟吗啉基质标准品稳定性检验的方差分析

稳定性检验结论：

分析结果表明，显著因子F=0.7205＞0.05，表示回归不显著，表明在95%置信度水平未观测到不稳定性。

4、协同定值

由福清出入境检验检疫局等6个获认证认可实验室参见协同定值研究，向各实验室发放标准使用液、空白样品和随机研制的基质标准品各一份，采用上述前处理方法和分析测试条件进行检测，同一基质标准品平行测试三次，返回报送结果。检测结果经过柯克伦检验、格拉布斯检验后进行平均结果定值。马铃薯粉中氟吗啉基质样品协同定值结果见表6。

表6马铃薯粉中氟吗啉基质样品协同定值结果

将上述检测结果进行如下的柯克伦检验、格拉布斯检验和双值格拉布斯检验：

（1）柯克伦检验

由给定的p个样品，重复测定n次的结果计算标准偏差Si，由柯克伦检验的定义，由以下柯克伦规则对结果进行判断：

在p=6，n=3时，柯克伦的临界值C_0（5%）=0.516，C_0（1%）=0.615，6个实验室的柯克伦检验结果值C=0.215，即C≤C_0（5%），表明6个实验室的数据均通过了柯克伦检验。

（2）格拉布斯检验

将6个协同定值实验室检测结果的平均值按照从小到大的顺序排列，分别为X₁、X₂、……X_P-1、X_P，用下列公式来计算统计了G₁的值。

按照如下单值格拉布斯检验规则进行判断：

在n=6时，格拉布斯的临界值G_1(5%,6)=2.032，G_1(1%,6)=0.221，而6个实验室测量结果均值的格拉布斯检验结果G₁₁=0.803，G_1p=1.360，均小于G_1(5%,6)，表明各实验室的均值均可保留用于协同定值。

协同定值结论：

由于参与定值单位所提供的结果均符合要求，因此本项目定值最终是协同定值实验室提供结果的平均值，即0.2441mg/kg。

5、不确定度分析

按照GB/T15000.3-2008的要求，特性值不确定度（U_CRM）由测定值不确定度（u_char）、袋间不确定度（u_bb）和长期稳定性不确定度（u_lts）合成并扩展（包含因子k=2）而得，见如下公式：

(1)测定值不确定度（u_char）

由于本项目中参与协同定值的所有数据经过检验并可用于定值，即本项目试验材料的特性值是各实验室平均值的均值，即。与平均值的均值有关的合成标准不确定度的主要分量由下列公式得到的标准偏差：

；

而合成不确定度为：

其中P代表实验室数，P=6。

由表6所给出的数据，S=0.004583，所以，本项目中u_char=0.001620。

袋间不确定度（u_bb）

在均匀性检验中已经证明袋间是均匀的（见表1和表2）。

表2显示，MS_among=5.345E-05，MS_within=2.602E-05；

袋间方差的计算为：=9.143E-06；

袋间标准偏差是该方差的平方根：=0.003024；重复性标准偏差为：=0.005101；

由袋间均匀性所带来的不确定度u_bb由以下公式计算得到：

；

其中，，p=12。

长期稳定性不确定度（u_lts）

在稳定性数据无显著性趋势的情况下，可假设特性值Y从初始值Y₀以一个常数b₁线性降解，b₁是相对降解速率，为时间X的函数，即Y(b₀,b₁,X)=Y₀(1+b₁X)。特性值的不确定度可通过将自变量Y₀、X和b₁的不确定度传播给因变量Y得到。

在给定的有效期X内没有降解的情况下，稳定性的不确定度为：。

在表5中给出了马铃薯粉中氟吗啉基质标准品稳定性检验的方差分析结果，其中的残差MS_res值可知，即MS_res=7.963E-05；由表5数据计算稳定性测定值的偏差平方和为：；

由如下公式计算与回归直线斜率相关的不确定度：

；

所以，在有效期为X=6(月)时长期稳定性不确定度计算为：

；

不确定度分析结论：

在6个月的有效期内，置信水平为95%时，k=2，特性值的扩展不确定为：

=0.02266。

6、马铃薯粉中氟吗啉基质标准品检验与定值结论

本发明的基质标准物质最终确定的标准值为：(0.244±0.023)mg/kg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）高纯度氟吗啉样品的制备：对市售的氟吗啉可湿性粉剂进行提取、分离、纯化得到纯度≥98.5%的结晶氟吗啉样品；

2）马铃薯基质标准样品的制备：以丙酮为溶剂，将步骤1）制得的氟吗啉样品配制成浓度为0.40~0.60mg/L的氟吗啉溶液，然后将氟吗啉溶液与正己烷混合均匀后，向其中添加马铃薯粉，使马铃薯粉全部浸润，经过200h密封浸泡使氟吗啉与马铃薯粉充分融合；然后将其放置在通风橱中，敞开瓶塞使有机溶剂挥发至干；

3）基质标准样品的混匀与分包：对步骤2）形成的稳定均一基质标准样品进行干燥、混匀、分包制得基质标准样品；

4）基质标准样品的检验与定值：对步骤3）所获得的基质标准样品进行前处理后，再进行均匀性、稳定性检验和协同定值。

2.根据权利要求1所述的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的制备方法，其特征在于：步骤2）中马铃薯粉是过200目筛的，每千克马铃薯粉中加入0.25mg氟吗啉。

3.根据权利要求1所述的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的制备方法，其特征在于：步骤3）具体步骤为：将步骤2）得到的粉状基质标准样品于35℃下真空干燥24h，压强保持1000Pa；研磨、过100目筛，分装至铝箔袋中，每袋10g，密封，常温保存。

4.根据权利要求1所述的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品的制备方法，其特征在于：氟吗啉溶液与正己烷的体积比为1000mL:500mL。

5.一种如权利要求1所述的制备方法制得的含有氟吗啉残留的马铃薯粉基质标准样品，其特征在于：所制得的基质标准样品中氟吗啉的含量为（0.244±0.023）mg/kg。