CN111323497A - 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法 - Google Patents

一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111323497A
CN111323497A CN201811541744.9A CN201811541744A CN111323497A CN 111323497 A CN111323497 A CN 111323497A CN 201811541744 A CN201811541744 A CN 201811541744A CN 111323497 A CN111323497 A CN 111323497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
optical purity
phase
tert
pasireotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811541744.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111323497B (zh
Inventor
吴砺
高红旗
李孝
吴醇
李雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd filed Critical Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd
Priority to CN201811541744.9A priority Critical patent/CN111323497B/zh
Publication of CN111323497A publication Critical patent/CN111323497A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111323497B publication Critical patent/CN111323497B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/64—Electrical detectors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法，包括：分别配制供试品溶液和对照品溶液；根据预设色谱条件，基于手性色谱柱，通过HPLC对所述供试品溶液和所述对照品溶液分别进样并洗脱；分别记录所述供试品溶液和所述对照品溶液的色谱图；基于面积归一法，根据所述色谱图按峰面积计算得到(S)‑型N(e)‑叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度。本发明所提供的光学纯度分析方法灵敏度高、提高了针对于(S)‑型N(e)‑叔丁氧羰基赖氨酸的化合物手性分析的准确性，重现性好，操作方法简单，速度快效率高，为对于(S)‑型N(e)‑叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度快速准确的分析提供了方便。

Description

一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种帕瑞肽起始原料的光学纯度 分析方法。
背景技术
帕瑞肽是一种多受体靶向生长激素(Somatostatin，SST)抑制剂类似物， 能够高亲和力结合5种促生长素抑制素受体(SST Receptor，SSTR)亚型中的 4种(SST1,2,3,5)，通过与生长抑素受体结合发挥其药理作用。它是由瑞士 诺华制药公司(Novartis PharmaAG)研制的一种多肽药物，于2012年4 月25日首次由欧盟药品监管当局按照罕见病的相关法规批准上市，商品名 Signifor，2012年12月14日获得了美国FDA批准，用于治疗肾上腺皮质 机能亢进和不能通过手术治疗的库欣病(Cushing’s disease)，之后陆续在48 个国家获准上市。
Figure BDA0001908338160000011
N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸是合成帕瑞肽的重要起始原料，在帕瑞肽的合 成中以(S)-型的N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸作为原料参与多肽反应。由于N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸其结构中含有一个α-氨基、一个α-羧基和一个手性中心， 存在(S)-型和(R)-型(见如下化学结构式)两种对映异构体，因此N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸原料中可能会存在有(R)-型的N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸， 会引入光学异构体杂质，将会大大增加帕瑞肽的纯化难度。
Figure BDA0001908338160000021
目前，由于N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸分子结构简单，分子量小，且分子 本身没有生色基团，在紫外光照下没有吸收和/或末端吸收很弱，在普通色 谱条件下无响应，难以用普通液相色谱法直接检测。传统方法中，主要采 用测定比旋度的方法控制氨基酸及其衍生物的光学纯度，但是受专属性、 灵敏度等的限制，方法误差大、重复性差、操作繁琐，比旋度法不能有效 的控制氨基酸的光学纯度，尤其是对于比旋度数值较小的保护氨基酸更是 如此。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析 方法，包括：
分别配制供试品溶液和对照品溶液；
根据预设色谱条件，基于手性色谱柱，通过HPLC对所述供试品溶液 和所述对照品溶液分别进样并洗脱；
分别记录所述供试品溶液和所述对照品溶液的色谱图；
基于面积归一法，根据所述色谱图按峰面积计算得到(S)-型N(e)-叔 丁氧羰基赖氨酸的光学纯度；
其中，所述对照品溶液包括：
第一对照品溶液为(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液；
第二对照品溶液为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和(R)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸标准品混合溶液。
优选地，所述预设色谱条件包括：
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈；
A相的体积占比为30％-60％；B相为总量减去A相占比的余量。
优选地，所述预设色谱条件中，所述B相还包括缓冲液；
所述缓冲液的浓度范围为0.005-0.1mol/L；
通过所述缓冲液将所述B相中的溶液的pH调为3.0-12。
优选地，所述缓冲液包括甲酸溶液、乙酸溶液、丙酸、三氟乙酸溶液、 二乙胺溶液、三乙胺溶液、三乙醇胺溶液、氨水溶液中的一种或几种。
优选地，所述预设色谱条件包括：
手性色谱柱填充剂为以(S,S)-反式-2-氨基环己基磺酸-奎宁键合相硅 胶，规格为150×4nm、200×4nm、250×4nm、200×4.6nm、250×4.6nm中 的一种或几种。
优选地，所述预设色谱条件包括：
柱温为20-30℃；
流动相速度为0.2-0.6mL/min；
检测波长为220nm。
优选地，所述预设色谱条件包括：
所述手性色谱柱规格为4×150nm，3μm；
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈+50mM甲酸+25mM 二乙胺；
其中，A相：B相＝40:60；
流动相速度：0.4mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：220nm；
洗脱方式为等度洗脱。
优选地，所述对照品溶液还包括第三对照品溶液，为(S)-型N(e)-叔 丁氧羰基赖氨酸标准溶液。
优选地，所述供试品溶液浓度为5-50mg/mL。
所述对照品溶液浓度为2.5-50mg/mL。
优选地，所述供试品溶液浓度为10-20mg/mL；
所述对照品溶液浓度为10-20mg/mL。
本发明提供一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法，通过手性HPLC 法，以(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液与(S)-型N(e)-叔丁氧羰 基赖氨酸和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品混合溶液为对照品，基 于面积归一法，根据所述色谱图按峰面积计算得到供试品(S)-型N(e)-叔 丁氧羰基赖氨酸的光学纯度，灵敏度高、提高了针对于(S)-型N(e)-叔丁 氧羰基赖氨酸的化合物手性分析的准确性，重现性好，操作方法简单，速 度快，效率高，为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度快速准确的 分析提供了方便。
附图说明
图1为本发明实施例1中对照品图谱，其中保留时间14.669min 为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸峰；17.300min为(R)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸峰；
图2为本发明实施例1中供试品图谱，其中保留时间14.476min 为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸峰；
图3为本发明实施例1的平行试验以及对照品的重叠图谱，其 中保留时间14.476min和14.669min为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨 酸峰；17.019和17.300min为(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸峰；
图4为本发明实施例4中对照品图谱，其中保留时间17.120min 为(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸峰；
图5为本发明实施例4中对照品图谱，其中保留时间14.687min 为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸峰。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附 图做进一步说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明， 但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的 有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本发明提供一种帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，包括：
分别配制供试品溶液和对照品溶液；
根据预设色谱条件，基于手性色谱柱，通过HPLC对所述供试品溶液 和所述对照品溶液分别进样并洗脱；
分别记录所述供试品溶液和所述对照品溶液的色谱图；
基于面积归一法，根据所述色谱图及其中的S和/或R型峰面积比按光 学纯度公式计算得到(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度；
其中，所述对照品溶液包括：
第一对照品溶液为(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液；
第二对照品溶液为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和(R)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸标准品混合溶液。
上述，供试品，可以为待测的(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸样品。
上述，需要说明的是，光学纯度又称旋光纯度，通常用％o.p.表示，是 衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度。对映体过量， 通常用手性柱进行区分，根据不同构型S、R的百分占比，进行计算。
具体的，光学纯度计算公式为：
光学纯度＝百分余数＝{([R]-[S])/[R]+[S])}×100％；
其中，在公式中[R]、[S]分别表示R型S型峰面积的占比。
在计算时，基于面积归一法，根据HPLC的色谱图及S和/或R型峰面 积比按光学纯度公式计算得到(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度；
现有技术中，测试(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸化合物的光学纯度， 一般包括以下几种方法：
1、通过旋光仪测试化合物的比旋光度：此种方法成本低速度快，但是 准确性差、稳定性差、重现性差，且极易受外界因素影响造成较大偏差， 尤其是对于外消旋体或者立体手性混合物进行测试时无法得到准确可信的 结果；(具体的，测出纯S或R的旋光度后，用试样比标样也可知光学含量： 光学纯度＝(测得样品的比旋光度/纯对映体的比旋光度)×100％)
2、X-ray，此种方法对化合物纯度和晶型要求较高，否则无法测试，测 试方法繁琐且成本高昂，不适合批量检测或随时检测；
3、核磁共振，此种方法需要使用昂贵的氘代试剂进行对化合物的溶解， 并且对于化合物的纯度有一定要求，且对于空间立体异构的混合物无法得 到可准确分析的结果；
4、CD谱，此种方法不适合于空间立体异构体的光学纯度的测试。
为解决上述问题，本实施例提供一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析 方法，通过手性HPLC法，以(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液与 (S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品 混合溶液为对照品，可通过HPLC基于面积归一法，根据所述色谱图按峰 面积计算得到供试品(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度。灵敏度 高、提高了针对于(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的化合物手性分析的准 确性，重现性好，操作方法简单，速度快，效率高，为(S)-型N(e)-叔丁 氧羰基赖氨酸的光学纯度快速准确的分析提供了方便。
优选地，所述预设色谱条件包括：
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈；
A相的体积占比为30％-60％；B相为总量减去A相占比的余量。
优选地，所述预设色谱条件中，所述B相还包括缓冲液；
所述缓冲液的浓度范围为0.005-0.1mol/L；
通过所述缓冲液将所述B相中的溶液的pH调为3.0-12。
优选地，所述缓冲液包括甲酸溶液、乙酸溶液、丙酸、三氟乙酸溶液、 二乙胺溶液、三乙胺溶液、三乙醇胺溶液、氨水溶液中的一种或几种。
通过大量实验摸索发现，通过调节色谱条件，对流动相比例以及在流 动相中加入缓冲试剂的量的优化，可以得到重复性好、分离度高、确定性 好以及方便快捷的鉴别和测定方法。上述缓冲溶液中，优选的，可加入甲 酸和二乙胺的混合溶液作为缓冲液，使峰型更好，分离度更高。
该方法设计科学合理，操作简便，通过液相HPLC方式，能够准确有 效的检测出氨基酸及其衍生物的光学纯度，很好地解决了现有技术中专属 性、灵敏度限制的问题。
优选地，所述预设色谱条件包括：
手性色谱柱填充剂为以(S,S)-反式-2-氨基环己基磺酸-奎宁键合相硅 胶，规格为150×4nm、200×4nm、250×4nm、200×4.6nm、250×4.6nm中 的一种或几种。
上述，填充剂为(S,S)-反式-2-氨基环己基磺酸-奎宁键合相硅胶，即 本实施例中所采用的色谱柱为包含有手性填柱料的手性色谱柱，从而可针 对于(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度快速准确的分析提供了方 便。
其规格，可依据进样量的不同，需要保留时间的不同、分离度的不同 进行选择。
优选地，所述预设色谱条件包括：
柱温为20-30℃；
流动相速度为0.2-0.6mL/min；
检测波长为220nm。
需要说明的是，通过实验证明，检测过程中，柱温过高会导致填料流 失而导致柱效下降，且柱温升高会导致保留时间变短，影响主峰与杂峰间 的分离度；若柱温比室温低太多，会使柱温箱难以准确控温；将柱温设置 为20-30℃之间；其中，柱温设置为25℃时检测效果最优。
将流速优选设定在0.2-0.6mL/min，通过实验证明，流速过大可能会使 色谱柱压力过高，流速过低可能会使出峰时间延长而不利于快速检测，在 本实施例中，通过将流速设置为0.2-0.6mL/min，可达到较好的分离效果。
检测波长为220nm左右，在本实施例中，优选检测波长为220nm，其 原因即为在该波长下有最大吸收且反应液中无其他物质干扰，从而可更好 的辨析图谱，达到准确检测的目的。
优选地，所述预设色谱条件包括：
所述手性色谱柱规格为4×150nm，3μm；
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈+50mM甲酸+25mM 二乙胺；
其中，A相：B相＝40:60；
流动相速度：0.4mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：220nm；
洗脱方式为等度洗脱。
上述，优选的色谱条件为所述手性色谱柱规格为4×150nm，3μm，流 动相：甲醇：乙腈(40：60)+50mM甲酸+25mM二乙胺；流速：0.4mL/min； 柱温：25℃；洗脱方式：等度洗脱；检测波长：220nm。在该条件下，可对 于(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸进行更加准确的光学纯度分析。
优选地，所述对照品溶液还包括第三对照品溶液，为(S)-型N(e)-叔 丁氧羰基赖氨酸标准溶液。
上述，在本实施例中，还可以采用手性HPLC法鉴别帕瑞肽起始氨基 酸原料N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的S-构型和R-构型。对于所得到的未知光学 纯度的疑似N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的S-构型化合物，可通过上述色谱条件 对其进行鉴别，判断该化合物的构型是否为S-构型或R-构型，或者为两者 的手性混合物。
鉴别方法包括如下步骤：
1、分别制备供试品溶液和对照品溶液；
2、设置进样程序；
3、记录色谱图，以主峰的出峰时间t(min)来鉴别N(e)-叔丁氧羰基 赖氨酸的光学异构体。
所述供试品溶液为：(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸溶液；
所述对照品溶液为：(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液。
通过试品溶液和对照品溶液的色谱图中相应化合物的出峰时间的比对， 从而可确定该化合物为(S)-构型或(R)-构型。
此外，还可在进行光学纯度检测时，同时进行对于该化合物的构型鉴 别实验，即在原有的对照品队列中，再加入第三对照品溶液，为(S)-型 N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液即可，从而可通过一次进样，达到一举多 得，同时进行鉴别和光学纯度分析的结果，节省了大量的实验时间、提高 了鉴别和分析效率，实验时间缩短减少了有机溶剂的浪费，降低了实验成 本，使本实施例中所提供的鉴别和光学纯度分析方法可适合于多批量样品 的同时测试，为对于(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的鉴别和光学纯度检 测提供了方便。
优选地，所述供试品溶液浓度为5-50mg/mL。
所述对照品溶液浓度为2.5-50mg/mL。
优选地，所述供试品溶液浓度为10-20mg/mL；
所述对照品溶液浓度为10-20mg/mL。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方 案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和 工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味 着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域 的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效 替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实验原料：
表1对照品化合物信息
Figure BDA0001908338160000111
表2试剂和耗材信息
试剂 规格 来源 批号
乙腈 色谱纯 Merck 1.00030.4000
甲醇 色谱纯 Merck 1.06007.4008
甲酸 色谱纯 国药 20170625
二乙胺 色谱纯 国药 20171104
水 超纯水 自制 20180327
实验设备：Agilent 1200液相色谱仪，包括各部件(型号)四元泵 (G1311C)、自动进样器(G1329B)、柱温箱(G1316A)、紫外检测器 (QC-LC001)；梅特勒十万分之一电子天平，XS105。
实施例1：
N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度检测实验方法：
色谱柱：ChiralPak ZWIX(+)，4×150nm，3μm。
流动相：A：甲醇；B：乙腈；以甲醇：乙腈(40:60)+50mM甲酸+25mM 二乙胺；
流速：0.4mL/min；
柱温：25℃；
洗脱方式：等度洗脱；
检测波长：220nm；
进样量：10μL。
对照样品溶液的配制：分别精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸 和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品适量，加ACN：H2O(1:1)+1％TFA 溶解并稀释制成每1mL中约含10mg S-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和R型 -N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸，过0.45μm微孔滤膜，作为对照品溶液。
供试样品溶液的配置：精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸适量， 加ACN：H2O(1:1)+1％TFA溶解并稀释制成每1mL中约含(S)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸10mg的溶液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
流动相的配置：流动相A：甲醇，过0.45μm微孔滤膜，即得。流动相 B：用1L量筒量取800mL乙腈，用1mL移液管移取25mL二乙胺，50mM 甲酸，加乙腈至满刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记 录色谱图。
以归一法按峰面积计算供试品中N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度。
实施例2：
N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度检测实验方法：
色谱柱：ChiralPak ZWIX(+)，250×4nm，3μm。
流动相：A：甲醇；B：乙腈；以甲醇：乙腈(40:60)+50mM乙酸+25mM 三乙胺溶液；
流速：0.6mL/min；
柱温：30℃；
洗脱方式：等度洗脱；
检测波长：220nm；
进样量：10μL。
对照样品溶液的配制：分别精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸 和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品适量，加ACN：H2O(1:1)+1％TFA 溶解并稀释制成每1mL中约含20mg(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和R 型-N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸，过0.45μm微孔滤膜，作为对照品溶液。
供试样品溶液的配置：精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸适量， 加ACN：H2O(1:1)+1％TFA溶解并稀释制成每1mL中约含(S)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸20mg的溶液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
流动相的配置：流动相A：甲醇，过0.45μm微孔滤膜，即得。流动相 B：用1L量筒量取800mL乙腈，用1mL移液管移取25mL三乙胺，50mM 乙酸，加乙腈至满刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记 录色谱图。
以归一法按峰面积计算供试品中N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度。
实施例3：
N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度检测实验方法：
色谱柱：ChiralPak ZWIX(+)，200×4.6nm，3μm。
流动相：A：甲醇；B：乙腈；以甲醇：乙腈(40:60)+50mM丙酸+25mM 氨水溶液；
流速：0.2mL/min；
柱温：20℃；
洗脱方式：等度洗脱；
检测波长：220nm；
进样量：10μL。
对照样品溶液的配制：分别精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸 和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品适量，加ACN：H2O(1:1)+1％TFA 溶解并稀释制成每1mL中约含15mg(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和R 型-N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸，过0.45μm微孔滤膜，作为对照品溶液。
供试样品溶液的配置：精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸适量， 加ACN：H2O(1:1)+1％TFA溶解并稀释制成每1mL中约含(S)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸15mg的溶液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
流动相的配置：流动相A：甲醇，过0.45μm微孔滤膜，即得。流动相 B：用1L量筒量取800mL乙腈，用1mL移液管移取25mL氨水，50mM 丙酸，加乙腈至满刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记 录色谱图。
以归一法按峰面积计算供试品中N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度。
实施例4：
N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的鉴别实验方法：
色谱柱：ChiralPak ZWIX(+)，4×150nm，3μm。
流动相：A：甲醇、B：乙腈；以甲醇：乙腈(40：60)+50mM甲酸+25mM 二乙胺；
流速：0.4mL/min；
柱温：25℃；
洗脱方式：等度洗脱；
检测波长：220nm；
进样量：5μL。
对照样品溶液的配制：精密称取(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准 品适量，加ACN：H2O(1:1)+1％TFA溶解并稀释配制成每1mL中约含(R) -型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸10mg的溶液，过0.45μm微孔滤膜，作为对照 品溶液。
供试样品溶液的配置：精密称取(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸适量， 加ACN：H2O(1:1)+1％TFA溶解并稀释制成每1mL中约含(S)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸10mg的溶液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
流动相的配置：流动相A：甲醇，过0.45μm微孔滤膜，即得。流动相 B：用1L量筒量取800mL乙腈，用1mL移液管移取25mL乙二胺，50mM 甲酸，加乙腈至满刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
分别精密量取供试品溶液与对照品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪， 记录色谱图。
以HPLC图谱中主峰的出峰时间t(min)的不同来鉴别N(e)-叔丁氧羰 基赖氨酸的光学构型。
实验结论：
通过基于本申请中所提供的帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法，分 别进行了实施例1-3中的对于N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度检测实验， 以及实施例4中的N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的鉴别实验，可获知上述方法均 可对于帕瑞肽起始原料N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸进行光学纯度分析，以及进 行N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的手性异构的鉴别。
其中，实施例1(图1-3)和实施例4(图4-5)中的实验效果较好，在 较短的保留时间内可得到分离度较高、稳定性好、精密度好的谱图。
而由图4和图5所示，对于供试品的鉴别试验中，通过与对照溶液中 的(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品进行出峰时间比对，可清晰地确 认供试品的化合物为区别于(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的(S)-型N(e)- 叔丁氧羰基赖氨酸化合物。
本发明尝试过仅采用A相为甲醇，B相为乙腈的两相流动相，但无法 有效分离R-构型和S构型对映异构体，分离度极低，但在流动相B中加入 缓冲液后，尤其是加入50mM甲酸和25mM二乙胺后，峰型更好，分离度 更高。
根据手性HPLC谱图2，本发明的方法能够检出R-构型的，而根据手 性HPLC谱图1，本发明供试品图谱中并未检出有R-构型峰，而即表明供 试品中不含有R-构型的光学杂质，表明供试品为单一S构型对映异构体， 是纯的光学活性物质为100％的对映异构体，R-构型光学杂质的光学纯度为 0。
不同次的平行实验，在液相图上出峰时间会出现局部飘移，但由图3 (实施例1的平行试验以及对照品的重叠图)可知，飘移的峰是相同的物 质，重现性较好。
由图1的对照品溶液和图2中的供试品溶液的色谱图，可获知相应的 色谱峰对应的出峰时间和相对峰面积，获得对应的光学纯度。
表3图3中供试品和对照品的保留时间和相对峰面积信息
Figure BDA0001908338160000161
Figure BDA0001908338160000171
综上，在该色谱条件下分别进行或同时进行鉴别和光学纯度分析实验， 提高了针对于(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的化合物手性分析的准确性， 重现性好，操作方法简单，速度快效率高，为对于(S)-型N(e)-叔丁氧羰 基赖氨酸的光学纯度快速准确的分析提供了方便。

Claims (10)

1.一种帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，包括：
分别配制供试品溶液和对照品溶液；
根据预设色谱条件，基于手性色谱柱，通过HPLC对所述供试品溶液和所述对照品溶液分别进样并洗脱；
分别记录所述供试品溶液和所述对照品溶液的色谱图；
基于面积归一法，根据所述色谱图及其中的S和/或R型峰面积比按光学纯度公式计算得到(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸的光学纯度；
其中，所述对照品溶液包括：
第一对照品溶液为(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液；
第二对照品溶液为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸和(R)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准品混合溶液。
2.如权利要求1所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述预设色谱条件包括：
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈；
A相的体积占比为30％-60％；B相为总量减去A相占比的余量。
3.如权利要求2所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述预设色谱条件中，所述B相还包括缓冲液；
所述缓冲液的浓度范围为0.005-0.1mol/L；
通过所述缓冲液将所述B相中的溶液的pH调为3.0-12。
4.如权利要求3所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述缓冲液包括甲酸溶液、乙酸溶液、丙酸、三氟乙酸溶液、二乙胺溶液、三乙胺溶液、三乙醇胺溶液、氨水溶液中的一种或几种。
5.如权利要求1所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述预设色谱条件包括：
手性色谱柱填充剂为以(S,S)-反式-2-氨基环己基磺酸-奎宁键合相硅胶，规格为150×4nm、200×4nm、250×4nm、200×4.6nm、250×4.6nm中的一种或几种。
6.如权利要求1所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述预设色谱条件包括：
柱温为20-30℃；
流动相速度为0.2-0.6mL/min；
检测波长为220nm。
7.如权利要求1所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述预设色谱条件包括：
所述手性色谱柱规格为4×150nm，3μm；
采用两相流动相；其中，A相为甲醇；B相为乙腈+50mM甲酸+25mM二乙胺；
其中，A相：B相＝40:60；
流动相速度：0.4mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：220nm；
洗脱方式为等度洗脱。
8.如权利要求1所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述对照品溶液还包括第三对照品溶液，为(S)-型N(e)-叔丁氧羰基赖氨酸标准溶液。
9.如权利要求1-8任一项所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述供试品溶液浓度为5-50mg/mL；
所述对照品溶液浓度为2.5-50mg/mL。
10.如权利要求1-8任一项所述帕瑞肽起始原料的光学纯度测定方法，其特征在于，所述供试品溶液浓度为10-20mg/mL；
所述对照品溶液浓度为10-20mg/mL。
CN201811541744.9A 2018-12-17 2018-12-17 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法 Active CN111323497B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811541744.9A CN111323497B (zh) 2018-12-17 2018-12-17 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811541744.9A CN111323497B (zh) 2018-12-17 2018-12-17 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111323497A true CN111323497A (zh) 2020-06-23
CN111323497B CN111323497B (zh) 2022-07-12

Family

ID=71168987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811541744.9A Active CN111323497B (zh) 2018-12-17 2018-12-17 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111323497B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473145A (zh) * 2000-11-02 2004-02-04 ��ʽ�����ɽ 氨基酸衍生物的光学异构体的分离方法
CN1538171A (zh) * 2003-04-18 2004-10-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种手性配体交换色谱固定相的制备方法
EP3358346A1 (en) * 2015-10-02 2018-08-08 Ajinomoto Co., Inc. Enantiomer analysis method
CN108982688A (zh) * 2018-06-29 2018-12-11 中国农业科学院茶叶研究所 一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473145A (zh) * 2000-11-02 2004-02-04 ��ʽ�����ɽ 氨基酸衍生物的光学异构体的分离方法
CN1538171A (zh) * 2003-04-18 2004-10-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种手性配体交换色谱固定相的制备方法
EP3358346A1 (en) * 2015-10-02 2018-08-08 Ajinomoto Co., Inc. Enantiomer analysis method
CN108982688A (zh) * 2018-06-29 2018-12-11 中国农业科学院茶叶研究所 一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAICEL CORPORATION: "INSTRUCTION MANUAL FOR CHIRALPAK® ZWIX(+) and CHIRALPAK® ZWIX(-)", 《HTTPS://WWW.HPLC.EU/DOWNLOADS/CHIRALPAK-ZWIX5UM_MANUAL.PDF》 *
FEDERICA IANNI ET AL.: "Diastereo- and enantioseparation of a N(α)-Boc amino acid with a zwitterionic quinine-based stationary phase: focus on the stereorecognition mechanism", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
TONG ZHANG ET AL.: "Zwitterionic chiral stationary phases based on cinchona and chiral sulfonic acids for the direct stereoselective separation of amino acids and other amphoteric compounds", 《JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE》 *
朱晓伟等: "手性固定相HPLC法拆分苏氨酸和赖氨酸对映体", 《西北药学杂志》 *
李晶等: "反相高效液相色谱法-蒸发光散射检测器测定普瑞巴林原料药中普瑞巴林R-对映异构体的含量", 《理化检验(化学分册)》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111323497B (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Buck et al. Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent
CN107907603B (zh) 一种测定氨基酸类注射液色氨酸有关物质的测定方法
CN114646701B (zh) 一种l-脯氨酰胺中有关物质的hplc测试方法
CN108663448A (zh) 一种复方氨基酸注射液中有关物质的检测方法
CN106872595B (zh) 基于圆二色光谱技术的手性分子含量的测定方法
CN111323497B (zh) 一种帕瑞肽起始原料的光学纯度分析方法
CN114324703B (zh) 一种同时检测多种氨基酸的方法
CN114705801B (zh) 一种利福霉素类药物中亚硝酸根离子的测定方法
CN114689737B (zh) 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法
CN112630314B (zh) 一种l-丙氨酸异丙酯盐酸盐与其对映异构体的分离方法
Liu Measurement of blood plasma amino acids in ultrafiltrates by high-performance liquid chromatography with automatic precolumn o-phthaldialdehyde derivatization
CN109613163B (zh) 一种酒石酸匹莫范色林及其杂质的检测方法
CN111323503A (zh) 复方氨基酸注射液含量测定方法
CN112881538A (zh) 一种福多司坦及福多司坦片中杂质及对映异构体的检测方法
CN116754705B (zh) 一种醋酸及醋酸根含量的检测方法
CN114200050B (zh) 一种对溴苯甲醚中的有关物质含量的hplc检测方法
CN116930368B (zh) 一种司替戊醇异构体的检测方法
JPS6193956A (ja) 生体液の分析方法およびその装置
CN111122742B (zh) 一种待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法
CN114200067B (zh) 一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法
CN117368337A (zh) 一种立他司特及立他司特滴眼液中对映异构体的检测方法
CN115097040B (zh) 一种木鳖子的uplc特征图谱构建方法及应用
Kesiūnaitė et al. Development of high-performance liquid chromatography for the determination of carbadox and olaquindox in animal feed.
CN117890519A (zh) 高效液相色谱法测定氟-18f标记psma放射性药物放化纯度的方法
CN107091895B (zh) 采用hplc分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant