CN115078565A - 一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法。该测定方法包括如下步骤：S1.将烟用香精样品、C18吸附剂和提取溶剂混合，进行萃取和净化，经固液分离后得提取液，将提取液作为待测液；S2.采用外标法，对待测液进行超高效液相色谱串联质谱分析，经计算后即得烟用香精中对羟基苯甲酸酯的含量。该测试方法实现了烟用香精中对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体)的准确定量，该测定方法的灵敏度高，回收率高，重复性好。

Description

一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法
技术领域
本发明涉及理化检验技术领域，更具体地，涉及一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法。
背景技术
对羟基苯甲酸酯(Paraben)又称尼泊金酯，是一类酯的总称，因其低毒、非挥发性、良好的杀菌能力和稳定性而被用作防腐剂，是一类低毒高效防腐剂。对羟基苯甲酸酯的作用机理为改变细胞膜、细胞壁的渗透性，使微生物体内的酶类和代谢物逸出。羟基苯甲酸酯水溶性较差，可以通过合成其钠盐来提高其水溶性。对羟基苯甲酸酯测定的研究范围较广，涉及化妆品、食品和医药等，所采用的检测方法也不统一，有的采用高效液相色谱法(HPLC)法，气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用法(GC/MS)。
对羟基苯甲酸酯是烟用香精常用的防腐剂，目前烟用香精主要添加的对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯。其中，对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯是两组同分异构体。对羟基苯甲酸酯不同的同分异构体的毒性及其在人体的代谢速率均有差异，故标准对不同的同分异构体最大限量是不同的。现有文献(香精中8种防腐剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定，邓乐乐等，中国食品添加剂分析测试，2019年第1期，156～160)提出了一种检测烟用香精中防腐剂的方法，其中包括了对对羟基苯甲酸酯的检测。但是，该方法未对对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体的检测进行研究。
因此，亟需研究一种能实现对烟用香精中对羟基苯甲酸酯同分异构体的准确定量的方法，为后续卷烟的质量控制提供保障。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中无法实现对烟用香精中对羟基苯甲酸酯同分异构体的准确定量的问题，提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法。该测定方法实现了烟用香精中对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体)的准确定量，该测定方法的灵敏度高，回收率高，重复性好。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，包括如下步骤：
S1.将烟用香精样品、C18吸附剂和提取溶剂混合，进行萃取和净化，经固液分离后得提取液，将提取液作为待测液；
S2.采用外标法，对待测液进行超高效液相色谱串联质谱分析，经计算后即得烟用香精中对羟基苯甲酸酯的含量；
所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱的色谱柱的固定相为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
本发明的发明人尝试利用文献(香精中8种防腐剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定，邓乐乐等，中国食品添加剂分析测试，2019年第1期，156～160)提出的方法对对羟基苯甲酸酯的同分异构体进行检测，该方法无法实现对对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体的分离，从而不能实现其准确定量。
现有的一些检测中，常选用手性柱来实现同分异构体的检测，但是，手性柱不具有普适性，当某一类手性柱可以分离某一类同分异构体，该类手性柱可能不适用于分离另一种同分异构体，其原因在于，不同类的同分异构体的分离难度，及与手性柱中的固定相及洗脱时的流动相的相互作用是有差异的。同时，选用同一手性柱对同一样品中同一类同分异构体进行分离，如前处理的净化方式不同，净化后待测液中的干扰基质也不同，同分异构体分离的效果也不同，故即使某一手性柱可有效分离经某一净化方式处理后的待测液中的某一类同分异构体，该手性柱不一定能有效分离其他净化方式处理后的待测液中的该类同分异构体。此外，对不同样品中的同一类同分异构体，同样因为待测液中的干扰基质可能不同，手性柱分离效果也不能预期。可知，要实现对同分异构体的准确定量，除了取决于手性柱本身对同分异构体的作用情况，同时还取决于样品净化后留下的干扰基质的干扰情况。
本发明的发明人通过多次试验发现，通过前处理时采用C18吸附剂进行净化和超高效液相色谱时采用特定固定相的色谱柱进行分离的共同配合，可实现烟用香精样品中对羟基苯甲酸酯的同分异构体的基线分离，从而准确地进行定量分析。如果将C18吸附剂替换成其他吸附剂，则会存在影响对羟基苯甲酸酯的同分异构体的基线分离的干扰基质，从而无法实现准确定量；如果将特定固定相的色谱柱替换成其他手性柱，也无法实现对羟基苯甲酸酯的同分异构体的基线分离，从而无法进行定量分析。
本发明的测试方法实现了烟用香精中对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体)的准确定量，尤其是对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯的准确定量。该方法的检测限分别为0.012～0.031μg/g，定量限分别为0.042～0.095μg/g，表明该方法的灵敏度高；该方法回收率在91％～108％之间，平均相对标准偏差(RSD)小于6.0％，表明该方法的回收率高，重复性好。
优选地，步骤S1中所述C18吸附剂为C18磁性微球。
进一步优选地，所述C18磁性微球的粒径为0.4～1.0μm。
优选地，步骤S1中所述提取溶剂为甲醇。
优选地，步骤S1中所述烟用香精样品与C18吸附剂的质量比为1:(0.09～0.15)；步骤S1中所述烟用香精样品与提取溶剂的质量比为1:(40～60)g/mL。
优选地，步骤S1中所述提取溶剂为甲醇、乙腈或乙酸乙酯中的至少一种。
进一步优选地，所述提取溶剂为甲醇。
优选地，步骤S1中所述萃取和净化在振荡或超声条件下进行。
进一步优选地，步骤S1中所述萃取和净化在振荡条件下进行。
进一步优选地，所述振荡的振荡时间为3～5min，振荡速率为200～250r/min。
优选地，步骤S1中所述固液分离前还包括静置处理，静置的时间为3～5min。
优选地，步骤S1中所述固液分离的方式为过滤。
优选地，步骤S1中得提取液后，还包括采用氨基化磁性微球对提取液进行净化处理的步骤。
进一步优选地，所述氨基化磁性微球的粒径为0.4～1.0μm。
优选地，步骤S2中所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水；
梯度洗脱的条件为：0min→1.0min→2.0min→4.0min→6.0min→7.0min，流动相A：10％→50％→80％→80％→10％→10％，按体积分数来变化。
在该特定的流动相和梯度洗脱的条件下，能实现对烟用香精中对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体)的更好定量分析。
进一步优选地，流动相B中还加入0.1％～0.3％体积分数的甲酸。加入甲酸，使得对羟基苯甲酸酯出峰的峰形更好。
进一步优选地，所述超高效液相色谱的色谱条件的流速为0.2～0.3mL/min，柱温为30～40℃，进样量为2～5μL。
进一步优选地，所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为含有0.1％体积分数的甲酸的水；
进一步优选地，超高效液相色谱的色谱条件为：流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。
优选地，步骤S2中所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的质谱的测定条件为：扫描方式为负离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度为130～150℃；毛细管电压为2.5～2.8kV；锥孔气流量为50～70L/hour；脱溶剂气流量为600～800L/hour；脱溶剂气温度为300～350℃；采用MRM模式采集。
进一步优选地，所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的质谱的测定条件为：离子源温度为140℃；毛细管电压为2.6kV；锥孔气流量为66L/hour；脱溶剂气流量为600L/hour；脱溶剂气温度为320℃。
进一步优选地，所述质谱的MRM参数：
表1质谱的MRM参数
Figure BDA0003643700610000041
Figure BDA0003643700610000051
优选地，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸异丙酯。
优选地，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯。
优选地，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯。
优选地，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯为羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯或对羟基苯甲酸异丁酯中的至少一种。
优选地，所述色谱柱为Acquity UPC2 Trefoil CEL1色谱柱或Acquity UPC2Trefoil AMY1色谱柱。
优选地，所述色谱柱的规格为：色谱柱直径2.1～3.0mm，色谱柱长度100～150mm，色谱填料粒径1.7～3.0μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的测试方法实现了烟用香精中对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯两组同分异构体)的准确定量。该方法的检测限分别为0.012～0.031μg/g，定量限分别为0.042～0.095μg/g，表明该方法的灵敏度高；该方法回收率在91％～108％之间，平均相对标准偏差(RSD)小于6.0％，该测定方法的灵敏度高，回收率高，重复性好。
附图说明
图1为实施例1的测定方法对烟用香精样品分析所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
图2为实施例1的测定方法对加标样品分析所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
图3为实施例2的测定方法所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
图4为实施例5的测定方法所得对羟基苯甲酸酯(MP)的色谱图。
图5为对比例1的测试定法所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
图6为对比例3的测试定法所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
图7为对比例4的测试定法所得对羟基苯甲酸酯(MP、EP、PP、IPP、BP、IPP)的色谱图。
具体实施方式
为了更清楚、完整的描述本发明的技术方案，以下通过具体实施例进一步详细说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。
实施例和对比例中涉及的部分试剂规格与仪器型号如下：
1)试剂
对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，含有：对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)、对羟基苯甲酸异丙酯(IPP)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)、对羟基苯甲酸异丁酯(IBP)，各物质的浓度都为100μg/mL，溶剂为甲醇，购自坛墨质检。
对羟基苯甲酸甲酯钠盐标准溶液，含有：对羟基苯甲酸甲酯钠、对羟基苯甲酸乙酯钠、对羟基苯甲酸丙酯钠、对羟基苯甲酸异丙酯钠、对羟基苯甲酸丁酯钠、对羟基苯甲酸异丁酯钠，各物质的浓度都为100μg/mL，溶剂为甲醇，购自坛墨质检。
甲醇为色谱级。
C18磁性微球(粒径为约0.4μm，北京京京未来科技发展有限公司)；
氨基化磁性微球(粒径为约1.0μm，表面氨基含量约600nmol/mg，磁含量35％～45％，南京先丰纳米材料科技有限公司)。
烟用香精样品：商购得到。
2)仪器
Waters高效液相色谱串联质谱仪；感量为0.0001g的AE 163电子天平和感量为0.01g的AE 166电子天平(瑞士Mettler公司)。
实施例1
本实施例提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，包括如下步骤：
(1)样品前处理
取烟用香精样品0.2g和C18磁性微球20mg，加入到提取管中，再加入10mL甲醇，振荡提取5min(速率为200r/min)，将提取管竖立于磁铁上静置分离3min，过滤，得到滤液。往滤液中加入氨基化磁性微球20mg，振荡5min(速率为200r/min)，将提取管竖立于磁铁上静置分离3min，过滤，得到滤液，作为待测液，备用。
(2)混合标准工作溶液的制备
分别移取0.1mL对羟基苯甲酸酯标准溶液至同一个10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，制得1.0μg/mL的混合标准储备液；分别移取一定体积的混合标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的混合标准工作溶液，浓度序列为：5、10、20、50、100、200、500ng/mL。
(3)标准曲线的获得
将配制好的不同浓度的混合标准工作溶液注入UPLC-MS/MS(超高效液相色谱串联质谱)，以外标法进行对羟基苯甲酸酯定量分析，即对各标样峰面积(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999。
(4)UPLC-MS/MS分析
将第(1)步所得的待测液注入UPLC-MS/MS进行分析，得色谱图，如图1所示。从图1可知，色谱图中未出现对羟基苯甲酸酯(包括MP、EP、PP、IPP、BP和IPP)的特征峰，表明样品中对羟基苯甲酸酯的含量均低于本方法的检出限。
取与第(1)步相同的烟用香精样品，加入对羟基苯甲酸酯的标准储备溶液，得到加标样品，加标样品中羟基苯甲酸酯的含量均为2mg/kg，加标样品按第(1)步样品前处理的步骤处理后进UPLC-MS/MS测定，经计算后得到MP的含量为2.03mg/kg，EP的含量为1.96mg/kg，PP含量为2.08mg/kg；IPP含量为2.02mg/kg；BP含量为1.85mg/kg；IBP含量为1.88mg/kg，分析过程中记录的色谱图如图2所示。从图2可知，不存在对六种对羟基苯甲酸酯的峰的分离和定量产生影响的干扰峰，且两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)可以得到完全的基线分离。
测定时采用的色谱条件为：色谱柱为Acquity UPC2 Trefoil CEL1(2.1mm×100mm，2.5μm,美国waters公司，填料为表面涂敷有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶颗粒)；流动相A为甲醇，流动相B为水(含0.1％的甲酸，体积分数比)；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 10 90
1.0 50 50
2.0 80 20
4.0 80 20
6.0 10 90
7.0 10 90
测定时采用的质谱条件为：扫描方式为负离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度为140℃；毛细管电压为2.6kV；锥孔气流量为66L/hour；脱溶剂气流量为600L/hour；脱溶剂气温度为320℃；采用MRM模式采集，MRM参数见表3。
表3质谱的MRM参数
Figure BDA0003643700610000081
Figure BDA0003643700610000091
*定量离子
实施例2
本实施例提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：UPLC-MS/MS分析步骤中，超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱所选用的色谱柱为Acquity UPC2 Trefoil AMY1(2.1mm×100mm，2.5μm，美国waters公司，填料为表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶颗粒)。该方法实现了对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)完全的基线分离，准确地测定了样品中对羟基苯甲酸酯(包括MP、EP、PP、IPP、BP和IPP)的含量。分析过程中记录的色谱图如图3所示。
实施例3
本实施例提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：样品前处理步骤中，烟用香精样品的用量为0.18g，C18磁性微球的用量18mg，甲醇的用量为9mL，氨基化磁性微球用量为18mg。该方法实现了对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)完全的基线分离，准确地测定了样品中对羟基苯甲酸酯(包括MP、EP、PP、IPP、BP和IPP)的含量。
实施例4
本实施例提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：样品前处理步骤中，烟用香精样品的用量为0.20g，C18磁性微球的用量18mg，甲醇的用量为12mL，氨基化磁性微球用量为22mg。该方法实现了对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)完全的基线分离，准确地测定了样品中对羟基苯甲酸酯(包括MP、EP、PP、IPP、BP和IPP)的含量。
实施例5
本实施例提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：样品前处理步骤中，完成第一次过滤后，将滤液作为待测液备用，即不采用氨基化磁性微球对滤液进行处理。该方法所得的色谱图中，MP峰前面有干扰峰，具体见图4。但该方法仍能实现了对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)完全的基线分离，准确地测定了样品中对羟基苯甲酸酯(包括MP、EP、PP、IPP、BP和IPP)的含量。
实施例6方法学验证
1、灵敏性
在不含对羟基苯甲酸酯的空白烟用香精样品中加入不同量的对羟基苯甲酸酯混合标准储备溶液，使得样品中对羟基苯甲酸酯的含量分别均为0.01、0.02、0.03、0.04、0.07、0.09mg/kg，采用实施例1的方法测定对羟基苯甲酸酯的含量；以产生3倍信噪比(S/N＝3)的浓度作为方法检测限(LOD)，产生10倍信噪比(S/N＝3)的浓度作为方法定量限(LOQ)。结果如表3所示。由表3可知，本发明的测定方法测定对羟基苯甲酸酯的检出限分别为0.012～0.031μg/g，定量限分别为0.042～0.095μg/g。
2、准确性
在不含对羟基苯甲酸酯的空白烟用香精样品中加入1.0μg/mL的对羟基苯甲酸酯的标准储备溶液，使得样品中对羟基苯甲酸酯的含量均为1.0μg/g，采用实施例1的方法测定对羟基苯甲酸酯的含量。通过实施例1的测定方法测得的MP、EP、PP、IPP、BP、IPP含量分别为0.91、0.93、0.92、1.04、0.99、1.08mg/kg，即MP、EP、PP、IPP、BP、IPP的加标回收率为91％、93％、92％、104％、99％、108％，回收率的范围为91％～108％，说明本发明的测定方法的准确性高。
3、重复性
为了判断本发明的测定方法的重复性，在不含对羟基苯甲酸酯的空白烟用香精样品中加入不同量的对羟基苯甲酸酯的标准储备溶液，使得样品中对羟基苯甲酸酯的含量分别均为0.5、1.0、2.0mg/kg，然后按照实施例1的测定方法测定对羟基苯甲酸酯的含量，重复5次实验，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表4。由表4可以看出，对羟基苯甲酸酯的回收率在91.0％-110.1％之间，平均相对标准偏差(RSD)小于6.0％，说明本发明的测定方法的回收率高，重复性好。
表4方法的回收率和重复性(n＝3)
Figure BDA0003643700610000111
对比例1
本对比例尝试提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：样品前处理步骤和待测液的分析步骤分别采用文献(香精中8种防腐剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定，邓乐乐等，中国食品添加剂分析测试，2019年第1期，156～160)中的样品处理的步骤和分析的步骤，即第1.3.2部分和第1.3.3部分。所得的色谱如图5所示，从图5可知，对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)不能分离。
对比例2
本对比例尝试提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：样品前处理步骤采用文献(香精中8种防腐剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定，邓乐乐等，中国食品添加剂分析测试，2019年第1期，156～160)中的样品处理步骤，即第1.3.2部分。结果如表5所示。由表5可知，对比例2的对羟基苯甲酸酯的回收率(86.8％～91.8％)明显低于实施例6的回收率(91％～108％)，对比例2的测定方法的准确性低，表明经对比例2的前处理步骤处理后得到的待测液存在影响对羟基苯甲酸酯的同分异构体的基线分离的干扰基质，从而无法实现准确定量。
表5不同方法得到的回收率
Figure BDA0003643700610000121
对比例3
本对比例尝试提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：待测液的分析采用文献(香精中8种防腐剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定，邓乐乐等，中国食品添加剂分析测试，2019年第1期，156～160)中的分析的步骤，即第1.3.3部分。所得的色谱如图6所示，从图6可知，对羟基苯甲酸酯的两组同分异构体(PP和IPP、BP和IBP)不能分离。
对比例4
本对比例尝试提供一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，测定的样品与实施例1的样品相同，测定方法的步骤与实施例1的不同之处在于：待测液的分析步骤中，超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱所选用的色谱柱为手性柱Acquity UPC2 TrefoilCEL2(2.1mm×100mm，2.5μm，美国waters公司，填料为表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶颗粒)。所得的色谱如图7所示，从图7可知，对羟基苯甲酸酯的同分异构体(BP和IBP)不能实现基线分离。IBP和BP分离度R＝1.02，小于基线分离要求的分离度R＝1.5。
应用实施例
采用本发明的测定方法对5个的未知烟用香精样品(分别记为1#、2#、3#、4#和5#)的对羟基苯甲酸酯进行测定，测定结果结果如下表6所示。
表6未知烟用香精样品的测定结果(mg/kg)
MP EP IPP PP BP IBP
1# 2.02 1.42 / / / /
2# / / / 1.55 / /
3# / 2.26 / / 1.04 /
4# 7.76 / / / / /
5# / 8.86 / / / /
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烟用香精中对羟基苯甲酸酯的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将烟用香精样品、C18吸附剂和提取溶剂混合，进行萃取和净化，经固液分离后得提取液，将提取液作为待测液；
S2.采用外标法，对待测液进行超高效液相色谱串联质谱分析，经计算后即得烟用香精中对羟基苯甲酸酯的含量；
所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱的色谱柱的固定相为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
2.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S1中所述C18吸附剂为C18磁性微球；步骤S1中所述提取溶剂为甲醇、乙腈或乙酸乙酯中的至少一种。
3.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S1中所述烟用香精样品与C18吸附剂的质量比为1:(0.09～0.15)；步骤S1中所述烟用香精样品与提取溶剂的质量体积比为1:(40～60)g/mL。
4.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S1中所述萃取和净化在振荡或超声条件下进行。
5.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S1中得提取液后，还包括采用氨基化磁性微球对提取液进行净化处理的步骤。
6.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S2中所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水；
梯度洗脱的条件为：0min→1.0min→2.0min→4.0min→6.0min→7.0min，流动相A：10％→50％→80％→80％→10％→10％，按体积分数来变化。
7.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S2中所述超高效液相色谱串联质谱的超高效液相色谱的质谱的测定条件为：扫描方式为负离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度为130～150℃；毛细管电压为2.5～2.8kV；锥孔气流量为50～70L/hour；脱溶剂气流量为600～800L/hour；脱溶剂气温度为300～350℃；采用MRM模式采集。
8.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸异丙酯。
9.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，步骤S2中所述对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯。
10.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，所述色谱柱为Acquity UPC2TrefoilCEL1色谱柱或Acquity UPC2 Trefoil AMY1色谱柱；所述色谱柱的规格为：色谱柱直径2.1～3.0mm，色谱柱长度100～150mm，色谱填料粒径1.7～3.0μm。
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