CN103675162A

CN103675162A - 含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备

Info

Publication number: CN103675162A
Application number: CN201310693779.5A
Authority: CN
Inventors: 余孔捷
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN103675162B

Abstract

本发明提供了一种含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，是将体内不含喹诺酮类药物残留的鳗鱼经5种药物同时药浴7h后捕捞，获得含5种喹诺酮类残留的阳性鳗鱼，将阳性鳗鱼冷冻处死，经处理得到鳗鱼糜均匀阳性材料，分装、辐照灭菌后，经均匀性检验、稳定性检验、协同定值，得到含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品，其所含喹诺酮类残留量范围为5μg/kg~30μg/kg。本发明制备的多残留鳗鱼糜自然基体标准样品外在形态及内在目标物结合情形都与真实检测样品完全一致，避免了冻干粉和加料基体标准样品的缺陷，产品均匀稳定，使用可靠，可在常温下传递，适用于水产品中相关药物残留检测分析的质量控制。

Description

含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备

技术领域

本发明具体涉及一种含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，该标准样品适用于水产品中相关药物残留量分析检测的质量控制。

背景技术

食品分析用标准样品作为食品化学测定量值溯源的实物载体，直接影响到食品安全。动物组织如肌肉、内脏、血液、尿液等新鲜或需冷冻保存的样品由于运输、保存及均匀过程较困难，通常将其真空干燥制得冻干粉。以冻干粉的方式制作标准样品，在保存、运输、包装和均匀性、稳定性等方面有其相对优越性，但由于冻干粉同实验室日常分析检测的真实样品形态不同，虽然可采用复水或其它手段使冻干粉尽可能与日常的分析基体类似，但使用冻干粉进行方法验证与质量控制时常遇到取样量及提取、净化方法等与日常分析样品有所不同的问题。用加料（加标）法制备的基体标准样品方法简便，但基体和目标物的结合情形与真实检测样品不完全一致，可能导致提取行为与日常分析样品有所不同。而常见鲜糜基体样品因易腐败变质在传递过程中需采取低温等保护措施。

喹诺酮类(quinolones，QNs)是一类人工合成的广谱杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌活性强、与其它抗菌药物无交叉耐药性等特点而广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的预防和治疗。由于该类药物在临床上容易导致耐药菌株的产生，因此欧盟、美国、日本等已将其列为动物性食品中残留检测的重点监控药物。喹诺酮类药物在美国属水产养殖业的禁用药；欧盟、日本等都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量；我国也规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10～500μg/kg。

自然基体标准样品通常是指标准样品的候选材料获取于天然基体，不包括获取于“在基体材料中加入已知量的化合物或元素”。本发明建立了一种含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，所获得的含5种喹诺酮类残留的自然基体标准样品均匀稳定，可在常温下传递，适用于水产品中相关药物残留检测分析的质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，制得的鳗鱼糜自然基体标准样品含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星，其含量在5 μg/kg～30 μg/kg范围内不等。其形态及目标物与基体结合的情形都与真实检测样品完全一致，产品均匀稳定，使用可靠，可在常温下传递，适用于水产品中相关药物残留检测分析的质量控制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法包括以下步骤：

1）选取体内不含喹诺酮类药物的鳗鱼；

2）配制含氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的药浴液，将药浴液均分至两个长宽均为0.67 m×0.47 m，药浴液深 0.20 m的小实验池中，此时实验池药浴液中5种药物的初始浓度分别为：氟甲喹0.0056 mg/L，噁喹酸0.0183 mg/L，氧氟沙星999 mg/L，诺氟沙星2902 mg/L，环丙沙星2405 mg/L。；

3）每个小实验池中入浴30尾所选取的鳗鱼，4尾/kg，连续供氧，药浴7 h后捕捞以获取阳性鳗鱼；

4）将阳性鳗鱼冷冻处死，宰杀，去内脏、头、尾，去骨，切段，再经搅碎匀浆，拍击均质，挤压过10目筛，制备得到鳗鱼糜均匀阳性材料；

5）将均匀阳性材料分装、辐照灭菌；

6）经均匀性检验、稳定性检验、协同定值，得到含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的鳗鱼糜自然基体标准样品。

所述制备方法制得的自然基体标准样品中5种喹诺酮类的特性值不等，范围为：5μg/kg～30μg/kg。

本发明的显著优点在于：本发明所制得的自然基体标准样品中同时含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星，其含量范围在5 μg/kg～30 μg/kg。目标物与基体结合的情形和外观形态都与真实检测样品完全一致，产品均匀稳定，使用可靠，可在常温下传递，适用于水产品中相关药物残留检测分析的质量控制。

附图说明

图1为鳗鱼中5种喹诺酮类药物残留量随药后时间变化的趋势。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 材料

鳗鱼：福建省长乐聚泉食品有限公司提供（约4尾/kg），经HPLC-MS/MS检测，均未检出含氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星（检测限为0.10μg/kg），人工转移至给药池；

药浴实验用药为：氟甲喹：使用前实测含量58.4％；噁喹酸：使用前实测含量70.7％；盐酸左旋氧氟沙星：使用前测定以氧氟沙星计含量70.5％；烟酸诺氟沙星：使用前实测以诺氟沙星计含量24.4％；乳酸环丙沙星：使用前实测以环丙沙星计含量62.2％。

包装材料为：尼龙/聚丙烯(PA/CPP)耐蒸煮复合膜袋：120 mm×110 mm，膜厚0.06 mm，为外包装袋；4号聚乙烯（PE）膜自封袋：120 mm×85 mm，膜厚0.04 mm，剪去自封口用作内袋。

1.2试剂

以下试剂中未标明纯度或级别的均为分析纯。水：GB 6682 规定的一级水；正己烷、乙腈、甲醇、甲酸：HPLC级；中性氧化铝：100~200目；无水硫酸钠：650℃灼烧4h，冷却后储于密封容器中备用；0.2%甲酸溶液：移取2 mL甲酸，加水混匀并定容至1 L；2%甲酸乙腈：将乙腈、甲酸按2：98的体积比混合；乙腈-甲酸-水（10：0.1：90，v/v）：将乙腈、甲酸、水按10：0.1：90的体积比混合；5 mmol/L乙酸铵-0.2％甲酸溶液：称取0.35 g乙酸铵，溶于约700 mL水中，加入2.0 mL甲酸，以水定容至1 L；磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，PH=7.0）：称取0.52 g磷酸二氢钾和21.92 g磷酸氢二钾，加水溶解并稀释至500 mL，用10%的磷酸调pH值至7.0；标准品氟甲喹(98.3%)、噁喹酸（98.0%）、氧氟沙星(99.0%)、诺氟沙星(99.5%)、环丙沙星（95.0%）及其同位素内标噁喹酸_D5(99.8%)、氧氟沙星_D5(99.0%)、诺氟沙星_D5(99.0%)、环丙沙星_D8(99.5%)：Dr.Ehrenstorfer GmbH；标准储备液：称取上述标准品适量，用甲醇溶解并稀释，分别配制成100.0 μg/mL的标准储备液，于-18℃保存；混合工作液：从冰箱中取出标准储备液，恢复至室温后取根据需要移取适量标准储备液并用乙腈稀释，配制成适当浓度的混合标准工作液。

1.3 仪器设备

API5500超高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）：美国AB SIEX；ANKE TDL-5离心机：上海安亭科学仪器厂；涡旋混合器：上海医科大学仪器厂；MilliQ纯水系统：Millipore公司；超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；2094型搅拌型匀浆器：丹麦FOSS；stomacher3500型拍击均质器：英国Seward；SC-300A型真空包装机：安溪县三和茶叶机械厂；KB720型培养箱：德国Binder；Co60-γ射线辐照装置：福建省康普顿辐照技术有限公司；BC/BD-718A冰柜：青岛海尔特种电冰柜有限公司；ACO-002型空气泵：浙江森森实业有限公司；10目不锈钢网筛。

1.4 鳗鱼中喹诺酮类残留量测定

采用HPLC-MS/MS测定。

1.4.1 提取与净化

称取5.00 g样品，加入100μL 100 ng/mL同位素内标标准溶液，再加入3.0mL磷酸盐缓冲液（pH=7.0），于涡旋振荡器振荡2min分散样品；再加入15 mL的2%甲酸乙腈，于涡旋振荡器振荡提取1 min后常温超声提取10 min，加入3g无水硫酸钠和2g中性氧化铝于涡旋振荡器上振荡5 min，4500 r/min离心5 min，取上清液；下层残余再用10 mL乙腈按上述振荡、超声、离心步骤操作后，取上清液；合并两次提取的上清液混匀，分取10 mL混合上清液，40 ℃氮吹至近干，加入2 mL乙腈-水-甲酸（体积比：10：90：0.1）溶液和3mL正己烷溶解残渣，涡旋振荡2 min，3500 r/min离心5 min，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱上机测定分析。

1.4.2 仪器参数及测定条件

a）液相色谱：ACQUITY UPLC BHE C18柱（2.1 mm × 100 mm, 1.7μm）；流动相A：5 mmol/L乙酸铵-0.2％甲酸溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2 min，10% B，2～4 min，10%～50% B，4～6 min，50%～90% B，6～10 min，10 % B；流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

b）质谱：电喷雾电离正离子模式（ESI+），MRM多反应监测；电喷雾电压（IS）：5500 V；气帘气压力（CUR）：0.241 MPa（氮气）；离子源温度（TEM）：500 ℃；雾化气压力0.379 MPa；辅助气压力0.379 MPa；其它质谱参数见表1。

表1 UPLC-MS/MS检测条件参数

*为定量离子

1.4.3 定性和定量分析

1.4.3.1定性测定

进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差

1.4.3.2定量分析

以0.00、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL标准溶液进样绘制标准工作曲线。进样等体积的试剂空白，阴性控制样、待测样（不超过20个）、阳性控制样，记录峰面积或峰高，内标法定量。

仅在满足以下条件时定量是有效的：

1）标准溶液的保留时间与未知物的保留时间相差不超过0.15 min；

2）未知物响应信号的信噪比大于10；

3）标准曲线的相关系数大于0.9900。

1.5 鳗鱼给药

1.5.1 药浴液配制

称取7.51 mg氟甲喹、20.4 mg噁喹酸、178.6 mg盐酸左旋氧氟沙星、1468 mg烟酸诺氟沙星、487.2 mg乳酸环丙沙星。将氟甲喹加10 mL饱和碳酸氢钠溶液溶解，加水稀释至100 mL；噁喹酸加乙醇溶解并稀释至100 mL；盐酸左旋氧氟沙星、烟酸诺氟沙星、乳酸环丙沙星分别加水溶解、混合并稀释至100 mL。取配制的氟甲喹、噁喹酸药液各16.0 mL，盐酸左旋氧氟沙星、烟酸诺氟沙星、乳酸环丙沙星混合药液全量注入126 L的水中，搅匀。

1.5.2 给药

上述药浴液均分至两个小实验池，每个实验池长宽为0.67 m×0.47 m，药浴液深 0.20 m。此时药浴液中5种药物的折算初始浓度分别为：氟甲喹0.0056 mg/L，噁喹酸0.0183 mg/L，氧氟沙星999 mg/L，诺氟沙星2902 mg/L，环丙沙星2405 mg/L。将鳗鱼转移入小实验池，每池30尾鳗鱼（4尾/kg），池水水温约23 ℃，以空气泵24 h增氧，药浴养殖7h，捕捞。

1.6 阳性材料的采集、均质

将药浴7 h后捕捞的鳗鱼冷冻处死，宰杀，去内脏、头、尾，去骨，切段（每段长约3cm），-20 ℃冷冻保存，作为阳性材料。

将冷冻的鳗鱼阳性材料转移至4 ℃冰箱解冻后置于匀浆器中，3000 rpm搅碎成糜样并匀浆3min，人工搅拌30 min混匀后再置于匀浆器中匀浆3 min。

取鱼糜装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180/min的频率拍击均质；每次拍击2 min后取出揉混袋中的鱼糜，再拍击，如此反复三次；将拍击后的鱼糜混置于大桶中，人工搅拌混合30 min；过筛，挤压过10目网筛，弃去筛余。

1.7 分装

取均质过筛后的鱼糜装入内袋中，每袋装25 g，套上外袋；用真空封口机对分装好的鱼糜外袋热封口，并贴上带编号的样品标签。

1.8 辐照灭菌与微生物检测

将分装好的鱼糜以钴60-γ射线辐照灭菌，辐照剂量为12 kGy，灭菌后的样本置于-20 ℃冰箱中贮存。辐照前后分别取样进行微生物学检测。

1.9 均匀性检验

抽取10个单元样品，按1.4的方法进行样品前处理和HPLC-MS/MS检测，每个样品重复测试三次，将测试结果进行均匀性统计，采用方差分析法（F-检验）检验样品的瓶间均匀性。

1.10 稳定性检验

稳定性实验设计采用经典稳定性研究，即将同时制备的样品在相同条件下随时间的推移进行测量。

采用线性拟合作为稳定性稳定性研究的基本模型：

，其中

和

为回归系数，

为随机误差分量；X为时间变量，Y为残留量。按照GB 15000.3给出第二种方法：采用F检验法检验一元线性回归模型的显著性，通过评估最后的回归方差分析表，对于95%置信水平，当Significance F≥0.05时表示回归是不显著的，判为未观测到不稳定性，此时计算

所用的直线上点的标准偏差

可以方便地从线性回归方差分析表所给出的残差

开平方得到。

1.11 定值与不确定度评估

根据国家标准GB/T 15000.3-2008“标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法”中有关要求，对本发明所制备的标准样品进行定值。

采用LC-MS/MS方法检测，检测结果经柯克伦检验、格拉布斯检验后取平均结果定值。特性值不确定度（

）由测定值标准不确定度（

）、瓶间标准不确定度（

）、长期稳定性标准不确定度（）和短期稳定性标准不确定度（

）合成并扩展（包含因子

＝2）而得。

2 结果与分析

2.1 给药时间的确定

鳗鱼中各药物残留量随药后时间变化趋势图如图1。

图1中可见，施药后，鳗鱼体内残留量浓度随时间推移而升高，24 h后实验池全量换新鲜水后（不含药物），鳗鱼体内5种喹诺酮类残留浓度随时间推移而降低。24 h换水时鳗鱼体内残留量处于最高峰，5h～10h和28h以后残留量浓度变化相对较平缓。同时考虑到适当缩短药浴时间，因此选择药浴时间为7 h，即药浴7h后可获取阳性鳗鱼。

2.2 药浴液与药浴密度

经鳗鱼中各药物残留量随药后时间的变化趋势实验，结合目标物在所制备标样中预期浓度和残留量变化趋势实验结果估测出合适的药浴液初始浓度；同时，如果药浴液中鳗鱼密度过高，或药浴液太深，都不利于鳗鱼药浴时的舒适度，甚至导致鳗鱼在药浴中死亡；且应有适当的工作效率，最终确定药浴液初始浓度分别为：氟甲喹0.0056 mg/L，噁喹酸0.0183 mg/L，氧氟沙星999 mg/L，诺氟沙星2902 mg/L，环丙沙星2405 mg/L，药浴液深度20 cm，本方法条件下每池投成鳗30尾。

2.3 辐照与包装阻隔性效果

常用灭菌方法有加热灭菌和辐照灭菌等方法，考虑到加热灭菌易引起基体物质变性、热涨压力导致包装物破损等缺点，因此选用辐照灭菌。

按1.8所述，辐照前后分别取样进行微生物学检验以考察辐照灭菌和包装防菌效果，检验结果见表3。

表3 辐照前、后及保温后微生物检验结果

从表3可见，辐照前菌落总数达10⁷cfu/g，经12 kGy辐照后可达到＜10 cfu/g的理想灭菌效果。对12 kGy辐照后的成品进行保温试验，按商业无菌保温试验，以37 ℃保温10天后菌检结果＜10 cfu/g，37天的保温试验后菌检结果仍＜10 cfu/g，可见包装的阻隔性可以满足防菌要求。

2.4 均匀性研究

随机抽取10个均匀性检验样本单元，均匀性实验的总体共261个单元，顺序编号后利用随机数表随机抽取10个样本进行均匀性实验。均匀性检验数据见表4，按F检验法进行均匀性统计分析，统计汇总数据见表5，方差分析结果见表6。

表4 均匀性检验结果

表5 每瓶样品的统计汇总数据

表6 瓶间均匀性研究方差分析

表6方差分析结果表明F＜2.39=F_0.05(9，18)，P-value>0.05，表明瓶间差异不显著，即5种喹诺酮类残留的瓶间均匀性均符合要求，同时也验证了所采取的均值操作可行。

由于机械匀浆受到容器容量的限制，无法全量一次匀浆，因此需要在机械匀浆后增加人工全量搅拌操作以保证整体均匀。同时由于鳗鱼鱼糜中小骨刺和小部分未搅碎鳗鱼皮片的存在将影响样品均匀性，且小骨刺也存在导致包装物破损的潜在威胁，因此采用过筛的办法，即均质后将鱼糜挤压通过10目网筛，弃去筛余，将小骨刺和小部分未搅碎鳗鱼皮片从鱼糜中剔除。

2.5 稳定性研究

2.5.1 短期稳定性

通过保温试验，结果证明没有微生物腐败情况出现；协同定值和组织比对测试是在7月份气温条件下将所制得的样品传递给13个实验室，从反馈的样品接收状态看，所有实验室均未有诸如胀包、样品变质等不正常样品状态的报告；以上说明所制得标准样品的基体短期稳定性。样品传递后的检测结果验证了样品中目标物（多残留特性值）具有短期稳定性。综合评估认为所制样品可以常温传递。

2.5.2 长期稳定性

样品长期冻藏于-20 ℃冰箱中。每月取样一次，进行6个月检测。稳定性研究的测量数据见表7，由于定值之前已开始稳定性研究，因此以定值时间X值为0，则之前时间的X值为负值。根据表7的汇总数据，回归统计见表8，方差分析结果见表9。

表7 稳定性研究的测量数据

表8 稳定性研究分析结果摘要

表9 稳定性研究方差分析

均大于0.05，表示回归是不显著的，认为未观测到不稳定。

2.6 定值与不确定度评定

2.6.1定值

12个实验室进行协同定值实验，采用LC-MS/MS方法检测，定值检测结果通过科克伦检验和格拉布斯检验，剔除统计无效数据，取平均结果定值。有效值个数为氟甲喹12个、噁喹酸11个、氧氟沙星12个、诺氟沙星12个、环丙沙星11个。检验步骤如下：

（1）先对所有数据进行柯克伦（Cochran）检验。

给定p个由相同的n次重复测试结果计算的标准偏差Si，柯克伦（Cochran）检验的定义为

，柯克伦检验的结果按下述判定：

柯克伦的临界值在n＝3，本发明可能涉及的不同p值所对应柯克伦的临界值C0为

当对所有数据进行柯克伦（Cochran）检验，为正确值的单元（实验室）结果予以保留，判定为离群值的予以删除，判为歧离值的则对该单元的最大值和最小值进行单值格拉布斯（Grubbs）检验，检验判定为正确值时，保留该单元结果。

（2）单值格拉布斯（Grubbs）检验：

单值格拉布斯（Grubbs）检验量

是检验该单元中最大值

是否为离群值，其中

；

则检验该单元中最小值

是否为离群值，其中

；单值格拉布斯检验结果按下述判定：

在n＝3时，单值格拉布斯（Grubbs）的临界值如下：

（3）对所有单元的均值进行单值格拉布斯（Grubbs）检验

对所有单元的均值进行单值格拉布斯（Grubbs）检验的判定规则同上述（2），本发明可能涉及的单元数p值所对应的单值格拉布斯（Grubbs）的临界值如下：

（4）对所有个单元的均值进行双值格拉布斯（Grubbs）检验

双值格拉布斯（Grubbs）检验量

是检验最大的两个值是否为离群值，

其中是原数组的方差，是p个数据去除最大两值后的方差。检验量

是检验最小两值是否为离群值，

其中是p个数据去除最小两值后方差。双值格拉布斯检验结果按下述判定：

本发明可能涉及的单元数p值所对应的双值格拉布斯（Grubbs）的临界值如下：

本发明定值最终是协同定值实验室有效结果的平均值，结果见表10。

表10 定值结果

注：**为统计无效值，在总平均值中已剔除。

2.6.2不确定度评定

特性值不确定度的评定按照GB/T 15000.3-2008，考虑了测定、均匀性、稳定性对特性值总不确定度的贡献，即通过测定值标准不确定度（

）、瓶间标准不确定度（

）、长期稳定性标准不确定度（

）和短期稳定性标准不确定度（

）的合成并扩展（包含因子

＝2）来评定特性值不确定度（），以下式表示：

式中各不确定度分量及其合成计算如下：

2.6.2.1 由协同定值实验室所带来的批测定的不确定度

：

实验室数为

，检测结果总平均值即：

，与平均值的总均值有关的合成标准不确定度的主要分量是标准偏差：

，而合成不确度为

。计算结果如表11。

表11 协同定值不确定度

2.6.2.2 由瓶间均匀性所带来的不确定度

：

在均匀性研究中，瓶间均匀性已被验证（见表4~表6）。表4已显示

和

，已知瓶内

＝3。瓶间均匀性所带来的不确定度

计算如表12。

表12 瓶间不均匀性所带来的不确定度

计算

2.6.2.3 由稳定性所带来的不确定度

的计算：

应用GB/T 15000.3-2008标准8.5方法，即稳定性不确定度

。

而

由表9得到残差的

值，由此可以计算出。

如在稳定性数据中无显著趋势，假设特性值

从初始值

以一个常数

线性降解，

是相对降解速率，为时间

的函数：

。特性值的不确定度可通过将自变量

、

和

的不确定度传播给因变量

得到。在给定的有效期内

没有显著降解的情况下，稳定性不确定度

。结果如表13。

表13 长期稳定性不确定度计算

2.6.2.4 特性值不确定度的合成与扩展

综上，由于采用协同定值，通过7月份气温条件下邮递将制备的标准样品分发给各参加协同定值的实验室，所得到的一系列测量值已包含了运输不稳定性造成的附加不确定度，故不再单独考虑

。

合成不确定度：由上述各不确定度分量计算合成不确定度，在置信水平为95%时，

。特性值扩展不确定度为：

，合成不确定度及扩展不确定度计算如表14：

表14 特性值不确定度的合成与扩展

因此，本发明制备的含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品特性值见表15：

表15 含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的特性值

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1. 含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：选取体内不含喹诺酮类药物的鳗鱼，置于含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的药浴液中药浴7 h后捕捞以获取阳性鳗鱼，将阳性鳗鱼冷冻处死，宰杀，去内脏、头、尾，去骨，切段，再经搅碎匀浆，拍击均质，挤压过10目筛，得到鳗鱼糜均匀阳性材料，将均匀阳性材料分装、辐照灭菌后，经均匀性检验、稳定性检验、协同定值，得到含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的鳗鱼糜自然基体标准样品。

2. 根据权利要求1所述的含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述制备方法制得的鳗鱼糜自然基体标准样品中5种喹诺酮类的特性值范围为：5μg/kg～30μg/kg。

3. 根据权利要求1所述的含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：药浴液中5种喹诺酮类的初始浓度分别为氟甲喹0.0056 mg/L、噁喹酸0.0183 mg/L、氧氟沙星999 mg/L、诺氟沙星2902 mg/L和环丙沙星2405 mg/L。

4. 根据权利要求1所述的含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：在每个长宽为0.67 m×0.47 m、药液深 0.20 m的药浴实验池中入浴30尾活的成鳗，4尾/kg。

5. 根据权利要求1所述的含5种喹诺酮类残留的鳗鱼糜自然基体标准样品的制备方法，其特征在于：所述阳性鳗鱼是将鳗鱼药浴7 h后直接捕捞、处死获得的。